KR100976005B1 - 만성 류마티스관절염 질환 감수성 유전자, 이의 단백질,이들을 이용한 만성 류마티스관절염의 발증가능성의 판정방법 및 판정 키트, 및 만성 류마티스관절염의 치료 방법및 치료 약제 - Google Patents

만성 류마티스관절염 질환 감수성 유전자, 이의 단백질,이들을 이용한 만성 류마티스관절염의 발증가능성의 판정방법 및 판정 키트, 및 만성 류마티스관절염의 치료 방법및 치료 약제 Download PDF

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Abstract

서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 중 269번째 아미노산으로서 글리신 삽입변이를 가진 단백질을 암호화하는 유전자를 사람 제8 염색체상의 RA 질환 감수성 유전자로 동정하였다. 또, 그 유전자 및 단백질의 변이가 RA의 발증에 관계하고 있음을 명백하게 하여, 이 변이를 이용해서 RA의 발증 또는 그의 발증가능성을 매우 정확하게 판정하는 방법 등을 확립하였다.
글리신 삽입변이, 만성 류마티스관절염 질환 감수성 유전자

Description

만성 류마티스관절염 질환 감수성 유전자, 이의 단백질, 이들을 이용한 만성 류마티스관절염의 발증가능성의 판정 방법 및 판정 키트, 및 만성 류마티스관절염의 치료 방법 및 치료 약제{Rheumatoid arthritis disease sensitive gene, its protein, method and kit of judging the onset of rheumatoid arthritis using the same, and method and drgus for treating rheumatoid arthritis}
본 발명은 만성 류마티스관절염 질환 감수성 유전자 및 이의 이용에 관한 것이고, 구체적으로는 당해 유전자 또는 이의 번역 산물인 단백질의 변이의 유무를 검출하는 것 등을 특징으로 한 만성 류마티스관절염의 발증 또는 그의 발증가능성의 신규한 판정 방법 및 판정 키트 등을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 당해 만성 류마티스관절염의 치료 방법 및 이의 치료 약제에 관한 것이다.
만성 류마티스관절염(rheumatoid arthritis, 이하 「RA」로 칭함)은 다발하는 만성 질환염을 주 특징으로 하지만, 동시에 많은 장기를 장해하는 원인 불명의 전신성 염증 질환이다. RA는 관해(remission)와 병세(exacerbation)의 악화를 반복하면서 만성으로 진행하고, 치료하지 않고 방치하면 관절의 파괴나 변형을 초래하고, 결국은 운동기의 기능 장해를 초래하게 된다. 때로는 생명을 위협하기도 한다. 따라서, RA 환자는 신체적으로도 정신적으로도 큰 고통을 생애에 걸쳐 짊어지 게 된다.
RA는 그 발증의 양태가 천태만상이고, 그 진단에는 미국 관절염 학회의 진단 기준이 광범위하게 이용되고 있다. 그러나, RA의 발증은, 통상, 서서히 수주간에서 수개월에 걸쳐 나타나며, 미국 관절염 학회의 진단 기준에 있어서 객관적인 지표로서의 류마티스 인자의 존재는 그 양성율이 3개월 이내에서 33%, 12개월 이상에 있어서도 88% 정도(치료, 제73권, 제3호, 제23 ~ 제27면, 1991년)이고, RA로 확실히 진단하는데는 이르지 못하고 있다. 그래서, 재조합 항원과 반응하는 환자 혈청중의 류마티스성 관절염 관련 항체 IgM 항체를 검출하고, 류마티스성 관절염을 진단하도록 하는 시도 등이 행해져 있다{참조: 일본 특허출원 특표평 10-513257호 공보(공표일: 평성 10년 12월 15일).
또, RA의 치료는, 통상 RA 병태의 병상의 진행 과정에 따라 선택해야 할 치료 수단이 상이하다. 일반적으로 확정 진단이 내려지지 않은 초기에서는, 비스테로이드항염증약(NSAID)을 투여하고, 확정 진단이 내려진 경우는 NSAID에 더하여 질환수식성 류마티스약(DMARD)을 투여한다. 특히, RA 발증의 초기에는, 확정 진단을 하는 것은 곤란하고, 현재 상황에서는, NSAID를 투여하고, 경과를 신중히 관찰하면서 교원성 질환을 포함하는 기타 류마티스 질환과의 감별을 동시에 행하고 있다. 또한 증상이 진행된 경우는, 스테로이드약의 투여를 행하는 경우도 있고, 동통을 위한 약물요법과 동시에 관절 기능의 유지 ㆍ 회복에 대해서 이학요법ㆍ재활보조도구요법을 행한다. 또, 관절 파괴에 의해 일상 생활이 부자유하게 된 경우에는, 수술 요법을 행하는 경우도 있다.
RA의 원인인 관절염과 관절 파괴의 양상, 특히 이들의 병리과정은 여러 연구를 통해서 차차 명백하게 되어가고 있는 중이지만, RA는 생활 환경을 포함한 다수의 원인 인자가 결부되어 비로소 질환으로 발전ㆍ병세가 악화되는 질환이다. 때문에, 질환의 바른 해명과 적절한 치료를 병행하는데는, 여러 인자 상호 작용의 정체 그 자체를 명확하게 해야 한다. RA는 세계적으로는 이환율 1% 이하의 질환이지만{참조: New England Journal of Medicine(N. Engl. J. Med), 제322권, 제1277 ~ 1289면, 1990년}, 환자의 동일 세포에서는 약 8% 이상이 발증하는(Cell, 제85권, 제311~318면, 1996년)이기 때문에 이 원인 인자로서 얼마간의 유전적 요인이 상정되어 있다. 또, 환경도 원인 인자의 하나로 생각되고 있기 때문에, 우선 발증가능성을 아는 것에 따라, 일상 생활에 있어서, 예를 들면, 식이, 바이러스 감염 및 스트레스 등에 주의함으로써 발증을 지연시키기도 하고 예방하는 것이 가능하다. 또한, 초기 진단 및 초기 단계에서 적절한 치료를 행하는 것에 따라 RA의 진행을 지연시키는 것이 가능하고, 예후의 개선이 기대된다.
