CN102741422A - 凝血因子ⅶ组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

凝血因子ⅶ组合物及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含与延伸重组多肽(XTEN)连接的因子Ⅶ凝血因子的组合物、编码所述组合物的分离的核酸和含有所述分离的核酸的载体和宿主细胞，以及制备所述组合物的方法和使用所述组合物治疗凝血因子相关的疾病、疾患和病症的方法。

Description

凝血因子Ⅶ组合物及其制备和使用方法
关于联邦资助研究的声明
本发明在由美国国立卫生研究院授予的SBIR基金2R44GM079873-02的政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年8月24日提交的美国临时申请No.61/236,493；2009年8月25日提交的美国临时申请No.61/236,836，2009年11月10日提交的美国临时申请No.61/280,955，2009年11月10日提交的美国临时申请No.61/280,956，以及2010年2月3日提交的美国申请No.12/699,761的优先权权益，所有这些申请，以及在代理人案号32808-72.201下随同提交的共同待决的申请，为了所有目的其全部内容以引用的方式并入本文。
发明背景
在血友病中，凝血受到缺乏某些血浆凝血因子的干扰。人因子IX(FIX)是一种丝氨酸蛋白酶的酶原，它是凝血级联的内源性途径的一个重要组分。在没有FIX缺乏的个体中，FIX的平均半衰期很短，约为18-24小时。在大约1/30000男性中发生的X-连锁疾病引起的功能FIX缺陷导致血友病B，也称为Christmas病，是以一位被发现缺乏该因子的叫做Stephen Christmas的年轻男孩命名的。已经记载了超过100个因子IX的突变；其中一些不引起症状，但许多导致明显的出血性疾病。如果不及时治疗，血友病B与损伤后无法控制的肌肉、关节和体腔内的出血有关，并可能导致死亡。此前，该疾病的治疗包括施用由来自供体库的人血浆制备的FIX，这具有随之而来的感染血源性病毒的风险，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)。最近，重组FIX产品已经市售。
外来提供的因子IX的体内活性受到蛋白质半衰期和凝血抑制剂(包括抗凝血酶III)的限制。因子IX组合物通常有短半衰期，这需要经常注射。此外，目前的基于FIX的疗法由于较差的生物利用度，需要静脉内施用。因此，需要当作为血友病(包括血友病B)的预防和/或治疗方案的一部分施用时具有延长的半衰期和保留活性的因子IX组合物。
因子VII是在肝脏中合成且作为具有约50kDa的分子量的单链酶原分泌入血中的凝血因子蛋白。FVII酶原通过蛋白水解性裂解被转化成活化形式(FVIIa)，并且该活性形式当与组织因子(TF)络合时能够将因子IX和因子X转化成它们的活性形式，导致快速凝血酶产生和血纤蛋白形成。因为rFVIIa的循环半衰期约2.3小时(“Summary Basis for Approval for NovoSeven”，FDA参考号96-0597)，所以对于血友病受试者和具有因子VII缺陷的受试者的出血病症的治疗，需要多次施用和频繁施用。
对治疗蛋白的化学修饰可以降低其体内清除率并随后增加血清半衰期。常见修饰的一个实例是添加聚乙二醇(PEG)部分，聚乙二醇(PEG)部分通常通过PEG上与胺基(例如赖氨酸侧链或N端)反应的醛或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团而与蛋白质偶联。然而，偶联步骤可导致需要分离的不均一产物混合物的形成，导致明显的产物损失和生产复杂性，并且得不到化学上完全均一的产物。而且，如果治疗蛋白结合位点附近的氨基酸侧链被PEG化过程所修饰，那么治疗蛋白的药理学功能可能受阻。Fc结构域与治疗蛋白的融合是增加治疗蛋白大小，因此降低通过肾的清除率的另一种方法。此外，Fc结构域赋予结合溶酶体并通过FcRn受体从溶酶体再循环的能力，这导致增加的药代动力学半衰期。不幸的是，Fc结构域未能在重组表达期间有效折叠，并易于形成被称为包涵体的不溶性沉淀。这些包涵体必须被溶解并且功能性蛋白质必须从错误折叠的聚集物复性，这种过程是耗时、低效且昂贵的。因此，依然需要具有增加半衰期的改善的凝血因子组合物，其能够以较低频率施用，和/或通过更简单的过程以更低成本生产。
发明概述
本发明涉及用于治疗或改善病症或增强与施用凝血因子IX和/或VII相关的参数的组合物和方法。具体地，本发明提供了包含一种或多种延伸重组多肽(XTEN)的融合蛋白的组合物。主题XTEN通常为非重复序列和非结构化构象。XTEN与选自因子IX(“FIX”)、因子VII(“FVII”)、因子VII-因子IX杂种和其序列变体的凝血因子(“CF”)连接，形成凝血因子-XTEN融合蛋白(“CFXTEN”)。在某种程度上，本公开涉及包含融合蛋白的药物组合物及其用于治疗凝血因子相关的疾病、病症或疾患。CFXTEN组合物与未连接XTEN的CF相比具有增强的药代动力学性质，其可允许更便利的给药和改善的药效。在一些实施方案中，本发明的CFXTEN组合物不具有选自以下的组分：聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗体和抗体片段。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的因子IX融合蛋白，其包含与选自表1的氨基酸序列具有至少约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％同一性的因子IX序列。具有这种序列同一性的因子IX进一步与具有至少约100至约3000个氨基酸残基的延伸重组多肽(XTEN)连接。在一个实施方案中，XTEN与FIX或FVII CF的C-端连接。在一些实施方案中，本发明提供了分离的因子VII融合蛋白，其包含与选自表2的氨基酸序列具有至少约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％同一性的因子VII。具有这种序列的因子VII与延伸重组多肽(XTEN)连接。
