KR20230159285A - 혈장 단백질의 동결 건조를 위한 신규한 액상 제형물 - Google Patents
혈장 단백질의 동결 건조를 위한 신규한 액상 제형물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230159285A KR20230159285A KR1020230059742A KR20230059742A KR20230159285A KR 20230159285 A KR20230159285 A KR 20230159285A KR 1020230059742 A KR1020230059742 A KR 1020230059742A KR 20230059742 A KR20230059742 A KR 20230059742A KR 20230159285 A KR20230159285 A KR 20230159285A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- residue
- substitution
- composition
- residues
- protein
- Prior art date
Links
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 title abstract description 30
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 title description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 126
- 102000043853 ADAMTS13 Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108091005670 ADAMTS13 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 154
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 103
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 77
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 65
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 65
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 65
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 52
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 17
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 17
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 17
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 206010043561 Thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 7
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000034841 Thrombotic Microangiopathies Diseases 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 5
- 208000032759 Hemolytic-Uremic Syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- -1 CaCl 2 Chemical compound 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 3
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 claims description 3
- 101800001224 Disintegrin Proteins 0.000 claims description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 claims description 2
- 229920001219 Polysorbate 40 Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 claims description 2
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000249 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010483 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940101027 polysorbate 40 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940113124 polysorbate 60 Drugs 0.000 claims description 2
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 20
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 19
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 19
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 9
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 108
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 80
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 51
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 44
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 25
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 23
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 22
- 102000029750 ADAMTS Human genes 0.000 description 21
- 108091022879 ADAMTS Proteins 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 description 14
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 12
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 11
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 10
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 10
- 208000035888 Immune-mediated thrombotic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 9
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 101000798281 Homo sapiens A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 13 Proteins 0.000 description 8
- 102000057210 human ADAMTS13 Human genes 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000007023 Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000003055 full factorial design Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229940124280 l-arginine Drugs 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 101100208237 Bos taurus THBS2 gene Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 2
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 10,10-dioxo-2-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thioxanthen-9-one Chemical compound O=C1c2ccccc2S(=O)(=O)c2ccc(cc12)-c1ccc(cc1)N(c1ccccc1)c1ccccc1 FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220575109 UDP-glucuronosyltransferase 1A10_F93I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016127 added sugars Nutrition 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013022 formulation composition Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C21 KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 102220041210 rs199517389 Human genes 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000001370 static light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000659 thermocoagulation Effects 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6815—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
본 발명은 혈장 단백질, 구체적으로는 ADAMTS-13 단백질에 대한 약제학적 제형 조성물 및 이를 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 혈액으로부터 분리 정제되는 순간부터 변성 및 오염의 위험성이 높아 장기간 저장 시 약리활성 및 품질의 저하가 발생하는 혈장 단백질에 있어 그 안정성을 현저히 개선하고, 특히 콜로이드 안정성, 냉장 안정성, 순도 및 응집 차단율을 높은 수준으로 유지할 뿐 아니라 동결 건조 후의 케익 성상이 장기간 양호하게 지속됨으로써 다양한 혈전성 질환에 사용되는 중요한 치료 자원인 ADAMTS-13 단백질을 치료학적 유효량의 손실 없이 장기간 유지, 보관하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 혈장 단백질, 구체적으로는 ADAMTS-13 단백질의 액상 제형 조성물에 관한 것이다.
단백질 의약품 개발에 있어 안정성이 취약한 단백질의 충분한 보관 안정성 확보를 위해 효율적인 동결건조 제형의 개발은 중요한 문제이다. 동결건조 공정이 시작되기 이전 액상인 상태로 일정 시간 보관이 필요하며, 이 보관 기간 동안의 품질 저하를 방지하기 위해 액상 제형에서도 어느 정도 안정성을 확보하여야 한다.
동결건조 제형에 사용되는 첨가제(Excipient)는 물질의 특성에 따라 결정형(Crystalline) 및 무결정형(Amorphous) 두 가지로 나뉜다. 결정형 첨가제는 동결건조 제형에서 증량제(bulking agent)의 역할을 하며 동결건조 케익에 기계적 강도 를 제공하여 케익을 보다 견고하게 만든다. 대표적인 결정형 첨가제는 만니톨, 글라이신 등이 있다. 반면 무결정형 첨가제는 동결건조 제형에 있어 단백질 안정화제 역할을 하며, 단백질과 인접하여 존재함으로써 동결건조 공정 중 발생되는 응력(stress)으로부터 단백질을 안정화시키는 역할을 한다.
한편 단백질 의약품 제형에 주로 사용되는 염화나트륨의 경우 첨가된 농도에 따라 무결정형 또는 결정형 두 가지 형태를 모두 가질 수 있다. 일반적으로 NaCl 150mM 이하의 경우 무결정형 성질을 주요하게 띄며, 200mM 이상의 경우 대부분 결정화된다고 보고되고 있다.
동결건조 제형에 안정화제는 동결건조 공정 중 발생되는 스트레스로부터 단백질을 보호하고 안정화시킴과 동시에 건조 완료 후 보관 기간 및 재구축(reconstitution) 시에도 단백질 안정화에 기여하므로, 특히 동결건조를 통한 장기 보관이 예정된 단백질 제제에 있어 최적의 안정화제 성분 및 이들의 최적의 함량비탐색은 단백질의 치료자원으로서의 가치와 효용성 차원에서 신규 약리성분의 발굴 못지않게 중요한 문제가 된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 혈액으로부터 분리 정제되는 순간부터 오염 및 변성의 위험이 높은 혈장 단백질의 안정성을 개선하고, 특히 동결 건조시에도 그 물성, 생물학적 활성 및 약리 효과를 장기간 유지시킬 수 있는 우수한 액상 제형 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 제형 내에 당 안정화제, 구체적으로는 수크로스가 0 내지 1.5 w/v%로 포함되면서 무기염, 구체적으로는 NaCl이 100 mM 내지 400 mM로 포함될 경우 콜로이드 안정성, 냉장 안정성, 풀림(unfolding) 억제, 응집 차단 및 동결 건조 후의 케익 성상을 비롯한 다각적인 지표에서 현저히 우수한 안정성을 나타냄을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 혈장 단백질용 약제학적 제형 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 전체 조성물에 대해 0 - 1.5 w/v%의 당(sugar) 안정화제 및 100 mM 내지 400 mM의 무기염을 포함하는 혈장 단백질용 약제학적 제형 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 혈액으로부터 분리 정제되는 순간부터 오염 및 변성의 위험이 높은 혈장 단백질의 안정성을 개선하고, 특히 동결 건조시에도 그 물성, 생물학적 활성 및 약리 효과를 장기간 유지시킬 수 있는 우수한 액상 제형 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 제형 내에 당 안정화제, 구체적으로는 수크로스가 0 내지 1.5 w/v%로 포함되면서 무기염, 구체적으로는 NaCl이 100 mM 내지 400 mM로 포함될 경우 콜로이드 안정성, 냉장 안정성, 풀림(unfolding) 억제, 응집 차단 및 동결 건조 후의 케익 성상을 비롯한 다각적인 지표에서 현저히 우수한 안정성을 나타냄을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“혈장 단백질(Plasma protein)”은 인간 또는 동물의 혈장에 존재하는 수용성 단백질을 총칭하는 의미로서, 혈액 속에 포함된 단백질 중 백혈구와 적혈구에 포함된 것 이외의 모든 단백질 성분을 포괄한다. 혈장단백질은 전체 혈장의 약 8% 정도를 차지하며, 지혈작용(프로트롬빈, 피브리노겐), 호르몬의 수송(혈청알부민과 지질단백질 등), 면역작용(면역글로불린과 보체 단백질)을 담당한다. 혈장 단백질은 당업계에 알려진 다양한 분획 및 정제 방법에 의해 혈액으로부터 수득될 수 있으나, 장기간 보관 및 환경 변화에 따른 화학적 불안정성 및 물리적 불안정성 문제가 극복되어야 한다. 물리적 불안정성은 단백질에서 공유결합 변화를 유도하지 않는 변형, 즉 흡착, 응집 및 침전을 형성하며, 화학적 불안정성은 탈아미드화, 라세미체화, 가수분해, 산화, 베타 제거 및 디설파이드 교환 등의 변형을 수반한다. 이러한 불안정성은 고유의 생물학적 활성의 왜곡 및 약리 효과의 감소로 이어진다.
본 명세서에서 용어“안정화제(stabilizer)”는 활성성분의 안정성을 증가시키고, 활성성분이 임의로 변성, 산화, 응집 또는 결정화되거나 유연물질로 변성되어 종국적으로 약리 활성이 상실되거나 저하되는 것을 방지하기 위하여 제형 내에 첨가되는 임의의 첨가제를 의미하며, 약학적으로 허용 가능한 것이라면 크게 제한되지 않는다.
용어“당 안정화제(sugar stabilizer)”란 당을 주성분 또는 보조적 성분으로 제형에 첨가하여 상술한 안정화 효과를 유도하는 안정화제를 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 당은 수크로스, 트레할로스 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 명세서에서 용어“약제학적으로 허용되는 염”은 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 트리플루로초산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어“무기염”은 수용액 상에서 양이온 및 음이온이 서로 이온 결합을 통해 조합된 염으로서 C-H 결합을 포함하지 않는 무기물 유래의 염을 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 무기염은 예를 들어 NaCl, CaCl2, KCl, MgCl2 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는, 본 발명의 무기염은 NaCl 및 CaCl2의 혼합물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 당 안정화제는 전체 조성물에 대해 0.5 - 1.3 w/v%로 포함되고, 보다 구체적으로는 0.7 - 1.3 w/v%로 포함되며, 보다 더 구체적으로는 0.9 - 1.1 w/v%로 포함되며, 가장 구체적으로는 약 1 w/v%로 포함된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 무기염은 150 - 350 mM로 포함된다.
보다 구체적으로는, 상기 당 안정화제가 전체 조성물에 대해 0 w/v% 내지 1 w/v%로 포함된 경우, 상기 무기염은 120 mM 내지 200 mM으로 포함된다.
보다 구체적으로는, 상기 당 안정화제가 전체 조성물에 대해 1.4 w/v% 내지 1.6 w/v%로 포함된 경우, 상기 무기염은 160 mM 내지 200 mM으로 포함된다.
보다 구체적으로는, 상기 당 안정화제는 전체 조성물에 대해 약 1.9 w/v% 내지 2.1 w/v%로 포함된 경우, 상기 무기염은 약 200 mM로 포함된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 무기염 중 CaCl2은 2 mM 내지 6 mM이 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는 3 내지 5 mM이 포함될 수 있고, 가장 구체적으로는 약 4 mM이 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 10mM 내지 30mM의 히스티딘을 포함하며, 보다 구체적으로는 15mM 내지 25mM의 히스티딘을 포함하며, 가장 구체적으로는 약 20mM의 히스티딘을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 40 mM 내지 200 mM의 아미노산 안정화제(stabilizer)를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서 용어 “아미노산 안정화제”란 아미노산을 주성분 또는 보조적 성분으로 제형에 첨가하여 상술한 안정화 효과를 유도하는 안정화제를 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 60 mM 내지 180 mM의 아미노산 안정화제를 포함하며, 보다 구체적으로는 60 mM 내지 160 mM의 아미노산 안정화제를 포함하고, 보다 더 구체적으로는 60 mM 내지 140 mM의 아미노산 안정화제를 포함하며, 보다 더 구체적으로는 80 mM 내지 135 mM의 아미노산 안정화제를 포함하고, 보다 더 구체적으로는 100 mM 내지 130 mM의 아미노산 안정화제를 포함하며, 가장 구체적으로는 약 120 mM의 아미노산 안정화제를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아미노산은 아르기닌(Arg), 프롤린(Pro) 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 40 mM 내지 200 mM의 아미노산 안정화제가 추가적으로 포함된 경우, 전술한 당 안정화제는 전체 조성물에 대해 0 - 1.5 w/v%로 포함되고 무기염은 200 - 300 mM로 포함된다.
보다 구체적으로는 상기 당 안정화제는 0.5 - 1.3 w/v%로 포함되고, 보다 구체적으로는 0.7 - 1.3 w/v%로 포함되며, 보다 더 구체적으로는 0.9 - 1.1 w/v%로 포함되며, 가장 구체적으로는 약 1 w/v%로 포함된다.
보다 구체적으로는, 상기 당 안정화제가 전체 조성물에 대해 약 0 w/v 내지 0.6%로 포함된 경우, 상기 무기염은 200 mM 내지 280 mM으로 포함된다.
보다 구체적으로는, 상기 당 안정화제가 전체 조성물에 대해 0.9 w/v% 내지 1.1 w/v%로 포함된 경우, 상기 무기염은 240 mM 내지 280 mM으로 포함된다.
본 발명자들은 아미노산 안정화제, 당 안정화제 및 무기염이 각각 서로의 최적 함량에 상호 영향을 미치며, 특히 액상 제형의 동결 건조 후 케익 성상이 양호하게 지속되는 조건이 아미노산 안정화제의 첨가 여부에 따라 각각 상이하다는 사실을 규명하였다. 이에, 제형 성분에 아미노산, 구체적으로는 아르기닌 100mM 내지 140mM가 필수적으로 포함될 경우 당 안정화제가 1.0% 첨가된 상황에서도 무기염은 최대 280mM까지 첨가될 수 있어, 제품의 안정성을 위해 수크로스나 아르기닌과 같은 무결정형 안정제의 함량을 증가시켜야 할 경우, 무기염의 함량을 늘림으로써 케익 성상을 유지할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조성물은 전체 조성물에 대해 0.01 내지 0.1 v/v %의 비이온성 계면활성제를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 “계면활성제”는 소수성 물질의 수용해도를 증가시키거나 상이한 소수성을 갖는 복수의 물질의 혼화성을 증가시키기 위해 사용되는 가용성 화합물을 의미한다. 용어“비이온성 계면활성제”는 전체 분자 내에 이온화되는 작용기 또는 원자단이 포함되지 않아 수용액 상태에서도 해리되지 않은 채 용해되는 계면활성제를 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면 본 발명에서 사용될 수 있는 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이며, 보다 구체적으로는 폴리소르베이트 80이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 0.03 내지 0.08 v/v %의 비이온성 계면활성제를 가장 구체적으로는 약 0.05 v/v %의 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 제형 조성물이 적용되는 혈장 단백질은 ADAMTS13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13) 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편이다.