국제공개 WO98/51791호 (국제공개일: 평성 10년 11월 19일)의 개시 내용에 의하면, 마이크로세털라이트(microsatellite) 마커를 사용한 연쇄해석을 RA 환자 및 그의 혈연자에 대해 실시함으로써, 만성 류마티스관절염 질환 유전자가 위치하는 3개소의 유전자 위치를 특정하고, 이하의 질환 유전자를 동정하고 있다.
(1) 사람 제1 염색체의, 마이크로세털라이트 마커 D1S214 및/또는 D1S253이 하이브리드화하는 DNA 서열로부터 ±1cM(centimorgan) 이내에 위치하는 만성 류마티스관절염 질환 유전자.
(2) 사람 제8 염색체의, 마이크로세털라이트 마커 D8S556이 하이브리드화하는 DNA 서열로부터 ±1cM 이내에 위치하는 만성 류마티스관절염 질환 유전자.
(3) 사람 X 염색체의, 마이크로세털라이트 마커 DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232가 하이브리드화하는 DNA 서열로부터 ±1cM 이내에 위치하는 만성 류마티스관절염 질환 유전자.
이와 같이, 만성 류마티스관절염 질환 감수성 유전자 위치는 제1, 제8, 및 X 염색체상에 존재하는 것이 명확하게 되어 있다. 그 중에서, 제1 염색체 및 X 염색체에 대해서는 이제까지 RA의 질환 감수성 유전자가 동정되어 있음에도 불구하고, 제8 염색체에 있어서는 RA의 질환 감수성 유전자는 아직 동정되어 있지 않다.
따라서, 본 발명은 사람 제8 염색체위에 존재하는 만성 류마티스관절염의 질환 감수성 유전자를 동정하고, 그 유전자 또는 그의 번역 산물인 단백질의 변이의 유무를 검출함으로써, RA의 발증 또는 그 발증가능성을 매우 정확하게 판정(진단)하는 방법, 및 그의 판정(진단) 키트를 제공함을 과제로 하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 만성 류마티스관절염 질환 감수성 유전자에 변이를 갖는 RA 환자에 대한 유효한 치료법 및 치료 약제를 제공함을 과제로 하는 것이다.
본 발명자는 상기 과제를 첨예하게 조사한 결과, 사람 제8 염색체에 대해서 복수의 마이크로세털라이트 마커를 사용한 상세한 유전자 지도 작성을 행하고, RA 관련 유전자 위치를 결정하였다. 또한, 그 주변에 위치하는 안지오포이에틴-1 유전자에 대해서 RA 질환 감수성 유전자로서의 가능성을 검토한 경우, 당해 유전자에 3 염기 삽입형 및 3 염기 결실형의 2종류가 존재하는 것, 3 염기 결실형 호모를 변이시키지 않고, 헤테로 및 3 염기 삽입형 호모를 변이시킨 경우, RA 환자와 건강정상인과의 사이에 유의차가 인지된 것, 및 RA 환자에서는 건강정상인에 비해 유의적으로 mRNA 발현량이 낮은 것을 각 실험에 의해 밝혀내었다.
이들의 지견에 의해, 피검자로부터 수득된 세포에서의 상기 유전자 및 그의 번역 산물인 단백질의 변이의 유무를 지표로 한 RA의 발증 또는 그의 발증가능성의 판정(진단) 방법, 및 판정(진단) 키트가 유용함을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 본 발명은 만성 류마티스관절염의 신규한 치료 방법 및 치료 약제로서도 유용하다.
이하, 본 발명에 대해서 상술하지만, 본 명세서에서, 특히 단정하지 않는 한, A, C, G 및 T는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민의 각염기를 나타낸다. 또, 아미노산 및 아미노산 잔기는 IUPAC 및 IUB의 규정된 1 문자 표기 또는 3 문자 표기를 사용한다.
본 발명에 따르는 유전자는, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열중 269번째의 아미노산으로서 글리신 삽이변이를 가진 단백질을 암호화하는 만성 류마티스관절염의 질환 감수성 유전자이다. 본 발명에 따르는 유전자로서는, 구체적으로는 서열번호 2에 나타낸 염기 서열을 갖고, 그 서열중 805 내지 807번째의 염기로서 「GGT」의 3 염기 삽입변이를 가진 안지오포이에틴-1 유전자를 예로 들 수 있다. 상기 805 내지 807번째의 염기는 안지오포이에틴-1 유전자의 cDNA로서 유전자은행(Gene Bank)에 등록된 염기 서열{등록 번호(Accession No.) U83508}의 1114 내지 1116번째의 염기에 상당한다.
상기 「유전자」라고 하는 것은, 적어도 게놈 DNA, cDNA, mRNA 등의 폴리뉴클레오티드를 함유한다는 의미이고, 본 발명에 따르는 유전자로서는, 상기 안지오포이에틴-1 유전자의 cDNA 이외에, 당해 cDNA의 염기 서열에 대응하는 염기 서열을 갖는 mRNA나, 당해 mRNA의 전사원인 게놈 DNA 등이 함유된다. 또, 상기 「유전자」라고 하는 것은, 2본쇄 DNA뿐만 아니라, 이를 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄라고 하는 각 1본쇄 DNA나 RNA를 포함한다. 또한, 상기 「유전자」는 번역 영역 이외에, 비번역 영역(UTR)의 서열이나 프로모터 서열, 벡터 서열(발현 벡터 서열을 포함한다)등의 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따르는 단백질은, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열중 269번째의 아미노산으로서 글리신 삽입변이를 가진 단백질이다. 이 단백질은 상기 안지오포이에틴-1 유전자의 번역 산물이고, 또한 부가적인 폴리펩티드를 함유하는 것일 수 있다. 이러한 폴리펩티드가 부가된 경우로서는, 예를 들면 His tag 등에 의해서 당해 단백질이 에피토프 표지된 바와 같은 경우를 들 수 있다.
상기 안지오포이에틴-1은 안지오포이에틴ㆍ계통(family)에 속하는 인자이고, 혈관 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 되어 있다. 혈관신생 관련 티로신 키나제형 수용체에는 VEGF 수용체 계통과 TIE 수용체 계통이 있고, RA 환자에서 VEGF 과잉생산이 보고되어 있다(Ann Rheum Dis: 59: i65-71, 2000 참조). 안지오포이에틴-1은, TIE2 수용체의 리간드이고, VEGF와 상보적으로 기능하여 혈관 손상 및 출혈 을 억제하는 효과를 갖는 것이 공지되어 있지만(Nature Medicine: Vol.6: 460-463: 2000 참조), 질병 상태와의 관련은 불명확한 부분이 많았다.