具有连接单个XTEN的单个FIX或单个FVII的CFXTEN的非限制性实例示于表41中。在一个实施方案中，本发明提供了与来自表41的CFXTEN相比具有至少约80％序列同一性，或者与来自表41的CFXTEN相比具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％序列同一性的CFXTEN组合物。在一些实施方案中，融合蛋白的CF和XTEN组分经由可通过蛋白酶(包括内源性哺乳动物蛋白酶)裂解的裂解序列连接。这类蛋白酶的实例包括但不限于FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa、FXa、凝血酶、弹性蛋白酶-2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20、TEV、肠激酶、鼻病毒3C蛋白酶和分选酶A，或选自表7的序列。在一个实施方案中，具有裂解序列的CFXTEN组合物与来自表42的CFXTEN相比具有至少约80％序列同一性的序列，或者与来自表42的CFXTEN相比具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或约100％序列同一性。然而，本发明还提供了用表1或表2的任一个CF序列替换表42的序列中的CF，以及用表4的任一个XTEN序列替换表42的序列中的XTEN，以及用表7的任何裂解序列替换表42的序列中的裂解序列。在具有裂解序列的CFXTEN实施方案中，通过蛋白酶从CF释放XTEN而裂解该裂解序列。在前述的一些实施方案中，一旦CF组分通过裂解序列的裂解而从XTEN释放，它就会变得具有生物活性或活性增加，其中促凝活性与未连接XTEN的相应的FIX或FVII相比至少为约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％。
本发明提供了分离的CFXTEN融合蛋白，其包含约36至约3000个氨基酸残基的第二XTEN，该第二XTEN可以与第一XTEN相同或可以不同，其中所述第二XTEN可以加入CF的任何两个相邻结构域之间，即在Gla、EFG1、EGF2、活化肽和蛋白酶结构域之间，或加入CF的结构域序列的现有环状结构域的序列内，如实施例中更完全描述的。在一个实施方案中，第一和第二XTEN可以是选自表4或9-13中任一者的氨基酸序列，或可以与选自表4和9-13的序列相比表现出至少至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性。在另一实施方案中，分离的融合蛋白包含约36至约3000个氨基酸残基的第二XTEN。融合蛋白可采用表6的多-XTEN构型或其变体。
本发明提供了包含连接因子VII的XTEN的CFXTEN组合物，该因子VII包含可通过相同或不同的促凝蛋白酶裂解的一个或多个异源裂解序列。在前述的一些实施方案中，因子VII包含加入或替换FVII序列部分的因子XI的异源序列，形成了因子VII-因子IX杂种序列变体。在一些实施方案中，将来自FIX活化肽结构域的部分或整个序列加入或替换桥连FVII组分的EFG2和蛋白酶结构域之间结构域的FVII序列，形成可以活化为凝血级联内源性系统的部分(例如，活化因子XI)的组合物。在这类情况中，因子VII-因子IXCFXTEN组合物可以在不存在组织因子的情况下由促凝蛋白酶活化，使得当这类因子缺乏时(例如，在血友病A或B中)或当存在对这些因子的抑制剂时，CFXTEN可以在内源性凝血途径中充当因子VIII和IX的旁路。在一个实施方案中，FVII-FIX序列变体加入全长FIX AP结构域加上至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个、或至少约6个、或至少约7个、或至少约8个、或至少约9个、或至少约10个、或至少约11个、或至少约12个或更多氨基酸，该氨基酸侧连在FIX AP结构域的R145-A146和R180-V181裂解位点的一侧或两侧上的氨基酸残基(例如，在12个侧翼氨基酸在N端侧而5个侧翼氨基酸在C端侧的情况中，序列RVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE)。
在另一实施方案中，在最佳比对时，CFXTEN FVII-FIX序列变体包含与序列：KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRV相比表现出至少至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或100％同一性的异源FIX序列。
在其它实施方案中，CFXTEN包含加入FIX AP的一部分的FVII-FIX序列变体，该FIX AP部分包括位于R145-A146裂解位点的一侧或两侧的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个、或更多氨基酸的序列(例如，在6个侧翼氨基酸在裂解位点任一侧上的情况中，序列TSKLTRAETVFP)，或位于R180-V181裂解位点的一侧或两侧的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个或更多氨基酸的序列(例如，在4个氨基酸在N端侧翼上且缬氨酸作为来自FIX的裂解位点的C端的情况中的序列和DFTRV)。在前述的一个实施方案中，在最佳比对时，CFXTENFVII-FIX序列变体包含与选自TSKLTRAETVFP和FNDFTRV的序列相比表现出至少至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或100％同一性的异源FIX序列。
