JP4889861B2 - 組織接着剤のための安定化されたタンパク質調製物 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明の主題は、液体状態で貯蔵した場合、または凍結状態での貯蔵後に再解凍した場合および液体状態でさらに貯蔵した場合に数カ月または数年にわたり本質的な効果の損失を示さない組織接着剤、および組織接着剤のための、または非経口的に適用可能な製剤のための安定化されたタンパク質調製物に関する。
【０００２】
ヒトまたは動物の組織を結合するために、特に、主成分であるフィブリノゲン、第XIII因子およびトロンビンからなる組織接着剤を使用できることが知られている。これらのタンパク質調製物は注意深い安定化を必要とし、従ってこれを外科的に使用するまで、その完全な効果およびその使用特性が組織接着剤において保持されたままであることを必要とする。
【０００３】
組織の接着は、既に今世紀の初めに、またその後にますます記載されるようになった方法である（S. Bergel: Ueber Wirkungen des Fibrins (フィブリンの効果について). Dtsch. med. Wschr. 35:663−5 (1909); E.P. Cronkite, E.L. Lozner, J.M. Deaver: Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting. JAMA 124:976−8 (1944); H. Matras; H.P. Dinges, H. Lassmann, B. Mammoli, Wr. Med. Wschr. 37:517 (1972); H. Matras, H.P. Dinges, H. Lassmann, B. Mammoli: J. max. fac. Surg. 1:37 (1973); H. Matras, F. Braun, H. Lassmann, H.P. Ammerer, B. Mammoli: Plasma clot welding of nerves (experimental report) J. max. fac. Surg. 1:236−4 (1973); H. Kuderna, H. Matras. Wiener klin. Wschr. 87:495−496 (1975)）。初期には血漿またはフィブリノゲンが粉末として用いられていたが、後になって精製フィブリノゲンが例えば寒冷沈降物の形態で使用された。
【０００４】
７０年代以来、フィブリノゲン−／第XIII因子−およびトロンビン−濃縮物の商業的製造に伴って、組織の接着は著しく重要になってきており、今日では、例えば縫合部を支持するため、局所的止血のため、体腔を閉鎖して体液損失を減少させるため、および傷を処置するために使用されている。フィブリン接着剤を用いる組織接着は生理的方法であり、それ故にこの組織接着は、その適合性および接着剤成分の生分解性の点で合成接着剤よりも有利である。
【０００５】
組織接着剤は、凍結乾燥物または凍結製剤のいずれかとして市場で入手できる。しかしながら、これらの製品は再構築後または解凍後に溶液として数日間しか安定でない。なぜならば、例えば高濃度のフィブリノゲン−／第XIII因子−溶液においては、凝集、従って粘度上昇または不活性化（例えばタンパク質分解による）が起こり、さらに使用することを不可能にするからである。
【０００６】
また、これまでに文献に記載されたが市場ではまだ入手できない組織接着剤は、通常は凍結成分または凍結乾燥成分からなり、使用前にこれらを解凍または溶解しなければならない。フィブリノゲン濃縮物の加工性、溶解性、解凍性または安定性を改善するために、欧州特許 0 085 923、ドイツ特許出願 196 17 369 および欧州特許出願 0 856 317 には、カオトロープ剤または一般的にタンパク質の溶解性を改善する添加剤、例えばアルギニンまたは尿素またはこれらの誘導体、またはベンゼン、イミダゾール、ピラゾール、フラン、チアゾールおよびプリンの誘導体の使用が記載されている。本明細書において、カオトロープ剤とは、タンパク質またはその一部の相互作用を低減または不安定化させ、従ってその凝集傾向を減少させる物質と理解すべきである。ここで重要なことは、これらのカオトロープ剤が存在していても、フィブリノゲンおよび第XIII因子のような成分の安定性が選択された条件下で保証されることである。解凍後に数週間および数カ月間も液状で貯蔵される凍結フィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物、または液状でのみ貯蔵されるフィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物は、これまで依然として成功していない。
【０００７】
液状で貯蔵した場合だけでなく特に凍結状態で貯蔵した場合にも、これまで記載された処方物における第XIII因子−活性の損失は、有効量のカオトロープ剤の存在下でしばしば数週間または数カ月後に一部は検出限界以下まで第XIII因子−含有量が明らかに低下するほどに高い。
【０００８】
欧州特許出願 0 856 317 による処方物において、トラネキサム酸（ＡＭＣＡ）は、特に例えばアルギニンのようなカオトロープ剤および無機塩の存在下でも、−２０℃での貯蔵の経過中に第XIII因子−含有量を明らかに低下させた（表１ｂ、バッチ１）。４℃での貯蔵は、この処方物において粘度上昇を引き起こし（表１ａ、バッチ１）、これはより長期の貯蔵を不可能にする。従ってこの処方物は、フィブリノゲンおよび第XIII因子の同時安定性から見て安定でないというべきである。DE 196 17 369 による処方物の場合にも、第XIII因子−活性の維持において問題を提示する（表１、バッチ２および３）。
【０００９】
さらに、欧州特許明細書 0 487 713 からは、液状形態で低温において安定化されたヒトまたは動物の組織のための生物学的接着剤が公知である。これは、フィブリノゲン含有調製物が少なくとも１種のカオトロープ剤を約０.３Ｍ〜１Ｍの濃度で含有し、接着剤が貯蔵温度で液状であることによって達成されるであろう。
【００１０】
典型的には、このようなフィブリノゲン濃縮物は、約４mMのクエン酸トリナトリウム、２４０mMのＮａＣｌ、８０mMの −アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、２４０mMのグリシン、１％のポリソルベート、０.６ｇ／Ｌのカプロン酸ナトリウム、０.５Ｍの尿素、場合により２.０００KIE／mlのアプロチニンを含有し、ｐＨ７.５である。安定性は、既に１カ月後に（治療用製剤にとっては極めて短期間である）評価された。この場合、第XIII因子−活性は測定されなかった。また、J. Chabbatらは、液体状態で４℃において６カ月にわたり安定であるフィブリノゲン濃縮物について報告した（J. Chabbat, M. Tellier, P. Porte および M. Steinbuch: Properties of a new fibrin glue stable in liquid state. Thromb. Res. 76: 525−533 (1994)）。この濃縮物は、他の処方成分、典型的には６０mM／ＬのＮａＣｌ、２０mM／ＬのＥＡＣＡおよび６０mM／Ｌのグリシンのほかに、カオトロープ添加剤として０.５Ｍの尿素または５％のアルギニン（＝０.２９Ｍ）を含有する。しかしながら、この場合にも第XIII因子−含有量は試験されなかった。
【００１１】
欧州特許明細書 0 487 713および文献に記載されたこれらの液状処方物は、冷蔵温度における濃縮フィブリノゲン成分の凝集（重合）、従って粘度上昇が防止または減少されていることによって優れている。しかしながら、フィブリン接着剤用のフィブリノゲン濃縮物の必須成分である第XIII因子は、これらの条件下で多少とも強く不活性化される。従って、欧州特許明細書 0 487 713または関連するChabbatらの刊行物［J. Chabbat, M. Tellier, P. Porte および M. Steinbuch: Properties of a new fibrin glue stable in liquid state. Thromb. Res. 76:525−533 (1994)］による、冷却状態で貯蔵するために意図された処方物において、第XIII因子の不安定性は提案された処方物によっても解決されない重大な問題を提示する（表１、バッチ４〜５参照）。さらに、カオトロープ剤の含有量は約０.３〜１.０Ｍ／Ｌと比較的に高く、これはより低いカオトロープ剤濃度が望ましいことを明らかにする（＜０.３Ｍ／Ｌ）。
【００１２】