본원 발명자는 전술한 바와 같이 상세한 유전자 지도 작성을 행한 결과, 마이크로세털라이트 마커 D8S556에 연쇄성을 발견하고, 이것이 이전에 행한 연쇄 해석의 결과와 일치하는 것으로부터 당해 위치가 사람 제8 염색체상 RA 질환 감수성 유전자 위치인 것으로 생각하였다.
상기 D8S556은 사람 제8 염색체상 장완 영역에 지도 작성되지만, 그 영역의 마우스에서의 상동 영역에 해당하는 제15 염색체상의 영역에는 관절염 감수성 유전자 Paam1이 존재하는 것이 보고되어 있다(Ryumachi 40(5):833-848, 2000 참조). 또, 상기 D8S556은 584.52-584.72cR에 위치하는 것이 명확하게 되어 있고(Ryumachi vol.39:P445, 1999 참조), 안지오포이에틴-1은 GB4 지도에서 589.07cR에 지도 작성된 것이기 때문에 안지오포이에틴-1은 질환 감수성 유전자 후보로서 염색체상의 위치로부터도 타당하다고 생각된다.
또한, RA 환자의 골막 및 말초혈로부터 단리된 유전자 해석의 결과, 상기 안지오포이에틴-1 유전자에 3 염기 삽입형 및 3 염기 결실형의 2 종류가 존재하는 것을 발견하였다. 이하, 유전자 서열상의 당해 3 염기 삽입 위치 및 3 염기 결실 위치를 간단히 「변이 위치」라고 한다. 마찬가지로, 이 유전자 서열상의 변이 위치에 대응하는 아미노산 서열상의 글리신 삽입 위치 및 글리신 결손 위치를 간단히 「변이 위치」라고 한다.
또한, 상기 3 염기 결실에 대해서는 사람 세포주 T98G에 있어서도 보고되어 있다(Cell. Vol. 87:1161-1169, 1996 참조).
안지오포이에틴-1은 VEGF와 상보적으로 작용하여 혈관망의 형성을 증강한다. 구체적으로는 VEGF는 혈관생성에 있어서 중요한 촉진 인자이고 내피 세포의 유주와 증식을 촉진한다. 한편, 이 내피 세포의 유주와 증식은 안지오포이에틴-1에 의해 조절된 인자에 의해 정지되고, 신규한 혈관기저막이 형성됨으로써 성숙된 혈관이 구축된다. 사실 VEGF 만에 의해 실험적으로 유도된 혈관은 미숙하여 출혈하기 쉽고, RA에서는 VEGF 과잉생산이 보고되어 있지만(Ann Rheum Dis: 59: i65-71, 2000 참조), 안지오포이에틴-1에 대해서는 지견은 없다. 본원 발명자는 안지오포이에틴-1의 mRNA 발현량을 RA 환자와 건강정상인과 비교한 경우, RA 환자의 말초혈중 mRNA 발현량이 유의적으로 낮다는 것을 밝혀내었다. 이에 따라, RA에서는 미숙한 혈관의 증식이 일어남에 따라, 혈중으로부터의 면역세포의 누출에 의한 만성염증 전개에 관여하고 있는 가능성이 고려된다.
본 발명에 따르는 유전자 및 단백질은, 이하 상술하는 바와 같이, RA의 발증 또는 이의 발증가능성을 판정하는 신규한 판정 방법 및 판정 키트에 유용하다.
(1) RA의 발증 또는 이의 발증가능성의 판정 방법
본 발명에 따르는 RA의 발증 또는 이의 발증가능성의 판정 방법(환언하면, RA의 진단방법)에 있어서, 본 발명에 따르는 유전자로서 ① 게놈 DNA를 사용한 경우, ② mRNA(cDNA)를 사용한 경우를 순번으로 설명하고, 그 후, ③ 본 발명에 따르는 단백질을 사용한 경우에 대해서 설명한다.
① 게놈 DNA를 사용한 경우
게놈 DNA를 사용한 본 판정 방법은 예를 들면 다음과 같이 실시할 수 있다.
피검자의 게놈은, 통상적인 방법에 따라 인체의 모든 세포로부터 수득하는 것이 가능하지만, 예를 들면, 모발, 각 장기, 말초 림파구, 골막세포 등으로부터 수득할 수 있다. 또, 수득된 세포를 배양하고, 증식한 것으로부터 수득할 수도 있다. 또한, 수득된 게놈은 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification) 법 및 SDA(Strand Displacement Amplification) 법 등의 통상적으로 행해지는 유전자 증폭법에 의해 증폭하여 사용할 수 있다.
게놈상의 변이의 유무의 검출 방법으로서는, 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 알릴 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브(Allele Specific Oligonucleotide Probe) 법, 올리고뉴클레오티드 결합검정(Oligonucleotide Ligation Assay)법, PCR-SSCP법, PCR-CFLP법, PCR-PHFA법, 인베이더(invader)법, RCA(Rolling Circle Amplification)법, 프라이머 올리고 베이스 익스텐션(Primer Oligo Base Extension)법 등을 들 수 있다.
예를 들면, 게놈으로부터, 유전자상의 상기 변이위치를 포함하는 영역을 증폭시킨 후, 수득되는 PCR 산물을 서브클로닝하고, 이를 직접 시퀀싱함으로써 게놈상의 변이의 유무를 검출할 수 있다.
또, 유전자상의 상기 변이 위치를 포함하는 영역을 올리고뉴클레오티드 프로브에 사용함으로써, 게놈상의 변이의 유무를 검출할 수 있다. 이와 같이 프로브에 사용하는 경우로서는, 예를 들면, 상기 변이 위치를 함유하는 염기 서열을 포함하 는 올리고뉴클레오티드를 칩상에 고정시켜 DNA 칩을 구성하고, 당해 DNA 칩을 상기 변이의 유무의 검출용으로 사용하는 것과 같은 경우가 있다. 이 경우, 올리코뉴클레오티드 프로브의 길이로서는, 상기 변이 위치를 함유하는 7 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드가 바람직하고, 15 내지 25 뉴클레오티드가 더 바람직하다.
또, 게놈 상의 변이의 유무는 적당한 제한효소를 사용하고, 절단된 게놈 절편의 사이즈의 차이를 써던 블로팅 등으로 검출함으로써도 검출할 수 있다.