在另一实施方案中，CFXTEN包含上文所公开的FVII-FIX序列变体，该FVII-FIX序列变体进一步包括与FVII组分C端和融合蛋白的XTEN组分之间的连接子相同的AP裂解序列，例如，FVII变体-AP序列-XTEN的N端至C端构型，由此当由与FVII向FVIIa转变的促凝蛋白酶相同的促凝蛋白酶裂解时，允许FVII变体组分从CFXTEN融合蛋白中释放。在一个实施方案中，任何前述实施方案的FVII-FIX CFXTEN都包括作为FVII-FIX序列和XTEN之间的连接子的因子XI裂解序列KLTRAET，由此使FVII变体组分从CFXTEN融合蛋白通过启动内源性凝血级联反应而释放。在一个实施方案中，本发明提供了具有与来自表43的序列相比表现出至少约80％、或至少约85％，或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的FVII-FIX杂种序列的CFXTEN。在其它实施方案中，本发明提供了具有加入的FIX-衍生的AP裂解序列的FVII-FIX序列变体，所述AP裂解序列未连接XTEN。在一个实施方案中，不含XTEN的FVII-FIX序列与来自表43的不含XTEN的序列相比表现出至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性。
在CFXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供了式I的融合蛋白：
(XTEN)x-CF-(XTEN)y      I
其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式II的融合蛋白：
(XTEN)x-(CF)-(S)y-(XTEN)y    II
其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子a；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白是式III：
(XTEN)x-(S)x-(CF)-(S)y-(XTEN)y  III
其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式IV的分离融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(XTEN)w-(AP)-(XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z  IV
其中对于每次出现独立地，Gla是FIX的Gla结构域；EGF1是FIX的EGF1结构域；EGF2是FIX的EFG2结构域；AP是FIX的激活肽；PRO是FIX的蛋白酶结构域；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；u是0或1；v是0或1；x是0或1；y是0或1；z是0或1，条件是u+v+w+x+z≥1；且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式V的分离的融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(AP1)-(XTEN)w-(AP2)-(XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z    V
其中对于每次出现独立地，Gla是FIX的Gla结构域；EGF1是FIX的EGF1结构域；EGF2是FIX的EFG2结构域；AP1是FIX的激活肽结构域的N端序列部分，其包括AP结构域的第一天然裂解序列；AP2是FIX的激活肽结构域的C端序列部分，其包括AP结构域的第二天然裂解序列；PRO是FIX蛋白酶结构域；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；u是0或1；v是0或1；x是0或1；y是0或1；z是0或1，条件是u+v+w+x+z≥1；且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式VI的分离融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(XTEN)w-(Pro)-(S)x-(XTEN)y  VI
其中对于每次出现独立地，Gla是FVII的Gla结构域；EGF1是FVII的EGF1结构域；EGF2是FVII的EFG2结构域；PRO是FVII的蛋白酶结构域；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；u是0或1；v是0或1；x是0或1；y是0或1，条件是u+v+w+y≥1；且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了式VII的分离融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)t-(EGF1)-(XTEN)u-(EGF2)-(AP1)v-(XTEN)w-(AP2)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z  VII
其中对于每次出现独立地，Gla是FVII的Gla结构域；EGF1是FVII的EGF1结构域；EGF2是FVII的EFG2结构域；PRO是FVII的蛋白酶结构域；AP1是FIX的激活肽结构域的N端序列部分，其包括天然裂解序列；AP2是FIX的激活肽结构域的C-端序列部分，其包括天然裂解序列；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；t是0或1；u是0或1；v是0或1；x是0或1；y是0或1；z是0或1，条件是t+u+w+z≥1；且XTEN是延伸重组多肽。在该实施方案中，CFXTEN组合物可以包含整个所述FIX激活肽结构域序列、或来自因子IX的激活肽结构域的一个或两个裂解序列，例如，如上文更完全描述的，位于R145-A146裂解位点侧翼的至少约3至约12个氨基酸的序列，以及位于R180-V181裂解位点侧翼的至少约1至约5个氨基酸的序列。本发明还涵盖表7中任何其它裂解序列替换AP裂解序列。