このように、フィブリノゲン／第XIII因子−調製物の安定性および公知の種々のフィブリノゲン／第XIII因子−調製物の粘度を、冷却状態（０〜１０℃）で、または凍結状態に続く冷却状態（０〜１０℃）で貯蔵して研究したとき、これまで記載された処方物は安定なタンパク質−調製物をもたらさないことが見出されたということを確認することができる。フィブリノゲンまたは第XIII因子のいずれかが貯蔵時間の経過中に著しい活性低下を示すか、またはフィブリノゲンの凝集がもはや使用できない粘調材料を生じさせる（表１、バッチ１〜５参照）。
【００１３】
従って本発明の課題は、フィブリノゲンまたは第XIII因子が数カ月または数年にわたり本質的な効果の損失なしに安定化されている、数カ月にわたり安定な液状タンパク質調製物、または解凍後に数カ月にわたり安定な凍結タンパク質調製物を開発することである。
【００１４】
この課題は、技術水準と比較して、第一の実施形態においては、フィブリノゲンだけでなく第XIII因子もが安定剤により安定化され、カオトロープ剤の含有量を低下できるという利点、または第二の実施形態においては、フィブリノゲンおよび第XIII因子が別個に処方され、従って安定に維持されるという利点を有する、安定化されたタンパク質調製物によって解決される。
【００１５】
これは、解凍後に数週間または数カ月間も安定に維持される凍結製剤においてフィブリノゲン凝集を減少させるために、本明細書に記載した定義によるカオトロープ剤をより低い濃度で使用することにより、無機塩の濃度を低下させることにより、および場合により抗線維素溶解剤ならびにさらなる慣用の添加剤および緩衝剤を使用することにより行われる。このために用いられるフィブリノゲン製剤は、出発材料に由来する第XIII因子、および例えばフィブロネクチンおよびフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）のようなさらなる血漿タンパク質、または添加剤としての精製第XIII因子を含有することができる。
【００１６】
抗線維素溶解剤としては、アプロチニンまたはリジンまたはε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）またはｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）、またはこれらの問題のない塩を用いることができる。種々の抗線維素溶解剤の効果の研究において、驚くべきことに、リジン、ＰＡＭＢＡまたはＥＡＣＡは第XIII因子−活性に負の影響を与えないが、トラネキサム酸は与えることが示された。従って、特に、凍結して貯蔵されるだけでなく液状でも貯蔵されるフィブリノゲン／第XIII因子−混合物においては、ＡＭＣＡの使用よりもＥＡＣＡまたはリジンの使用が好ましい。第XIII因子のためのさらなる安定剤としては、例えばクエン酸ナトリウム、アミノ酸および糖類を用いることができる。
【００１７】
第XIII因子およびフィブリノゲンの両方をこれらの個々の安定剤と共に含有する上記のタンパク質調製物の代わりに、両方の調製物を互いに分離して保存し、組織接着剤として使用する直前に初めて、トロンビン含有調製物と一緒に混合することも可能であり、これはより良い安定性のためにも好ましい。従って、本発明の主題はまた、安定化された第XIII因子を含有する溶液、安定化されたフィブリノゲンを含有する溶液および安定化されたトロンビンを含有する溶液からなり、これらの溶液が一緒に使用するために用意された１つの包装単位において、互いに分離して提供される組織接着剤である。これは、必要に応じて第XIII因子とフィブリノゲンとの比率を変化させ、それぞれの状況に適合させることができるというさらなる利点をも有する。
【００１８】
Ａ) 液体状態においても０〜１０℃で数週間／数カ月間も貯蔵できる凍結または凍結乾燥された濃縮物（表１参照）
安定な凍結フィブリノゲン濃縮物は公知であり、文献に記載されているが、解凍後のその安定性は数日間に限られている。フィブリノゲン濃縮物の限られた安定性は、特に、フィブリノゲンの凝集により粘度がすぐに上昇するためである。実際、液体状態において凝集を防止する化合物、すなわちカオトロープ化合物を添加することにより、低い粘度を得ることができる。しかしながら、これらの剤は、凍結状態（例えば−２０℃）において第XIII因子−活性の低下をもたらすという欠点を有する。この場合、一般的にカオトロープ剤の濃度が高いほど、第XIII因子−活性の損失が速くなる。
【００１９】
本発明に係る安定化されたタンパク質調製物を開発する際に、全てのカオトロープ剤が第XIII因子の安定性に同様に影響を与えるのではないこと、および特に、本発明により用いられる他の添加剤も、第XIII因子-安定性に対して、およびフィブリノゲン凝集によって影響される粘度に対しても重要な効果を有することが示された。このように、アルギニンは、フィブリノゲンの重合または凝集の防止において同じモル濃度で、尿素よりも著しく効果的である。さらに、抗線維素溶解添加剤、例えばε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、ｐ−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（ＡＭＣＡ）またはｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）、およびこれらの生理的に問題のない塩は、フィブリノゲン凝集および第XIII因子−安定性に対して効果を発揮する。この場合、特にＡＭＣＡは凍結状態での貯蔵において第XIII因子−安定性に対して負に作用する。驚くべきことに、ＥＡＣＡは、化学構造がＡＭＣＡと極めて類似しているにもかかわらず、相当する条件下でＡＭＣＡと同じ第XIII因子−低下を引き起こさない。さらに、特定濃度のカオトロープ剤が存在する凍結タンパク質調製物において、このような調製物に従来慣用の無機塩の添加を完全にまたは出来るだけ放棄した場合、第XIII因子−活性は低下しないことが見出された。こうして、本発明により開発された調製物において、この調製物がフィブリノゲン凝集を防止または減少させる物質としてカオトロープ化合物を０.２８Mol／Ｌ未満の量で含有する場合、フィブリノゲンおよび第XIII因子が凍結および再解凍の後に少なくとも数週間または数カ月間も液状のままであり、活性が保持される。約２重量％の量のアルギニンが特に有利であることが証明された。他の弱カオトロープ剤、例えばシトルリン、ニコチンアミド、尿素等、またはこれらの混合物またはアルギニンとの混合物を、約０.２８Ｍ以下、特に０.１〜０.２０Ｍの量で使用することができる。さらに、抗線維素溶解剤のほかに、無機塩を≦１００mMol／Ｌ、特に≦５０mMol／Ｌの濃度、とりわけ≦２０mMol／Ｌの濃度で添加することができる。
【００２０】
本発明に係る調製物において、フィブリノゲンおよび第XIII因子の両方が、凍結状態だけでなく液体状態でも、少なくとも数週間／数カ月間安定したままである。安定性のために、他の成分、例えばクエン酸または乳酸の塩または１種またはそれ以上のアミノ酸または単糖類または二糖類または糖アルコール、またはこれらの混合物を添加することが好ましい場合がある。これらの組成において、本発明に係る調製物を再凍結および再解凍するか、またはフィブリン接着剤の再構築後に再凍結および再解凍することができ、安定なフィブリノゲン／第XIII因子−製剤として貯蔵することができる。これは、組織接着剤に用いられる市販の凍結または凍結乾燥タンパク質調製物では再凍結が不可能なので、本発明に係る処方物のもう一つの利点である。この特性は、全量を一度に消費できない場合に、再構築後の凍結乾燥物または凍結貯蔵製剤の取り扱いを容易にする。
【００２１】
下記の実施例により、種々の処方物の安定性を研究するためのフィブリノゲン−、フィブリノゲン／第XIII因子−または第XIII因子−濃縮物の製造を説明する。出発材料としては、形質転換または組み換え製法からのフィブリノゲン、第XIII因子またはトロンビンを使用することもできる。
【００２２】
実施例１
寒冷沈降物から、沈殿、Ａｌ(ＯＨ)3−吸着、ウイルスの不活性化および再沈殿により、フィブリノゲン濃縮物を製造した［P. Fuhge, P. Gratz, H. Geiger. Moderne Methoden zur Herstellung von Gerinnungstherapeutika (凝固治療剤の最新の製造方法). Behring Inst. Mitt. 79:164−176 （1986）参照］。ウイルスの不活性化または除去のためには、外皮および／または非外皮ウイルスに対して有効である種々の化学的または物理的な方法を使用することができる。透析し、続いて濃縮することにより、フィブリノゲン濃縮物を各組成に調節し、１５mg／mlを越え、好ましくは６０mg／mlを越えるフィブリノゲン最終濃度に調節した。０.０５％のナトリウムアジドの存在下にそれぞれの温度で貯蔵し、凝固可能はフィブリノゲン、第XIII因子−活性、粘度、タンパク質分解のような適切な分析パラメーターをＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で試験することにより、これらのフィブリノゲン製剤の安定性を測定した。