이와 같이, 게놈상의 변이를 검출함으로써, 피검자의 RA의 진단(발증 또는 이의 발증가능성의 판정)을 매우 정확하게 행할 수 있다. 구체적으로는 후술하는 바와 같이, 3 염기 결실형 호모를 변이시키지 않고, 헤테로 및 3 염기 삽입형 호모를 변이시킨 경우 RA 환자와 건강정상인과의 사이에서 유의차가 인식되었기 때문에, 3 염기 결실형 호모가 검출된 경우는, RA를 발증하고 있는 가능성 또는 장래 발증할 가능성은 낮고, 한편, 헤테로 및 특히 3 염기 삽입형 호모가 검출된 경우는, RA를 발증하고 있는 가능성 또는 장래 발증할 가능성은 높다고 판정할 수 있다.
또한, 상기 판정 방법에 따라 사용되는 프라이머 및 프로브는 통상적인 방법에 따라, DNA 합성기 등에 의해 제작할 수 있다.
② mRNA(cDNA)를 사용한 경우
mRNA를 이용하는 경우, 예를 들면, 피검자의 세포로부터 검출된 mRNA로부터 역전사 반응에 따라 cDNA를 제작하고, 상기 변이위치를 포함하는 영역을 증폭후, 상기와 동일한 양태로, 증폭 단편의 염기 서열을 직접 시퀀싱함으로써, 또는 DNA 칩을 사용함으로써, 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 법을 사용함으로써, 상기 변이의 유무를 검출할 수 있다.
상기 변이 위치를 포함하는 영역의 증폭에 사용하는 프라이머로서는 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 이하의 프라이머의 조합에 의해 cDNA를 주형으로한 증폭 반응이 가능하다.
센스 프라이머: 5'-GCTGGCAGTACAATGACAG-3' (서열번호 3)
안티센스 프라미어: 5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3' (서열번호 4)
이와 같이, mRNA(cDNA)상의 변이를 검출함으로써, 상기와 동일한 양태로, 피검자의 RA의 진단(발증 또는 그의 발증가능성의 판정)을 매우 정확하게 행할 수 있다.
또한, mRNA를 이용하여 RA의 발증 또는 그 발증가능성을 판정하는 또 하나의 방법으로서는, 서열번호 2에 나타낸 염기 서열에 있어서, 그 서열중 805 내지 807번째 염기로서 「GGT」의 3 염기 삽입변이를 갖지 않은 염기 서열을 가진 만성 류마티스관절염의 질환 감수성 유전자 유래의 mRNA(즉, 3 염기 결실형의 안지오포이에틴-1의 mRNA)의 발현량을 측정하는 방법이 있다.
더 구체적으로 말하자면, 상기 판정 방법은, 상기 3 염기 결실형 mRNA의 발현량에 대해서 2개의 역치 1, 역치 2(단, 역치 1 < 역치 2)를 설계하고, 상기 mRNA의 발현량이 상기 역치 1 이하이면, RA를 발증하고 있는 가능성이 높고, 또는 장래 발증할 가능성이 높다고 판정하고, 상기 역치 2 이상이면, RA를 발증하고 있는 가 능성은 낮고, 또는 장래 발증할 가능성은 낮다고 판정함을 특징으로 한다. 이 RA의 발증 또는 그 발증가능성을 판정하는 방법에 사용되는 mRNA의 발현량의 측정에는, 종래 공지의 RT-PCR 법 등을 사용할 수 있다.
③ 단백질을 사용한 경우
피검자의 세포로부터 조제된 단백질을 이용하는 경우, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 상기 변이위치에서의 글리신 삽입의 유무를 검출하는 방법을 들 수 있다. 당해 글리신 삽입의 유무의 검출은, 통상의 단백질의 시퀀싱 방법에 준할 수 있지만, 예를 들면, 글리신 삽입형 단백질만을 인식하는 항체를 제작하고, ELISA 법으로 검출하는 방법, 단백질을 단리하고, 직접 또는 필요에 따라서, 효소 등으로 절단하고, 프로테인 시퀀서를 이용하여 변이를 검출하는 방법, 아미노산의 등전점의 변이를 검출하는 방법 및 질량분석에 따라 질량의 차를 검출하는 방법을 들 수 있고, 바람직하게는, 글리신 삽입형 단백질만을 인식하는 항체를 제작하고, ELISA법으로 검출하는 방법을 들 수 있다.
이와 같이, 상기 변이 위치에 있어서, 글리신 삽입의 유뮤를 검출함으로써, 피검자의 RA 진단(발증 또는 그의 발증가능성의 판정)을 매우 정확하게 행할 수 있다. 구체적으로는 후술하는 바와 같이, 3 염기 결실형 호모를 변이없이, 헤테로 및 3 염기 삽입형 호모를 변이시킨 경우, RA 환자와 건강정상인과의 사이에서 유의차가 인식되기 때문에, 글리신 삽입형 단백질이 검출되지 않은 경우(환언하면, 글리신 결손형 단백질밖에 검출되지 않은 경우)는, RA를 발증하고 있는 가능성 또는 장래 발증할 가능성은 낮고, 한편, 양방의 단백질이 검출된 경우 및 특히 글리신 삽 입형 단백질만 검출된 경우는 RA를 발증하고 있는 가능성 또는 장래 발증할 가능성은 높다고 판정할 수 있다.
(2) RA의 발증 또는 그의 발증가능성의 판정 키트
본 발명에 따르는 RA의 발증 또는 그의 발증가능성의 판정 키트(환언하면, RA의 진단 키트)는 상기의 변이를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 프라이머, 프로브, 항체 등을 포함하는 것이면, 특히 한정되지 않고, 또한 그 외에 시약을 조합함으로써 수득할 수 있다.
예를 들면, 게놈 및 mRNA(cDNA) 상의 변이의 유무를 검출하는 키트로서는, 상기 변이 위치를 포함하는 영역을 증폭할 수 있도록 설계된 프라이머를 포함하고, 또한 상기 변이의 유무를 검출할 수 있도록 설계된 프로브, 제한효소, 막삼 길버트(Maxam Gilbert)법 및 상가(Sanger)법 등의 염기 서열 결정법에 이용된 시약 등, 변이를 검출하기 위해 필요한 시약을 1개 이상 조합시킨 키트를 들 수 있다. 또한, 특정 시약은, 채용된 검출 방법에 따라서 적절 선택 채용하지만, 예를 들면, dATP, dUTP, dTTP, dGTP, DNA 합성 효소, RNA 합성 효소 등을 들 수 있다. 또한, 변이의 검출에 방해가 되지 않는 적절한 완충액 및 세정액 등이 포함될 수도 있다.
