WO2003050299A2 - Verfahren zur untersuchung der erblichen infertilität des mannes - Google Patents

Verfahren zur untersuchung der erblichen infertilität des mannes Download PDF

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WO2003050299A2
WO2003050299A2 PCT/EP2002/013995 EP0213995W WO03050299A2 WO 2003050299 A2 WO2003050299 A2 WO 2003050299A2 EP 0213995 W EP0213995 W EP 0213995W WO 03050299 A2 WO03050299 A2 WO 03050299A2
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting hereditary male infertility and claims the priority of German patent application 101 60 563.3, to which reference is made in terms of content.
  • genes are known in animals that appear to be responsible for male infertility. These can be located both on the autosomes and on the Y chromosome. Y chromosomal infertility-associated genes have not yet been clearly identified in humans. Nevertheless, it is believed that there are also homologous genes in humans, which are also associated with male infertility and are located on certain regions of the long arm of the Y chromosome. For example, about 7% of all men with idiopathic infertility have a so-called microdeletion in one of these regions on the Y chromosome [Bhasin S, Ma K, De Kretser DM. Y chromosome microdeletions and male infertility. Ann. Med. 29: 261-263, 1997, Hargreave TB. Genetics and male infertility. Curr. Op. Obstet. Gyne-col. 12: 207-219, 2000].
  • CONFIRMAT90M COPY So far there are indications of four regions of the Y chromosome associated with infertility. Since they are probably (partly) responsible for the absence of mature sperm, they are also called azoospermia factors. They are also abbreviated to AZFa, AZFb, AZFc and AZFd.
  • azoospermia Rare genetic causes for azoospermia are mutations in 5 ⁇ -reductase, which converts the male hormone testosterone within the target cells into 5 ⁇ -dihydrotestosterone, and in the androgen receptor, which transports 5 ⁇ -dihydrotestosterone into the cell nucleus, which thus induces specific androgen-dependent activity becomes. Mutations in the 21-hydroxylase gene in congenital adrenal hyperplasia can also be responsible for infertility. In addition, there is also an association with Klinefelter syndrome (karyotype XXY) or other chromosomal aberrations (e.g. karyotype XYY) [Hargreave TB op. Cit.].
  • the invention is therefore based on the object of providing a method for improving the diagnosis of the genetic causes of male infertility and the means necessary for carrying out the method.
  • the essence of the present invention lies in making a targeted selection of mutations, examining the patient for the presence of the mutations, and then evaluating the examination results in a multi-factorial manner.
  • recessive or intermediate mutations are selected which may already be heterozygously associated with male infertility.
  • the multifacorial evaluation of the examination results following the examination of the man then allows an analysis of the possible interactions of the examined sequence sections.
  • the method according to the invention thus enables the representation of a complex mutation pattern which only causes the hereditary infertility of the patient in its complexity and the interactions therein.
  • the method according to the invention thus follows an approach which is fundamentally different from the previous examination methods for male infertility.
  • the method according to the invention also proceeds from a multifactorial or oligo - or polygenetic cause, which can only be identified in a multifactorial analysis.
  • mice with a mutated MDHC7 gene are infertile due to an impaired spermatogenesis (Neesen J, Kirschner R, Ochs M, Schmiedl A, Habermann B, Müller C, Holstein AF, Nuesslein T, Adham I, Engel W: Disruption of an inner arm of dynein heavy chain gene results in asthenozoospermia and reduced ciliary beat frequency.
  • an impaired spermatogenesis Neesen J, Kirschner R, Ochs M, Schmiedl A, Habermann B, Müller C, Holstein AF, Nuesslein T, Adham I, Engel W: Disruption of an inner arm of dynein heavy chain gene results in asthenozoospermia and reduced ciliary beat frequency.
  • mice with a defective gene encoding the estrogen receptor ⁇ (ERalpha) (Mahato D, Goulding EH, Korach KS, Eddy EM; estrogen receptor-alpha is required by supporting somatic cells for spermatogenesis. In: Mol Cell Endocrinol 2001, 178: 57). These defects are all knock-out mutations that lead to infertility.
  • the method according to the invention also examines mutations which - if they are only heterozygous in the patient - stand alone taken do not cause infertility, but nevertheless lead to infertility due to the unexpectedly complex interactions between different mutations in interaction with other mutations - possibly only heterozygous. Mutations can also be taken into account which, even in the homozygous state, do not result in infertility in the sense of a knock out mutation.
