Bei
einer Vielzahl der betroffenen Männer
kann die Unfruchtbarkeit bisher nicht zufriedenstellend erklärt werden.
Vermutlich geht ein erheblicher Anteil dieser sog. "idiopathischen" – d.h. ohne erkennbare Ursache
entstandenen – Infertilität auf genetische
Störungen
zurück
[Bhasin S, Ma K, Sinha I, Limbo M, Taylor WE, Salehian B. The genetic
basis of male infertility. Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 27:783-805,
1998].
So
sind beispielsweise bei Tieren einige Gene bekannt, die für die männliche
Infertilität
verantwortlich zu sein scheinen. Diese können sowohl auf den Autosomen
als auch auf dem Y-Chromosom lokalisiert sein. Y-chromosomale infertilitäts-assoziierte
Gene wurden beim Menschen zwar noch nicht eindeutig identifiziert. Gleichwohl
wird vermutet, daß es
auch beim Menschen homologe Gene gibt, die ebenso mit der männlichen Unfruchtbarkeit
assoziiert sind und auf bestimmten Regionen des langen Arms des
Y-Chromosoms liegen. So weisen beispielsweise etwa 7% aller Männer mit
einer idiopathischen Infertilität
eine sog. Mikrodeletion in einer dieser Regionen auf dem Y-Chromosom
auf [Bhasin S, Ma K, De Kretser DM. Y- chromosome microdeletions and male infertility.
Ann. Med. 29:261-263, 1997, Hargreave TB. Genetics and male infertility.
Curr. Op. Obstet. Gynecol. 12:207-219, 2000].
Bisher
bestehen Hinweise auf vier mit der Infertilität assoziierte Regionen des
Y-Chromosoms. Da sie vermutlich (mit)-verantwortlich sind für das Fehlen
reifer Spermien, werden sie auch als Azoospermie-Faktoren bezeichnet.
Sie werden auch mit den Buchstabenkombinationen AZFa, AZFb, AZFc
und AZFd abgekürzt.
Während der
eindeutige Nachweis der infertilitäts-assoziierten Gene des Y-Chromosoms des Mannes noch
nicht erbracht ist, sind bereits einige Defekte der Autosomen bekannt,
die in einem Zusammenhang mit der männlichen Infertilität stehen.
So sind zum Beispiel eine Reihe von Mutationen in dem Mukoviszidose(CFTR)-Gen
beschrieben worden, die zu Fehlbildungen (Aplasie) der Samenleiter
und so zur Azoospermie führen können. Seltenere
genetische Ursachen für
eine Azoospermie sind Mutationen der 5α-Reduktase, die das männliche
Hormon Testosteron innerhalb der Zielzellen in das 5α-Dihydrotestosteron
umwandelt sowie des Androgenrezeptors, der das 5α-Dihydrotestosteron in den Zellkern
transportiert, der damit zur spezifischen androgenabhängigen Aktivität veranlaßt wird.
Auch Mutationen im 21-Hydroxylase-Gen bei der congenitalen adrenalen
Hyperplasie können
für die
Infertilität
verantwortlich sein. Darüber
hinaus besteht zudem auch eine Assoziation zu dem Klinefelter-Syndrom
(Karyotyp XXY) oder anderen chromosomalen Aberrationen (z.B. Karyotyp
XYY) [Hargreave TB a.a.O.].
Es
ist bekannt, mögliche
genetische Ursachen der Infertilität durch die vollständige Sequenzierung
der relevanten Gene zu untersuchen. Alternativ zu der vollständigen Sequenzierung
können
auch nur einzelne Genabschnitte (wie z.B. nur die deltaF508 Mutation
im CTFR-Gen) oder kleine Untergruppen von Mutationen gesondert dargestellt
werden. Ein Beispiel einer solchen Untergruppe stellt das panel
von 33 Mutationen im CTFR-Gen dar, das häufig in molekulargenetischen
Labors in Deutschland untersucht wird. Die Untersuchungen erfolgen
in der Regel mittels der allelspezifischen Polymerasekettenreaktion.
Ein
Nachteil dieser Methode besteht darin, daß sie in der Regel nur einzelne
Sequenzveränderungen, bestenfalls
einzelne Gene erfasst. Darüber
hinaus ist dies relativ arbeitsintensiv und erfordert Spezialkenntnisse
sowohl bei der Durchführung
als auch bei der Interpretation der Ergebnisse.
Mit
solchen Methoden kann zudem ein deutlicher Zusammenhang zwischen
genetischen Defekten einerseits und der männlichen Infertilität andererseits
nicht ausreichend genau erkannt werden. Eine zufriedenstellende
Diagnose der genetischen Ursachen der Infertilität ist somit oft nicht möglich.
Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verbesserung
der Diagnose der genetischen Ursachen für die männliche Infertilität sowie
die für
das Durchführen
des Verfahrens erforderlichen Mittel bereitzustellen.
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren gemäß dem Hauptanspruch.
Ein vorteilhaftes Untersuchungsmittel ist Gegenstand eines unabhängigen Nebenanspruchs.
Vorteilhafte Weiterentwicklungen werden in den Unteransprüchen beansprucht.
Der
Kern der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine gezielten Auswahl
an Mutationen zu treffen, den Patienten auf dem Vorhandensein der
Mutationen zu untersuchen und die Untersuchungsergebnisse anschließend multifaktoriell
auszuwerten.
In
einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden rezessive oder intermediäre
Mutationen ausgewählt,
die bereits heterozygot mit der Infertilität des Mannes assoziiert sein
können.
Die sich an die Untersuchung des Mannes anschließende multifakorielle Auswertung
der Untersuchungsergebnisse erlaubt dann eine Analyse der möglichen
Interaktionen der untersuchten Sequenzabschnitte. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
damit die Darstellung eines komplexen Mutationsmusters, das erst
in seiner Komplexität
und den darin liegenden Interaktionen die erbliche Infertilität des Patienten verursacht.
Damit
verfolgt das erfindungsgemäße Verfahren
ein von den bisherigen Untersuchungsverfahren zur männlichen
Infertilität
grundlegend verschiedenen Ansatz. Während die bekannten Verfahren
auf der Annahme basieren, daß die
erbliche Infertilität
des Patienten auf die Homozygotie oder zusammengesetzter Heterozygotie
einzelner rezessiver Mutationen zurückgeht – also eine monokausale Beziehung
zwischen der Infertilität
und einzelnen Gendefekten annimmt – geht das erfindungsgemäße Verfahren
auch von einer multifaktoriellen oder oligo- bzw. polygenetischen
Ursache aus, die nur in einer multifaktoriellen Analyse erkennbar
wird.
Die
bisherige Annahme, daß die
erbliche Infertilität
des Mannes in der Regel monokausal durch homozygot oder zusammengesetzt
heterozygot vorliegende rezessive Mutationen verursacht wird, geht
im wesentlichen auf Untersuchungen an Mäusemodellen zurück. So ist
es beispielsweise bekannt, daß Mäuse mit mutiertem
MDHC7-Gen aufgrund einer gestörten
Spermatogenese infertil sind (Neesen J, Kirschner R, Ochs M, Schmied)
A, Habermann B, Müller
C, Holstein AF, Nuesslein T, Adham I, Engel W: Disruption of an
inner arm of dynein heavy chain gene results in asthenozoospermia
and reduced ciliary beat frequency. In: Hum. Mol. Genet 2001, 10:
1117). Gleiches gilt für
Mäuse,
mit defektem den Östrogen-Rezeptor α (ERalpha)
codierenden Gen (Mahato D, Goulding EH, Korach KS, Eddy EM; estrogen
receptor-alpha is required by supporting somatic cells for spermatogenesis.
In: Mol Cell Endocrinol 2001, 178: 57). Bei diesen Defekten handelt
es sich übereinstimmend
um knock out Mutationen, die zur Infertilität führen.
Des
weiteren ist die Annahme einer durch Homozygotie rezessiver Mutationen
verursachten angeborenen Infertilität bereits deswegen in der Fachwelt
weit verbreitet, weil dominant heterozygot vorliegende Mutationen
naturgemäß nicht
in die nächste
Generation weitergegeben werden können.
Nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren
werden dagegen auch Mutationen untersucht, die – sofern sie nur heterozygot
im Patienten vorliegen – für sich genommen
keine Infertilität
verursachen, gleichwohl aber aufgrund der unerwartet komplexen Interaktionen
zwischen verschiedenen Mutationen im Zusammenspiel mit anderen – möglicherweise
auch nur heterozygot vorlie genden Mutationen – zu einer Infertilität führen. Ebenso können auch
Mutationen berücksichtigt
werden, die selbst im homozygoten Zustand nicht im Sinne einer knock out
Mutation die Infertilität
nach sich ziehen. Bei den berücksichtigten
Mutationen kann es sich sowohl um angeborene oder aber – durch
Umwelteinflüsse
induzierte oder spontan auftretende – Neumutationen handeln.
Erst
diese parallele Untersuchung mindestens zweier verschiedener Mutationen
mit einer sich daran anschließenden
multifaktorieller Analyse der Ergebnisse ermöglicht die Diagnose der auf
diese komplexen Interaktionen heterozygot vorliegender Mutationen
verursachten Infertilität.