使用本文所公开的任何适当的体外测定(例如，表40的测定或实施例中所述的测定)，可以评估本文所述的实施方案的CFXTEN组合物的保留活性(包括在任何加入的XTEN-释放裂解位点裂解后)，以确定该构型在治疗凝血-因子相关的疾病、疾患或病症中用作治疗剂的适合性。在一个实施方案中，CFXTEN与未连接XTEN的天然CF相比表现出至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的活性。在另一实施方案中，通过酶促裂解连接CF和XTEN组分的加入的裂解序列而从CFXTEN释放的CF组分与未连接XTEN的天然CF相比表现出至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的活性。
所述CFXTEN组合物的XTEN具有至少约200、或至少约400、或至少约800、或至少约900、或至少约1000、或至少约2000，最多约3000个氨基酸残基。所述CFXTEN融合蛋白组合物的XTEN的特征在于它们具有下列特征的一种或多种：(a)至少第一XTEN包含显示与类似长度的选自表4所示序列的氨基酸序列具有至少约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％同一性的至少约200个连续氨基酸；(b)当通过TEPITOPE算法分析时，所述XTEN序列缺少预测的T细胞表位，其中所述TEPITOPE算法对所述XTEN序列中表位的预测是基于-5、或-6、或-7、或-8、或-9或更高的评分；(c)所述XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5、或甚至更小的序列评分；(d)天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的10％；(e)蛋氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的2％；(f)通过GOR算法确定，所述XTEN具有大于90％的无规卷曲形成、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的无规卷曲形成；(g)如通过Chou-Fasman算法确定，所述XTEN序列具有小于2％的α螺旋和2％的β折叠；和(h)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成所述XTEN的总氨基酸残基的超过约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％。
在另一实施方案中，本发明提供了CFXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于：天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的10％，甲硫氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的2％，所述XTEN序列具有小于5％的带正电荷的氨基酸残基，通过GOR算法确定所述XTEN序列具有大于90％的无规卷曲形成、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的无规卷曲形成；并且通过Chou-Fasman算法确定所述XTEN序列具有小于2％的α螺旋和2％的β折叠。在一些实施方案中，没有一种类型的氨基酸构成超过30％的CFXTEN的XTEN序列。
在另一实施方案中，本发明提供了CFXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于：XTEN序列的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％由非重叠序列基序组成，其中每个序列基序具有约9至约14个氨基酸残基，并且其中任何两个连续氨基酸残基的序列在每个序列基序中出现不超过两次，所述序列基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4至6个类型的氨基酸组成。在一个实施方案中，所述XTEN特征在于至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中所述基序选自表3。
在一些实施方案中，所述XTEN具有其中没有三个连续氨基酸是相同的序列，除非所述氨基酸是丝氨酸，在这种情况下，不超过三个连续氨基酸是丝氨酸残基。在其它实施方案中，所述CFXTEN的XTEN组分具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5、或更小的序列得分。在该段的实施方案中，所述XTEN特征为“基本上非重复的”。
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少第二XTEN的CFXTEN，其中所述XTEN序列与来自表4、表9、表10、表11、表12或表13的序列相比表现出至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性。