  • the mutations taken into account can be either innate or - mutually induced by environmental influences or spontaneously occurring - new mutations.
  • the man is examined whether he is the carrier of the selected mutations by using a microarray.
  • This is particularly suitable for being able to display and evaluate the complex interactions between the mutations.
  • the known methods such as allele-specific PCR, restriction fragment length polymorphism or SSCP, are also possible, for example, for identifying sequence deviations in parts of the male genome.
  • the advantage of using a microarray is that a large number of relevant mutations in an equally high number of relevant genes can be detected simultaneously in just one work step.
  • This invented The embodiment according to the invention is also particularly suitable for automation and thus for the rapid processing of extensive series of samples.
  • the multifactional analysis can be carried out using known statistical standard methods, e.g. B. Correlation check. If microarrays are used, the so-called QTL analysis (quantitative tsait locus) is particularly preferred. It is a statistical analysis method that is used to determine the quantitative contribution of individual chromosonal sections to the expression of complex features.
  • the improved diagnosis of hereditary infertility according to the invention is particularly advantageous also in connection with in vitro fertilization. This procedure has become more important since it has been possible for men with low sperm count (oligozoospermia) to fertilize a woman's egg using the so-called intracytoplasmic sperm injection. In order to prepare this method, a meaningful examination of the causes of the man's infertility is essential, which is made possible by the method according to the invention.
  • the method according to the invention can serve as a tool in the scientific research into male fertility.
  • the consensus sequences attributable to the azoospermic factors can be applied to the support. This can diagnose infertility caused by complete azoospermia.
  • the carrier can be used according to the invention for the detection and display of complex interactions between mutations of the CFTR gene.
  • the mutations of the CFTR gene can be divided into two groups, the "light" and the "heavy” mutations. If there are two severe mutations, the clinical picture of cystic fibrosis is pronounced. In contrast, two slight mutations lead to the congenital aplasia of the vas deferens (vas deferens). The combination of a mild mutation with a severe mutation can either lead to the formation of cystic fibrosis or to congenital bilateral aplasia of the vas deferens - depending on which mutations are involved in the individual case.
  • vas deferens is associated with a so-called second defect (either another slight mutation or an additional severe mutation). This does not have to be in the coding region of the CFTR gene. Rather, over 60% of all men with a missing vas deferens and a heterozygous mutation in the coding CFTR gene have the so-called 5T allele polymorphism in the non-coding part of the gene, namely in the eighth intron, [Chilon M et al. Mutations in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens. N. Engl. J. Med. 332: 1475-1480, 1995].
  • This second defect which is also only heterozygous, and which only causes infertility in the interaction with the first defect, can be identified using the method according to the invention, and the cause of the infertility can thus be diagnosed.
  • the selected probes are applied to a support using standard methods and hybridized with nucleic acids or oligonucleotides from the patient sample [for example Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., Vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gillespie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques.
  • the hybridization can be combined with a detection reaction and subsequent identification of the nucleotide sequence.
  • the first strand of nucleic acid i.e. the patient sample
  • the first strand of nucleic acid can be, for example, by
  • Molecules are labeled while the second (i.e. the probe) is attached to a solid phase, i.e. the carrier or gene chip is bound [Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C,
  • the carrier can be equipped with the oligonucleotides selected as probes according to the invention by known methods, for example by means of lithography, screen printing or reaction channel methods, electrochemical / synthetic methods, inkjet systems, micropin methods or open capillary tips.
  • microbeads are also possible [Lackner KJ etl. Multiplex DNA and RNA analysis on fluorescent microbeads as an alternative to the DNA array. Status seminar chip technology for DNA diagnostics and sequence analysis in Germany. DECHEMA 1999].
  • the mutations which can be represented by the method according to the invention can be simple mutations, e.g. Act substitutions or insertions. More complex mutations such as inversions and indels are also possible.
  • oligonucleotides can also be applied to the support, which are complementary to regions of the native gene segments (so-called reference sequences), which are often lacking in male hereditary infertility (so-called microdeletions, see above). In the absence of a subsequent hybridization, it can be concluded that the examined patient has a deletion.
  • the length of the oligonucleotides applied to the support is advantageously 16 to 25 nucleotides. Preferably 15 to 18 mers are used. Both DNA and RNA sequences as well as combinations or modifications thereof can be applied. Correspondingly, nucleotides with uracil can also be used. Natural or synthetic base analogs can also be used.