본 명세서에서 용어“기능적 일부”는 전장 단백질에서 일부 아미노산 잔기가 삭제된 절편으로서 그 본연의 생물학적 활성 및 기능을 유지하는 전장 단백질의 유사체를 의미한다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열은 1427개 아미노산으로 구성된 ADAMTS13 단백질의 아미노산 서열이다. 이에, 본 발명의 ADAMTS13 변이 단백질 또는 이의 기능적 일부 절편은 전장(1427a.a) ADAMTS13 단백질 또는 75-685번 영역을 포함하는 이의 일부 절편 내에 아미노산 변이가 도입된 ADAMTS13 변이체일 수 있다. 75-685번 영역을 포함하는 일부 절편은 예를 들어 1-685 (685 a.a) 또는 75-685 (611 a.a)일 수 있다.
본 발명의 ADAMTS13 단백질 및 이의 기능적 일부 절편이 필수적으로 포함하는 아미노산 서열인 서열목록 제1서열은 상기 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함한다. 실질적인 동일성이란, 상기 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석할 시, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 ADAMTS13 단백질의 변이체는 서열목록 제1서열의 85, 93, 126, 135, 278, 282, 308, 314, 317, 334, 364, 376, 413, 427, 452, 465, 567, 578, 585, 589, 607, 608, 609, 612, 618, 624, 630, 635, 643, 650, 651, 654, 655, 656, 658, 664 및 672번째 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다.
본 발명자들은 ADAMTS13의 자가항체가 인식하는 핵심 영역을 동정하고, 이들 영역 내 일부 아미노산에 치환을 가할 경우 자가항체와의 결합이 차단되고 vWF 분해 활성 및 혈전 억제 활성이 유지됨으로써, 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)을 비롯하여 과도한 혈전 형성을 원인으로 하는 다양한 질환에 대해 효율적인 치료 조성물로 사용될 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“자가 항체(autoantibody)”는 항원의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하여 해당 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 단백질의 하나로써, 개체 자신의 면역 시스템에 의해 생성되어 개체 자신의 단백질을 인식하고 표적화하는 항체를 의미한다. 자가항체의 존재는 해당 자가항체에 의해 특이적으로 인식되는 단백질의 고유 기능 또는 생물학적 활성의 저하 또는 상실을 야기하므로, 다양한 질환의 원인이 된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 ADAMTS13 단백질의 변이체는 다음 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 각 변이 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된다:
- 85 및 317번째 잔기; 612번째 잔기; 282, 465 및 672번째 잔기 중 둘 이상; 635번째 잔기; 452 및 612번째 잔기; 278, 334 및 427번째 잔기 중 둘 이상; 618번째 잔기; 135번째 잔기; 126, 567 및 651번째 잔기 중 둘 이상; 413번째 잔기; 334번째 잔기; 314번째 잔기; 93, 364 및 376번째 잔기 중 둘 이상; 308번째 잔기; 656번째 잔기; 607번째 잔기; 612 및 624번째 잔기; 589번째 잔기; 650 및 656번째 잔기; 643번째 잔기; 585 및 658번째 잔기; 630, 654 및 664번째 잔기 중 둘 이상; 589, 608, 609, 624 및 655번째 잔기 중 넷 이상; 578번째 잔기; 585번째 잔기; 314 및 635번째 잔기; 및 314 및 612번째 잔기.
보다 구체적으로는, 상기 아미노산 잔기의 치환은 85번째 잔기의 Phe로의 치환, 93번째 잔기의 Val으로의 치환, 126번째 잔기의 Met으로의 치환, 135번째 잔기의 Ile으로의 치환, 278번째 잔기의 Ile으로의 치환, 282번째 잔기의 Ala으로의 치환, 308번째 잔기의 Lys으로의 치환, 314번째 잔기의 Thr으로의 치환, 317번째 잔기의 His으로의 치환, 334번째 잔기의 Thr 또는 Val으로의 치환, 364번째 잔기의 Arg으로의 치환, 376번째 잔기의 Asp으로의 치환, 413번째 잔기의 Asp으로의 치환, 427번째 잔기의 Asn으로의 치환, 452번째 잔기의 Ile으로의 치환, 465번째 잔기의 Asp으로의 치환, 567번째 잔기의 Ser으로의 치환, 578번째 잔기의 Leu으로의 치환, 585번째 잔기의 Asn 또는 Met으로의 치환, 589번째 잔기의 Gln으로의 치환, 607번째 잔기의 Arg으로의 치환, 608번째 잔기의 Met으로의 치환, 609번째 잔기의 Leu으로의 치환, 612번째 잔기의 Phe 또는 Tyr으로의 치환, 618번째 잔기의 Ser으로의 치환, 624번째 잔기의 Asp 또는 Cys으로의 치환, 630번째 잔기의 Leu으로의 치환, 635번째 잔기의 Val으로의 치환, 643번째 잔기의 Phe으로의 치환, 650번째 잔기의 His으로의 치환, 651번째 잔기의 Asp으로의 치환, 654번째 잔기의 Gly으로의 치환, 655번째 잔기의 Val으로의 치환, 656번째 잔기의 Arg 또는 His으로의 치환, 658번째 잔기의 His으로의 치환, 664번째 잔기의 Asn으로의 치환, 672번째 잔기의 Val으로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 전술한 본 발명의 혈장 단백질은 IgG4 면역글로불린의 Fc 영역이 접합되어 있다.
본 발명자들은 본 발명에서 발굴된 ADAMTS13 변이 단백질에 IgG4 면역글로불린 유래의 Fc 영역을 접합시킬 경우, 고유의 vWF 절단 활성 및 중화항체 회피 활성을 그대로 유지하면서도 생체 내 안정성이 크게 증가하며, 특히 ADAMTS13의 C-말단 일부가 제거된 개방형(open form) 절편들에서 나타나는 구조적 불안정성이 현저히 개선됨을 발견하였다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 Fc 영역은 서열목록 제2서열의 22, 24 및 26번째 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 아미노산 잔기의 치환은 22번째 잔기의 Tyr으로의 치환, 24번째 잔기의 Thr으로의 치환 및 26번째 잔기의 Glu으로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제2서열은 IgG4 면역글로불린 유래의 Fc 영역(217a.a)이다. 본 발명자들은 전술한 ADAMTS13 변이 단백질 또는 이의 기능적 일부 절편에 22, 24 및 26번째 잔기가 각각 Tyr, Thr 및 Glu으로 치환된 IgG4 면역글로불린 유래의 Fc 영역[IgG4 (YTE)]을 융합시킬 경우 혈중 반감기가 극대화되어 투여 후 생리 활성이 장기간 지속될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 혈장 단백질과 상기 IgG4 면역글로불린의 Fc 영역 사이에 IgG1 면역글로불린의 힌지(hinge) 영역이 추가적으로 포함된다.
본 발명에 따르면, IgG1 면역글로불린 유래의 힌지(hinge) 영역은 서열목록 제3서열(15a.a)로 표시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈장 단백질로서 ADAMTS13 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편에 대한 전술한 본 발명의 약제학적 제형 조성물을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어“혈전성 질환”은 혈관의 미세순환계에 혈소판이 응집되면서 생성된 혈전으로 인해 혈류가 감소 또는 차단되고, 이로 인해 신장, 심장, 뇌 등의 각 기관에 허혈성 손상이 유발되는 전신 질환을 의미한다.
ADAMTS13 효소가 중화항체에 의해 활성이 억제되어 폰빌레란트인자(vWF)를 제대로 분해하지 못할 경우, 과도한 혈소판 응집 및 혈전 과생성이 발생한다. 따라서, 중화항체를 높은 효율로 회피하면서도 vWF 분해 활성이 유지 또는 개선된 본 발명의 ADAMTS13 변이 단백질은 다양한 혈전성 질환에 대한 효율적인 예방 또는 치료 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 중화항체의 존재 여부와 무관하게 vWF를 특이적으로 인식 및 분해하여 과도한 혈전의 생성을 차단함으로써 혈전성 질환의 진행을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어 “대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 혈전성 질환은 혈전성 미세 혈관병증(thrombotic microangiopathy, TMA)이다. 보다 구체적으로는, 상기 혈전성 미세 혈관병증은 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombocytopenic purpura, TTP), 용혈성 요독성 증후군(Hemolytic uremic syndrome, HUS), HELLP(Hemolysis, Elevated Liver enzymes, Low Platelet count), 자간전증(Preeclampsia) 및 겸상적혈구질환(sickle cell disease)으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 더 구체적으로는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 또는 겸상적혈구질환이며, 가장 구체적으로는 혈전성 혈소판 감소성 자반증이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈장 단백질로서 ADAMTS13 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편에 대한 전술한 본 발명의 약제학적 제형 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 혈장 단백질, 이의 제형 성분 및 이를 통해 예방 또는 치료될 수 있는 혈전성 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 혈장 단백질, 구체적으로는 ADAMTS-13 단백질에 대한 약제학적 제형 조성물 및 이를 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 혈액으로부터 분리 정제되는 순간부터 변성 및 오염의 위험성이 높아 장기간 저장 시 약리활성 및 품질의 저하가 발생하는 혈장 단백질에 있어 그 안정성을 현저히 개선하고, 특히 콜로이드 안정성, 냉장 안정성, 순도 및 응집 차단율을 높은 수준으로 유지할 뿐 아니라 동결 건조 후의 케익 성상이 장기간 양호하게 지속됨으로써 다양한 혈전성 질환에 사용되는 중요한 치료 자원인 ADAMTS-13 단백질을 치료학적 유효량의 손실 없이 장기간 유지, 보관하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 NaCl 농도 변화에 따른 케익 성상(도 1a) 및 SE-HPLC를 통해 평가한 순도 차이(도 1b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 2는 20 mM의 아르기닌이 존재하는 경우 액상 제형에서 NaCl 농도에 따른 SE-HPLC 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 120 mM의 NaCl 존재 하에서 수크로스의 농도 및 트레할로스의 첨가 여부에 따른 케익 성상(도 3a)과 SE-HPLC 결과(도 3b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 4는 수크로스와 증량제(bulking agents)인 만니톨 또는 글리신의 배합비에 따른 케익 성상(도 4a) 및 SE-HPLC 결과(도 4b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 5는 120 mM의 NaCl 존재 하에 글리신 농도에 따른 케익 성상을 비교한 그림이다.
도 6은 120 mM의 NaCl 존재 하에 아르기닌 농도에 따른 케익 성상을 비교한 그림이다.
도 7은 아르기닌이 첨가되지 않은 경우 NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 케익 성상(도 7a) 및 SE-HPLC 결과(도 7b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 8은 120mM의 아르기닌 존재 하에 NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 케익 성상(도 8a) 및 SE-HPLC 결과(도 8b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 9는 NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 40℃에서 1개월차의 순도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 5가지 아미노산 안정화제의 첨가에 따른 제형의 콜로이드 안정성을 평가하기 위해 B22 값을 측정한 결과를 나타내는 그림이다.
도 11은 7가지 안정화제(아미노산 6종 및 수크로스)를 첨가 후 상온에서의 단량체 회복 정도를 평가하기 위해 크기배제 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 수행한 결과를 보여주는 그림이다.
도 12는 20 mM의 아르기닌 첨가에 따른 대조군 대비 냉장 안정성을 SE-HPLC로 평가한 결과를 나타내는 그림이다.
도 13은 약리 성분인 단백질(ADAMTS-13)의 농도 및 아르기닌 농도에 따른 순도 및 안정성을 SE-HPLC로 평가한 결과를 나타낸 그림이다.
도 14는 폴리소르베이트 80 농도에 따른 교반-유도 응집의 방지효과를 성상 관찰(도 14a), 탁도(Turbidity) 측정(도 14b) 및 SE-HPLC(도 14c)를 통해 각각 보여주는 그림이다.
도 15는 폴리소르베이트 80 농도에 따른 액상 안정성을 SE-HPLC로 평가한 결과이다.
도 16은 폴리소르베이트 80 농도에 따른 동결건조 후의 제형 품질을 SE-HPLC(도 16a) 및 고차 응집체(Higher-order aggregates) 생성 여부(도 16b)를 통해 평가한 결과이다.
도 17은 pH에 따른 열 풀림(thermal unfolding, Tm) 측정 결과(도 17a) 및 열 응집(thermal aggregation, Tagg) 평가 결과(도 17b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 18은 CaCl2 농도에 따른 동결 건조 케익 성상(도 18a) 및 SE-HPLC 분석 결과(도 18b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 19는 NaCl 및 수크로스 농도에 따른 성상 평가 결과를 도식화한 그림(도 19a) 및 각 농도별 케익 성상(도 19b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 20은 NaCl 및 수크로스 농도에 따른 케익 성상을 보여주는 그림이다.
도 21은 아르기닌 농도에 따른 콜로이드 안정성 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 아르기닌 농도에 따른 케익 성상(도 22a) 및 순도(도 22b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 23은 본 발명에서 최종적으로 선정된 액상 제형 조성물의 물성을 보여주는 그림으로, 시간의 경과에 따른 순도 변화(도 23a), 역가 변화(도 23b), 단백질 농도 변화(도 23c) 및 탁도 변화(도 23d)를 각각 나타낸다.
도 24는 NaCl 및 수크로스 농도에 따른 장기 보관 안정성을 보여주는 그림으로, 보관 개시 시점과 6개월 경과 후의 순도(도 24a) 및 역가(도 24b) 변화를 각각 보여준다.
도 25는 중화항체와 결합하는 ADAMTS13의 각 도메인의 결합부위를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 25a는 ADAMTS13의 발현율 혹은 중화 항체의 결합 부위 확인을 위해 제작한, 다양한 도메인이 조합된 6종의 ADAMTS13 절편(혹은 야생형 전장 ADAMTS13)의 모식도를 나타낸다. 도 25b는 각 ADAMTS13 도메인에서 발현하는 단백질을 이용하여 단백질 A-세파로스와 각 중화항체를 섞어 면역침강한 뒤 항-V5 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과를 보여준다. Input은 도메인별 단백질의 발현 정도를 보여준다. 도 25c는 ADAMTS13 중화항체 결합 부위의 모식도로 Ab 4-16 항체는 S 도메인, Ab 67 항체는 D 도메인, Ab 66 항체는 T2-T8 도메인에 각각 특이적으로 결합함을 도식화한 그림이다.