在一些实施方案中，CFXTEN融合蛋白与未连接XTEN的CF相比表现出增强的药代动力学性质，其中增强的性质包括但不限于与未连接XTEN的CF相比更长的终末半衰期、更大的曲线下面积、血药浓度在治疗窗内维持时间的增加、连续剂量之间的时间的增加导致血药浓度在治疗窗内、和随时间的可施用的摩尔剂量的降低，仍会导致血药浓度在组合物的治疗窗内。在一些实施方案中，施用给受试者的CFXTEN融合蛋白的终末半衰期增加至以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的CF的终末半衰期的至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍、或甚至更高。在其它实施方案中，施用给受试者的CFXTEN融合蛋白的终末半衰期为至少约12h、或至少约24h、或至少约48h、或至少约72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约144h、或至少约21日或更长。在其它实施方案中，增强的药代动力学性质由以下事实反映：CFXTEN融合蛋白在给定时段在治疗窗内维持的血药浓度是以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的CF的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍。与未连接XTEN的相应CF相比，半衰期和治疗窗内维持时间的增加允许较低频率的给药和施用给受试者的融合蛋白量(以摩尔当量表示)的减少。在一个实施方案中，使用治疗-有效剂量方案向受试者施用CFXTEN导致融合蛋白的血药水平的至少两个连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至使用类似剂量方案施用给受试者的未连接至XTEN的CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少8倍、或至少10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍，或更高。
在一些实施方案中，与未连接XTEN的生物活性蛋白相比，与XTEN连接时XTEN增强了CF的热稳定性，其中热稳定性通过在暴露于约37℃的温度下至少约7天之后测量生物活性的保留来确定。在前述一个实施方案中，与未连接XTEN的CF相比，生物活性保留时间增加至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、或约150％、至少约200％、至少约300％或约500％。
在一些实施方案中，构造分离的融合蛋白使之与未连接XTEN的相应CF相比具有降低的对清除受体的结合亲和力。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白对CF的清除受体表现出如下范围的结合亲和力：未连接XTEN的相应CF的结合亲和力的约0.01％-30％、或约0.1％至约20％、或约1％至约15％、或约2％至约10％。在另一实施方案中，亲和力降低的CFXTEN融合蛋白可以具有降低的活性清除和相应的半衰期增加，半衰期是未连接XTEN的相应CF的至少约3倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约12倍、或至少约15倍、或至少约17倍、或至少约20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。
在一些实施方案中，本发明提供了CFXTEN融合蛋白，其中CFXTEN在生理条件下表现出溶解度增加至未连接XTEN的CF的溶解度的至少3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。
在一些实施方案中，通过尺寸排阻色谱测定，CFXTEN融合蛋白表现出与实际分子量相比增加的表观分子量。在某些实施方案中，包含FIX和至少第一XTEN的CF表现出至少约400kD、或至少约500kD、或至少约700kD、或至少约1000kD、或至少约1400kD、或至少约1600kD、或至少约1800kD、或至少约2000kD的表观分子量，而融合蛋白的每个FIX组分的实际分子量为约50kD且融合蛋白的分子量的范围为约70至约125kDa。在其它实施方案中，包含FVII和至少第一XTEN的CF表现出至少约400kD、或至少约500kD、或至少约700kD、或至少约1000kD、或至少约1400kD、或至少约1600kD、或至少约1800kD、或至少约2000kD的表观分子量，而融合蛋白的每个FIX组分的实际分子量为约50kD且融合蛋白的分子量为约70至约125kDa。因此，CFXTEN融合蛋白的表观分子量可以是融合蛋白的实际分子量的约6倍、或约8倍、或约10倍、或约12倍、或约15倍。在一些情况下，本文所公开的任何实施方案的分离的CFXTEN融合蛋白在生理条件下表现出大于约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约10、或大于约15的表观分子量因子。
在一些实施方案中，治疗有效剂量的式I-VII之一的融合蛋白施用给有相应需要的受试者可以导致在融合蛋白治疗窗内维持的时间增加至以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的相应CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍或更多。在其它情况下，治疗有效剂量的式I-VII的实施方案的融合蛋白施用给有相应需要的受试者可以导致与以类似剂量施用的未连接XTEN的CF相比，维持治疗有效剂量方案所必需的连续剂量之间时间增加至少48h、或至少72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约7天、或至少约14天、或至少约21天。
所公开的组合物的融合蛋白可以被设计为具有不同构型，CF的N端至C端和XTEN以及任选的间隔区序列，包括但不限于XTEN-CF、CF-XTEN、XTEN-S-CF、CF-S-XTEN、XTEN-CF-XTEN、CF-CF-XTEN、XTEN-CF-CF、CF-S-CF-XTEN、XTEN-CF-S-CF及其多聚体。如本文所公开的，构型的选择可以赋予特定的药代动力学性质、理化性质或药理性质，包括就加入的裂解序列而言、CF的释放伴随活性增加。