Damit
stellt es einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
dar, eine erbliche Infertilität
aufzuzeigen, die erst durch die Kombination verschiedener -jeweils
heterozygot vorliegender – genetischer Defekte
entsteht und daher durch herkömmliche
Genanalysen, die nur einzelne oder allenfalls eine sehr begrenzte
Anzahl von Genen ohne multifakorielle Auswertung erfassen, nicht
nachweisbar ist.
In
einer besonders vorteilhaften Ausführungsform erfolgt die Untersuchung
des Mannes, ob er Träger der
ausgewählten
Mutationen ist, über
die Verwendung eines Microarrays. Dieses ist in besonderer Weise
geeignet, die komplexen Interaktionen zwischen den Mutationen darstellen
und auswerten zu können.
Es sind aber auch beispielsweise die bekannten Verfahren, wie allelspezifische
PCR, Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
oder SSCP zur Identifizierung von Sequenzabweichungen in Teilen
des Genoms des Mannes möglich.
Mit
der Verwendung eines Microarrays geht der Vorteil einher, daß eine hohe
Anzahl relevanter Mutationen in einer ebenso hohen Anzahl relevanter
Gene in nur einem Arbeitsgang simultan erfaßt werden können. Diese erfindungsgemäße Ausführungsform
eignet sich darüber
hinaus in besonderer Weise für
die Automatisierung und somit für
die rasche Bearbeitung umfangreicher Probenserien.
Neben
der Darstellung über
einen Microarray können
auch andere Methoden eingesetzt werden, die eine multifaktorielle
Analyse erlauben, so z. B. die sog. Differential Display PCR, Northern
Blots, SAGE oder Massively Parallel Signature Sequencing.
Die
multifaktionelle Analyse kann mittels bekannter statistischer Standardverfahren,
so z. B. Korrelationsprüfung
erfolgen. Sofern Microarrays verwendet werden, ist der sog. QTL-Analyse
(Quantitative Tsait Locus) besonders bevorzugt. Dabei handelt es
sich um ein statistissches Analyseverfahren, das der Ermittlung des
quantitativen Beitrags einzelner chromosonaler Abschnitte an der
Ausprägung
komplexer Merkmale dient.
Die
erfindungsgemäß verbesserte
Diagnose der erblichen Infertilität ist insbesondere auch im
Zusammenhang mit der in vitro Fertilisation vorteilhaft. Dieses
Verfahren hat an Bedeutung gewonnen, seitdem es bei Männern mit
niedriger Spermienzahl (Oligozoospermie) möglich ist, ein Ei der Frau
mit Hilfe der sog. intrazytoplasmatischen Spermieninjektion zu befruchten.
Zur Vorbereitung dieser Methode ist eine aussagekräftige Untersuchung
der Ursachen für
die Infertilität
des Mannes unerläßlich, die das
erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht.
Neben
dieser Verwendung kann das erfindungsgemäße Verfahren als Werkzeug bei
der wissenschaftlichen Erforschung der Fertilität des Mannes dienen.
In
einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die
den Azoospermie-Faktoren zuzurechnenden Konsensussequenzen auf den
Träger
aufgebracht werden. Hierdurch kann eine durch die vollständige Azoospermie
verursachten Infertilität
diagnostiziert werden.
In
einer anderen Ausführungsform
kann der Träger
erfindungsgemäß zum Nachweis
und zur Darstellung komplexer Interaktionen zwischen Mutationen
des CFTR-Gens verwendet werden. Die Mutationen des CFTR-Gens lassen
sich – etwas
vereinfacht – in
zwei Gruppen, nämlich
die "leichten" und die "schweren" Mutationen unterteilen.
Liegen zwei schwere Mutationen vor, wird das Krankheitsbild der
Zystischen Fibrose ausgeprägt.
Zwei leichte Mutationen führen
hingegen zu der angeborenen Aplasie des Samenleiters (Vas deferens).
Die Kombination von einer leichten Mutation mit einer schweren Mutation
kann allerdings entweder zur Ausbildung der Zystischen Fibrose oder
zur kongenitalen bilateralen Aplasie des Samenleiters führen – je nachdem,
welche Mutationen im Einzelfall beteiligt sind.
Ein
abwesender Vas deferens ist damit mit einem sog. Zweitdefekt (entweder
eine weitere leichte Mutation oder eine zusätzliche schwere Mutation) verbunden.
Dieser muß nicht
in dem kodierenden Bereich des CFTR-Gens liegen. Vielmehr weisen über 60%
aller Männer
mit fehlendem Samenleiter und einer heterozygoten Mutation im kodierenden
CFTR-Gen den sog. 5T-Allel Polymorphismus im nicht kodierenden Teil
des Gens; nämlich
in dem achten Intron, auf [Chilon M et al. Mutations in the cystic
fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens.