도 26은 항-ADAMTS13 항체를 회피하거나 야생형 ADAMTS13보다 우수한 활성을 가지는 변이체의 선별 결과를 보여주는 그림이다. 야생형 클론과 ADAMTS13 변이체에서 Ab 4-16 항체(도 26a) 및 Ab 67 항체(도 26b)에 대한 회피율과 ADAMTS13 활성을 측정하였다. 상대활성은 야생형 클론 및 변이체의 비역가를 확인하여 다음수식에 대입함으로써 산출하였다: 상대활성 (%) = 변이체 비역가 / 야생형 ADAMTS13 비역가 X 100
도 27a-27b는 12종의 전장 ADAMTS13 변이체의 단일 중화항체 회피율을 확인한 결과이다. 12종의 전장 ADAMTS13 변이체에서 중화항체 7종(Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)에 대한 항체 회피율을 측정하였다. 중화항체 회피율은 WT ADAMTS13 수치와 비교하여 상대적 결합 수준을 확인한 후, 이를 이용하여 상대 회피율을 다음 수식에 대입하여 산출하였다: 회피율(%) = (1- 변이체 결합능/WT ADAMTS13 결합능) x 100
도 28a-28b는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 단일 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 선정된 12종 변이체를 MDTCS 절편화하여 Fc를 부착한 변이체와 선별된 변이 아미노산 잔기를 조합하여 2개의 아미노산 변이를 갖는 DM1, DM2 변이 2종을 포함한 총 14종의 변이체가 발현된 배양액을 이용하여 단일 중화항체 8종(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)의 중화항체 회피율과 ADAMTS13 상대 활성을 측정하였다. 회피율(%)=(1- 변이체 결합능/결합능) x 100; 상대활성(%)=변이체 비역가/WT ADAMTS13 비역가 x 100
도 29는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 혼합 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 대조군인 MDTCS-Fc와 12종의 후보 변이체를 발현하는 배양액 4nM에 동일 비율로 혼합된 9종의 중화항체(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab66, Ab67)를 혼합하여 반응시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존 활성을 다음 수식에 대입하여 산출하였다: 잔존활성(%) = A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성)
도 30a-30b는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체 배양액과 정제액 조건에서의 단일 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 12종의 변이체(1C03, 2B01, 2B02, 3B05, 4E11, 4H07, 5G08, 7A02, 8D01, 8D05, DM1, DM2)가 발현된 배양액 혹은 Phytip system으로 정제한 정제액을 이용하여 단일 중화항체 8종(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)에 대한 중화항체 회피율과 상대 활성을 측정하였다(도 30a 및 30b). 해당 정제액의 농도는 Fc ELISA를 통해 확인하였다. 회피율(%)=(1- 변이체 결합능/MDTCS-Fc 결합능) x 100, 상대활성 (%) = 변이체 비역가/ MDTCS-Fc 비역가 x 100. 파란색 바(bar)는 정제된 변이 단백질을, 회색 바는 발현된 변이 단백질의 중앙값을 각각 나타낸다.
도 31은 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체의 배양액과 정제액 조건에서의 혼합 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 대조군인 MDTCS-Fc와 12종의 후보 변이체를 발현하는 배양액 혹은 정제액 4 nM에 동일 비율로 혼합된 8종의 중화항체(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)를 혼합하여 반응 시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존활성을 측정하였다. 잔존 활성은 아래 수식에 대입하여 산출하였다. 잔존활성 (%) = A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성)
도 32는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체의 약동학 결과를 보여주는 그래프이다. MDTCS 혹은 Fc(IgG1-YTE)가 부착 되어있는 MDTCS 및 4개 최종 후보 변이체(1C03, 5C09, 7A02, DM2) 절편 단백질을 마우스에 꼬리 정맥에 투여한 후 시간 별로 혈장을 확보하였다. 각 물질의 비역가를 기준으로 160 IU/kg가 되도록 투여하였고 활성 어세이를 통해 각 시간별로 확보한 혈장 내 잔존하는 물질의 활성을 측정하였다.
도 33은 IgG1-YTE 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 단일 중화항체에 대한 회피력을 확인한 결과이다. 선정된 5종 변이체를 MDTCS 절편화하여 IgG1-YTE를 부착한 변이체가 발현된 배양액을 이용하여 단일 중화항체 8종 (Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)의 중화항체 회피율과 상대 활성을 측정하였다(도 33a 및 33b). 회피율(%)=(1-변이체 결합능/ MDTCS-IgG1-YTE 결합능) x 100, 상대활성(%) = 변이체 비역가/MDTCS-IgG1-YTE 비역가 x 100.
도 34는 IgG1-YTE 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 혼합 중화항체에 대한 회피력을 확인한 결과이다. 대조군인 MDTCS-IgG1-YTE와 5종의 후보 변이체를 발현하는 배양액 4nM에 동일 비율로 혼합된 9종의 중화항체 (Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab66, Ab67)를 혼합하여 반응 시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존활성을 다음 수식으로 산출하였다: 잔존활성(%)= A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성).
도 35는 IgG1-YTE 부착 MDTCS 절편 변이체의 정제액 조건에서의 혼합 중화항체에 대한 회피력을 확인한 결과를 나타낸다. 대조군인 MDTCS-IgG1-YTE와 5종의 후보 변이체를 정제액 4nM에 동일 비율로 혼합된 9종의 중화항체 (Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab66, Ab67)를 혼합하여 반응 시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존활성을 다음 수식으로 산출하였다: 잔존활성(%) = A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성).
도 36은 aTTP-mimic 마우스 모델을 이용한 중화항체 회피율 시험절차에 대한 모식도(도 36a) 및 변이체 후보물질들의 용량 별 ADAMTS13 잔존 활성(도 36b)을 각각 보여주는 그림이다.
도 37은 TTP-mimic 마우스 모델을 이용하여 가장 우수한 중화항체 회피율을 보인 DM2-IgG1-YTE의 농도별 ADAMTS13 잔존활성 유지력과 임상학적 증상의 시험절차에 대한 모식도(도 37a), 혈소판과 LDH 수치의 개선 및 ADAMTS13 활성(도 37b) 및 임상 증상 관찰 결과(도 37c)를 각각 보여주는 그림이다.
도 38은 cTTP 마우스 모델에 DM2-IgG1-YTE를 투여하여 혈액학적 그리고 임상학적 증상의 개선 여부와 인간 ADAMTS13 활성 회복 정도의 시험절차에 대한 모식도(도 38a) 및 혈소판과 LDH 수치의 개선 및 ADAMTS13 활성 회복을 관찰한 결과(도 38b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 2는 20 mM의 아르기닌이 존재하는 경우 액상 제형에서 NaCl 농도에 따른 SE-HPLC 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 120 mM의 NaCl 존재 하에서 수크로스의 농도 및 트레할로스의 첨가 여부에 따른 케익 성상(도 3a)과 SE-HPLC 결과(도 3b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 4는 수크로스와 증량제(bulking agents)인 만니톨 또는 글리신의 배합비에 따른 케익 성상(도 4a) 및 SE-HPLC 결과(도 4b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 5는 120 mM의 NaCl 존재 하에 글리신 농도에 따른 케익 성상을 비교한 그림이다.
도 6은 120 mM의 NaCl 존재 하에 아르기닌 농도에 따른 케익 성상을 비교한 그림이다.
도 7은 아르기닌이 첨가되지 않은 경우 NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 케익 성상(도 7a) 및 SE-HPLC 결과(도 7b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 8은 120mM의 아르기닌 존재 하에 NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 케익 성상(도 8a) 및 SE-HPLC 결과(도 8b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 9는 NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 40℃에서 1개월차의 순도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 5가지 아미노산 안정화제의 첨가에 따른 제형의 콜로이드 안정성을 평가하기 위해 B22 값을 측정한 결과를 나타내는 그림이다.
도 11은 7가지 안정화제(아미노산 6종 및 수크로스)를 첨가 후 상온에서의 단량체 회복 정도를 평가하기 위해 크기배제 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 수행한 결과를 보여주는 그림이다.
도 12는 20 mM의 아르기닌 첨가에 따른 대조군 대비 냉장 안정성을 SE-HPLC로 평가한 결과를 나타내는 그림이다.
도 13은 약리 성분인 단백질(ADAMTS-13)의 농도 및 아르기닌 농도에 따른 순도 및 안정성을 SE-HPLC로 평가한 결과를 나타낸 그림이다.
도 14는 폴리소르베이트 80 농도에 따른 교반-유도 응집의 방지효과를 성상 관찰(도 14a), 탁도(Turbidity) 측정(도 14b) 및 SE-HPLC(도 14c)를 통해 각각 보여주는 그림이다.
도 15는 폴리소르베이트 80 농도에 따른 액상 안정성을 SE-HPLC로 평가한 결과이다.
도 16은 폴리소르베이트 80 농도에 따른 동결건조 후의 제형 품질을 SE-HPLC(도 16a) 및 고차 응집체(Higher-order aggregates) 생성 여부(도 16b)를 통해 평가한 결과이다.
도 17은 pH에 따른 열 풀림(thermal unfolding, Tm) 측정 결과(도 17a) 및 열 응집(thermal aggregation, Tagg) 평가 결과(도 17b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 18은 CaCl2 농도에 따른 동결 건조 케익 성상(도 18a) 및 SE-HPLC 분석 결과(도 18b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 19는 NaCl 및 수크로스 농도에 따른 성상 평가 결과를 도식화한 그림(도 19a) 및 각 농도별 케익 성상(도 19b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 20은 NaCl 및 수크로스 농도에 따른 케익 성상을 보여주는 그림이다.
도 21은 아르기닌 농도에 따른 콜로이드 안정성 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 아르기닌 농도에 따른 케익 성상(도 22a) 및 순도(도 22b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 23은 본 발명에서 최종적으로 선정된 액상 제형 조성물의 물성을 보여주는 그림으로, 시간의 경과에 따른 순도 변화(도 23a), 역가 변화(도 23b), 단백질 농도 변화(도 23c) 및 탁도 변화(도 23d)를 각각 나타낸다.
도 24는 NaCl 및 수크로스 농도에 따른 장기 보관 안정성을 보여주는 그림으로, 보관 개시 시점과 6개월 경과 후의 순도(도 24a) 및 역가(도 24b) 변화를 각각 보여준다.
도 25는 중화항체와 결합하는 ADAMTS13의 각 도메인의 결합부위를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 25a는 ADAMTS13의 발현율 혹은 중화 항체의 결합 부위 확인을 위해 제작한, 다양한 도메인이 조합된 6종의 ADAMTS13 절편(혹은 야생형 전장 ADAMTS13)의 모식도를 나타낸다. 도 25b는 각 ADAMTS13 도메인에서 발현하는 단백질을 이용하여 단백질 A-세파로스와 각 중화항체를 섞어 면역침강한 뒤 항-V5 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과를 보여준다. Input은 도메인별 단백질의 발현 정도를 보여준다. 도 25c는 ADAMTS13 중화항체 결합 부위의 모식도로 Ab 4-16 항체는 S 도메인, Ab 67 항체는 D 도메인, Ab 66 항체는 T2-T8 도메인에 각각 특이적으로 결합함을 도식화한 그림이다.
도 26은 항-ADAMTS13 항체를 회피하거나 야생형 ADAMTS13보다 우수한 활성을 가지는 변이체의 선별 결과를 보여주는 그림이다. 야생형 클론과 ADAMTS13 변이체에서 Ab 4-16 항체(도 26a) 및 Ab 67 항체(도 26b)에 대한 회피율과 ADAMTS13 활성을 측정하였다. 상대활성은 야생형 클론 및 변이체의 비역가를 확인하여 다음수식에 대입함으로써 산출하였다: 상대활성 (%) = 변이체 비역가 / 야생형 ADAMTS13 비역가 X 100
도 27a-27b는 12종의 전장 ADAMTS13 변이체의 단일 중화항체 회피율을 확인한 결과이다. 12종의 전장 ADAMTS13 변이체에서 중화항체 7종(Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)에 대한 항체 회피율을 측정하였다. 중화항체 회피율은 WT ADAMTS13 수치와 비교하여 상대적 결합 수준을 확인한 후, 이를 이용하여 상대 회피율을 다음 수식에 대입하여 산출하였다: 회피율(%) = (1- 변이체 결합능/WT ADAMTS13 결합능) x 100
도 28a-28b는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 단일 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 선정된 12종 변이체를 MDTCS 절편화하여 Fc를 부착한 변이체와 선별된 변이 아미노산 잔기를 조합하여 2개의 아미노산 변이를 갖는 DM1, DM2 변이 2종을 포함한 총 14종의 변이체가 발현된 배양액을 이용하여 단일 중화항체 8종(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)의 중화항체 회피율과 ADAMTS13 상대 활성을 측정하였다. 회피율(%)=(1- 변이체 결합능/결합능) x 100; 상대활성(%)=변이체 비역가/WT ADAMTS13 비역가 x 100
도 29는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 혼합 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 대조군인 MDTCS-Fc와 12종의 후보 변이체를 발현하는 배양액 4nM에 동일 비율로 혼합된 9종의 중화항체(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab66, Ab67)를 혼합하여 반응시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존 활성을 다음 수식에 대입하여 산출하였다: 잔존활성(%) = A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성)
도 30a-30b는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체 배양액과 정제액 조건에서의 단일 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 12종의 변이체(1C03, 2B01, 2B02, 3B05, 4E11, 4H07, 5G08, 7A02, 8D01, 8D05, DM1, DM2)가 발현된 배양액 혹은 Phytip system으로 정제한 정제액을 이용하여 단일 중화항체 8종(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)에 대한 중화항체 회피율과 상대 활성을 측정하였다(도 30a 및 30b). 해당 정제액의 농도는 Fc ELISA를 통해 확인하였다. 회피율(%)=(1- 변이체 결합능/MDTCS-Fc 결합능) x 100, 상대활성 (%) = 변이체 비역가/ MDTCS-Fc 비역가 x 100. 파란색 바(bar)는 정제된 변이 단백질을, 회색 바는 발현된 변이 단백질의 중앙값을 각각 나타낸다.
도 31은 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체의 배양액과 정제액 조건에서의 혼합 중화항체 회피력을 확인한 결과이다. 대조군인 MDTCS-Fc와 12종의 후보 변이체를 발현하는 배양액 혹은 정제액 4 nM에 동일 비율로 혼합된 8종의 중화항체(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)를 혼합하여 반응 시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존활성을 측정하였다. 잔존 활성은 아래 수식에 대입하여 산출하였다. 잔존활성 (%) = A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성)
도 32는 Fc 부착 MDTCS 절편 변이체의 약동학 결과를 보여주는 그래프이다. MDTCS 혹은 Fc(IgG1-YTE)가 부착 되어있는 MDTCS 및 4개 최종 후보 변이체(1C03, 5C09, 7A02, DM2) 절편 단백질을 마우스에 꼬리 정맥에 투여한 후 시간 별로 혈장을 확보하였다. 각 물질의 비역가를 기준으로 160 IU/kg가 되도록 투여하였고 활성 어세이를 통해 각 시간별로 확보한 혈장 내 잔존하는 물질의 활성을 측정하였다.