在一些实施方案中，所述CFXTEN融合蛋白特征在于：(i)与在另外的等效剂量下施用于受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，它在施用于受试者时具有更长的半衰期；(ii)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少XTEN的相应凝血因子相比，当较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积(AUC)；(iii)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少XTEN的相应凝血因子相比，当较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的治疗效应；(iv)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积(AUC)；(v)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的治疗效应；(vi)与以另外等同的剂量期施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积(AUC)；或(vii)与以另外等同的剂量期施用给受试者的未连接XTEN的相应凝血因子相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的治疗效应。
本发明提供了制备包含与一个或多个延伸重组多肽(XTEN)融合的因子VII或因子IX或因子VII-因子IX杂种凝血因子的融合蛋白的方法，该方法包括：(a)提供包含编码所述融合蛋白的重组多核苷酸分子的宿主细胞；(b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；和(c)从培养物中回收所述融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，融合蛋白的凝血因子与选自表1或表2的序列相比具有至少90％序列同一性。在该方法的另一实施方案中，所表达的融合蛋白的一个或多个XTEN与选自表4的序列相比具有至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％序列同一性。在该方法的另一实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在该方法的另一实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在该方法的另一实施方案中，分离的融合蛋白以基本上可溶的形式从宿主细胞的细胞质中回收。
本发明提供了包含选自以下的多核苷酸序列的分离的核酸：(a)编码前述实施方案任一个的融合蛋白的多核苷酸，或(b)(a)的多核苷酸的互补体。在一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其包含与以下相比具有至少80％序列同一性、或约85％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％序列同一性的多核苷酸序列：(a)选自表41和表42的类似长度的多核苷酸序列；或(b)(a)的多核苷酸的互补体。本发明提供了包含与本段所述的上述实施方案任何一个的核酸的表达载体。在一个实施方案中，前述表达载体还包含与多核苷酸序列可操作连接的重组调控序列。在另一实施方案中，前述表达载体的多核苷酸序列与编码分泌信号序列的多核苷酸在框内融合，所述分泌信号序列可以是CF天然信号序列。本发明提供了宿主细胞，其包含本段描述的上述任何实施方案的表达载体。在一个实施方案中，所述的宿主细胞是真核细胞。在另一实施方案中，所述的宿主细胞是CHO细胞。在另一实施方案中，所述是宿主细胞是HEK细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含前述实施方案的任何一个的融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括：包装材料和包含前述实施方案的药物组合物的至少第一容器以及标识所述药物组合物以及存储和处理条件的标签，以及关于所述药物组合的重建和/或施用给受试者的一张说明。
本发明提供了治疗受试者凝血紊乱或凝血因子相关的疾病、疾患或病症的方法，该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的前述实施方案任一个的CFXTEN融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，凝血因子相关病症选自出血疾患(例如，血小板功能缺损、血小板减少或von Willebrand病)、凝血紊乱(凝血的任何疾患，包括凝血因子缺乏)、血友病B(又称为Christmas病)、因子IX-相关的出血疾患、因子VII缺乏、血友病A、血管损伤、未患血友病受试者的失控出血、创伤或手术引起的出血、由抗凝治疗引起的出血和由肝病引起的出血。在治疗方法的一个实施方案中，所述凝血紊乱是血友病A。在治疗方法的一个实施方案中，所述凝血紊乱是血友病B。在治疗方法的另一实施方案中，所述凝血紊乱是因子VII缺乏。在治疗方法的另一实施方案中，将所述CFXTEN施用于受试者以控制出血事件。在治疗方法的另一实施方案中，将包含因子VII-因子IX序列杂种的CFXTEN施用于受试者以控制出血事件，其中所述CFXTEN由内源性凝血级联的促凝蛋白酶(例如，活化因子XI)活化。在另一实施方案中，本发明提供了治疗受试者凝血因子缺乏的方法，该方法包括：向所述受试者施用包含治疗有效量的本文所提供的因子VII的组合物。