N. Engl. J. Med. 332: 1475-1480, 1995].
Dieser – auch nur
heterozygot vorliegende – Zweitdefekt,
der in der Interaktion mit dem Erstdefekt erst die Infertilität verursacht,
kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erkannt und somit die Ursache der Infertilität diagnostiziert werden. Entsprechendes
gilt ebenso für
andere Interaktionen von Genen oder Nukleinsäureabschnitten, so beispielsweise
für die
Interaktion zwischen Mutationen im Kallmann-Syndrom-Gen und Mutationen
des CFTR-Gens.
Gleiches
gilt für
Mutationen in Genen des Steroid-Stoffwechsels, die im Zusammenspiel
mit anderen Mutationen zu einer genetisch bedingten Infertilität führen können.
Sofern
ein Microarray für
die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
eingesetzt wird, werden die ausgewählten Sonden mit Standardverfahren
auf einem Träger
aufgebracht und mit Nukleinsäuren bzw.
Oligonukleotiden aus der Patientenprobe hybridisiert [beispielsweise
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory
manual. 2nd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gillespie D: Fast blots:
immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular
cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Academic
Press Inc., San Diego; Methods in Enzymology 1987, 152:p582-587;
Schena M et al.; Quantitative monitoring of gene expression patterns
with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270:p467-470].
Die
Hybridisierung kann mit einer Nachweisreaktion und anschließender Identifizierung
der Nukleotidsequenz kombiniert werden. Dazu kann der erste Nukleinsäurestrang
(d.h. die Patientenprobe) beispielsweise durch Farbstoffe, Radioaktivität oder chemilumineszierende
oder fluoreszierende Moleküle
markiert werden, während
der zweite (d.h. die Sonde) an eine festen Phase, d.h. dem Träger oder
Genchip, gebunden ist [Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie
MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H und
Brown EL. Expression monitoring by hybridization to high-density
oligonucleotide arrays. Nature Biotechnology 14:1675-1680, 1996;
Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, and Lockhart DJ. Genome-wide
expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nature Biotechnology
15:1359-1367, 1997].
Die
Bestückung
des Trägers
mit den erfindungsgemäß ausgewählten Oligonukleotiden
als Sonden kann mittels bekannter Verfahren erfolgen, beispielsweise
mittels Lithographie, Siebdruck oder Reaktionskanalverfahren, elektrochemischer/-synthetischer
Verfahren, inkjet-Systemen, micropin-Verfahren oder open capillary
tips. Auch ist die Verwendung von Microbeads möglich [Lackner KJ etl. Multiplex
DNA- und RNA-Analyse an fluoreszenten Microbeads als Alterantive
zum DNA-Array. Statusseminar Chiptechnologie für DNA-Diagnostik und Sequenzanalyse
in Deutschland. DECHEMA 1999].
Bei
den durch das erfindungsgemäße Verfahren
darstellbaren Mutationen kann es sich um einfache Mutationen, wie
z.B. Substitutionen oder Insertionen handeln. Ebenso sind komplexere
Mutationen wie Inversionen und Indels möglich. Selbstverständlich können auch
Oligonukleotide auf den Träger
aufgebracht werden, die komplementär sind zu Regionen der nativen
Genabschnitte (sog. Referenzsequenzen), die bei der erblichen Infertilität des Mannes
häufig
fehlen (sog. Mikrodeletionen, siehe oben). Durch das Ausbleiben
einer sich anschließenden
Hybridisierung kann auf das Vorliegen einer Deletion bei dem untersuchten
Patienten geschlossen werden.
Die
Länge der
auf den Träger
aufgetragenen Oligonukleotide beträgt vorteilhafterweise 16 bis
25 Nukleotide. Vorzugsweise werden 15 bis 18-Mere verwendet. Es können sowohl DNA- als auch RNA-Sequenzen sowie
Kombinationen oder Modifikationen davon aufgebracht werden. Entsprechend
können
auch Nukleotide mit Uracil Verwendung finden. Ebenso können natürliche oder
synthetische Basenanaloga eingesetzt werden.
Zum
Nachweis der Mutationen können
Sonden auf dem Träger
aufgebracht werden, die entweder identisch oder komplementär zu den
nativen Referenzsequenzen sind. Sofern dazu identische Oligonukleotide verwendet
werden, können
die dazu komplementären
Sequenzen aus der Patientenprobe synthetisiert werden. Diese Synthese
erfolgt vorzugsweise während
der für
den späteren
Nachweis der Hybridisierung notwendigen Markierungsreaktion.
Vorteilhafterweise
werden mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die in der Tabelle
1 genannten, mit der Infertilität
des Mannes assoziierten Gene untersucht. Mögliche nachweisbare Mikrodeletionen
des Y-Chromosomens
sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt.