도 33은 IgG1-YTE 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 단일 중화항체에 대한 회피력을 확인한 결과이다. 선정된 5종 변이체를 MDTCS 절편화하여 IgG1-YTE를 부착한 변이체가 발현된 배양액을 이용하여 단일 중화항체 8종 (Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab67)의 중화항체 회피율과 상대 활성을 측정하였다(도 33a 및 33b). 회피율(%)=(1-변이체 결합능/ MDTCS-IgG1-YTE 결합능) x 100, 상대활성(%) = 변이체 비역가/MDTCS-IgG1-YTE 비역가 x 100.
도 34는 IgG1-YTE 부착 MDTCS 절편 변이체를 발현하는 배양액 조건에서의 혼합 중화항체에 대한 회피력을 확인한 결과이다. 대조군인 MDTCS-IgG1-YTE와 5종의 후보 변이체를 발현하는 배양액 4nM에 동일 비율로 혼합된 9종의 중화항체 (Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab66, Ab67)를 혼합하여 반응 시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존활성을 다음 수식으로 산출하였다: 잔존활성(%)= A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성).
도 35는 IgG1-YTE 부착 MDTCS 절편 변이체의 정제액 조건에서의 혼합 중화항체에 대한 회피력을 확인한 결과를 나타낸다. 대조군인 MDTCS-IgG1-YTE와 5종의 후보 변이체를 정제액 4nM에 동일 비율로 혼합된 9종의 중화항체 (Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab66, Ab67)를 혼합하여 반응 시킨 후, 각 후보 변이체의 잔존활성을 다음 수식으로 산출하였다: 잔존활성(%) = A ÷ B x 100 (A: 혼합 중화항체 조건에서의 활성, B: 중화항체 처리하지 않은 조건에서의 활성).
도 36은 aTTP-mimic 마우스 모델을 이용한 중화항체 회피율 시험절차에 대한 모식도(도 36a) 및 변이체 후보물질들의 용량 별 ADAMTS13 잔존 활성(도 36b)을 각각 보여주는 그림이다.
도 37은 TTP-mimic 마우스 모델을 이용하여 가장 우수한 중화항체 회피율을 보인 DM2-IgG1-YTE의 농도별 ADAMTS13 잔존활성 유지력과 임상학적 증상의 시험절차에 대한 모식도(도 37a), 혈소판과 LDH 수치의 개선 및 ADAMTS13 활성(도 37b) 및 임상 증상 관찰 결과(도 37c)를 각각 보여주는 그림이다.
도 38은 cTTP 마우스 모델에 DM2-IgG1-YTE를 투여하여 혈액학적 그리고 임상학적 증상의 개선 여부와 인간 ADAMTS13 활성 회복 정도의 시험절차에 대한 모식도(도 38a) 및 혈소판과 LDH 수치의 개선 및 ADAMTS13 활성 회복을 관찰한 결과(도 38b)를 각각 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: ADAMTS13 단백질의 제형 성분의 선별
하기 실시예 3에서 후술하는 ADAMTS13 단백질에 대한 액상 제형 조성물의 각 성분과 함량을 아래와 같은 과정을 통해 결정하였다.
동결건조 공정
제형화가 완료된 각 샘플 용액을 글래스 바이알(3 ml)에 1.0ml씩 분주하고, 고무마개로 반타전 후 동결 건조기(Freeze dryer, Lyostar 3, SP scientific) 선반 위에 로딩하였다. 이후, 하기 표 1의 조건으로 동결 건조를 진행하고, 제조된 동결 건조 제제는 동결 건조 완료 후 알루미늄 캡(Aluminum cap)으로 캡핑하였다.
| 단계 | 구분 | Rate/hold | 선반온도 | 시간(min) | 진공도(mTorr) |
| 1 | 로딩 | Hold | 5℃ | 20 | N/A |
| 2 | 동결 | Rate | -55℃ | 200 | N/A |
| 3 | 동결 | Hold | -55℃ | 300 | N/A |
| 4 | 1차 가온 | Rate | -25℃ | 100 | 60 |
| 5 | 1차 건조 | Hold | -25℃ | 2000 | 60 |
| 7 | 2차 가온 | Rate | 25℃ | 167 | 50 |
| 8 | 2차 건조 | Hold | 25℃ | 600 | 50 |
제조된 동결 건조 제제의 안정성은 1.0 ml 증류수로 재구축(reconstitution) 한 후 분석을 수행하였다.
크기 배제 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)
크기 배제 크로마토그래피 수행을 위해 검체를 이동상(1 x PBS, Lonza)으로 1.0 mg/ml가 되도록 희석한 후(1.0 mg/mml 이하 시 희석없이 진행) 멸균 여과하고, 여과된 검체 200μL를 바이알 인서트(vial insert)에 주입 후 스크류탑 바이알(screw top vial)에 끼워서 준비하였다. 이후 이동상을 펌프에 연결한 뒤, Waters e2695와 Waters 2489 기기(일본 Waters사)에 0.5 mL/min의 유속으로 이동상을 흘려주며 분석 컬럼(TSKgel G3000SWXL, Tosoh)을 장착하였다. 0.5mL/min 속도로 이동상을 30분 이상 흘려주어 검출 신호(detector signal)가 안정화 될 때까지 평형에 도달시키고, 오토샘플러의 온도가 4℃로 떨어지면 검체를 샘플러에 꽂았다. 검체 30μL를 주입한 뒤 이동상으로 35분 간 흘려주어 280 nm에서 검출 피크(detection peak)를 확인하였다. 이후 PC의 Empower Pro software로 분석을 수행하였다.
콜로이드 안정성 (B
22
)
단백질-단백질 상호작용 정도가 응집과 용해도 등에 영향을 미치기 때문에 콜로이드 안정성은 단백질 제형의 개발에 있어 반드시 고려되어야 하는 중요한 항목이다. 대표적인 콜로이드 안정성 지표인 B22(second virial coefficient)를 활용하였으며, 일반적으로 B22값이 큰 양의 값을 띌 경우, 단백질 간 반발력(repulsion force)이 강하여 응집이 발생한 확률이 줄어들게 된다.
분석하고자 하는 검체를 5가지 농도(1.2, 0.96, 0.72, 0.48 및 0.24 mg/ml)로 희석하여 준비한 뒤, 희석된 검체 8.8 μL를 Uni sample loader(Unchained Labs)에 3회 반복하여 주입하였다. 각 해당 농도에서의 산란광 세기(scattered light intensities)를 측정하고 플라시보 완충액의 산란광 세기를 빼준 뒤 Zimm 공식을 통해 최종적인 B22값을 계산하였다(4). 형광 데이터 분석은 UNcle Analysis 소프트웨어(Unchained Labs)를 사용하였다.
탁도(Turbidity) 분석
탁도는 Lunatic(Unchained Labs)으로 분석하였으며, 샘플 2.0 μL를 Lunatic 플레이트(Unchained Labs)에 주입하고 350nm에서의 탁도를 측정하였으며, 플라시보 완충액의 탁도는 샘플의 탁도 값에서 빼서 최종값을 계산하였다.
열 풀림 및 열 응집체 형성 (Thermal unfolding and thermal aggregation) 분석
온도가 높아짐에 따라 단백질이 풀릴 때(unfolding) 표면에 노출된 트립토판에 의한 방출(emission) 파장을 검출함으로써 단백질이 풀린 정도를 측정할 수 있다. 이와 같은 고유 형광 강도에 기반한 시차 주사 형광측정법(differential scanning fluorimetry) 분석을 위해 UNCLE(Unchained Labs) 장비를 사용하였다. 상기 장비를 이용하여 단백질의 열 안정성을 분석하기 위해 Tm(Thermal unfolding) 및 Tagg(Thermal aggregation)를 다음과 같이 측정하였다:
검체 8.8 μL를 Uni 샘플 로더(Unchained Labs)에 2회 반복 주입 후 온도를 25℃부터 1℃/min 속도로 95℃까지 증가시켰다. 온도를 증가시키면서 266nm의 여기 파장(Excitation wavelength)에 의해 방출되는 파장(250-720nm)의 강도를 측정하였다. 형광 데이터 분석(Fluorescence data analysis)은 UNCLE Analysis 소프트웨어(Unchained Labs)를 사용하였다.
상기 분석을 통해 형광 방출 피크의 최대값 시점의 온도를 Tm으로 정의하고, 단백질의 266 nm (SLS266)에서의 정적 광산란(static light scattering)을 측정하여 단백질 응집이 시작되는 시점의 온도(protein aggregation onset temperature)를 Tagg으로 정의하였다.
NaCl 농도에 따른 동결건조 조성물의 품질 평가
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 0.05% PS80를 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 50, 100, 120, 150, 200 및 300 mM 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결 건조하여 케익 성상을 관찰하고 SE-HPLC 분석을 수행g나 결과, NaCl 농도가 증가될수록 보다 견고하고 우수한 케익 성상을 보인 반면(도 1a), SE-HPLC 결과 NaCl 농도에 따른 주요할 만한 순도 차이는 관찰되지 않았다(도 1b).
NaCl 농도에 따른 액상 안정성 평가
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 20mM 아르기닌을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 0, 40, 80, 120 및 160 mM 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 액상 샘플을 상온에서 보관하며, 4, 8, 12시간이 되는 시점마다 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 NaCl의 농도가 높을수록 액상 안정성이 개선됨을 확인하였다.
당 농도에 따른 동결건조 조성물의 품질 평가 (NaCl 120mM)
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 120 mM NaCl, 20mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 0.05% PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 0.0, 0.5, 1.0 및 2.0 %(w/v) 농도의 수크로스 또는 1.0 %(w/v) 농도의 트레할로스를 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰하고 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, NaCl 120mM에서는 수크로스 1.0% 첨가 시엔 붕괴(collapse)가 발생하지 않았지만 2.0% 첨가 시 붕괴가 발생하여 붕괴가 개시되는 수크로스 농도는 1.0 - 2.0% 사이로 예측되었다(도 3a). 트레할로스 1.0% 첨가 제형은 수크로스 1.0% 첨가 제형과 유사한 성상을 보였다(도 3a). 한편, SE-HPLC 결과 첨가되는 당 농도에 따른 유의한 순도 차이는 관찰되지 않아 붕괴가 발생하여도 순도는 유지됨을 알 수 있었다(도 3b).
수크로스와 증량제(bulking agent)의 함량비에 따른 동결건조 조성물의 품질 평가(NaCl 120mM)
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 120 mM NaCl, 20mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 0.05% PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 수크로스와 증량제(만니톨, 글라이신)를 각각 1.0 / 3.0(w/v) (함량비 1:3)과 2.0 / 2.0 %(w/v)(함량비 1:1)로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰하고 및 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, NaCl을 120mM로 고정하고 수크로스 대 증량제의 함량비를 1:3 및 2:2로 첨가한 경우 모두 붕괴가 발생하였으며(도 4a), SE-HPLC 결과 시료 간 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 4b).
글라이신 농도에 따른 동결건조 품질 평가 (NaCl 120mM)
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 120mM NaCl, 수크로스 1.0%, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 0.05% PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 글라이신을 0, 20, 40, 60, 80 및 100 mM 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰하고 및 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, NaCl 120mM과 수크로스 1.0%가 고정적으로 첨가되고 글라이신의 농도를 증가시킬 경우 케익 성상에 부정적인 영향을 미치며, 글라이신을 60mM 이상 첨가 시 완전히 붕괴됨을 알 수 있었다(도 5).
아르기닌 농도에 따른 동결건조 품질 평가 (NaCl 120mM)
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 120mM NaCl, 수크로스 1.0%, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 0.05% PS80을 포함하는 pH7.4의 조성물에 아르기닌을 0, 20, 60 및 100 mM의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰하고 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, NaCl 120mM 및 수크로스 1.0%가 고정적으로 첨가되고 아르기닌 농도를 증가시킬 경우 케익 성상에 부정적인 영향을 미치며, 아르기닌을 60mM 이상 첨가 시 완전히 붕괴되었다(도 6).
NaCl과 수크로스의 함량비에 따른 동결건조 품질 평가 (w/o 아르기닌)
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 0.05% PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 120, 160 및 200 mM의 농도로, 수크로스를 1.0, 1.5 및 2.0 %(w/v)의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰하고 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, NaCl 농도가 증가될수록, 수크로스 농도가 감소될수록 양호한 케익 성상을 보였는데, 구체적으로 i) NaCl 120mM 첨가한 경우 수크로스 1.0-1.5% 범위 내에 붕괴 개시 시점이 존재하며, ⅱ) NaCl 160mM 첨가한 경우 수크로스 1.5-2.0% 구간에서, ⅲ) NaCl 200mM 첨가한 경우 수크로스 2.0% 초과 구간에서 각각 붕괴가 개시되는 것으로 확인되었다(도 7a).
한편 SE-HPLC 결과 아르기닌이 첨가되지 않은 경우에는 NaCl과 수크로스 함량비에 따른 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 7b).
NaCl과 수크로스의 함량비에 따른 동결건조 품질 평가 (아르기닌 120mM)
공통 조성으로 0.5 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2, 0.05% PS80 및 120mM 아르기닌을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 160, 200, 240 및 280 mM의 농도로, 수크로스를 0.0, 0.5 및 1.0 %(w/v)의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결 건조하여 케익 성상을 관찰하고 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, 아르기닌 120mM로 고정 첨가한 경우, NaCl 농도는 증가될수록, 수크로스 농도는 감소될수록 견고한 케익 성상이 나타났으며, 구체적으로 i) NaCl 160mM 첨가한 경우 수크로스 0.0-0.5% 이상 첨가 구간에서, ⅱ) NaCl 200mM 첨가한 경우 수크로스 1.0% 초과 첨가 구간에서, ⅲ) NaCl 240mM 첨가한 경우 수크로스 1.0% 초과 첨가 구간에서, ⅳ) NaCl 280mM 첨가한 경우 수크로스 1.0% 초과 첨가 구간에서 각각 붕괴 개시 시점이 존재함을 알 수 있었다(도 8a).
한편, SE-HPLC 결과 아르기닌 120mM가 포함된 경우 NaCl 및 수크로스 농도에 따른 주목할 만한 순도 변화는 확인되지 않았으나, NaCl 160mM 및 수크로스 미첨가 제형에서 순도 97.4%로 다른 시료 대비 상대적으로 낮은 결과를 보였다(도 8b).
NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 동결건조 안정성 평가 (아르기닌 120mM)
공통 조성으로 0.5 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2, 0.05% PS80 및 120mM 아르기닌을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 200, 240 및 280 mM의 농도로, 수크로스를 0.0, 0.5 및 1.0 %(w/v)의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결 건조하여 가속 안정성(40℃)를 평가한 결과, 120mM 아르기닌 존재 하에서 NaCl 대 수크로스 배합비에 따라 40℃ 1개월차 순도는 초기 대비 유의한 변화가 나타나지 않았다(도 9).
안정제 5종에 대한 콜로이드 안정성 평가(UNCLE, B
22
)
안정제 5종에 대한 콜로이드 안정성을 평가하기 위해 공통조성으로서 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2, 120mM NaCl, 1.0% 수크로스를 포함하는 pH 7.4의 조성물에 아미노산으로서 글라이신, 라이신, 프롤린, 알라닌 또는 아르기닌을 각 100mM 포함시켰다.
제형화가 완료된 각 조성물의 액상 샘플을 UNCLE 기기를 활용하여 콜로이드 안정성(B22)을 분석하였다.
B22 값이 양의 값으로 커질수록 단백질끼리 서로 뭉치지 않고 잘 분산되어 있음을 의미하므로, 도 10에서 보는 바와 같이 콜로이드 안정성은 아르기닌 > 글라이신 > 프롤린 > 알라닌 > 라이신 > 대조군 순으로 확인되었다.
안정제 7종에 대한 SE-HPLC평가
공통 조성으로서 0.9 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 2.0 mM CaCl2 및 120 mM NaCl를 포함하는 pH 7.4의 조성물에 아미노산 안정화제로서 아르기닌, 세린, 발린, 트레오닌, 프롤린 또는 글라이신을 각 100mM 포함시키거나 또는 당 안정화제로서 수크로스를 1.0 w/v%를 포함시켰다.
제형화가 완료된 각 조성물의 액상 샘플을 상온에서 7시간 보관 후 SE-HPLC 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 비교실험을 진행한 7종의 안정화제에 의한 액상 안정성은 역시 아르기닌이 가장 우수하였으며, 안정성 및 순도는 아르기닌 > 수크로스 > 프롤린 > 글라이신 > 발린, 트레오닌 > 대조군 > 세린의 순서로 높았다.
아르기닌 첨가에 따른 액상 안정성 평가
0.049 mg/mL ADAMTS 단백질, 15 mM 인산나트륨, 50mM NaCl을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 20mM 아르기닌의 첨가 여부에 따른 액상 안정성을 평가하기 위해 제형화가 완료된 액상 샘플을 상온에서 3시간 및 19시간 보관 후 각 분석 시점마다 SE-HPLC 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이 아르기닌 20mM 첨가 시 대조군 대비 5℃에서의 냉장 안정성이 현저히 개선됨을 확인하였다.
목적 단백질 농도 및 아르기닌 농도에 따른 액상 안정성 평가
SE-HPLC 분석
공통 조성으로서 20 mM 히스티딘, 4.0 mM CaCl2 및 160 mM NaCl를 포함하는 pH 7.4의 조성물에 ADAMTS 단백질을 각각 0.2, 0.6 및 1.0 mg/ml로 포함시키고, 아르기닌을 20, 80 및 140 mM 농도로 포함시킨 액상 샘플의 안정성을 평가하였다.
제형화가 완료된 시료를 상온에서 18시간 보관 후 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, 도 13a에서 보는 바와 같이 목적 단백질의 농도가 감소될수록, 아르기닌 농도가 증가될수록 순도가 개선됨을 확인하였다.
DOE 설계
한편, 아르기닌과 목적 단백질의 최적 농도를 보다 면밀하게 탐색하기 위해 DOE (Design Of Experiments)를 수행하였다. 아르기닌 농도 및 ADAMTS 단백질 농도라는 2개의 작동 파라미터를 요인(X 값)으로 설정하고 순도(SE-HPLC)를 반응(Y 값)으로 설정한 후 JMP® 10.0 통계 프로그램을 사용하여 DOE 설계를 실시하였다. 구체적으로, RSM(Response Surface Model)을 이용하였으며, CCD(Central Composite Design) 타입으로 축점을 설정하였다. 최종적으로 “2수준의 full factorial design 4 Runs + 중심점 1 Run + 2개의 인자에 대한 축점 4 Runs”을 포함한 총 9 Run의 조건을 설계하였다.
시료 원액(1.1 mg/mL)을 DOE 조건에 맞게 아르기닌을 첨가하고 희석한 뒤 상온(약 15~25℃)에서 18시간 방치한 후, SE-HPLC 분석을 수행하였다.
DOE 통계분석은 단계적 회귀분석(Stepwise regression)을 활용한 다중회귀분석을 통해 수행하였으며, 모델의 확립은 반응표면 모델링(Response surface modeling) 방식을 따랐다. 분석은 JMP의 Fit model 방법을 이용하였으며, 모델에 사용되는 효과(effect)로는 2개의 주효과, 2차 교호작용, 각 주효과의 제곱항을 포함시켰다. 유의하지 않은 요인을 제거하고 유의한 항을 선정하기 위한 정지 규칙(Stopping Rule)은 P-값 역치를 사용하였다(P 값≤0.25, direction: Mixed).
분석 결과, 모델식의 R square는 0.96이며 R square 수정은 0.94이다. 모델식의 ANOVA(analysis of variance)의 P-값은 유의수준 0.05보다 작은 0.0006 로 본 모델의 유의성을 확인할 수 있었다.
유의 수준 α=0.05 보다 낮은 P-값을 가져서 유의하다고 판단되는 요인은 주효과인 단백질 농도와 주효과인 아르기닌 농도이다. 아르기닌*아르기닌 곡률에 대한 P-값은 0.0765로써 유의 수준 α=0.05에 근접한 수치를 보였다(도 13b).
예측 프로파일러(Prediction profiler) 분석 결과 아르기닌 120 mM 부근에서 단량체 % 값이 가장 높아 100 내지 140 mM가 아르기닌의 최적 농도임을 알 수 있었다(도 13c).
폴리소르베이트 80 농도에 따른 교반(agitation)-유도 응집 방지
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 20mM 히스티딘, 4.0mM CaCl2, 120mM NaCl 및 1.0% 수크로스를 포함하는 pH 7.4의 조성물에 폴리소르베이트 80을 0.0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05 및 0.1 %(v/v)의 농도로 각각 첨가하였다. 제형화가 완료된 액상 샘플을 볼택싱하여 인위적인 전단 응력를 발생시킨 후 분석(성상, 탁도, SE-HPLC)을 수행하였으며, 교반 개시 후 30초 및 2분에 샘플링하여 분석하였다. 교반 2분 경과 후 성상 분석 결과 폴리소르베이트 80을 0.005% 이상 첨가 시 시료가 맑고 투명해짐을 확인하였다(도 14a).
한편, 폴리소르베이트 80을 0.005% 이상 첨가 시 초기 대비 탁도 변화가 없음을 확인함으로써 교반-유도 응집이 발생하지 않았음을 알 수 있었다(도 14b). 아울러 SE-HPLC 결과 폴리소르베이트 80을 0.05% 이상 첨가 시 초기 대비 5% 이내 수준의 순도 감소가 발생함을 확인하였다(도 14c).
폴리소르베이트 80 농도에 따른 액상 안정성 평가
공통 조성으로 0.5mg/ml ADAMTS 단백질, 20mM 히스티딘, 4.0mM CaCl2, 120 mM NaCl 및 1.0% 수크로스를 포함하는 pH 7.4의 조성물에 폴리소르베이트 80을 0.0, 0.005, 0.01, 0.05 및 0.09 %(v/v) 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 액상 샘플을 상온에서 6시간 보관 후 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, 폴리소르베이트 80 농도가 증가될수록 액상 안정성(순도)은 소폭 감소됨을 확인하였다(도 15).
폴리소르베이트 80 농도에 따른 동결건조 품질 평가
공통 조성으로 0.5mg/ml ADAMTS 단백질, 20mM 히스티딘, 4.0mM CaCl2, 120mM NaCl 및 1.0% 수크로스를 포함하는 pH 7.4의 조성물에 폴리소르베이트 80을 0.0, 0.005, 0.01, 0.05 및 0.09 %(v/v) 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 액상 샘플을 동결건조 후 SE-HPLC 분석을 수행한 결과, 폴리소르베이트 80 농도가 증가 될수록 동결건조 공정에 의한 순도 손실 방지 효과가 커지고, 0.01% 이상 첨가 시 94% 이상의 단량체 회복을 확인하였다(도 16a). 아울러, 폴리소르베이트 80 농도가 증가할수록 고차 응집체(Higher-order aggregates) 생성이 효율적으로 차단되었다(도 16b).
pH에 따른 열 풀림(Thermal unfolding) 및 열-응집 평가
공통 조성으로 20mM 히스티딘, 4mM CaCl2 및 0.05% PS80을 포함하며 pH만 6.0, 6.5, 7.0, 7.2 및 7.4으로 상이한 Diafiltration 버퍼를 미리 제조한 후, ADAMTS 단백질이 포함된 용액과 버퍼교환 과정을 거쳐 샘플을 제조하였다. (Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Units 30K 사용, 원심분리는 냉장조건에서 3000rpm으로 수행)
버퍼교환이 완료된 샘플의 공통조성은 10mg/ml ADAMTS 단백질, 20mM 히스티딘, 4mM CaCl2 및 0.05% PS80이며 pH는 각각 6.0, 6.5, 7.0, 7.2 및 7.4이다.
제형화가 완료된 액상 샘플을 UNCLE 기기를 활용하여 Tm및 Tagg분석 수행한 결과, 단백질의 구조적 열안정성과 비례하는 Tm(thermal unfolding) 값은 pH가 높을수록 증가되며, pH 6.0에서는 타 실험군 대비 낮은 Tm값을 보임을 확인하였다(도 17a). 불안정한 응집 발생 정도를 반영하는 열 응집(thermal aggregation, Tagg)의 경우, pH가 높을수록 Tagg 값이 증가됨을 확인하였으며, pH 6.0 및 pH 6.5에서는 타 실험군 대비 낮은 Tagg 값을 보였다(도 17b).
CaCl
2
농도에 따른 동결건조 품질 평가
공통 조성으로 1.2 mg/ml ADAMTS 단백질, 20 mM 히스티딘, 120mM NaCl, 1.0% 수크로스 및 0.05% PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 2.0, 4.0 및 8.0 mM 농도의 CaCl2를 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조 하여 SE-HPLC 분석 수행한 결과, CaCl2 농도에 관계없이 부분적으로 붕괴된 성상을 보였으며(도 18a), SE-HPLC 분석 결과 CaCl2 농도가 증가될수록 순도가 개선됨을 확인하였다(도 18b).
실시예 2: ADAMTS13 단백질의 제형 성분의 추가 최적화
NaCl 대 수크로스 배합비에 따른 동결건조 품질 평가
공통조성으로 0.36 mg/ml의 ADAMTS 단백질, 히스티딘 20 mM, CaCl2 4mM, L-Arg 120mM 및 0.05%의 PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 100, 150, 200, 250, 300, 350 및 400 mM의 농도로, 수크로스를 0, 0.5, 1 및 1.5 %(w/v)의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰하고 공정 전, 후의 순도를 SE-HPLC로 분석하였다. 그 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 NaCl과 수크로스 함량비에 따른 유의한 순도 변화는 관찰되지 않아 실험한 모든 범위에서 우수한 순도를 유지함을 알 수 있었다.
| 구분 | NaCl (mM) | |||||||
| 100 | 150 | 200 | 250 | 300 | 350 | 400 | ||
|
수크로스
(%) |
0 | 100.6 | 100.8 | 100.3 | 100.1 | 99.4 | 99.8 | 100.0 |
| 0.5 | 100.7 | 100.9 | 100.3 | 100.2 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | |
| 1 | 100.7 | 100.9 | 100.4 | 100.2 | 100.2 | 99.9 | 99.9 | |
| 1.5 | 100.1 | 101.0 | 100.1 | 100.2 | 100.2 | 100.0 | 100.0 | |
단, 도 19a 및 도 19b에서 보는 바와 같이, NaCl 농도가 증가할수록, 수크로스가 농도가 감소할수록 양호한 케이크 성상을 보임을 확인할 수 있었다.
수크로스 고농도 처리에 따른 동결건조 품질 평가
공통조성으로 0.36 mg/ml의 ADAMTS 단백질, 히스티딘 20 mM, CaCl2 4mM, L-Arg 120mM 및 0.05%의 PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 200, 250 및 300mM 농도로, 수크로스를 1.5 및 2.5 %의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰한 결과, 도 20에서 보는 바와 같이 NaCl 농도가 증가할수록, 수크로스가 농도가 감소할수록 양호한 케이크 성상을 나타냄을 확인할 수 있었다.
아르기닌 농도에 따른 콜로이드 안정성 평가 (B
22
,kD)
공통조성으로 0.36 mg/ml의 ADAMTS 단백질, 히스티딘 20 mM, CaCl2 4mM, NaCl 280mM, 수크로스 1% 및 0.05%의 PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 아르기닌을 40, 80, 120, 160 및 200 mM의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 액상 샘플을 UNCLE 기기를 활용하여 콜로이드 안정성(B22, kD)을 분석하였다. B22와 kD 값이 양의 값으로 커질수록 단백질 간 응집 없이 양호하게 분산되어 있음을 의미하는데, 도 21에서 보는 바와 같이 아르기닌 120 mM에 가까울수록 우수한 콜로이드 안정성을 나타냄을 확인하였다.
아르기닌 농도에 따른 동결건조 품질 평가
공통조성으로 0.36 mg/ml의 ADAMTS 단백질, 히스티딘 20 mM, CaCl2 4mM, NaCl 280mM, 수크로스 1% 및 0.05%의 PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 아르기닌을 40, 80, 120, 160 및 200 mM의 농도로 첨가하였다. 제형화가 완료된 샘플을 동결건조하여 케익 성상을 관찰하고 SE-HPLC로 순도를 분석하였다. 그 결과, 아르기닌 농도가 80 mM 및 120 mM의 경우 케?? 성상이 우수함을 확인할 수 있었으나(도 22a), 아르기닌 농도에 따른 주요할 만한 순도 차이는 관찰되지 않았다(도 22b).