  • probes can be applied to the support, which are either identical or complementary to the native reference sequences. If identical oligonucleotides are used for this, the complementary sequences can be synthesized from the patient sample. This synthesis is preferably carried out during the labeling reaction necessary for the later detection of the hybridization.
  • Example 1 DNA chip for the detection of mutations with genes associated with oligo or azoospermia
  • nucleotide number refers to the position of the nucleotide in the transcript, i.e. Nucleotide No. 1 is the first base of the messenger ribonucleotide sequence (and not the first base of the protein-coding nucleotide sequence).
  • nucleotide number refers to the base which is immediately 5 'of the insert.
  • the deletion of individual nucleotides is determined by the nucleotide number of the deleted one Base specified.
  • the nucleotide refers to deletions of several nucleotides Number on the first base at the 5 'end of the deletion.
  • Table 3 lists aberrations of the nucleotide sequence of a reference nucleic acid (i.e. wild-type Vahante). However, the aberration mentioned in each case can take (theoretically) different positions in a nucleotide sequence. Taking into account the exon-intron limits and the associated splice sites, two or more of the oligonucleotides according to the Seq. ID Nos. 1 to 497 can be used.
  • Example 3 DNA chip for the detection of microdeletions in the Y chromosome
  • Table 4 shows consensus sequences of the microdeletions in the Y chromosome. These sequences are applied to the carrier. If there is no hybridization with the nucleotides from the patient sample, it can be concluded that the patient has a corresponding deletion. The relevant sections of their complementary sequences selected according to their melting temperature and specificity are applied to the chip. Up to 5 sequences are shown on the chip per microdeletion.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der genetischen Infertilität oder Disposition des Mannes, wobei eine Auswahl von mindestens zwei mit der Infertilität assoziierten Mutationen erfolgt, sowie ferner eine Untersuchung des Mannes auf Vorhandensein der ausgewählten Mutationen und eine multifaktorielle Auswertung der Untersuchungsergebnisse erfolgt, um eine Diagnose der genetischen Ursachen für die männliche Infertilität bereitzustellen.

Description

"Verfahren zur Untersuchung der erblichen Infertilitat des Mannes"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der erblichen Infertilitat des Mannes und nimmt die Priorität der deutschen Patentanmeldung 101 60 563.3 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.
Weltweit sind etwa 2 bis 7 % aller Paare ungewollt kinderlos. Etwa die Hälfte dieser Fälle geht dabei auf die Infertilitat des Mannes zurück [Spira A. Epi- demiology of human reproduction. Human reproduction 1 :111-115; 1986].
Bei einer Vielzahl der betroffenen Männer kann die Unfruchtbarkeit bisher nicht zufriedenstellend erklärt werden. Vermutlich geht ein erheblicher Anteil dieser sog. "idiopathischen" - d.h. ohne erkennbare Ursache entstandenen - Infertilitat auf genetische Störungen zurück [Bhasin S, Ma K, Sinha I, imbo M, Taylor WE, Salehian B. The genetic basis of male infertility. Endocήnol. Metab. Clin. North Am. 27:783-805, 1998].
So sind beispielsweise bei Tieren einige Gene bekannt, die für die männliche Infertilitat verantwortlich zu sein scheinen. Diese können sowohl auf den Autosomen als auch auf dem Y-Chromosom lokalisiert sein. Y-chromosomale infertilitäts-assoziierte Gene wurden beim Menschen zwar noch nicht eindeutig identifiziert. Gleichwohl wird vermutet, daß es auch beim Menschen homologe Gene gibt, die ebenso mit der männlichen Unfruchtbarkeit assoziiert sind und auf bestimmten Regionen des langen Arms des Y-Chromosoms liegen. So weisen beispielsweise etwa 7% aller Männer mit einer idiopathischen Infertilitat eine sog. Mikrodeletion in einer dieser Regionen auf dem Y-Chromosom auf [Bhasin S, Ma K, De Kretser DM. Y- chromosome microdeletions and male infertility. Ann. Med. 29:261-263, 1997, Hargreave TB. Genetics and male infertility. Curr. Op. Obstet. Gyne- col. 12:207-219, 2000].