【００２３】
実施例２
第XIII因子−含有血漿画分（コーン画分Ｉ(Cohn−Fraktion I)）から、精製第XIII因子を製造した（H.E. Karges および R. Rapp: Production and virus safety of human F XIII concentrates. in: Factor XIII, eds. J. McDonagh, R. Seitz, R. Egbring, Schattauer, Stuttgart／New York (1993), S. 66−67）。透析または透析濾過、および場合により限外濾過の後、この第XIII因子−溶液を被験安定剤と混合し、滅菌濾過した後、種々の温度で貯蔵したか、またはフィブリノゲン濃縮物をストックするために用いた。
【００２４】
実施例３
実施例１と同様にしてフィブリノゲン濃縮物を製造し、第XIII因子−溶液を添加して第XIII因子−含有量をストックした。次いで透析し、フィブリノゲンを約６０mg／ml以上および第XIII因子を１０Ｅ／ml以上に濃縮することにより、安定性の研究に用いる調製物を製造した。バクテリアの増殖を阻止するために、各バッチにさらに０.０５％のナトリウムアジドを加えたか、または各バッチを孔径０.２μｍのフィルターを用いて滅菌濾過した。
【００２５】
実施例４
市販のフィブリン接着剤（Beriplast P）の凍結乾燥フィブリノゲン濃縮物を、注射用水中またはアプロチニン溶液中で、＞１５mg／ml、好ましくは＞６０mg／mlのフィブリノゲン含有量に再構築し、種々の添加剤の混合物に対して透析した。バクテリアの増殖を阻止するために０.０５％のＮａＮ3の存在下にフィブリノゲン／第XIII因子−濃縮物を貯蔵し、その安定性を種々の時間後に測定した。
【００２６】
実施例５
寒冷沈降物から、その後のＡＬ(ＯＨ)3−吸着およびウイルス不活性化によりフィブリノゲン濃縮物を製造し、その第XIII因子−濃度を、場合により精製第XIII因子を添加してストックした。この濃縮物を透析濾過した後、濃縮することにより、それぞれの組成に調節し、１５mg／mlを越え、好ましくは４０mg／mlを越えるフィブリノゲン最終濃度に調節した。貯蔵安定性を評価するために、０,０５％のナトリウムアジドの存在下に貯蔵した。
【００２７】
実施例６
上記の実施例に従ってフィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物を製造し、種々の処方用緩衝剤に対して透析し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物をそのままで安定性について試験したか、または再構築後に得られた溶液を０〜１０℃の温度で貯蔵し、その安定性を上記のように試験した。
【００２８】
実施例１〜６の一つに従って製造したフィブリノゲン−、第XIII因子−およびフィブリノゲン−／第XIII因子−製剤の安定性を、それぞれの温度で貯蔵して適切な分析パラメーターを試験することにより測定した。これらの試験結果を表１〜３に示す。しかしながら、一般的に、フィブリノゲンまたは第XIII因子の他の製造方法も適しており、これらの方法は別の精製工程を含んでいてもよい。
【００２９】
Ｂ) フィブリノゲン−またはフィブリノゲン／第XIII因子−濃縮物を含有する液状で貯蔵される濃縮物（表１および２参照）
凍結されずに約０〜１０℃において冷却状態でだけ貯蔵される液状のフィブリノゲン−またはフィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物においても、凝集、従って粘度上昇をカオトロープ剤の添加により制御する必要がある。一般的に、これによって第XIII因子−活性は多少とも強く低下する（表１、バッチ４および５参照）。カオトロープ物質を０.２８Mol／Ｌ未満の量で用いると、粘度上昇を防止または減少させ、第XIII因子−低下を抑制できることが見出された。好適なカオトロープ物質としては、例えばアルギニン、グアニジン、シトルリン、ニコチンアミドおよびこれらの混合物が、これらを前記の量で用いる場合に優れていることが見出されれた。さらに、調製物に抗線維素溶解剤、この場合、特にアプロチニン、リジン、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、ｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）、またはこれらの生理的に許容される塩または誘導体、ならびにフィブリノゲン−またはフィブリノゲン−／第XIII因子−調製物のさらなる安定剤として、有機酸、特にクエン酸または乳酸の生理的に許容される塩、および場合により１種またはそれ以上のアミノ酸または単糖類または二糖類または糖アルコールを添加することが有利である。従って、カオトロープ剤を０.２８Ｍ以下の量で用いると、フィブリノゲン含有量が１５mg／mlを越え、好ましくは６０mg／mlを越えるフィブリノゲン濃縮物において改善された安定性を達成することができる。
【００３０】
フィブリノゲンと第XIII因子との混合物を製造する場合、カオトロープ剤および上記の添加剤または混合物を同時に存在させることにより、これらの調製物が公知の処方物よりもフィブリノゲンおよび第XIII因子の両方に関して改善された安定性値が達成されることが証明された。フィブリノゲンと第XIII因子とのこの混合物は、トロンビン含有調製物と共に組織接着剤として一緒に使用するために予定された１つの包装単位において提供することができる。
【００３１】
Ｃ) フィブリノゲンおよび第XIII因子を別個に貯蔵するための液状濃縮物（表１〜３参照）
フィブリノゲンおよび第XIII因子を別個に貯蔵し、使用直前または使用中に初めて一緒に混合すると、フィブリノゲン含有液状調製物および第XIII因子含有液状調製物の安定性をさらに改善できることが実証された。この場合、第XIII因子−濃縮物はフィブリノゲンから独立して安定化される。有機のジ−またはトリカルボン酸、特にクエン酸の生理的に許容される塩を添加すること、および第XIII因子のさらなる慣用の安定剤またはその混合物を１０重量％以下、特に５重量％以下の量で添加することにより、本質的にフィブリノゲンを含まない第XIII因子−調製物を、０〜１０℃または２０〜２５℃における液体状態での貯蔵に対して安定化できることが実証された（表３参照）。第XIII因子のための慣用の安定剤としては、単糖類または二糖類または糖アルコール、およびグリシン、グリシルグリシン、アラニン、システイン、ヒスチジン、グルタミンの群からのアミノ酸、またはグルタミン酸またはアスパラギン酸の生理的に許容される塩、またはこれらの混合物が有利に用いられる。さらに、場合によりオスモル濃度、ｐＨ値を調節するための添加剤または第XIII因子のための他の慣用の安定剤を添加することもできる。フィブリノゲン濃縮物は上記で述べたように安定化される。
【００３２】
それぞれの特定の安定剤が供給された第XIII因子−およびフィブリノゲン−調製物を別個に０〜１０℃で貯蔵することは、３つの安定な液状成分、すなわち、フィブリノゲン濃縮物、第XIII因子−濃縮物およびトロンビン−濃縮物からなるフィブリン接着剤の製造を可能にする。この形態において、これらの成分は長時間にわたり安定であり、組織接着剤として使用する直前またはその間に互いに混合されるまで、それらの活性を持続する。本明細書に記載した調製物は、著しい活性損失なしに個々の成分の凍結をも可能にする。
【００３３】
さらに、本発明に係る安定化された第XIII因子調製物およびフィブリノゲン調製物は、個々の成分として治療の目的で非経口的または局所的に使用することもできる。
【００３４】
フィブリノゲンおよび／または第XIII因子を含有する処方物：
技術水準に類似の処方物：
１．０.１Mol／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、８ｇ／Ｌ グリシン、０.０９Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.５８Mol／Ｌ ＡＭＣＡ、ｐＨ７.４
２．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ グリシン、２％ ニコチンアミド、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