GC1126A 최종 액상 제형에 대한 보관 시간 및 온도 안정성
0.36 mg/ml의 ADAMTS 단백질, 히스티딘 20 mM, CaCl2 4mM, L-Arg 120 mM, NaCl 280 mM, Sucrose 1 % 및 0.05%의 PS80를 포함하는 pH 7.4의 제형화 완료된 액상 샘플을 상온(25℃)과 냉장(4℃) 조건에서 각각 보관 후 순도(SE-HPLC), 역가(ADAMTS13 활성), 단백질 농도(UV) 및 탁도 분석을 수행함으로써 경시 변화를 확인하였다. 그 결과, 순도의 경우 상온 보관 3일부터 초기 대비 약 4% 순도 감소를 보였으며, 보관 7일에는 초기 대비 약 15% 순도 감소를 보였고, 냉장 보관 7일까지 경시 변화 관찰되지 않았다(도 23a).
역가 변화를 관찰한 결과 상온 보관 7일에서 초기 대비 약 50%의 역가 감소를 보였으며, 역가 분석 편차를 고려했을 때, 냉장 보관 7일까지 뚜렷한 경시 변화가 관찰되지 않았다(도 23b).
단백질 농도의 경우, 상온 보관 3일부터 초기 대비 단백질 농도가 증가하였는데, 이는 입자의 응집으로 인해 시료의 불투명도가 증가함으로서 UV 흡광도가 증가한 결과로 판단된다. 냉장 보관 7일까지 경시 변화가 관찰되지 않았다(도 23c).
한편, 최종 액상 제형의 탁도는 상온 보관 3일부터 증가하는 양상을 보였으나 냉장 보관 7일까지 경시 변화가 관찰되지 않았다(도 23d).
NaCl 및 수크로스 농도의 최적화
공통조성으로 0.5 mg/ml의 ADAMTS 단백질, 히스티딘 20 mM, CaCl2 4mM, L-Arg 120mM 및 0.05%의 PS80을 포함하는 pH 7.4의 조성물에 NaCl을 200, 240 및 280 mM의 농도로, 수크로스를 0, 0.5 및 1 %의 농도로 첨가하였다.
NaCl 및 수크로스의 최적 농도 탐색을 위해 DOE (Design Of Experiments)를 수행하였다. NaCl 및 수크로스 농도라는 2개의 작동 파라미터를 요인(X 값)으로 설정하고 순도(SE-HPLC)와 역가(ADAMTS13 활성)를 반응(Y 값)으로 설정한 후 JMP® 10.0 통계 프로그램을 사용하여 DOE 설계를 실시하였다. 실험설계를 위해 완전요인배치법(full factorial design)을 이용하였으며, 중심점 2개를 포함하였다. 최종적으로“2 수준의 full factorial design 4 Runs + 중심점 2 Runs”를 포함하여 총 6개의 조건을 설계하였다.
| Run | X | |
| NaCl (mM) | 수크로스 | |
| 1 | 280 | 0 |
| 2 (중심점) | 240 | 0.5 |
| 3 | 280 | 1 |
| 4 | 200 | 0 |
| 5 | 200 | 1 |
| 6 (중심점) | 240 | 0.5 |
사전에 설계된 조건에 맞게 제형 완충액을 제조하고 원액과 혼합하여 최종원액을 제조하였다. 제조된 제형은 3 ml 바이알에 1 ml씩 분주하여 동결건조하였으며, 동결건조 완료된 검체는 냉장보관(5℃)하고 6개월 뒤 품질 분석을 실시하였다.
DOE 통계 분석은 단계적 회귀분석(Stepwise regression)을 활용한 다중회귀분석을 진행하였다. 분석(Analyze)은 JMP의 'Fit model' 방법을 이용하였으며, 모델에 사용되는 효과(effect)로는 2개의 주효과, 2차 교호작용, 각 주효과의 제곱항을 포함시켰다. 유의하지 않은 요인을 제거하고 유의한 항을 선정하기 위한 정지규칙(stopping rule)은 p-값 역치를 사용하였다(P 값≤0.25, direction: Mixed).
분석 결과, 모든 실험 조건에서 6개월 간 양호한 순도를 보여 NaCl, sucrose 농도에 따른 순도 차이는 확인되지 않았다(도 24a). 아울러, 각 실험군의 초기 역가 대비 6개월 경과 뒤의 역가는 분석 편차 이내로서 유의한 차이를 보이지 않았다(도 24b).
실시예 3: ADAMTS13 단백질 변이체의 제작
본 발명자들은 무작위 돌연변이법을 이용하여 aTTP 환자가 가지고 있는 ADAMTS13 중화항체를 효율적으로 회피할 수 있는 인간 ADAMTS13 변이체 제작하고자 하였다. MDTCS 부분 혹은 S 도메인에 돌연변이를 갖는 변이체가 ADAMTS13의 중화항체를 회피할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 인간 ADAMTS13에 대한 서로 다른 에피토프를 인식하는 항체에 대해 Bio-Rad사 HuCAL 시스템을 이용하여 Fab을 제작하였으며, 인간 ADAMTS13에 대한 결합력이 우수한 16종을 선별하였다. 각 항체의 결합 영역은 도 25c에 나타낸 바와 같이 Ab 4-16은 S 도메인, Ab 67은 MDTCS 부분, Ab 66은 C-말단부(TSP-2 부터 TSP-8 도메인)에 특이적으로 결합한다.
변이체의 평가는 야생형 ADAMTS13 컨스트럭트와 무작위 돌연변이 생성을 통해 제작된 변이체 중 야생형 ADAMTS13과 동일한 아미노산 서열을 갖는 비-돌연변이 혹은 침묵 돌연변이 변이체(이하 야생형 클론)에 대한 상대적 결과 분석을 통해 진행되었다. 총 59개의 야생형 클론에 대해 활성 및 Ab 4-16, Ab 67의 결합력을 분석하였고, 각 야생형 클론의 분석 결과를 야생형 ADAMTS13 컨스트럭트의 결과값을 기준으로 상대화하여 도 26에 나타내었다. 도 26에서 보는 바와 같이, 보전적 아미노산 치환을 포함하는 야생형 ADAMTS13(59 종), 돌연변이된 ADAMTS13(304 종) 및 선정된 ADAMTS13(26 종)에 대한 Ab 4-16 및 Ab 67 항체에 대한 회피율 및 상대활성을 나타내었다. 야생형 클론은 변이가 없음에도 불구하고 야생형 ADAMTS13 컨스트럭트 결과 값과 상대적인 결과 차이를 보였고, 돌연변이된 ADAMTS13(304 종) 중에서 하기의 표 4에 나타낸 바와 같이 특정 수치의 회피율 또는 상대활성 이상의 값을 갖는 26 종의 돌연변이 ADAMTS13이 선별되었다.
구체적으로, 돌연변이된 ADAMTS13의 Ab 4-16 회피율은 -29.5% 내지 33.4%의 범위를 나타내었고, Ab 67 회피율은 -24.4% 내지 30.5%의 범위를 나타내었으며, 상대활성의 경우 62.7% 내지 128.9%의 범위를 나타내었다(표 4). Three-sigma rule을 이용한 정규분포를 적용한 결과, Ab 4-16 회피율의 경우 -34.1% 내지 38.5%, Ab 67 회피율의 경우-38.5% 내지 42.3% 그리고 상대 활성의 경우 47.0% 내지 145.2%의 범위로 WT 클론은 거의 모든 결과가 이 분포도 내에 존재할 것이라 예상하였다. 따라서 변이체 선별에 있어 three-sigma의 최대값을 기준으로 Ab 4-16 회피율이 38.5% 초과, Ab 67 회피율이 42.3% 초과 또는 상대활성이 47.0% 이상을 선정 기준으로 적용하였다.
| 카테고리 | Ab 4-16 회피율 | Ab 67 회피율 | 상대적 활성 |
| 최소값 | -29.5% | -24.4% | 62.7% |
| 최대값 | 33.4% | 30.5% | 128.9% |
| 평균 | 2.2% | 1.9% | 96.1% |
| 표준편차 | 12.1% | 13.5% | 16.4% |
| 평균 - 3표준편차 | -34.1% | -38.5% | 47.0% |
| 평균 + 3표준편차 | 38.5% | 42.3% | 145.2% |
ADAMTS13 중화항체를 회피 및 야생형 ADAMTS13 수준 이상의 활성을 갖는 변이체의 선별
WT 클론과 아미노산 변이를 갖는 변이체를 세포에 형질주입한 후, 배양액에 존재하는 단백질의 양을 측정하여 발현 농도가 50 ng/mL 이상인 304개의 변이체에 대해 중화항체 결합력과 활성 어세이를 수행하였다. 아미노산 변이를 갖는 변이체는 WT 클론 대비 중화항체 결합력 혹은 상대활성에 있어 다양한 분포를 갖고 있음을 알 수 있었으며, 이 중 선정 기준을 만족하는 26종의 변이체를 최종 선별하였다. 26종의 변이체 중 18종이 S 도메인에 대한 변이를 지닌 것을 확인하였으며, 특히 S 도메인에 대한 변이를 지닌 변이체 중 13종(1C03, 1G07, 2B01, 2B02, 3B05, 3G04, 5C09, 5G08, 6B12, 7A02, 8C04, 8D01, 8F01)은 Ab 4-16에 대한 회피율이 높았으며 5종(7E01, 7G08, 8C02, 8D01, 8D05)은 높은 상대 활성을 지니는 특성을 보였다(표 5). 6종의 변이체는 D 도메인에 대한 변이를 지니며 이 중 5종(46, 3A06, 4C07, 4E11, 4H07)은 Ab 67에 대한 회피율이 높은 특성을 보였다. 이 밖에 M 도메인에 대한 변이를 지닌 변이체는 6종, C 도메인은 2종, T 도메인은 2종이 확인되었다. 선별한 26종의 변이체에 대하여 3회 반복 실험을 통해 결과의 반복 재현성을 확인하였으며 WT 클론 대비 우수성을 반복 시험에서도 연속적으로 유지하는 변이체 12종을 인 비트로 효력 시험의 대상으로 선정하였다. 12종 변이체 중 1C03, 2B01, 2B02, 3B05, 5C09, 5G08, 7A02 및 8D01은 Ab4-16 항체 회피율이 우수하여 선정하였으며, 4C07, 4E11 그리고 4H07은 Ab67 회피율이 우수하여 선정하였다. 마지막으로 8D05는 우수한 상대 활성에 기반하여 선정되었다.
선정한 12종 변이체에서 추가 중화항체에 대한 회피력을 확인하기 위해서 스크리닝에 이용한 Ab4-16과 Ab67 항체 이외에 Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64 그리고 Ab65 중화항체에 대해서도 회피가 가능한지를 확인하고자 하였다. 12종의 변이체 중에 S 도메인에 아미노산 변이가 존재하는 9종 중 8D05를 제외한 8종의 변이체 1C03, 2B01, 2B02, 3B05, 5C09, 5G08, 7A02, 8D01의 경우 aTTP 환자가 지닌 ADAMTS13 자가항체 서열을 바탕으로 제작된 Ab4-16, Ab4-20에 대한 우수한 회피율을 보였으며, Ab60과 Ab61에 대한 회피력도 우수함을 보여주었다. 반면에 D 도메인에 아미노산 변이가 있는 변이체 4C07, 4E11, 4H07의 경우 Ab67에 대한 회피율이 우수하였다(도 27, 표 6).
| 변이체 ID | 돌연변이 적용 도메인 |
변이 아미노산 잔기 | Ab4-16 항체의 회피율 | Ab67 항체의 회피율 | 상대적 활성 |
| 46 | M,D | L85F P317H |
46.30% | 53.90% | 66.80% |
| 1C03 | S | S612Y | 48.00% | 10.40% | 104.60% |
| 1G07 | M,C,S | V282A A465D D672V |
41.40% | 57.90% | 63.80% |
| 2B01 | S | D635V | 87.40% | 5.40% | 62.20% |
| 2B02 | C,S | R452I S612Y |
69.80% | 15.30% | 88.80% |
| 3A06 | M,D,T | R278I A334T D427N |
42.60% | 58.50% | 62.90% |
| 3B05 | S | P618S | 66.00% | 48.40% | 71.20% |
| 3E01 | M | T135I | 52.30% | 36.00% | 60.00% |
| 3G04 | M,S | V126M A567S E651D |
42.00% | 29.40% | 103.50% |
| 3H12 | T | N413D | -69.00% | -104.60% | 162.40% |
| 4C07 | D | A334V | -6.60% | 72.30% | 153.10% |
| 4E11 | D | A314T | 10.30% | 96.40% | 71.90% |
| 4H03 | M, D | F93V K364R E376D |
40.30% | 37.60% | 65.70% |
| 4H07 | D | N308K | 30.20% | 64.60% | 106.40% |
| 5C09 | S | S612F | 60.90% | -10.50% | 88.50% |
| 5G08 | S | Q656H | 41.40% | 26.00% | 91.90% |
| 6B12 | S | G607R | 43.90% | -101.60% | 93.80% |
| 7A02 | S | S612F G624D |
57.00% | -80.50% | 128.50% |
| 7E01 | S | R589Q | -36.60% | -89.70% | 149.90% |
| 7G08 | S | Q650H Q656R |
-25.20% | -47.60% | 160.70% |
| 8C02 | S | I643F | -19.20% | -50.90% | 168.10% |
| 8C04 | S | I585N Y658H |
51.30% | 34.80% | 69.00% |
| 8C12 | S | V630L D654G E664N |
-12.00% | 73.20% | 48.10% |
| 8D01 | S | R589Q K608M M609L G624C I655V |
85.10% | -78.30% | 193.60% |
| 8D05 | S | P578L | -1.20% | -5.70% | 172.30% |
| 8F01 | S | I585M | 45.20% | 34.40% | 99.40% |
| 변이체 ID | 변이 위치 | 중화항체 회피율 (%) | 상대적활성 | ||||||
| Ab4-16 | Ab4-20 | Ab60 | Ab61 | Ab64 | Ab65 | Ab67 | |||
| 1C03 | S612Y | 57.5% | 59.4% | 97.2% | 94.7% | 5.2% | -11.0% | 15.1% | 103.7% |
| 2B01 | D635V | 82.9% | 88.6% | 92.4% | 97.4% | 96.3% | 8.1% | 7.9% | 66.8% |
| 2B02 | R452I S612Y |
65.4% | 61.1% | 97.3% | 95.5% | 0.9% | -15.0% | 15.1% | 112.6% |
| 3B05 | P618S | 51.3% | -6.5% | 24.9% | 39.4% | 19.4% | -63.8% | 37.4% | 77.3% |
| 4C07 | A334V | 4.2% | -5.0% | -3.3% | -6.9% | -2.2% | -4.7% | 78.5% | 152.2% |
| 4E11 | A314T | 16.6% | -1.3% | 2.7% | 3.2% | 5.4% | -0.8% | 98.9% | 78.3% |
| 4H07 | N308K | 27.9% | 1.5% | 11.0% | 16.4% | 17.0% | 12.8% | 61.3% | 94.7% |
| 5C09 | S612F | 64.6% | 54.7% | 97.3% | 95.2% | 7.8% | -1.6% | 11.8% | 104.8% |
| 5G08 | Q656H | 47.0% | 7.2% | 32.1% | 46.2% | 27.4% | -51.4% | 30.3% | 95.9% |
| 7A02 | S612F G624D |
57.1% | 55.4% | 97.6% | 95.5% | 1.9% | -26.2% | -12.9% | 125.3% |
| 8D01 | R589Q K608M M609L G624C I655V |
90.1% | 98.5% | 95.2% | 94.1% | 20.0% | -95.9% | 7.3% | 127.0% |
| 8D05 | P578L | -9.3% | -43.1% | 3.2% | 15.9% | -0.9% | -116.4% | 11.5% | 154.7% |
한편, 구조-기능적 연구에서 ADAMTS13의 총 14개의 도메인 중에 C-말단의 TSP-2부터 CUB2 도메인이 제거된 MDTCS 도메인이 ADAMTS13와 유사한 메탈로프로테아제 기능을 가지고 있어 VWF 절단 가능함이 보고 되었다(Shelat et al., 2005). 이는 전장 ADAMTS13이 아닌 MDTCS 절편만으로도 TTP 질환 치료제로써 기능을 할 가능성을 시사하며 말단이 제거(truncated)된 형태로서 C-말단 부분에 결합하는 환자 혈장에 존재하는 중화항체를 회피할 수 있다는 것을 의미한다.