CONFIRMAT90M COPY Bisher bestehen Hinweise auf vier mit der Infertilitat assoziierte Regionen des Y-Chromosoms. Da sie vermutlich (mit)-verantwortlich sind für das Fehlen reifer Spermien, werden sie auch als Azoospermie-Faktoren bezeichnet. Sie werden auch mit den Buchstabenkombinationen AZFa, AZFb, AZFc und AZFd abgekürzt.
Während der eindeutige Nachweis der infertilitäts-assoziierten Gene des Y- Chromosoms des Mannes noch nicht erbracht ist, sind bereits einige Defekte der Autosomen bekannt, die in einem Zusammenhang mit der männlichen Infertilitat stehen. So sind zum Beispiel eine Reihe von Mutationen in dem Mukoviszidose(CFTR)-Gen beschrieben worden, die zu Fehlbildungen (Aplasie) der Samenleiter und so zur Azoospermie führen können. Seltenere genetische Ursachen für eine Azoospermie sind Mutationen der 5α-Reduktase, die das männliche Hormon Testosteron innerhalb der Zielzellen in das 5α-Dihydrotestosteron umwandelt sowie des Androgenrezep- tors, der das 5α-Dihydrotestosteron in den Zellkern transportiert, der damit zur spezifischen androgenabhängigen Aktivität veranlaßt wird. Auch Mutationen im 21-Hydroxylase-Gen bei der congenitalen adrenalen Hyperplasie können für die Infertilitat verantwortlich sein. Darüber hinaus besteht zudem auch eine Assoziation zu dem Klinefelter-Syndrom (Karyotyp XXY) oder anderen chromosomalen Aberrationen (z.B. Karyotyp XYY) [Hargreave TB a.a.O.].
Es ist bekannt, mögliche genetische Ursachen der Infertilitat durch die vollständige Sequenzierung der relevanten Gene zu untersuchen. Alternativ zu der vollständigen Sequenzierung können auch nur einzelne Genabschnitte (wie z.B. nur die deltaF508 Mutation im CTFR-Gen) oder kleine Untergruppen von Mutationen gesondert dargestellt werden. Ein Beispiel einer sol- chen Untergruppe stellt das panel von 33 Mutationen im CTFR-Gen dar, das häufig in molekulargenetischen Labors in Deutschland untersucht wird. Die Untersuchungen erfolgen in der Regel mittels der allelspezifischen Polymerasekettenreaktion. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, daß sie in der Regel nur einzelne Sequenzveränderungen, bestenfalls einzelne Gene erfasst. Darüber hinaus ist dies relativ arbeitsintensiv und erfordert Spezialkenntnisse sowohl bei der Durchführung als auch bei der Interpretation der Ergebnisse.
Mit solchen Methoden kann zudem ein deutlicher Zusammenhang zwischen genetischen Defekten einerseits und der männlichen Infertilitat andererseits nicht ausreichend genau erkannt werden. Eine zufriedenstellende Diagnose der genetischen Ursachen der Infertilitat ist somit oft nicht möglich.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verbesserung der Diagnose der genetischen Ursachen für die männliche Infertilitat sowie die für das Durchführen des Verfahrens erforderlichen Mittel bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß dem Hauptanspruch. Ein vorteilhaftes Untersuchungsmittel ist Gegenstand eines unabhängigen Nebenanspruchs. Vorteilhafte Weiterentwicklungen werden in den Unteransprüchen beansprucht.
Der Kern der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine gezielten Auswahl an Mutationen zu treffen, den Patienten auf dem Vorhandensein der Mutationen zu untersuchen und die Untersuchungsergebnisse anschließend multi- faktoriell auszuwerten.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden rezessive oder intermediäre Mutationen ausgewählt, die bereits heterozygot mit der Infertilitat des Mannes assoziiert sein können. Die sich an die Untersuchung des Mannes anschließende multifakorielle Auswertung der Untersuchungsergebnisse erlaubt dann eine Analyse der möglichen Interaktionen der untersuchten Sequenzabschnitte. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht damit die Darstellung eines komplexen Mutationsmusters, das erst in seiner Komplexität und den darin liegenden Interaktionen die erbliche Infertilitat des Patienten verursacht. Damit verfolgt das erfindungsgemäße Verfahren ein von den bisherigen Untersuchungsverfahren zur männlichen Infertilitat grundlegend verschiedenen Ansatz. Während die bekannten Verfahren auf der Annahme basie- ren, daß die erbliche Infertilitat des Patienten auf die Homozygotie oder zusammengesetzter Heterozygotie einzelner rezessiver Mutationen zurückgeht - also eine monokausale Beziehung zwischen der Infertilitat und einzelnen Gendefekten annimmt - geht das erfindungsgemäße Verfahren auch von einer multifaktoriellen oder oligo- bzw. polygenetischen Ursache aus, die nur in einer multifaktoriellen Analyse erkennbar wird.