３．１.８ｇ／Ｌ Ｎａ3-クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１６.３ｇ／Ｌ グリシン、０.３６ｇ／Ｌ トリトン、８.１ｇ／Ｌ ＨＳＡ、０.２Mol／Ｌ ニコチンアミド、ｐＨ７.３
４．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、０.２９Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.０
５．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、０.５Mol／Ｌ 尿素、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.０
【００３５】
フィブリノゲンまたはフィブリノゲン／第XIII因子を含有する本発明に係る処方物および比較のバッチ
６．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７.４
７．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.１４Mol／Ｌ シトルリン、ｐＨ７.４
８．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.０９５Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
９．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.１４Mol／Ｌ シトルリン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
10．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、、ｐＨ７.４*
11．０.１Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
12．０.１Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、３２０mMol／Ｌ Ｌ−リシン、ｐＨ７.４
13．６mg／ml Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.１４Mol／Ｌ シトルリン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
14．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.０
15．０.１５Ｍ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.０
16．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.５
17．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、８０mMol／Ｌ ＰＡＭＢＡ、ｐＨ７.２
18．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、８％ マンニトール、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.５
19．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、２％ ニコチンアミド、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
20．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、３２０mMol／Ｌ リシン、ｐＨ７.５
21．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.５
22．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、３２０mMol／Ｌ リシン、ｐＨ７.０
23．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.０
24．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、２％ Ｌ−ヒスチジン、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
25．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、２％ しょ糖、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
* 相当する凍結乾燥物を注射用水で再構築することにより製造したバッチ
【００３６】
第XIII因子を含有する単独成分としての本発明に係る処方物
26．１.５ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２.９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、ｐＨ７.４
27．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７.４
28．１.５ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２.９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４
29．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ グリシン、ｐＨ７.４
30．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２％ マンニトール、１０mMol／Ｌ Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ７.４
31．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２％ マンニトール、ｐＨ７.４
32．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ ＨＳＡ、ｐＨ７.４
33．５mMol／Ｌ ＥＤＴＡ、５０mMol／Ｌ トリスメチルアミン×ＨＣｌ、ｐＨ７.４
34．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ７.４
35．１.５ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２.９２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５０mMol／Ｌ グリシルグリシン、ｐＨ７.４
36．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ｌ−ヒスチジン、ｐＨ７.４
37．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、３８mMol／Ｌ グリシルグリシン、ｐＨ７.４
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
【表５】
本発明の主題は、液体状態で貯蔵した場合、または凍結状態での貯蔵後に再解凍した場合および液体状態でさらに貯蔵した場合に数カ月または数年にわたり本質的な効果の損失を示さない組織接着剤、および組織接着剤のための、または非経口的に適用可能な製剤のための安定化されたタンパク質調製物に関する。
【０００２】
ヒトまたは動物の組織を結合するために、特に、主成分であるフィブリノゲン、第XIII因子およびトロンビンからなる組織接着剤を使用できることが知られている。これらのタンパク質調製物は注意深い安定化を必要とし、従ってこれを外科的に使用するまで、その完全な効果およびその使用特性が組織接着剤において保持されたままであることを必要とする。
【０００３】