이에, 선정된 12종의 변이체를 MDTCS로 절편화하고, 이중 선별된 변이 아미노산 잔기를 조합하여 2개의 아미노산 변이를 가지는 DM1, DM2 변이체를 추가로 제작하였다. 앞서 언급한 방법으로 세포에서 발현한 배양액과 정제액을 이용하여 단일 혹은 혼합 중화항체 회피율과 상대 활성을 측정하여 최종 후보물질을 선별하고자 하였다.
배양액을 이용한 단일 중화항체 8종의 결합 회피율과 상대 활성을 측정한 결과, 2B01, 3B05, 4H07, 5G08, 8D05 및 DM1의 경우 모든 중화항체를 유사한 수준으로 회피하였다(도 28, 표 7). 1C03, 2B02, 5C09, 7A02, 8D01 및 DM2의 경우 3-01과 Ab60에 대한 우수한 결합 회피율을 보였다. 6종의 후보는 모두 S 도메인에 아미노산 변이를 가지고 있으며, 8D01를 제외하고는 공통적으로 612번째 아미노산에 변이를 가지고 있다. 4E11과 DM2의 경우 Ab67에 대한 결합 회피율이 우수하였으며, 모두 D 도메인인 314번째 아미노산에 변이를 가지고 있다. 상대 활성의 경우 DM1이 57.9%로 가장 낮았으며 1C03이 133.1%로 가장 높았다. 위의 2종을 제외한 모든 후보는 78.2 - 125.1%의 상대활성을 보여 MDTCS-Fc 대조군과 유사한 활성을 보였다(표 7). 9종 중화항체(Ab3-01, Ab4-16, Ab4-20, Ab60, Ab61, Ab64, Ab65, Ab66, Ab67)를 동일 비율로 혼합한 조건에서 대조군인 MDTCS-Fc 대비 4C07과 5C09를 제외한 12종의 후보 변이체의 회피력을 확인하기 위해 혼합 중화항체 7.5 nM과 각 변이체 발현 배양액 4nM를 혼합한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켜 잔존활성을 측정하였다. MDTCS-Fc의 경우 3.5%의 잔존활성을 유지함을 보였고, 3B05, 4E11, 4H07, 5G08 그리고 8D05는 1.24 - 2.42%의 잔존활성을 가지는 것으로 확인되어 MDTCS-Fc 대비 잔존활성이 낮음을 보여주었다(도 29). 반면에 1C03, 2B01, 2B02, 7A02, 8D01, DM1 및 DM2의 경우 7.69-18.81%로 잔존활성이 유지되어 MDTCS-Fc 대비 혼합 중화항체에 의한 회피력이 우수함을 확인하였다(도 29).
정제액을 이용한 후보물질 변이체의 중화항체 회피력을 확인하기 위하여 Phytip system(protein A resin)을 이용하여 각 배양액에서 단백질 정제를 진행하고, 수득된 정제액을 이용하여 단일 중화항체의 회피율을 확인한 결과, 대부분의 변이체가 배양액 상태에서 평가한 결과와 경향성이 유사한 것을 확인하였다(도 30).
2B01 5G08, 8D05 그리고 DM1 변이체는 8종 모든 중화항체에 대해 24.6% 이상 중화항체를 회피함을 확인하였고, 1C03, 2B02, 7A02, 8D01 그리고 DM2의 경우는 배양액 결과와 유사하게 3-01과 Ab60에 대한 우수한 결합 회피율을 보였다. 4E11과 DM2의 경우는 배양액 결과와 동일하게 Ab67에 대한 결합 회피율이 우수함을 확인하였다. 각 변이체의 상대 활성은 도 30 및 표 8에 나타내었다. 혼합 중화항체 조건에서의 잔존활성 측정 결과, MDTCS-Fc는 3.76% 유지되는 것을 확인하였으며, 3B05, 4E11, 4H07 그리고 8D05 변이체는 2.05 - 3.50%으로 MDTCS-Fc 대비 활성이 더 많이 억제된 것을 확인하였다. 반면에 1C03, 2B01, 2B02, 5G08, 7A02, 8D01, DM1 그리고 DM2의 경우 6.34-12.8%의 잔존활성이 유지되는 것을 확인하였으며, 이는 MDTCS-Fc 대비 혼합 중화항체 회피력이 우수함을 보였다 (도 31).
이상의 결과를 바탕으로 상대활성 또는 혼합 중화항체 회피율을 종합적으로 고려하여 1C03, 2B02, 7A02, DM2와 612번 아미노산 변이를 지니고 있어 혼합 중화항체 회피력이 우수할 것으로 판단되는 5C09를 추가 연구를 위한 5종의 후보로 선정하였다.
| 변이체ID |
변이
위치 |
중화항체 회피율 (%) |
상대적
활성 |
|||||||
| 3-01 | 4-16 | 4-20 | Ab60 | Ab61 | Ab64 | Ab65 | Ab67 | |||
| 1C03 | S612Y | 100.0% | 2.0% | -11.0% | 91.3% | 3.9% | -5.9% | -16.9% | 1.1% | 133.1% |
| 2B01 | D635V | 25.1% | 28.2% | 38.1% | 38.4% | 36.2% | 26.8% | 11.0% | 24.9% | 78.2% |
| 2B02 | R452I S612Y |
99.0% | 1.2% | 4.2% | 93.5% | 2.9% | -2.1% | -12.9% | 3.1% | 116.5% |
| 3B05 | P618S | 35.3% | 18.9% | 25.5% | 23.6% | 19.1% | 21.3% | 17.9% | 17.8% | 92.7% |
| 4C07 | A334V | -5.9% | -11.2% | -9.6% | -11.3% | -3.3% | -12.4% | -14.6% | 14.5% | 118.2% |
| 4E11 | A314T | 15.3% | 7.3% | 11.9% | 8.1% | 9.0% | 9.7% | 8.8% | 83.5% | 89.7% |
| 4H07 | N308K | 36.1% | 20.4% | 25.8% | 19.5% | 22.5% | 25.1% | 21.0% | 53.8% | 93.6% |
| 5C09 | S612F | 100.0% | 15.7% | 18.7% | 100.0% | 12.4% | 13.0% | 0.5% | 8.5% | 108.2% |
| 5G08 | Q656H | 48.7% | 38.3% | 41.2% | 44.2% | 41.9% | 37.2% | 27.8% | 47.6% | 85.4% |
| 7A02 | S612F G624D |
100.0% | 7.5% | 17.4% | 97.5% | 11.2% | 7.2% | -7.2% | 12.3% | 125.1% |
| 8D01 | R589Q K608M M609L G624C I655V |
100.0% | 38.9% | 49.1% | 71.2% | 31.6% | 36.3% | 18.1% | 41.8% | 78.4% |
| 8D05 | P578L | 39.6% | 29.9% | 38.3% | 32.6% | 32.4% | 32.5% | 21.5% | 43.7% | 82.1% |
| DM1 | A314T D635V |
52.3% | 48.2% | 56.9% | 60.6% | 54.7% | 51.6% | 38.1% | 86.8% | 57.9% |
| DM2 | A314TS612F | 100.0% | 12.0% | 22.0% | 95.1% | 21.6% | 13.0% | 7.3% | 84.8% | 97.7% |
| 변이체 ID |
변이
위치 |
중화항체 회피율 (%) |
상대적
활성 |
|||||||
| 3-01 | 4-16 | 4-20 | Ab60 | Ab61 | Ab64 | Ab65 | Ab67 | |||
| 1C03 | S612Y | 100.0% | 15.6% | 21.1% | 100.0% | 16.3% | 7.3% | -7.1% | 10.9% | 81.4% |
| 2B01 | D635V | 46.0% | 37.8% | 49.6% | 65.5% | 43.7% | 49.7% | 28.5% | 28.2% | 56.3% |
| 2B02 | R452I | 100.0% | 8.4% | 15.0% | 100.0% | 10.3% | 4.4% | -9.0% | 0.2% | 91.1% |
| S612Y | ||||||||||
| 3B05 | P618S | 25.5% | 11.9% | 13.3% | 14.9% | 10.5% | 13.8% | 7.9% | 10.2% | 83.7% |
| 4E11 | A314T | 19.6% | 6.2% | 11.5% | 15.7% | 1.8% | 8.8% | 12.6% | 84.4% | 77.5% |
| 4H07 | N308K | 32.6% | 12.80% | 16.8% | 29.0% | 9.4% | 16.9% | 17.0% | 47.1% | 77.5% |
| 5G08 | Q656H | 89.6% | 64.5% | 70.2% | 81.9% | 57.90% | 68.9% | 59.0% | 37.7% | 18.3% |
| 7A02 | S612FG624D | 100.0% | 10.4% | 12.8% | 100.0% | 8.5% | 3.4% | -7.3% | 14.4% | 97.8% |
| 8D01 | R589QK608M M609L G624C I655V |
100.0% | 29.5% | 48.2% | 91.7% | 20.5% | 17.1% | 14.2% | 31.5% | 65.1% |
| 8D05 | P578L | 51.0% | 27.4% | 35.1% | 49.5% | 27.2% | 33.8% | 29.9% | 46.0% | 56.3% |
| DM1 | A314TD635V | 50.2% | 34.0% | 54.0% | 66.50% | 45.3% | 52.9% | 24.6% | 85.1% | 50.3% |
| DM2 | A314TS612F | 100.0% | 16.2% | 24.2% | 100.0% | 24.0% | 11.5% | 11.0% | 86.5% | 73.1% |
최종 선정된 5종 MDTCS 변이체 절편에 IgG1-YTE를 접합한 DNA를 제작하여 세포에서 발현한 배양액에서 단일 중화항체 8종의 결합 회피력과 상대활성을 측정하였다. 그 결과, 1C03, 2B02, 5C09 및 7A02는 Ab3-01, Ab60에 대한 우수한 결합 회피율을 보였으며, DM2의 경우, Ab3-01, Ab60 및 Ab67에 대한 결합 회피율이 우수함을 확인하였다(도 33). 상대활성의 경우, 98.6-127.7%로 MDTCS-IgG1-YTE와 유사한 활성을 보였다(도 33). 9종 중화항체를 동일 비율로 혼합한 조건에서 대조군인 MDTCS-IgG1-YTE 대비 5종 변이체 물질에서 회피력을 확인하기 위해 혼합 중화항체 (9종)와 각 변이체 발현 배양액을 혼합한 후, 상온에서 1 시간 동안 반응하여 잔존활성을 측정하였다. MDTCS-IgG1-YTE의 경우 5.5%의 잔존활성을 유지함을 보였고, 5종 물질의 경우는 8.18 - 13.42%로 잔존활성이 유지되어 대조군 대비 중화항체에 의한 회피력이 우수함을 확인하였다(도 34).
위의 5종 MDTCS 변이체 절편에 IgG1-YTE를 접합한 발현 배양액에서 Phytip system(protein A resin)을 이용하여 단백질을 정제하여 정제액에서 혼합 중화항체의 잔존활성과 비역가를 측정하였다. 해당 정제액의 농도는 Fc ELISA를 통해 확인하였고, 은 염색을 통해 목적 단백질이 용출된 것을 확인하였다. 혼합 중화항체 조건에서의 잔존활성 측정 결과, MDTCS-IgG1-YTE는 0.4% 유지되는 것을 확인하였으며, 1C03, 2B02, 5C09, 7A02 그리고 DM2는 각각 5.7%, 1.7%, 8.8%, 2.6%, 7.9%의 잔존활성이 유지되는 것으로 나타나 MDTCS-IgG1-YTE 대비 혼합항체 회피력이 우수함을 확인하였다. 비역가 측정결과, 7A02(10,288 IU/mg)를 제외한 4종 변이체는 대조군(18,030 IU/mg)과 유사한 19,091-22,379 IU/mg의 비역가를 보임을 확인하였다(도 35). 결과적으로 5종 변이체 절편의 IgG1-YTE 접합 물질은 대조군 대비 혼합 중화항체에서의 회피력이 우수하며, 7A02를 제외한 4종 변이체에서는 대조군과 유사한 수준의 비역가를 가지고 있음을 확인하였다.