Die bisherige Annahme, daß die erbliche Infertilitat des Mannes in der Regel monokausal durch homozygot oder zusammengesetzt heterozygot vorliegende rezessive Mutationen verursacht wird, geht im wesentlichen auf Untersuchungen an Mäusemodellen zurück. So ist es beispielsweise bekannt, daß Mäuse mit mutiertem MDHC7-Gen aufgrund einer gestörten Spermatogenese infertil sind (Neesen J, Kirschner R, Ochs M, Schmiedl A, Habermann B, Müller C, Holstein AF, Nuesslein T, Adham I, Engel W: Dis- ruption of an inner arm of dynein heavy chain gene results in astheno- zoospermia and reduced ciliary beat frequency. In: Hum. Mol. Genet 2001 , 10: 1117). Gleiches gilt für Mäuse, mit defektem den Östrogen-Rezeptor α (ERalpha) codierenden Gen (Mahato D, Goulding EH, Korach KS, Eddy EM; estrogen receptor-alpha is required by supporting somatic cells for sperma- togenesis. In: Mol Cell Endocrinol 2001 , 178: 57). Bei diesen Defekten han- delt es sich übereinstimmend um knock out Mutationen, die zur Infertilitat führen.
Des weiteren ist die Annahme einer durch Homozygotie rezessiver Mutationen verursachten angeborenen Infertilitat bereits deswegen in der Fachwelt weit verbreitet, weil dominant heterozygot vorliegende Mutationen naturgemäß nicht in die nächste Generation weitergegeben werden können.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden dagegen auch Mutationen untersucht, die - sofern sie nur heterozygot im Patienten vorliegen - für sich genommen keine Infertilitat verursachen, gleichwohl aber aufgrund der unerwartet komplexen Interaktionen zwischen verschiedenen Mutationen im Zusammenspiel mit anderen - möglicherweise auch nur heterozygot vorliegenden Mutationen - zu einer Infertilitat führen. Ebenso können auch Mutationen berücksichtigt werden, die selbst im homozygoten Zustand nicht im Sinne einer knock out Mutation die Infertilitat nach sich ziehen. Bei den berücksichtigten Mutationen kann es sich sowohl um angeborene oder aber - durch Umwelteinflüsse induzierte oder spontan auftretende - Neumutationen handeln.
Erst diese parallele Untersuchung mindestens zweier verschiedener Mutationen mit einer sich daran anschließenden multifaktorieller Analyse der Ergebnisse ermöglicht die Diagnose der auf diese komplexen Interaktionen heterozygot vorliegender Mutationen verursachten Infertilitat.
Damit stellt es einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, eine erbliche Infertilitat aufzuzeigen, die erst durch die Kombination verschiedener - jeweils heterozygot vorliegender - genetischer Defekte entsteht und daher durch herkömmliche Genanalysen, die nur einzelne oder , allenfalls eine sehr begrenzte Anzahl von Genen ohne multifakorielle Auswertung erfassen, nicht nachweisbar ist.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform erfolgt die Untersuchung des Mannes, ob er Träger der ausgewählten Mutationen ist, über die Ver- wendung eines Microarrays. Dieses ist in besonderer Weise geeignet, die komplexen Interaktionen zwischen den Mutationen darstellen und auswerten zu können. Es sind aber auch beispielsweise die bekannten Verfahren, wie allelspezifische PCR, Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus oder SSCP zur Identifizierung von Sequenzabweichungen in Teilen des Genoms des Mannes möglich.
Mit der Verwendung eines Microarrays geht der Vorteil einher, daß eine hohe Anzahl relevanter Mutationen in einer ebenso hohen Anzahl relevanter Gene in nur einem Arbeitsgang simultan erfaßt werden können. Diese erfin- dungsgemäße Ausführungsform eignet sich darüber hinaus in besonderer Weise für die Automatisierung und somit für die rasche Bearbeitung umfangreicher Probenserien.
Neben der Darstellung über einen Microarray können auch andere Methoden eingesetzt werden, die eine multifaktorielle Analyse erlauben, so z. B. die sog. Differential Display PCR, Northern Blots, SAGE oder Massively Parallel Signature Sequencing.