組織の接着は、既に今世紀の初めに、またその後にますます記載されるようになった方法である（S. Bergel: Ueber Wirkungen des Fibrins (フィブリンの効果について). Dtsch. med. Wschr. 35:663−5 (1909); E.P. Cronkite, E.L. Lozner, J.M. Deaver: Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting. JAMA 124:976−8 (1944); H. Matras; H.P. Dinges, H. Lassmann, B. Mammoli, Wr. Med. Wschr. 37:517 (1972); H. Matras, H.P. Dinges, H. Lassmann, B. Mammoli: J. max. fac. Surg. 1:37 (1973); H. Matras, F. Braun, H. Lassmann, H.P. Ammerer, B. Mammoli: Plasma clot welding of nerves (experimental report) J. max. fac. Surg. 1:236−4 (1973); H. Kuderna, H. Matras. Wiener klin. Wschr. 87:495−496 (1975)）。初期には血漿またはフィブリノゲンが粉末として用いられていたが、後になって精製フィブリノゲンが例えば寒冷沈降物の形態で使用された。
【０００４】
７０年代以来、フィブリノゲン−／第XIII因子−およびトロンビン−濃縮物の商業的製造に伴って、組織の接着は著しく重要になってきており、今日では、例えば縫合部を支持するため、局所的止血のため、体腔を閉鎖して体液損失を減少させるため、および傷を処置するために使用されている。フィブリン接着剤を用いる組織接着は生理的方法であり、それ故にこの組織接着は、その適合性および接着剤成分の生分解性の点で合成接着剤よりも有利である。
【０００５】
組織接着剤は、凍結乾燥物または凍結製剤のいずれかとして市場で入手できる。しかしながら、これらの製品は再構築後または解凍後に溶液として数日間しか安定でない。なぜならば、例えば高濃度のフィブリノゲン−／第XIII因子−溶液においては、凝集、従って粘度上昇または不活性化（例えばタンパク質分解による）が起こり、さらに使用することを不可能にするからである。
【０００６】
また、これまでに文献に記載されたが市場ではまだ入手できない組織接着剤は、通常は凍結成分または凍結乾燥成分からなり、使用前にこれらを解凍または溶解しなければならない。フィブリノゲン濃縮物の加工性、溶解性、解凍性または安定性を改善するために、欧州特許 0 085 923、ドイツ特許出願 196 17 369 および欧州特許出願 0 856 317 には、カオトロープ剤または一般的にタンパク質の溶解性を改善する添加剤、例えばアルギニンまたは尿素またはこれらの誘導体、またはベンゼン、イミダゾール、ピラゾール、フラン、チアゾールおよびプリンの誘導体の使用が記載されている。本明細書において、カオトロープ剤とは、タンパク質またはその一部の相互作用を低減または不安定化させ、従ってその凝集傾向を減少させる物質と理解すべきである。ここで重要なことは、これらのカオトロープ剤が存在していても、フィブリノゲンおよび第XIII因子のような成分の安定性が選択された条件下で保証されることである。解凍後に数週間および数カ月間も液状で貯蔵される凍結フィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物、または液状でのみ貯蔵されるフィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物は、これまで依然として成功していない。
【０００７】
液状で貯蔵した場合だけでなく特に凍結状態で貯蔵した場合にも、これまで記載された処方物における第XIII因子−活性の損失は、有効量のカオトロープ剤の存在下でしばしば数週間または数カ月後に一部は検出限界以下まで第XIII因子−含有量が明らかに低下するほどに高い。
【０００８】
欧州特許出願 0 856 317 による処方物において、トラネキサム酸（ＡＭＣＡ）は、特に例えばアルギニンのようなカオトロープ剤および無機塩の存在下でも、−２０℃での貯蔵の経過中に第XIII因子−含有量を明らかに低下させた（表１ｂ、バッチ１）。４℃での貯蔵は、この処方物において粘度上昇を引き起こし（表１ａ、バッチ１）、これはより長期の貯蔵を不可能にする。従ってこの処方物は、フィブリノゲンおよび第XIII因子の同時安定性から見て安定でないというべきである。DE 196 17 369 による処方物の場合にも、第XIII因子−活性の維持において問題を提示する（表１、バッチ２および３）。
【０００９】
さらに、欧州特許明細書 0 487 713 からは、液状形態で低温において安定化されたヒトまたは動物の組織のための生物学的接着剤が公知である。これは、フィブリノゲン含有調製物が少なくとも１種のカオトロープ剤を約０.３Ｍ〜１Ｍの濃度で含有し、接着剤が貯蔵温度で液状であることによって達成されるであろう。
【００１０】
典型的には、このようなフィブリノゲン濃縮物は、約４mMのクエン酸トリナトリウム、２４０mMのＮａＣｌ、８０mMの −アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、２４０mMのグリシン、１％のポリソルベート、０.６ｇ／Ｌのカプロン酸ナトリウム、０.５Ｍの尿素、場合により２.０００KIE／mlのアプロチニンを含有し、ｐＨ７.５である。安定性は、既に１カ月後に（治療用製剤にとっては極めて短期間である）評価された。この場合、第XIII因子−活性は測定されなかった。また、J. Chabbatらは、液体状態で４℃において６カ月にわたり安定であるフィブリノゲン濃縮物について報告した（J. Chabbat, M. Tellier, P. Porte および M. Steinbuch: Properties of a new fibrin glue stable in liquid state. Thromb. Res. 76: 525−533 (1994)）。この濃縮物は、他の処方成分、典型的には６０mM／ＬのＮａＣｌ、２０mM／ＬのＥＡＣＡおよび６０mM／Ｌのグリシンのほかに、カオトロープ添加剤として０.５Ｍの尿素または５％のアルギニン（＝０.２９Ｍ）を含有する。しかしながら、この場合にも第XIII因子−含有量は試験されなかった。
【００１１】
欧州特許明細書 0 487 713および文献に記載されたこれらの液状処方物は、冷蔵温度における濃縮フィブリノゲン成分の凝集（重合）、従って粘度上昇が防止または減少されていることによって優れている。しかしながら、フィブリン接着剤用のフィブリノゲン濃縮物の必須成分である第XIII因子は、これらの条件下で多少とも強く不活性化される。従って、欧州特許明細書 0 487 713または関連するChabbatらの刊行物［J. Chabbat, M. Tellier, P. Porte および M. Steinbuch: Properties of a new fibrin glue stable in liquid state. Thromb. Res. 76:525−533 (1994)］による、冷却状態で貯蔵するために意図された処方物において、第XIII因子の不安定性は提案された処方物によっても解決されない重大な問題を提示する（表１、バッチ４〜５参照）。さらに、カオトロープ剤の含有量は約０.３〜１.０Ｍ／Ｌと比較的に高く、これはより低いカオトロープ剤濃度が望ましいことを明らかにする（＜０.３Ｍ／Ｌ）。
【００１２】
このように、フィブリノゲン／第XIII因子−調製物の安定性および公知の種々のフィブリノゲン／第XIII因子−調製物の粘度を、冷却状態（０〜１０℃）で、または凍結状態に続く冷却状態（０〜１０℃）で貯蔵して研究したとき、これまで記載された処方物は安定なタンパク質−調製物をもたらさないことが見出されたということを確認することができる。フィブリノゲンまたは第XIII因子のいずれかが貯蔵時間の経過中に著しい活性低下を示すか、またはフィブリノゲンの凝集がもはや使用できない粘調材料を生じさせる（表１、バッチ１〜５参照）。
【００１３】
従って本発明の課題は、フィブリノゲンまたは第XIII因子が数カ月または数年にわたり本質的な効果の損失なしに安定化されている、数カ月にわたり安定な液状タンパク質調製物、または解凍後に数カ月にわたり安定な凍結タンパク質調製物を開発することである。
【００１４】
この課題は、技術水準と比較して、第一の実施形態においては、フィブリノゲンだけでなく第XIII因子もが安定剤により安定化され、カオトロープ剤の含有量を低下できるという利点、または第二の実施形態においては、フィブリノゲンおよび第XIII因子が別個に処方され、従って安定に維持されるという利点を有する、安定化されたタンパク質調製物によって解決される。
【００１５】