프라이머를 포함하는 키트의 경우, 프라이머는, 상기 변이 위치를 포함하는 영역을 증폭할 수 있지만, 특히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 상기 서열번호 3 및 4에 나타낸 한 세트의 프라이머 세트를 들 수 있다.
또, 단백질상의 변이의 유무를 검출하는 키트로서는, 예를 들면, 글리신 삽입형 단백질 만을 인식하는 항체를 포함하는 키트 등을 들 수 있다.
이들의 판정 키트를 사용함으로써 전기한 바와 같이, RA의 진단(발증 또는 그의 발증가능성의 판정)을 매우 정확하게 행할 수 있다.
(3) RA의 치료 방법 및 치료 약제로의 정상형 단백질 등의 이용
이와 같이, 안지오포이에틴-1 유전자 상의 3 염기 삽입변이(및, 이에 대응하는 아미노산 서열상의 글리신 삽입변이)는, RA의 발증원인중의 하나로서 고려되고, 따라서, 안지오포이에틴-1에 상기 글리신 삽입변이를 가진 RA 환자에 정상형 단백질(즉, 글리신 결손형 단백질)을 보완하는 것은, RA의 치료법으로서 유효하다고 생각된다. 따라서, 본 발명은 이하의 RA의 치료방법 및 치료 약제를 제공한다.
상기 글리신 삽입변이를 가진 단백질을 갖는 만성 류마티스관절염 환자에, 그 변이를 초래하지 않는 정상형 단백질 또는 당해 정상형 단백질을 암호화하는 DNA, 또는 당해 정상형 단백질이 리간드가 되는 수용체 단백질의 효능제로서의 저분자 화합물을 보완함을 특징으로 하는 만성 류마티스관절염의 치료 방법.
상기 글리신 삽입변이를 가진 단백질을 갖는 만성 류마티스관절염 환자의 치료에 사용되는 치료 약제로서, 그 변이를 갖지 않은 정상형 단백질 또는 당해 정상형 단백질을 암호화하는 DNA, 또는 당해 정상형 단백질이 리간드가 되는 수용체 단백질의 효능제로서의 저분자 화합물을 주성분으로 하는 만성 류마티스관절염의 치료 약제.
정상형 단백질의 보완 방법은 특히 한정되지는 않고, 예를 들면 공지의 단백질 발현계나 유전자 도입 방법 등을 사용할 수가 있고, 구체적으로는 포유 세포에 단백질을 발현시킨 경우에 사용하는 발현 벡터나 바이러스 벡터 등을 사용한 방법 을 들 수 있다. 또, 전술하는 바와 같이, 안지오포이에틴-1은, TIE2 수용체의 리간드이기 때문에, 이 TIE2 수용체의 효능제로서 작용하는 저분자 화합물을 경구 또는 정주 등에 의해 체내에 투여하는 것도 RA의 치료법으로서 유효하다고 생각되어 진다. 또, 여기서 언급되는 저분자 화합물로는 펩티드 등의 단백질을 포함한다.
또, 상기 정상형 단백질 또는 당해 정상형 단백질을 암호화하는 DNA와, 상기 TIE2 수용체의 효능제로서의 저분자 화합물과는, 치료 약제로서 택일적으로 사용될 뿐만 아니라, 조합시켜 사용하는 것도 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예에서, 6종의 마이크로세털라이트 마커를 사용하여 행한 유전해석의 결과를 도시한 표이다.
도 2는 본 발명에 따르는 RA 관련 유전자를 모식적으로 도시한 개략도이다. 또, 도 2중에서 A. 및 B. 에는 본 발명의 실시예에서 사용되는 프라이머 및 프로브의 설정 위치를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 실시예에서, RA 관련 유전자의 3 염기 삽입변이 위치를 포함하는 영역의 시퀀스 해석을 행한 결과를 나타낸 도이다. 도 3a는 3 염기 삽입형의 시퀀스 해석 결과이고, 도 3b는 3 염기 결손형의 시퀀스 해석 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서, RA 환자 및 건강정상인에 대해서, 3 염기 삽입변이의 유무의 검출을 행한 결과를 나타내는 표이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서의 mRNA의 발현량의 정량 결과를 나타낸 그래프 이다.
도 6은 3 염기 삽입형(Ang1) 및 3 염기 결실형(Ang1(del3))의 HUVEC 세포의 유주능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 실시의 한 형태에 대해서, 도 1 내지 도 6을 근거로 설명하면 하기와 같다. 또, 본 발명은 이의 기재에 한정되는 것은 아니다.
(1) 마이크로세털라이트 마커를 이용한 유전해석
환자 2명, 건강한 정상인 1명을 1가계로 한 33가계에 있어 쇄장 분석을 행하였다. 말초혈로부터 추출한 DNA로부터, 제8 염색체 상의 상기 마이크로세털라이트 마커 D8S556 근방 10.8cM 중에 있는 헤테로 접합도 0.7 이상인 D8S176, D8S521, D8S1738, D8S556, D8S1830 및 D8S539의 각 마이크로세털라이트 마커를, 형광표지된 프라이머를 사용한 PCR법에 의해 증폭시키고, ABI377형 시퀀서에서 3000V, 2시간 전기영동하였다. 이어서, GeneScan(ver. 2.0.2)을 사용하여 마커의 사이즈를 결정하고, MAPMAKER/SIBS(ver.2.1)(Complete multipoint sib-pair analysis of quantitative and qualitative traits. Am. J. Hum. Genet. 57:439, 1995 참조)를 사용하고, 병에 걸린 동세포에 대한 검색법을 기본으로 한 2점 해석에 의해 최대 연쇄성취도(Maximum Lod Score)를 산출하였다.
결과를 도 1에 나타낸다. 당해 도에 나타낸 바와 같이, D8S556에 있어서 Lod치는 최대 단독 피크치 1.35를 나타내었다. 이 결과에 따라, 본 발명에 따르는 RA 관련 유전자는, 마이크로세털라이트 마커 D8S556과의 연쇄성이 밝혀졌다. 또, D8S556의 근방에는 혈관신생에 관여하는 유전자 안지오포이에틴-1이 위치하는 등으로부터, 상기 안지오포이에틴-1이 RA 질환 감수성 유전자의 후보 유전자인것으로 생각되어 진다.