Die multifaktionelle Analyse kann mittels bekannter statistischer Standardverfahren, so z. B. Korrelationsprüfung erfolgen. Sofern Microarrays verwendet werden, ist der sog. QTL-Analyse (Quantitative Tsait Locus) besonders bevorzugt. Dabei handelt es sich um ein statistissches Analyseverfahren, das der Ermittlung des quantitativen Beitrags einzelner chromosonaler Abschnitte an der Ausprägung komplexer Merkmale dient.
Die erfindungsgemäß verbesserte Diagnose der erblichen Infertilitat ist insbesondere auch im Zusammenhang mit der in vitro Fertilisation vorteilhaft. Dieses Verfahren hat an Bedeutung gewonnen, seitdem es bei Männern mit niedriger Spermienzahl (Oligozoospermie) möglich ist, ein Ei der Frau mit Hilfe der sog. intrazytoplasmatischen Spermieninjektion zu befruchten. Zur Vorbereitung dieser Methode ist eine aussagekräftige Untersuchung der Ursachen für die Infertilitat des Mannes unerläßlich, die das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht.
Neben dieser Verwendung kann das erfindungsgemäße Verfahren als Werkzeug bei der wissenschaftlichen Erforschung der Fertilität des Mannes dienen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die den Azoosper- mie-Faktoren zuzurechnenden Konsensussequenzen auf den Träger aufgebracht werden. Hierdurch kann eine durch die vollständige Azoospermie verursachten Infertilitat diagnostiziert werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Träger erfindungsgemäß zum Nachweis und zur Darstellung komplexer Interaktionen zwischen Mutationen des CFTR-Gens verwendet werden. Die Mutationen des CFTR-Gens lassen sich - etwas vereinfacht - in zwei Gruppen, nämlich die "leichten" und die "schweren" Mutationen unterteilen. Liegen zwei schwere Mutationen vor, wird das Krankheitsbild der Zystischen Fibröse ausgeprägt. Zwei leichte Mutationen führen hingegen zu der angeborenen Aplasie des Samenleiters (Vas deferens). Die Kombination von einer leichten Mutation mit einer schweren Mutation kann allerdings entweder zur Ausbildung der Zystischen Fibröse oder zur kongenitalen bilateralen Aplasie des Samenleiters führen - je nachdem, welche Mutationen im Einzelfall beteiligt sind.
Ein abwesender Vas deferens ist damit mit einem sog. Zweitdefekt (entweder eine weitere leichte Mutation oder eine zusätzliche schwere Mutation) verbunden. Dieser muß nicht in dem kodierenden Bereich des CFTR-Gens liegen. Vielmehr weisen über 60% aller Männer mit fehlendem Samenleiter und einer heterozygoten Mutation im kodierenden CFTR-Gen den sog. 5T-Allel Polymorphismus im nicht kodierenden Teil des Gens, nämlich in dem achten Intron, auf [Chilon M et al. Mutations in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens. N. Engl. J. Med. 332: 1475-1480, 1995].
Dieser - auch nur heterozygot vorliegende - Zweitdefekt, der in der Interaktion mit dem Erstdefekt erst die Infertilitat verursacht, kann mit dem erfin- dungsgemäßen Verfahren erkannt und somit die Ursache der Infertilitat diagnostiziert werden. Entsprechendes gilt ebenso für andere Interaktionen von Genen oder Nukleinsäureabschnitten, so beispielsweise für die Interaktion zwischen Mutationen im Kallmann-Syndrom-Gen und Mutationen des CFTR-Gens.
Gleiches gilt für Mutationen in Genen des Steroid-Stoffwechsels, die im Zusammenspiel mit anderen Mutationen zu einer genetisch bedingten Infertilitat führen können. Sofern ein Microarray für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt wird, werden die ausgewählten Sonden mit Standardverfahren auf einem Träger aufgebracht und mit Nukleinsäuren bzw. Oligonu- kleotiden aus der Patientenprobe hybridisiert [beispielsweise Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96- 97; Constanzi C, Gillespie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Academic Press Inc., San Diego; Methods in Enzymology 1987, 152:p582-587; Schena M et al.; Quantitative monitoring of gene expression pattems with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270:p467-470].