Fc 부착에 의한 MDTCS 절편 변이체의 반감기 증가 여부 평가
MDTCS에 부착된 Fc(IgG1-YTE)가 실제로 반감기 증가를 가져올지를 확인하고자 마우스에서 약동학 분석을 수행하였다. 이를 위해 MDTCS 혹은 IgG1-YTE가 부착 되어있는 MDTCS, 및 4종 최종 후보(1C03, 5C09, 7A02, DM2) 변이체 절편 단백질을 마우스에 꼬리 정맥 투여한 후 시간 별로 혈장을 확보하였다. 각 물질의 비역가를 기준으로 160 IU/kg가 되도록 투여하였고 활성 어세이를 통하여 각 시간별로 확보한 혈장 내에 잔존하는 물질의 활성을 측정하였다. 확보한 결과는 단순병합법 (naive pooled method)으로 정리하였고, 이를 이용하여 비구획 분석법 (noncompartmental analysis)으로 약동학 분석을 수행하였다. MDTCS의 반감기는 2.898시간, MDTCS-IgG1-YTE는 11.51 시간, 그리고 각 변이체의 경우 5.184 - 9.902 시간으로 측정되었다. 대조군인 MDTCS 대비 IgG1-YTE 접합에 의해 1.79 - 3.97배로 반감기가 연장되었다. 뿐만 아니라, 물질의 생체 평균 체류 시간을 나타내는 MRT(Mean Residence Time) 수치도 IgG1-YTE 접합에 의해 7.189 - 11.67시간으로 3.743시간 대비 증가된 체류 시간을 나타내었다(표 9, 도 32). 결과적으로 IgG1-YTE 융합체가 혈중 반감기 및 생체 내 평균 지속시간을 통한 활성을 유지하는데 효과적임을 확인하였다.
| 후보물질 | Parameter of PK 분석 파라미터 | ||
| t1/2,terminal (hr) | AUCInf (IU*hr/mL) | MRT (hr) | |
| MDTCS | 2.898 | 5.467 | 3.743 |
| MDTCS-IgG1-YTE | 11.51 | 16.89 | 11.67 |
| 1C03-IgG1-YTE | 6.087 | 12.33 | 8.695 |
| 5C09-IgG1-YTE | 5.184 | 12.06 | 7.982 |
| 7A02-IgG1-YTE | 9.902 | 14.49 | 10.35 |
| DM2-IgG1-YTE | 5.986 | 11.39 | 7.189 |
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 MDTCS 부분 혹은 S 도메인과 결합하는 ADAMTS13 중화항체를 회피하거나 혹은 야생형 ADAMTS13 이상의 활성을 보이는 26종의 신규 변이체를 발굴하였다. 이 중 중화항체 9종에 대하여 가장 회피력이 우수하거나 비교 활성이 현저히 우수한 12종을 선정하여 C-말단과 결합하는 중화항체를 효율적으로 회피하면서 vWF 절단에 필수적인 MDTCS 절편을 제작함으로써 aTTP 환자의 D, C 혹은 S 도메인과 결합하는 자가항체 회피율이 크게 향상된 변이체를 동정하였다. 본 발명의 변이체는 IgG1-YTE 접합을 통하여 혈중 반감기를 증가시킴으로써 안정성 및 생리 활성의 지속성이 개선된, 효과적인 약리성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
aTTP mimic 질환 마우스 모델에서 변이체 PoC 확인 결과
확립된 aTTP-mimic 마우스 모델에서 최종 후보물질 선별을 위해 대조물질 (MDTCS-IgG1-YTE) 혹은 선정된 5종 변이체 후보물질(1C03-IgG1-YTE, 2B02-IgG1-YTE, 5C09-IgG1-YTE, 7A02-IgG1-YTE, DM2-IgG1-YTE) 투여 후, 중화항체 회피율을 평가하였다(도 36a). 5종 변이체 중 DM2-IgG1-YTE가 5,000 혹은 7,000 IU/kg의 모든 투여 용량에서 가장 높은 인간 ADAMTS13 잔존 활성을 보였다(도 36b). 가장 우수한 중화항체 회피율을 보인 DM2-IgG1-YTE 물질을 최종 선정하여 농도별로 투여하여 인간 ADAMTS13 잔존활성 유지력과 임상학적 증상의 완화 정도를 확인한 결과(도 37a), DM2 용량이 증가할 수록 임상 증상의 완화 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 7000 IU/kg 투여 그룹에서 MDTCS-IgG1-YTE 대비 DM2-IgG1-YTE 투여에 의해 혈소판과 LDH의 수치의 개선이 상대적으로 높음을 관찰할 수 있었다(도 37b). 혈소판 및 LDH 수치의 개선과 일치하게 인간 ADAMTS13 활성 검사 결과, 대조물질 또는 후보물질 투여 용량과 비례하는 잔존 활성 증가를 관찰할 수 있었다(도 37b). 임상 증상 관찰 결과, aTTP-mimic 마우스 모델에서 나타나는 폐사나 혈뇨가 대조물질 또는 후보물질의 투여에 의해 완화되는 경향을 확인할 수 있었다. 특히 DM2-IgG1-YTE 처리군의 경우 모든 투여 용량에서 사망 개체 없었으며, 7000 IU/kg 이상 투여 시 혈뇨 증상을 보인 개체를 관찰할 수 없었다 (도 37c). 7000 IU/kg 투여 시 평균 잔존 활성은 DM2-IgG1-YTE 0.32 IU/mL로 MDTCS-IgG1-YTE 0.03 IU/mL 대비 9.6 배 더 높았으며, 앞선 임상 증상 관찰 결과의 차이는 이러한 잔존 활성 차이에서 기인한 것으로 판단되었다. 일반 혈액검사, 임상화학검사 및 임상증상의 관찰 결과, MDTCS-IgG1-YTE와 DM2-IgG1-YTE의 투여는 aTTP-mimic 마우스 모델에서 나타나는 aTTP 임상 증상을 개선시키는 경향을 보였고, 이를 통해 인 비보 PoC를 확인할 수 있었다. 특히 7000 IU/kg 투여 시, DM2-IgG1-YTE가 MDTCS-IgG1-YTE 대비 그 개선 효과가 우수함을 확인하였다.
cTTP 질환 마우스 모델에서 변이체 PoC 확인 결과
aTTP mimic 마우스 모델에서 5종 변이체 후보 중 가장 우수한 효력을 보였던 DM2-IgG1-YTE를 이용하여 cTTP 마우스 모델에서 TTP 질환에서 보이는 혈액학적 그리고 임상학적 증상의 개선 여부와 인간 ADAMTS13 활성 회복 정도를 확인하였다 (도 38a). DM2-IgG1-YTE의 투여 용량 증가에 따라 혈소판과 LDH 수치의 개선이 농도 의존적으로 일어남을 확인할 수 있었으며, DM2-IgG1-YTE 180, 360 IU/kg 투여군에서 대조군 대비 유의한 혈소판 증가가 관찰되었고, 특히 360 IU/kg 투여군의 경우 정상 수준만큼으로 회복됨을 볼 수 있었다(도 38b). LDH 수치의 경우, 180 IU/kg 투여군에서 대조군과 유사한 수준으로 LDH가 회복됨을 확인하였다(도 38b). ADAMTS13 활성의 경우, DM2-IgG1-YTE 60 IU/kg 투여군부터 평균 0.1 IU/mL이상의 활성을 보였으며 360 IU/kg 투여 용량에서는 평균 1.08 IU/mL의 활성이 측정되었다 (도 38b). 따라서 DM2-IgG1-YTE 변이체가 cTTP 질환 마우스에서 효과적인 임상증상의 개선과 ADAMTS13의 활성을 회복시킴을 알 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 DM2-IgG1-YTE를 이용하여 전술한 실시예 1 및 2의 ADAMTS13 단백질 제형 성분의 선별 및 최적화를 수행하였다
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (21)
- 전체 조성물에 대해 0 - 1.5 w/v%의 당(sugar) 안정화제 및 100 mM 내지 400 mM의 무기염을 포함하는 혈장 단백질용 약제학적 제형 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 당은 수크로스, 트레할로스 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 무기염은 NaCl, CaCl2, KCl 및 MgCl2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 무기염은 NaCl 및 CaCl2의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 당 안정화제는 전체 조성물에 대해 0.7 - 1.3 w/v%로 포함되고 상기 무기염은 150 - 350 mM로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 40 mM 내지 200 mM의 아미노산 안정화제(stabilizer)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌(Arg), 프롤린(Pro) 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 무기염은 200 - 300 mM로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 전체 조성물에 대해 0.01 내지 0.1 v/v %의 비이온성 계면활성제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 9 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 혈장 단백질은 ADAMTS13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13) 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 상기 ADAMTS13 단백질의 변이체는 서열목록 제1서열의 85, 93, 126, 135, 278, 282, 308, 314, 317, 334, 364, 376, 413, 427, 452, 465, 567, 578, 585, 589, 607, 608, 609, 612, 618, 624, 630, 635, 643, 650, 651, 654, 655, 656, 658, 664 및 672번째 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 상기 ADAMTS13 단백질의 변이체는 다음 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 각 변이 단백질들로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
- 85 및 317번째 잔기; 612번째 잔기; 282, 465 및 672번째 잔기 중 둘 이상; 635번째 잔기; 452 및 612번째 잔기; 278, 334 및 427번째 잔기 중 둘 이상; 618번째 잔기; 135번째 잔기; 126, 567 및 651번째 잔기 중 둘 이상; 413번째 잔기; 334번째 잔기; 314번째 잔기; 93, 364 및 376번째 잔기 중 둘 이상; 308번째 잔기; 656번째 잔기; 607번째 잔기; 612 및 624번째 잔기; 589번째 잔기; 650 및 656번째 잔기; 643번째 잔기; 585 및 658번째 잔기; 630, 654 및 664번째 잔기 중 둘 이상; 589, 608, 609, 624 및 655번째 잔기 중 넷 이상; 578번째 잔기; 585번째 잔기; 314 및 635번째 잔기; 및 314 및 612번째 잔기.
- 제 12 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 치환은 85번째 잔기의 Phe로의 치환, 93번째 잔기의 Val으로의 치환, 126번째 잔기의 Met으로의 치환, 135번째 잔기의 Ile으로의 치환, 278번째 잔기의 Ile으로의 치환, 282번째 잔기의 Ala으로의 치환, 308번째 잔기의 Lys으로의 치환, 314번째 잔기의 Thr으로의 치환, 317번째 잔기의 His으로의 치환, 334번째 잔기의 Thr 또는 Val으로의 치환, 364번째 잔기의 Arg으로의 치환, 376번째 잔기의 Asp으로의 치환, 413번째 잔기의 Asp으로의 치환, 427번째 잔기의 Asn으로의 치환, 452번째 잔기의 Ile으로의 치환, 465번째 잔기의 Asp으로의 치환, 567번째 잔기의 Ser으로의 치환, 578번째 잔기의 Leu으로의 치환, 585번째 잔기의 Asn 또는 Met으로의 치환, 589번째 잔기의 Gln으로의 치환, 607번째 잔기의 Arg으로의 치환, 608번째 잔기의 Met으로의 치환, 609번째 잔기의 Leu으로의 치환, 612번째 잔기의 Phe 또는 Tyr으로의 치환, 618번째 잔기의 Ser으로의 치환, 624번째 잔기의 Asp 또는 Cys으로의 치환, 630번째 잔기의 Leu으로의 치환, 635번째 잔기의 Val으로의 치환, 643번째 잔기의 Phe으로의 치환, 650번째 잔기의 His으로의 치환, 651번째 잔기의 Asp으로의 치환, 654번째 잔기의 Gly으로의 치환, 655번째 잔기의 Val으로의 치환, 656번째 잔기의 Arg 또는 His으로의 치환, 658번째 잔기의 His으로의 치환, 664번째 잔기의 Asn으로의 치환 및 672번째 잔기의 Val으로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 상기 혈장 단백질은 IgG4 면역글로불린의 Fc 영역이 접합된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 15 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 서열목록 제2서열의 22, 24 및 26번째 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 16 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 치환은 22번째 잔기의 Tyr으로의 치환, 24번째 잔기의 Thr으로의 치환 및 26번째 잔기의 Glu으로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 15 항에 있어서, 상기 혈장 단백질과 상기 IgG4 면역글로불린의 Fc 영역 사이에 IgG1 면역글로불린의 힌지(hinge) 영역이 추가적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 19 항에 있어서, 상기 혈전성 질환은 혈전성 미세 혈관병증(thrombotic microangiopathy, TMA)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 20 항에 있어서, 상기 혈전성 미세 혈관병증은 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombocytopenic purpura, TTP), 용혈성 요독성 증후군(Hemolytic uremic syndrome, HUS), HELLP(Hemolysis, Elevated Liver enzymes, Low Platelet count), 자간전증(Preeclampsia) 및 겸상적혈구질환(sickle cell disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220057122 | 2022-05-10 | ||
| KR20220057122 | 2022-05-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230159285A true KR20230159285A (ko) | 2023-11-21 |
Family
ID=88730687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230059742A KR20230159285A (ko) | 2022-05-10 | 2023-05-09 | 혈장 단백질의 동결 건조를 위한 신규한 액상 제형물 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230159285A (ko) |
| TW (1) | TW202400224A (ko) |
| WO (1) | WO2023219379A1 (ko) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4889861B2 (ja) * | 1998-11-18 | 2012-03-07 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 組織接着剤のための安定化されたタンパク質調製物 |
| JP5254973B2 (ja) * | 2007-06-22 | 2013-08-07 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 新規ａｄａｍｔｓ−１３改変体 |
| US8945895B2 (en) * | 2009-07-31 | 2015-02-03 | Baxter International Inc. | Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof |
| WO2013096793A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Gain-of-function adamts13 variants resistant to autoantibody inhibition and methods of use thereof |
| LT2968477T (lt) * | 2013-03-15 | 2020-03-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Faktoriaus viii polipeptido kompozicijos |
-
2023
- 2023-05-09 KR KR1020230059742A patent/KR20230159285A/ko unknown
- 2023-05-09 WO PCT/KR2023/006256 patent/WO2023219379A1/ko unknown
- 2023-05-09 TW TW112117177A patent/TW202400224A/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202400224A (zh) | 2024-01-01 |
| WO2023219379A1 (ko) | 2023-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11046943B2 (en) | DNase therapy for intravascular accumulation of extracellular DNA | |
| JP6723319B2 (ja) | 出血性障害の治療に対する改変セルピン | |
| US20200129600A1 (en) | Combination therapy using a factor xii inhibitor and a c-1 inhibitor | |
| KR100450856B1 (ko) | 활성 단백질 ｃ 제제 | |
| US8741844B2 (en) | Use of mutated antithrombins for treating or preventing coagulation disorders | |
| KR20230159285A (ko) | 혈장 단백질의 동결 건조를 위한 신규한 액상 제형물 | |
| KR20230159284A (ko) | 혈장 단백질에 대한 신규한 액상 제형물 | |
| KR20150132449A (ko) | 재조합 인자 viii 제제 | |
| KR20220068144A (ko) | 자가 항체에 대한 회피율 또는 활성이 증가된 adamts13 변이체 | |
| JP2024001135A (ja) | Ｔｔｐの初回エピソードを免疫グロブリン単一可変ドメインで処置する方法 | |
| DE4241659C1 (de) | Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern | |
| US20120065137A1 (en) | Therapeutics for trauma induced factor v consumptive coagulopathy | |
| WO2002059268A2 (en) | Factor ixa: factor viiia interaction and methods therefor |