これは、解凍後に数週間または数カ月間も安定に維持される凍結製剤においてフィブリノゲン凝集を減少させるために、本明細書に記載した定義によるカオトロープ剤をより低い濃度で使用することにより、無機塩の濃度を低下させることにより、および場合により抗線維素溶解剤ならびにさらなる慣用の添加剤および緩衝剤を使用することにより行われる。このために用いられるフィブリノゲン製剤は、出発材料に由来する第XIII因子、および例えばフィブロネクチンおよびフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）のようなさらなる血漿タンパク質、または添加剤としての精製第XIII因子を含有することができる。
【００１６】
抗線維素溶解剤としては、アプロチニンまたはリジンまたはε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）またはｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）、またはこれらの問題のない塩を用いることができる。種々の抗線維素溶解剤の効果の研究において、驚くべきことに、リジン、ＰＡＭＢＡまたはＥＡＣＡは第XIII因子−活性に負の影響を与えないが、トラネキサム酸は与えることが示された。従って、特に、凍結して貯蔵されるだけでなく液状でも貯蔵されるフィブリノゲン／第XIII因子−混合物においては、ＡＭＣＡの使用よりもＥＡＣＡまたはリジンの使用が好ましい。第XIII因子のためのさらなる安定剤としては、例えばクエン酸ナトリウム、アミノ酸および糖類を用いることができる。
【００１７】
第XIII因子およびフィブリノゲンの両方をこれらの個々の安定剤と共に含有する上記のタンパク質調製物の代わりに、両方の調製物を互いに分離して保存し、組織接着剤として使用する直前に初めて、トロンビン含有調製物と一緒に混合することも可能であり、これはより良い安定性のためにも好ましい。従って、本発明の主題はまた、安定化された第XIII因子を含有する溶液、安定化されたフィブリノゲンを含有する溶液および安定化されたトロンビンを含有する溶液からなり、これらの溶液が一緒に使用するために用意された１つの包装単位において、互いに分離して提供される組織接着剤である。これは、必要に応じて第XIII因子とフィブリノゲンとの比率を変化させ、それぞれの状況に適合させることができるというさらなる利点をも有する。
【００１８】
Ａ) 液体状態においても０〜１０℃で数週間／数カ月間も貯蔵できる凍結または凍結乾燥された濃縮物（表１参照）
安定な凍結フィブリノゲン濃縮物は公知であり、文献に記載されているが、解凍後のその安定性は数日間に限られている。フィブリノゲン濃縮物の限られた安定性は、特に、フィブリノゲンの凝集により粘度がすぐに上昇するためである。実際、液体状態において凝集を防止する化合物、すなわちカオトロープ化合物を添加することにより、低い粘度を得ることができる。しかしながら、これらの剤は、凍結状態（例えば−２０℃）において第XIII因子−活性の低下をもたらすという欠点を有する。この場合、一般的にカオトロープ剤の濃度が高いほど、第XIII因子−活性の損失が速くなる。
【００１９】
本発明に係る安定化されたタンパク質調製物を開発する際に、全てのカオトロープ剤が第XIII因子の安定性に同様に影響を与えるのではないこと、および特に、本発明により用いられる他の添加剤も、第XIII因子-安定性に対して、およびフィブリノゲン凝集によって影響される粘度に対しても重要な効果を有することが示された。このように、アルギニンは、フィブリノゲンの重合または凝集の防止において同じモル濃度で、尿素よりも著しく効果的である。さらに、抗線維素溶解添加剤、例えばε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、ｐ−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（ＡＭＣＡ）またはｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）、およびこれらの生理的に問題のない塩は、フィブリノゲン凝集および第XIII因子−安定性に対して効果を発揮する。この場合、特にＡＭＣＡは凍結状態での貯蔵において第XIII因子−安定性に対して負に作用する。驚くべきことに、ＥＡＣＡは、化学構造がＡＭＣＡと極めて類似しているにもかかわらず、相当する条件下でＡＭＣＡと同じ第XIII因子−低下を引き起こさない。さらに、特定濃度のカオトロープ剤が存在する凍結タンパク質調製物において、このような調製物に従来慣用の無機塩の添加を完全にまたは出来るだけ放棄した場合、第XIII因子−活性は低下しないことが見出された。こうして、本発明により開発された調製物において、この調製物がフィブリノゲン凝集を防止または減少させる物質としてカオトロープ化合物を０.２８Mol／Ｌ未満の量で含有する場合、フィブリノゲンおよび第XIII因子が凍結および再解凍の後に少なくとも数週間または数カ月間も液状のままであり、活性が保持される。約２重量％の量のアルギニンが特に有利であることが証明された。他の弱カオトロープ剤、例えばシトルリン、ニコチンアミド、尿素等、またはこれらの混合物またはアルギニンとの混合物を、約０.２８Ｍ以下、特に０.１〜０.２０Ｍの量で使用することができる。さらに、抗線維素溶解剤のほかに、無機塩を≦１００mMol／Ｌ、特に≦５０mMol／Ｌの濃度、とりわけ≦２０mMol／Ｌの濃度で添加することができる。
【００２０】
本発明に係る調製物において、フィブリノゲンおよび第XIII因子の両方が、凍結状態だけでなく液体状態でも、少なくとも数週間／数カ月間安定したままである。安定性のために、他の成分、例えばクエン酸または乳酸の塩または１種またはそれ以上のアミノ酸または単糖類または二糖類または糖アルコール、またはこれらの混合物を添加することが好ましい場合がある。これらの組成において、本発明に係る調製物を再凍結および再解凍するか、またはフィブリン接着剤の再構築後に再凍結および再解凍することができ、安定なフィブリノゲン／第XIII因子−製剤として貯蔵することができる。これは、組織接着剤に用いられる市販の凍結または凍結乾燥タンパク質調製物では再凍結が不可能なので、本発明に係る処方物のもう一つの利点である。この特性は、全量を一度に消費できない場合に、再構築後の凍結乾燥物または凍結貯蔵製剤の取り扱いを容易にする。
【００２１】
下記の実施例により、種々の処方物の安定性を研究するためのフィブリノゲン−、フィブリノゲン／第XIII因子−または第XIII因子−濃縮物の製造を説明する。出発材料としては、形質転換または組み換え製法からのフィブリノゲン、第XIII因子またはトロンビンを使用することもできる。
【００２２】
実施例１
寒冷沈降物から、沈殿、Ａｌ(ＯＨ)3−吸着、ウイルスの不活性化および再沈殿により、フィブリノゲン濃縮物を製造した［P. Fuhge, P. Gratz, H. Geiger. Moderne Methoden zur Herstellung von Gerinnungstherapeutika (凝固治療剤の最新の製造方法). Behring Inst. Mitt. 79:164−176 （1986）参照］。ウイルスの不活性化または除去のためには、外皮および／または非外皮ウイルスに対して有効である種々の化学的または物理的な方法を使用することができる。透析し、続いて濃縮することにより、フィブリノゲン濃縮物を各組成に調節し、１５mg／mlを越え、好ましくは６０mg／mlを越えるフィブリノゲン最終濃度に調節した。０.０５％のナトリウムアジドの存在下にそれぞれの温度で貯蔵し、凝固可能はフィブリノゲン、第XIII因子−活性、粘度、タンパク質分解のような適切な分析パラメーターをＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で試験することにより、これらのフィブリノゲン製剤の安定性を測定した。
【００２３】
実施例２
第XIII因子−含有血漿画分（コーン画分Ｉ(Cohn−Fraktion I)）から、精製第XIII因子を製造した（H.E. Karges および R. Rapp: Production and virus safety of human F XIII concentrates. in: Factor XIII, eds. J. McDonagh, R. Seitz, R. Egbring, Schattauer, Stuttgart／New York (1993), S. 66−67）。透析または透析濾過、および場合により限外濾過の後、この第XIII因子−溶液を被験安定剤と混合し、滅菌濾過した後、種々の温度で貯蔵したか、またはフィブリノゲン濃縮物をストックするために用いた。
【００２４】
実施例３