Die Hybridisierung kann mit einer Nachweisreaktion und anschließender Identifizierung der Nukleotidsequenz kombiniert werden. Dazu kann der erste Nukleinsäurestrang (d.h. die Patientenprobe) beispielsweise durch
Farbstoffe, Radioaktivität oder chemilumineszierende oder fluoreszierende
Moleküle markiert werden, während der zweite (d.h. die Sonde) an eine festen Phase, d.h. dem Träger oder Genchip, gebunden ist [Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C,
Kobayashi M, Horton H und Brown EL. Expression monitoring by hybridi- zation to high-density oligonucleotide arrays. Nature Biotechnology 14:1675-
1680, 1996; Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, and Lockhart DJ.
Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nature Biotechnology 15:1359-1367, 1997].
Die Bestückung des Trägers mit den erfindungsgemäß ausgewählten Oligo- nukleotiden als Sonden kann mittels bekannter Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels Lithographie, Siebdruck oder Reaktionskanalverfahren, elektrochemischer/-synthetischer Verfahren, ink-jet-Systemen, micropin- Verfahren oder open capillary tips. Auch ist die Verwendung von Micro- beads möglich [Lackner KJ etl. Multiplex DNA- und RNA-Analyse an fluo- reszenten Microbeads als Alterantive zum DNA-Array. Statusseminar Chip- technologie für DNA-Diagnostik und Sequenzanalyse in Deutschland. DECHEMA 1999].
Bei den durch das erfindungsgemäße Verfahren darstellbaren Mutationen kann es sich um einfache Mutationen, wie z.B. Substitutionen oder Insertio- nen handeln. Ebenso sind komplexere Mutationen wie Inversionen und Indels möglich. Selbstverständlich können auch Oligonukleotide auf den Träger aufgebracht werden, die komplementär sind zu Regionen der nativen Genabschnitte (sog. Referenzsequenzen), die bei der erblichen Infertilitat des Mannes häufig fehlen (sog. Mikrodeletionen, siehe oben). Durch das Ausbleiben einer sich anschließenden Hybridisierung kann auf das Vorliegen einer Deletion bei dem untersuchten Patienten geschlossen werden.
Die Länge der auf den Träger aufgetragenen Oligonukleotide beträgt vor- teilhafterweise 16 bis 25 Nukleotide. Vorzugsweise werden 15 bis 18-Mere verwendet. Es können sowohl DNA- als auch RNA-Sequenzen sowie Kombinationen oder Modifikationen davon aufgebracht werden. Entsprechend können auch Nukleotide mit Uracil Verwendung finden. Ebenso können natürliche oder synthetische Basenanaloga eingesetzt werden.
Zum Nachweis der Mutationen können Sonden auf dem Träger aufgebracht werden, die entweder identisch oder komplementär zu den nativen Referenzsequenzen sind. Sofern dazu identische Oligonukleotide verwendet werden, können die dazu komplementären Sequenzen aus der Patienten- probe synthetisiert werden. Diese Synthese erfolgt vorzugsweise während der für den späteren Nachweis der Hybridisierung notwendigen Markierungsreaktion.
Vorteilhafterweise werden mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die in der Tabelle 1 genannten, mit der Infertilitat des Mannes assoziierten Gene untersucht. Mögliche nachweisbare Mikrodeletionen des Y-Chromo- somens sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt. Tab.1:
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Tab. 2:
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Ausführunqsbeispiele
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Beispiel 1 : DNA-Chip zum Nachweis von Mutationen mit Oligo- bzw. Azoospermie assoziierten Genen
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Auf dem Chip werden die in Tabelle 3 charakterisierten Sonden aufgebracht. Zur Charakterisierung der Oligonukleotide werden folgende Angaben gemacht:
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Zur Charakterisierung der Nonsense-/Missense-Mutationen (Substitutionen) ist die Nummer des betroffenen Kodons sowie die Nummer des ausgetauschten Nukleo- tids angegeben. Dabei bezieht sich die Nukleotidnummer auf die Position des Nu- kleotids im Transkript, d.h. Nukleotid Nr. 1 ist die erste Base der Botenribonukleo- tidsequenz (und nicht etwa die erste Base der eiweißkodierenden Nukleotidsequenz).
Zur Charakterisierung der Insertionen bezieht sich die Nukleotidnummer auf die Base, die sich unmittelbar 5' der Insertion befindet.