(2) 안지오포이에틴-1 cDNA의 시퀀스 해석
RA 환자의 골막 세포 및 말초혈 단핵구 분획으로부터 조제한 전체 RNA로부터 올리고 dT 프라이머를 사용한 역전사반응(GeneAmp RNA PCR Kit)(어플라이드 바이오시스템즈)에 의해 cDNA를 합성하였다. 그리고, 안지오포이에틴-1 유전자 영역 1508bp를 증폭한 후, 다이 터미네이터(dye terminator)법에 의해 시퀀스 해석을 행하였다. 또, 상기 반응에 사용된 프라이머는, 이하에 나타낸 바와 같다.
센스 프라이머-AngF1.5: 5'-GCTGGCAGTACAATGACAG-3' (서열번호 3)
안티센스 프라이머-AngR1.5: 5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3' (서열번호 4)
또, 상기 센스 프라이머-AngF1.5 및 상기 안티센스 프라이머 AngR1.5의 설정위치에 대해서는, 도 2중의 A.에 나타낸 바와 같다. 또한, 안지오포이에틴-1 분자내에는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 꼬인 코일 도메인 및 피브리노겐상 도메인이 존재한다.
시퀀스에 따라 결정된 cDNA 서열은, 안지오포이에틴-1 유전자의 공지 서열(등록 번호 U83508)와 비교된다. 그 결과 , 안지오포이에틴-1 유전자에 있어서는 전술한 바와 같이, 3 염기 삽입형 및 3 염기 결실형의 2 종류가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 서열번호 2에는 이중 3 염기 삽입형의 유전자 서열이 나타나있다. 이 3 염기 삽입형에서는 서열번호 2에 나타낸 바와 같이, 그 서열 중 805 내지 807번째 의 염기로서 「 GGT」의 3 염기가 삽입되어 있다.
도 3a 및 도 3b에는 변이 위치를 포함하는 시퀀스 해석결과가 도시되어 있다. 도 3a는 3 염기 삽입형의 해석결과이고, 도 3b는 3 염기결실형 (3 염기 결손형)의 해석결과이다. 또, 도 3a 및 도 3b는 각 유전자서열의 상보서열을 시퀀스 해석된 결과를 나타내는 것이다. 따라서, 도 3a에 의해, 3 염기삽입형에서는 「 GGT」의 3 염기 삽입(상보서열에서는 「ACC」의 3 염기 삽입)이 일어나고 있음이 확인될 수 있고, 도 3b에 의해, 3 염기 결실형에서는, 이 3 염기가 결손되어 있음이 확인될 수 있다.
상기 3 염기 삽입형 유전자의 번역 산물인 단백질은, 서열번호 1에 나타낸 바와 같이, 그 아미노산 서열중 269번째의 아미노산으로서 글리신이 삽입되어 잇다. 한편, 상기 3 염기 결실형 유전자의 번역산물인 단백질에 있어서는 그 269번째의 글리신이 결손되어 있다.
(3) RA 환자 및 건강정상인(RA 미발증자)에 있어서 상기 변이의 유무 검출
(a)환자 본인 이외의 친족에 RA 환자가 있는 가계(이하, RA 가계로 칭한다)의 RA 환자, (b)RA 가계의 건강정상인, (c)환자 본인 이외의 친족에 RA 환자가 없는 가계(이하, 단발성 가계로 칭한다)의 RA 환자 및 (d)단발성 가계의 건강정상인 각각에 대해서, 상기 3 염기 삽입변이의 유무의 검출을 행하였다.
상기의 검출은, 각 피검자보다 게놈 DNA를 추출하고, 상기 변이 위치를 포함하는 영역을 적당한 프라이머를 사용한 PCR 반응에 따라 증폭시키고, 수득된 PCR 산물을 시퀀스 해석함으로써 실시하였다. 또한, 상기 적당한 프라이머로서는, 상 기 3 염기 삽입변이를 포함하는 영역을 증폭하는 것이 가능한 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 임의로 사용할 수 있다. 또, 상기 적당한 프라이머의 길이는 불일치에 의한 표적영역 이외의 증폭이 일어나지 않는 한 특히 한정되지 않는다. 일반적으로는 15 내지 25 뉴클레오티드의 범위내의 길이의 프라이머가 사용된다. 그 예로서, 상기 센스 프라이머 및 상기 안티센스 프라이머에는 이하에 나타낸 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
센스 프라이머: 5'-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3' (서열번호 5)
안티센스 프라이머: 5'-ACACCTTTTTGGGTTCTGGC-3' (서열번호 6)
상기의 방법에 의한 변이의 검출결과를 도 4에 나타낸다. 또, 도 4의 표중에서, 가족성 RA는 RA 가계의 RA 환자, 가족성인 아닌 RA는 RA 가계의 건강정상인, 산발성 RA는 단발성 가계의 RA 환자, 산발성이 아닌 RA는 단발성 가계의 건강정상인을 나타낸다. 또, n은 각종 피검자의 전체수를 나타내고, 정상형 유전자를 호모로 가진 자(도면에서는 「nt805(del 3) 호모」로 나타낸다), 변이형 유전자를 헤테로로 가진 자(도면에서는 「nt805(del 3) 헤테로」로 나타낸다), 변이형 유전자를 호모로 가진 자(도면에서는 「nt805 호모」로 나타낸다)의 수를 각각의 란에 기재하고 있다. 또한, 괄호안에는 각종 피검자에 있어서의 상기 각각의 것에 대한 비율을 나타낸다.
도 4에 도시한 바와 같이, RA 가계 및 단발성 가계와 동시에, RA 환자만이 상기 3 염기 삽입형 유전자를 호모로 가진 자가 확인된다. 또, 3 염기 결실형 호모를 변이시키지 않고, 헤테로 및 3 염기 삽입형 호모를 변이시킨 경우, 단발성 가 계 RA 환자와 단발성 가계 건강정상인과의 사이 및 단발성 가계 RA 환자와 RA 가계 정상건강인과의 사이에서 각각 유의차가 인식된다. 이로써, 상기 변이의 유무는 RA 발증에 관계함이 확인된다.