在一些实施方案中，组合物可以皮下、肌肉内或静脉内施用。在一个实施方案中，组合物以治疗有效量施用，其中所述施用导致与以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的融合蛋白的相应CF相比，在融合蛋白的治疗窗内维持的时间增加。在治疗窗内维持的时间增加至未连接XTEN的CF的至少3倍，或者可选地是未连接XTEN的相应CF的至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。在治疗方法的一些实施方案中，(i)与以另外相同的剂量方案施用的未连接XTEN的相应凝血因子相比，施用较小摩尔量(例如，约1/2、或约1/3、或约1/4、或约1/5、或约1/6、或约1/8、或约1/100或更少)的所述融合蛋白，并且所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应；(ii)与使用另外相同的剂量的未连接XTEN的相应凝血因子相比，所述融合蛋白以较低频率(例如，每2天一次、约每7天一次、约每14天一次、约每21天一次、或约每月一次)施用，并且所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应；或(iii)与以另外相同的剂量方案的未连接XTEN的相应凝血因子相比，施用累积较低摩尔量的所述融合蛋白(例如，约5％、或约10％、或约20％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％)，所述融合蛋白达到与未连接XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应。所述累积更低的摩尔量是针对至少约一周、或约14天、或约21天、或约一个月的时段的测量。在治疗方法的一些实施方案中，治疗效应是选自以下的测量参数：凝血因子血药浓度、凝血酶原(PT)测定、部分活化凝血酶原(aPTT)测定、出血时间测定、全血凝血时间(WBCT)和血栓弹力描记法。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，包括利用使用治疗有效剂量方案施用的多次连续剂量的药物组合物给受试者施用上述药物组合物。在前述的一个实施方案中，所述治疗有效剂量方案可以导致所述融合蛋白的血药水平的至少两个连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至以类似剂量方案施用给受试者的未连接所述融合蛋白的相应融合蛋白的CF的至少3倍、或可选地至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。前述另一实施方案中，与使用治疗有效方案施用给受试者的未连接融合蛋白的相应生物活性蛋白组分相比，使用药物组合物的融合蛋白的较低频率给药或较低总剂量(以摩尔计)施用融合蛋白导致凝血因子相关的疾病的至少一个测量参数的改善。
本发明还提供了包含前述实施方案任何一个的融合蛋白的组合物在制备用于治疗有相应需要的受试者的疾病、疾患或病症的药剂中的用途。在前述一个实施方案中，所述疾病、疾患或病症选自出血疾患、凝血紊乱、血友病B(又称为Christmas病)、因子IX-相关的出血疾患、因子VII缺乏、血管损伤、创伤或手术引起的出血、由抗凝治疗和肝病引起的出血。所公开的实施方案的任何一个可以根据感兴趣的应用而单独实施或者组合实施。
通过引用并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用的方式并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请明确且单独地被指明而通过引用的方式并入。
附图简述
本发明的特征和优势可以参考以下详述和列出示例性实施方案的附图来进一步解释。
图1示出了示例性CFXTEN(FIX-XTEN)融合蛋白的示意图。图1A示出天然FIX的结构域构造，该天然FIX具有γ-羧基谷氨酸盐结构域、EGF1和EGF2结构域、活化肽和蛋白酶结构域，其中XTEN在C端连接。箭头指示活化肽结构域的裂解位点。图1B示出具有经由裂解序列连接至C端的XTEN多肽的FIX分子，并指示蛋白水解性裂解释放XTEN的位点(箭头指示活化肽结构域的裂解位点和XTEN的释放点)。
图2显示FIX-XTEN的CXTEN构型和缔合的蛋白酶裂解位点的若干实例。图2A示出具有在FIX的活化肽内的两个蛋白水解性裂解位点的FIX-XTEN(箭头)，以及无裂解位点连接子的C端XTEN。图2B的构型与图2A相似，但C端XTEN经由裂解序列连接，箭头指示释放位点。图2C示出FIX-XTEN的三种构型，其中XTEN在FIX的不同结构域之间整合。图2D示出具有插入天然裂解位点间的活化肽中的XTEN部分的FIX-XTEN，一旦FIX蛋白水解性活化，所述FIX-XTEN将会释放XTEN。图2E显示包含插入不同结构域之间的多XTEN序列并且在C端添加可释放的XTEN的FIX-XTEN。图2F显示XTEN已插入FIX环状结构域内情况下的FIX-XTEN。
图3是凝血级联的示意图，其示出外源性和内源性途径。
图4示出FVII-XTEN的CXTEN构型的若干实例。图4A示出并未活化的FVII-XTEN。图4B示出在FVII-XTEN中肽已裂解，形成活化的FVIIa-XTEN；图4C显示具有可释放XTEN的裂解序列的FVII-XTEN组合物，其中FVII组分已被活化，含有活化蛋白酶(AP)的裂解位点和释放蛋白酶(RP)的第二裂解位点。图4D示出含有释放蛋白酶的裂解位点的活化FVIIa-XTEN的组合物。