Die Deletion einzelner Nukleotide wird durch die Nukleotidnummer der deletierten
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Base angegeben. Bei Deletionen mehrerer Nukleotide bezieht sich die Nukleotid
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nummer auf die erste Base am 5'-Ende der Deletion.
Tab. 3
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(*) Wildtyp
Kallmann Syndrom Nonsense-fMissense-Mutationen
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Insertionen
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Deletionen
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(*) Wildtyp
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Deletionen
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(*) Wildtyp
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Insertionen
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Deletionen
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Indels
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(*) Wildtyp
Beispiel 2
In der Tabelle 3 sind Aberrationen der Nukleotidsequenz einer Referenznuklein- säure (d. h. Wildtyp-Vahante) aufgeführt. Die jeweils angeführte Aberration kann in einer Nukleotidsequenz jedoch (theoretisch) unterschiedliche Positionen einnehmen. Unter Berücksichtigung der Exon-Intron-Grenzen und den damit verbundenen splice-sites können für Infertilitätsuntersuchungen zwei oder mehrere der Oligonukleotide gemäß den Seq. ID Nr. 1 bis 497 verwendet werden.
Beispiel 3: DNA-Chip zum Nachweis von Mikrodeletionen im Y-Chromosom
In der Tabelle 4 werden Konsensussequenzen der Mikrodeletionen im Y-Chromosom angegeben. Diese Sequenzen werden auf den Träger aufgebracht. Sofern mit den Nukleotiden aus der Patientenprobe keine Hybridisierung erfolgt, kann auf das Vorliegen einer entsprechenden Deletion bei dem Patienten geschlossen werden. Die nach ihrer Schmelztemperatur und ihrer Spezifität ausgewählten relevanten Ausschnitte ihrer Komplementärsequenzen werden auf den Chip aufgebracht. Pro Mikrodeletion werden bis zu 5 Sequenzen auf dem Chip dargestellt.
Tab. 4: AZF: interne Bezeichnung/ offizielle Locus-Bezeichnung*
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung der genetischen Infertilitat oder Disposition des Mannes, umfassend folgende Schritte:
Auswahl von mindestens zwei mit der Infertilitat assoziierten
Mutationen;
Untersuchung des Mannes auf Vorhandensein der ausgewählten
Mutationen; multifaktorielle Auswertung der Untersuchungsergebnisse.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch mindestens zwei rezessive oder intermediäre Mutationen, die bereits heterozygot mit der Infertilitat assoziiert sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Aufbringen von Sonden für die ausgewählten Mutationen oder deren Komplementärstränge und/oder für die nativen Nukleinsäuren oder deren Komplementärstränge auf einem Träger; Hybridisieren der Sonden mit Oligonukleotiden aus einer Patien- tenprobe oder mit einer aus einer Patientenprobe synthetisierten
Oligonukleotiden; Nachweis der Hybridisierung.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 gekennzeichnet durch vollstän- dige oder partielle Sequenzierung des Genoms des Mannes, vorzugsweise durch allelspezifische PCR, Restriktionsfragment-Längen- polymorphismus oder SSCP.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die Auswahl mindestens einer rezessiven oder intermediären Mutation, die homozygot mit der Infertilitat des Mannes assoziiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch mindestens einen Azoospermie-Faktor.
7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch mindestens einen der Azoospermie-Faktoren der Tabelle 2.
8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch mindestens einen Azoospermie-Faktor einer der Sequenzen SEQ. ID. Nr. 498 bis 515.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch mindestens eine native oder mutierte Nukleinsäure aus einem der folgenden Gene: CFTR; KALI ; AR; CYP21.
10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch mindestens eine mutierte oder native Nukleinsäure aus der Tabelle 3.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Nukleinsäuren eine Länge von 16 bis 25 bp aufweisen.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , gekennzeichnet durch Nukleinsäuren mit einer Länge von 15 bis 18 bp.
13. Verfahren nach Anspruch 11 , gekennzeichnet durch mindestens eine
Nukleinsäure umfassend eine der Sequenzen SEQ.ID Nr. 1 bis 497.
14. Träger zum Nachweis der erblichen Infertilitat des Mannes, gekenn- zeichnet durch mindestens eine Nukleinsäure einer der Sequenzen
SEQ.ID.Nr. 498 bis 515.
15. Träger nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch mindestens eine mutierten Nukleinsäure der Tabelle 3 nach einer der Sequenzen SEQ.ID.Nr. 1 bis 497.
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