따라서, 상기 방법을 이용해서 상기 RA 관련 유전자에 3 염기 삽입변이가 생성되어 있는지의 여부를 판정함으로써, RA를 발증하고 있는지, 또는 RA 발증가능성을 갖고 있는지의 판정을 할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 특정 피검자에 대해서 상기와 같은 방법에 따라 상기 3 염기 삽입변이의 검출을 행하고, 변이형 유전자만이 검출된 경우(즉, 변이형 유전자를 호모로 가진 경우) 및 변이형 유전자 및 정상형 유전자의 양쪽이 검출된 경우는, RA를 발증하고 있는 가능성이 높다고 판정할 수 있다. 또, 상기의 검출 결과, 변이형 유전자가 검출되지 않은 경우(즉, 정상형 유전자를 호모로 가진 경우)는 RA를 발증하고 있는 가능성 또는 장래 발증할 가능성은 낮다고 판정할 수 있다. 또, 본 발명에 따르는 판정 방법은 상술의 방법에 한정되는 것은 아니고, 상기의 검출 데이터를 기본으로 하여 적절히 선택할 수 있다.
(4) 상기 RA 관련 유전자의 mRNA의 정량
RA 환자 21명, 건강정상인 18명을 대상으로 하여 TaqMan EZ RT-PCR 키트(어플라이드 바이오 시스템즈)를 사용하고, ABI7700으로 정량 RT-PCR를 행하고, 말초혈중에서의 안지오포이에틴-1 mRNA의 발현량을 측정하였다. 프라이머 및 프로브에는 이하의 것을 사용하고, GAPDH를 내부 표준으로 하였다. 또, 하기 프라이머 및 프로브의 설정 위치는 도 2의 B.에 나타낸 바와 같다.
센스 프라이머 AngF272 : 5'-TTTGCGAGAGGCACGGAA-3' (서열번호 7)
안티센스 프라이머 AngR389 : 5'-TATATCTTCTCCCACTGTTT-3' (서열번호 8)
프로브 Taq Man 프로브: 5'-TTCCTCGCTGCCATTCTGACTCACATA-3' (서열번호 9)
정량 결과는, 대 내부 표준비의 상대량으로서 산출하고, 웰치의 t 테스트(Welch's t-test)에 의해 통계처리하였다. 도 5는 건강정상인(대조군) 및 RA 환자의 말초혈로부터 추출하고, 정량된 mRNA의 발현량의 평균치 및 표준편차를 나타내는 그래프이다. 그 결과를 평균치 ± 표준편차로서 이하에 나타낸다.
건강정상인 : 0.3372±0.2421
RA 환자 : 0.0986±0.0937
상기의 결과로부터, RA 환자는 건강정상인과 비교해서 안지오포이에틴-1 mRNA의 발현량이 유의적으로 낮다는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 상기의 방법을 사용하여 mRNA의 발현량을 측정함으로써 RA를 발증하고 있는지 아닌지의 판정을 행할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 상기 mRNA의 발현량에 대해서 2개의 역치(역치 1ㆍ역치 2)를 설계하고, 상기 mRNA의 발현량이 상기 역치 1이하라면, RA를 발증하고 있는 가능성이 높고, 또는 장래 발증할 가능성이 높다고 판정하고, 상기 역치 2이상이면, RA를 발증하고 있는 가능성은 낮고, 또는 장래 발증할 가능성은 낮다고 판정할 수 있다. 또, 상기 역치 1의 값은 RA 환자에서의 평균치 이하(즉 0.0986 이하)의 값으로 설정되는 것이 바람직하다. 또 상기 역치 2의 값은 건강정상인에서의 평균치 이상(즉 0.03372 이상)의 값으로 설정된 것이 바람직하다.
(5) 안지오포이에틴-1 유전자에 있어서 3 염기 삽입형(변이형)과 3 염기 결실형(야생형)과의 생리기능의 비교
이어서, 안지오포이에틴-1 유전자(Ang1)에 있어서 상기 3 염기 삽입을 가진 3 염기 삽입형, 및 상기 3 염기가 결실된 3 염기 결실형의 생리 기능을 비교검토하였다. 이 생리 기능의 비교는 HUVEC 세포의 유주능을 이하로 설명하는 방법으로 조사함으로써 실시하였다.
트랜스웰-24(transwell-24; Coster Inc., #3422)의 막(공극 크기 8.0㎛)에, 최종농도 50㎍/ml의 사람 피브로넥틴(Becton, Dickinson and Company, #354008)를 암호화하였다. 본 트랜스웰은 세포의 유주능을 조사하기 위해 2층으로 하고, 상층에 파종시킨 세포가 막을 삽입하여 막의 하면으로 이동한 세포의 수를, 유주 세포수로서 계수한다. 준비한 상기 트랜스웰 1개에 대해서, M199중의 1% BSA 100㎕에 현탁시킨 2만 5천개의 HUVEC 세포를 파종하였다. 이 트랜스웰에 M199중의 1% BSA에서 2일간 배양시킨 3 염기 삽입형 Ang1 또는 3 염기 결실형 Ang1 각각을 도입한 SVS 세포(J. Mol. Cell. Cardiol., 29(8), 1997, 2177-2186 참조)의 배양상청액을 600㎕씩 첨가하였다.
6 시간 배양후, 정량법에 따라 고정ㆍ염색하고, 막의 하면으로 유주하여 온 세포의 수를 3 염기 삽입형, 3 염기 결실형 각각에 대해서 계수하였다. 도립현미경을 사용하여, 배율 40배로 1웰당 6시야 계수하고, 그 총계 (A) 및 평균 (B)를 구하였다. 또, 그 계수에 대해서는, 6웰분 행하고, 평균치 및 표준편차를 산출하였다. 그 결과를 이하에 나타낸다. 또, 도 6에는, 3 염기 삽입형 (Ang1), 3 염기 결실형 (Ang1(del3)) 각각에 대해서, 유주하여 온 세포수의 평균치를 나타낸다.
결과)
평균치(A/B) 표준편차 (A/B)
3 염기 결실형 260/43 41/7
3 염기 삽입형 520/87 81/14

상기 결과 및 도 6에 도시한 바와 같이, Ang1에 관해서 상기 3 염기 삽입을 가진 변이형에서는, HUVEC 세포의 유주능이 유의적으로 항진되어 있는 것이 확인되었다. 그 결과로부터, 류마티스형에서 발견된 Ang1의 3 염기 삽입형이 건강정상인형에 비해 혈관신생을 보다 항진하는 것으로 골막증식의 한 원인이 되고 있다는 것이 고찰된다.