実施例１と同様にしてフィブリノゲン濃縮物を製造し、第XIII因子−溶液を添加して第XIII因子−含有量をストックした。次いで透析し、フィブリノゲンを約６０mg／ml以上および第XIII因子を１０Ｅ／ml以上に濃縮することにより、安定性の研究に用いる調製物を製造した。バクテリアの増殖を阻止するために、各バッチにさらに０.０５％のナトリウムアジドを加えたか、または各バッチを孔径０.２μｍのフィルターを用いて滅菌濾過した。
【００２５】
実施例４
市販のフィブリン接着剤（Beriplast P）の凍結乾燥フィブリノゲン濃縮物を、注射用水中またはアプロチニン溶液中で、＞１５mg／ml、好ましくは＞６０mg／mlのフィブリノゲン含有量に再構築し、種々の添加剤の混合物に対して透析した。バクテリアの増殖を阻止するために０.０５％のＮａＮ3の存在下にフィブリノゲン／第XIII因子−濃縮物を貯蔵し、その安定性を種々の時間後に測定した。
【００２６】
実施例５
寒冷沈降物から、その後のＡＬ(ＯＨ)3−吸着およびウイルス不活性化によりフィブリノゲン濃縮物を製造し、その第XIII因子−濃度を、場合により精製第XIII因子を添加してストックした。この濃縮物を透析濾過した後、濃縮することにより、それぞれの組成に調節し、１５mg／mlを越え、好ましくは４０mg／mlを越えるフィブリノゲン最終濃度に調節した。貯蔵安定性を評価するために、０,０５％のナトリウムアジドの存在下に貯蔵した。
【００２７】
実施例６
上記の実施例に従ってフィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物を製造し、種々の処方用緩衝剤に対して透析し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物をそのままで安定性について試験したか、または再構築後に得られた溶液を０〜１０℃の温度で貯蔵し、その安定性を上記のように試験した。
【００２８】
実施例１〜６の一つに従って製造したフィブリノゲン−、第XIII因子−およびフィブリノゲン−／第XIII因子−製剤の安定性を、それぞれの温度で貯蔵して適切な分析パラメーターを試験することにより測定した。これらの試験結果を表１〜３に示す。しかしながら、一般的に、フィブリノゲンまたは第XIII因子の他の製造方法も適しており、これらの方法は別の精製工程を含んでいてもよい。
【００２９】
Ｂ) フィブリノゲン−またはフィブリノゲン／第XIII因子−濃縮物を含有する液状で貯蔵される濃縮物（表１および２参照）
凍結されずに約０〜１０℃において冷却状態でだけ貯蔵される液状のフィブリノゲン−またはフィブリノゲン−／第XIII因子−濃縮物においても、凝集、従って粘度上昇をカオトロープ剤の添加により制御する必要がある。一般的に、これによって第XIII因子−活性は多少とも強く低下する（表１、バッチ４および５参照）。カオトロープ物質を０.２８Mol／Ｌ未満の量で用いると、粘度上昇を防止または減少させ、第XIII因子−低下を抑制できることが見出された。好適なカオトロープ物質としては、例えばアルギニン、グアニジン、シトルリン、ニコチンアミドおよびこれらの混合物が、これらを前記の量で用いる場合に優れていることが見出されれた。さらに、調製物に抗線維素溶解剤、この場合、特にアプロチニン、リジン、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、ｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）、またはこれらの生理的に許容される塩または誘導体、ならびにフィブリノゲン−またはフィブリノゲン−／第XIII因子−調製物のさらなる安定剤として、有機酸、特にクエン酸または乳酸の生理的に許容される塩、および場合により１種またはそれ以上のアミノ酸または単糖類または二糖類または糖アルコールを添加することが有利である。従って、カオトロープ剤を０.２８Ｍ以下の量で用いると、フィブリノゲン含有量が１５mg／mlを越え、好ましくは６０mg／mlを越えるフィブリノゲン濃縮物において改善された安定性を達成することができる。
【００３０】
フィブリノゲンと第XIII因子との混合物を製造する場合、カオトロープ剤および上記の添加剤または混合物を同時に存在させることにより、これらの調製物が公知の処方物よりもフィブリノゲンおよび第XIII因子の両方に関して改善された安定性値が達成されることが証明された。フィブリノゲンと第XIII因子とのこの混合物は、トロンビン含有調製物と共に組織接着剤として一緒に使用するために予定された１つの包装単位において提供することができる。
【００３１】
Ｃ) フィブリノゲンおよび第XIII因子を別個に貯蔵するための液状濃縮物（表１〜３参照）
フィブリノゲンおよび第XIII因子を別個に貯蔵し、使用直前または使用中に初めて一緒に混合すると、フィブリノゲン含有液状調製物および第XIII因子含有液状調製物の安定性をさらに改善できることが実証された。この場合、第XIII因子−濃縮物はフィブリノゲンから独立して安定化される。有機のジ−またはトリカルボン酸、特にクエン酸の生理的に許容される塩を添加すること、および第XIII因子のさらなる慣用の安定剤またはその混合物を１０重量％以下、特に５重量％以下の量で添加することにより、本質的にフィブリノゲンを含まない第XIII因子−調製物を、０〜１０℃または２０〜２５℃における液体状態での貯蔵に対して安定化できることが実証された（表３参照）。第XIII因子のための慣用の安定剤としては、単糖類または二糖類または糖アルコール、およびグリシン、グリシルグリシン、アラニン、システイン、ヒスチジン、グルタミンの群からのアミノ酸、またはグルタミン酸またはアスパラギン酸の生理的に許容される塩、またはこれらの混合物が有利に用いられる。さらに、場合によりオスモル濃度、ｐＨ値を調節するための添加剤または第XIII因子のための他の慣用の安定剤を添加することもできる。フィブリノゲン濃縮物は上記で述べたように安定化される。
【００３２】
それぞれの特定の安定剤が供給された第XIII因子−およびフィブリノゲン−調製物を別個に０〜１０℃で貯蔵することは、３つの安定な液状成分、すなわち、フィブリノゲン濃縮物、第XIII因子−濃縮物およびトロンビン−濃縮物からなるフィブリン接着剤の製造を可能にする。この形態において、これらの成分は長時間にわたり安定であり、組織接着剤として使用する直前またはその間に互いに混合されるまで、それらの活性を持続する。本明細書に記載した調製物は、著しい活性損失なしに個々の成分の凍結をも可能にする。
【００３３】
さらに、本発明に係る安定化された第XIII因子調製物およびフィブリノゲン調製物は、個々の成分として治療の目的で非経口的または局所的に使用することもできる。
【００３４】
フィブリノゲンおよび／または第XIII因子を含有する処方物：
技術水準に類似の処方物：
１．０.１Mol／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、８ｇ／Ｌ グリシン、０.０９Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.５８Mol／Ｌ ＡＭＣＡ、ｐＨ７.４
２．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ グリシン、２％ ニコチンアミド、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
３．１.８ｇ／Ｌ Ｎａ3-クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１６.３ｇ／Ｌ グリシン、０.３６ｇ／Ｌ トリトン、８.１ｇ／Ｌ ＨＳＡ、０.２Mol／Ｌ ニコチンアミド、ｐＨ７.３
４．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、０.２９Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.０
５．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、０.５Mol／Ｌ 尿素、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.０
【００３５】
フィブリノゲンまたはフィブリノゲン／第XIII因子を含有する本発明に係る処方物および比較のバッチ
６．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７.４
７．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.１４Mol／Ｌ シトルリン、ｐＨ７.４
８．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.０９５Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
９．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.１４Mol／Ｌ シトルリン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
10．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、、ｐＨ７.４*
11．０.１Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
12．０.１Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、３２０mMol／Ｌ Ｌ−リシン、ｐＨ７.４
13．６mg／ml Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１２Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.１４Mol／Ｌ シトルリン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.４
14．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.０
15．０.１５Ｍ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.０
16．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.５
17．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、８０mMol／Ｌ ＰＡＭＢＡ、ｐＨ７.２
18．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、８％ マンニトール、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.５
19．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、２％ ニコチンアミド、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
20．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、３２０mMol／Ｌ リシン、ｐＨ７.５
21．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.５
22．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、３２０mMol／Ｌ リシン、ｐＨ７.０
23．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、８０mMol／Ｌ ＥＡＣＡ、ｐＨ７.０
24．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、２％ Ｌ−ヒスチジン、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
25．０.１５Mol／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、０.２４Mol／Ｌ Ｌ−アルギニン、２％ しょ糖、１.０００KIE／ml アプロチニン、ｐＨ７.５
* 相当する凍結乾燥物を注射用水で再構築することにより製造したバッチ
【００３６】
第XIII因子を含有する単独成分としての本発明に係る処方物
26．１.５ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２.９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン×ＨＣｌ、ｐＨ７.４
27．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７.４
28．１.５ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２.９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４
29．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ グリシン、ｐＨ７.４
30．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２％ マンニトール、１０mMol／Ｌ Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ７.４
31．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２％ マンニトール、ｐＨ７.４
32．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ ＨＳＡ、ｐＨ７.４
33．５mMol／Ｌ ＥＤＴＡ、５０mMol／Ｌ トリスメチルアミン×ＨＣｌ、ｐＨ７.４
34．６ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ７.４
35．１.５ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、２.９２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５０mMol／Ｌ グリシルグリシン、ｐＨ７.４
36．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、１％ｌ−ヒスチジン、ｐＨ７.４
37．３ｇ／Ｌ Ｎａ3−クエン酸×２Ｈ2Ｏ、３８mMol／Ｌ グリシルグリシン、ｐＨ７.４
【００３７】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
Claims (5)
- 互いに分離した３つの成分、
（ｉ）フィブリノゲンを含まない、液体状態で貯蔵可能な安定化された血液凝固第XIII因子含有タンパク質調製物であって、クエン酸の生理的に許容される塩を安定剤として添加した調製物、
（ii）フィブリノゲンの凝集を防止または減少させるために０.０４Mol／Ｌを越えて０.２８Mol／Ｌ未満の濃度で、アルギニン、シトルリン、ニコチンアミドまたはこれらの混合物から選択されるカオトロープ物質が添加された、液体状態で貯蔵可能な安定化されたフィブリノゲン含有タンパク質調製物、および
（iii）トロンビン含有調製物
を含み、これらの成分が一緒に使用するために用意された１つの包装単位において提供されることを特徴とする、貯蔵可能な組織接着剤。 - （ｉ）第XIII因子タンパク質調製物に、さらなる安定剤として、
単糖類または二糖類または糖アルコール、および／または
グリシン、グリシルグリシン、アラニン、システイン、ヒスチジン、グルタミンからなる群から選択されるアミノ酸、またはグルタミン酸またはアスパラギン酸の生理的に許容される塩、および／または
界面活性剤
が添加されていることを特徴とする、請求項１に記載の組織接着剤。 - （ii）フィブリノゲン含有タンパク質調製物に、アプロチニン、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、ｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）、リジンおよびこれらの生理的に許容される塩からなる群から選択される抗線維素溶解剤がさらに添加されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組織接着剤。
- （ii）フィブリノゲン含有タンパク質調製物に、安定剤として、
有機カルボン酸の生理的に許容される塩、または
１種またはそれ以上のアミノ酸、または
単糖類または二糖類、または
糖アルコール、
またはこれらの混合物が添加されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織接着剤。 - 安定剤が、クエン酸または乳酸の生理的に許容される塩であることを
特徴とする、請求項４に記載の組織接着剤。
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