또한, 실시예항에 있어서 나타낸 구체적인 실시 양태 또는 실시예는 어디까지나 본 발명의 기술내용을 명확하게 하는 것이고, 그러한 구체예만으로 한정하여 협의로 해석되어서는 안되고, 본 발명의 취지와 이어서 기재하는 청구의 범위내에서, 여러가지로 변경하여 실시할 수가 있는 것이다.
이상과 같이, 본 발명에 따르면, 변이를 가진 유전자 또는 단백질을 이용하여, 그 변이의 유무를 검출함으로써, 만성 류마티스관절염의 발병 또는 그 발증가능성을 매우 정확하게 간편하고 확실하게 판정할 수 있어 유용하다. 또한, 본 발명은 만성 류마티스관절염의 신규한 예방법, 치료법 및 치료 약제로서도 유용하다.
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Gln Thr Arg Lys 130 135 140 Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu 145 150 155 160 Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln 165 170 175 Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser 180 185 190 Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu 195 200 205 Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr 210 215 220 Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala 225 230 235 240 Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp 245 250 255 Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu 260 265 270 Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp 275 280 285 Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile 290 295 300 Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn 305 310 315 320 Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp 325 330 335 Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser 340 345 350 Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln 355 360 365 Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg 370 375 380 Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn 385 390 395 400 Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser 405 410 415 Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn 420 425 430 Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp 435 440 445 Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala 450 455 460 Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu 485 490 495 Asp Phe <210> 2 <211> 1497 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgacagttt tcctttcctt tgctttcctc gctgccattc tgactcacat agggtgcagc 60 aatcagcgcc gaagtccaga aaacagtggg agaagatata accggattca acatgggcaa 120 tgtgcctaca ctttcattct tccagaacac gatggcaact gtcgtgagag tacgacagac 180 cagtacaaca caaacgctct gcagagagat gctccacacg tggaaccgga tttctcttcc 240 cagaaacttc aacatctgga acatgtgatg gaaaattata ctcagtggct gcaaaaactt 300 gagaattaca ttgtggaaaa catgaagtcg gagatggccc agatacagca gaatgcagtt 360 cagaaccaca cggctaccat gctggagata ggaaccagcc tcctctctca gactgcagag 420 cagaccagaa agctgacaga tgttgagacc caggtactaa atcaaacttc tcgacttgag 480 atacagctgc tggagaattc attatccacc tacaagctag agaagcaact tcttcaacag 540 acaaatgaaa tcttgaagat ccatgaaaaa aacagtttat tagaacataa aatcttagaa 600 atggaaggaa aacacaagga agagttggac accttaaagg aagagaaaga gaaccttcaa 660 ggcttggtta ctcgtcaaac atatataatc caggagctgg aaaagcaatt aaacagagct 720 accaccaaca acagtgtcct tcagaagcag caactggagc tgatggacac agtccacaac 780 cttgtcaatc tttgcactaa agaaggtgtt ttactaaagg gaggaaaaag agaggaagag 840 aaaccattta gagactgtgc agatgtatat caagctggtt ttaataaaag tggaatctac 900 actatttata ttaataatat gccagaaccc aaaaaggtgt tttgcaatat ggatgtcaat 960 gggggaggtt ggactgtaat acaacatcgt gaagatggaa gtctagattt ccaaagaggc 1020 tggaaggaat ataaaatggg ttttggaaat ccctccggtg aatattggct ggggaatgag 1080 tttatttttg ccattaccag tcagaggcag tacatgctaa gaattgagtt aatggactgg 1140 gaagggaacc gagcctattc acagtatgac agattccaca taggaaatga aaagcaaaac 1200 tataggttgt atttaaaagg tcacactggg acagcaggaa aacagagcag cctgatctta 1260 cacggtgctg atttcagcac taaagatgct gataatgaca actgtatgtg caaatgtgcc 1320 ctcatgttaa caggaggatg gtggtttgat gcttgtggcc cctccaatct aaatggaatg 1380 ttctatactg cgggacaaaa ccatggaaaa ctgaatggga taaagtggca ctacttcaaa 1440 gggcccagtt actccttacg ttccacaact atgatgattc gacctttaga tttttga 1497 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 3 gctggcagta caatgacag 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 4 tcaaaaatct aaaggtcgaa t 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 5 caaccttgtc aatctttgc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 6 acaccttttt gggttctggc 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 7 tttgcgagag gcacggaa 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 8 tatatcttct cccactgttt 20 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 9 ttcctcgctg ccattctgac tcacata 27

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지고, 그 서열 중 269번째의 아미노산으로서 글리신 삽입 변이를 가지는 단백질을 암호화하는 유전자의 변이 유무를 생체 밖에서(ex vivo) 검출하는 단계를 포함하는, 만성 류마티스관절염의 발증 또는 이의 발증 가능성을 판정하기 위하여 정보를 제공하는 방법.
  5. 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지고, 그 서열 중 269번째의 아미노산으로서 글리신 삽입 변이를 가지는 단백질의 변이 유무를 생체 밖에서(ex vivo) 검출하는 단계를 포함하는, 만성 류마티스관절염의 발증 또는 이의 발증 가능성을 판정하기 위하여 정보를 제공하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 기재된 방법을 이용한, 만성 류마티스관절염의 발증 또는 이의 발증가능성의 판정 키트.
  7. 만성 류마티스관절염의 발증 또는 이의 발증 가능성을 판정하기 위하여, 서열번호 2에 나타낸 염기 서열 중 805 내지 807번째 염기인 「GGT」의 3 염기를 결실한 염기 서열을 가진 만성 류마티스관절염의 질환 감수성 유전자 유래의 mRNA의 발현량을 측정하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 269번째 아미노산으로서 글리신의 삽입 변이를 갖지 않은 정상형 단백질 또는 당해 정상형 단백질을 암호화하는 DNA, 또는 당해 정상형 단백질이 리간드가 되는 수용체 단백질의 효능제로서의 저분자 화합물을 주성분으로 하는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 그 서열 중 269번째 아미노산으로서 글리신 삽입 변이를 가지는 단백질을 갖는 만성 류마티스관절염의 치료 약제.
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