图5显示使用内部XTEN的FVII-XTEN设计方法的策略。图5A-D示出在FVII结构域(左边是未活化的FVII而在右边是FVII活化形式)的边界，XTEN插入的示例性位点(A：XTEN在Gla和EGF1结构域之间插入，B：XTEN在EGF1和EGF2之间插入。C：XTEN在活化肽的C端插入，D：XTEN在活化肽的N端插入)。图5E示出FVII-XTEN的实例，其中XTEN位于独立的结构域融合蛋白内的外环内，左边是未活化的FVII而右边是FVIIa。相对于显示为粗线的XTEN，FVII中的活化肽显示为细线。
图6显示与图5基本上相同的构建体，但是在每个构建体的C端连接有XTEN。
图7示出一些不同部位的示意图，其中XTEN可以内插入凝血因子FVII或FIX序列。
图8是凝血系统主要组分的示意图。图7A：具有内源性和外源性级联组分的正常凝血系统。图7B显示一种变化，在该变化中FVII-XTEN的无活性/低活性形式(FVII*)意欲在施用后被内源性活化时旁路内源性系统的FIX和FVIII组分。
图9是通过对来自pBC0014CHO-K1转化体的初步筛选的克隆进行ELISA而得到的细胞群集大小分布(灰色条)和以ng/ml计的FVII ELISA滴度(黑色条)的图(由于空间不够，在条的下面并没有标记所有的克隆)(参见实施例25的实验细节)。根据ELISA滴度低至高(从左至右)分选克隆。
图10是前pBC0014克隆的细胞计数(白色条)和以ng/ml计的FVII滴度(黑色条)的图(参见实施例25的实验细节)。根据ELISA滴度低至高(从左至右)分选克隆。
图11是FVII滴度与前pBC0014克隆的细胞计数的比值的图(参见实施例25的实验细节)。根据比值低至高(从左至右)分选克隆。
图12是根据ELISA、凝血、ELISA/细胞计数和凝血/细胞计数比值的前pBC0014克隆的蛋白质印迹(参见实施例25的实验细节)。克隆6G1表达了截短产物，且并未进一步评估。
图13是根据ELISA、凝血、ELISA/细胞计数和凝血/细胞计数比值的前pBC0016克隆的蛋白质印迹(参见实施例25的实验细节)。
图14是根据ELISA、凝血、ELISA/细胞计数和凝血/细胞计数比值的前pBC0018克隆的蛋白质印迹(参见实施例25的实验细节)。克隆3B2表达了截短产物，且并未进一步评估。
图15示出通过抗GLA亲和色谱纯化FVII-AE864(参见实施例26的实验细节)。SDS-PAGE分析表明从浓缩的上清液中纯化FVII-AE864和纯度＞90％的EDTA洗脱级分。
图16示出通过FXa处理将FVII-XTEN融合物活化为FVIIa-XTEN融合物(参见实施例26的实验细节)。SDS-PAGE分析表明在Fxa处理后，而不是在未处理的样本中，轻链条带在还原条件下的外观。此外，上面的条带出现下移，这表明轻链损失。
图17示出表明FVII-XTEN融合物自体活化为FVIIa-XTEN融合物的SDS-PAGE(参见实施例26的实验细节)。SDS-PAGE分析表明在FXa处理后且在4℃下用CaCl2高浓度孵育后，轻链条带在还原条件下的外观。此外，上面的条带出现下移，这表明轻链损失。
图18示出FVII-AE864和FVII-AE288的SEC分析(参见实施例26的实验细节)。SEC示出在柱的空体积(～22ml)处有极低污染而无聚集物的单分散群。
图19示出由阴离子交换色谱纯化FVII-AE864(参见实施例26的实验细节)。色谱图描绘了来自Macrocap Q柱的总蛋白质含量和FVII活性物的洗脱图，大量活性物迟于污染蛋白质洗脱，产生净5倍纯化。
图20示出由疏水相互作用色谱纯化FVII-AE864(参见实施例26的实验细节)。色谱图描绘了来自toyopearl phenyl柱的总蛋白质含量和FVII活性物的洗脱图，大量活性物早于污染蛋白质洗脱，产生净2倍纯化。
图21示出两种色谱法的产量，其表明用阴离子交换色谱从单体FVII-AE864中移除了聚集蛋白(参见实施例26的实验细节)。图21A是描绘来自macrocap Q柱的FVII-XTEN洗脱图的色谱图，双峰在缓冲相关的前峰后洗脱。图21B示出前后macrocap Q峰的SEC色谱图，表明在前峰中没有聚集物。
图22示出ELISA或aPTT测定的结果，该结果示出与FIX-XTEN相比，FIX/cFXI/XTEN具有增高的活性(参见实施例29的实验细节)。短暂表达的FIX构建体通过ELISA来测定抗原含量，并通过基于aPTT的测定来测定活性。当FIX-XTEN与FIX/cFXI/XTEN构建体的抗原含量相似时，活性显著增加。在测定中这种增加归因于FXI蛋白酶的特异作用，因为FIX/cTEV/XTEN与FIX-XTEN并没有示出显著不同的活性。记录FIX样本的ELISA滴度为197ng/ml且在图的比例之外。
图23示出给大鼠皮下施用单次剂量后药代动力学的图，示出导出的当量FIX浓度，如实施例30所述。
图24示出给大鼠皮下施用单次剂量后药代动力学的图，示出导出的当量FIX浓度，如实施例31所述。
图25示出在皮下或静脉内施用与不同长度的非结构化多肽连接的GFP的不同组合物的单次剂量后，食蟹猴的药代动力学的图(血浆浓度)，如实施例39所述。所述组合物是GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-Y576和XTEN_AD836-GFP。在注射后不同时间分析血样，并使用抗GFP的多克隆抗体用于捕获以及使用相同多克隆抗体的生物素化制剂用于检测，通过ELISA测定GFP在血浆中的浓度。结果显示为相对于给药后时间(小时)的血浆浓度，并且示出，特别是XTEN_AD836-GFP(具有最长序列长度的XTEN的组合物)的半衰期显著增加。构建体的序列长度越短，GFP-L288半衰期越短。
图26示出来自与GFP的N端融合的融合蛋白XTEN_AE864的稳定性研究的样本SDS-PAGE凝胶(参见实施例40)。使GFP-XTEN在食蟹猴血浆和大鼠肾裂解物中于37℃下孵育达7天。此外，还评估了施用给食蟹猴的GFP-XTEN。在第0、1和7天提取样本并通过SDS PAGE分析，随后使用Western分析和抗GFP抗体进行检测。
图27示出用于来自LCW546、LCW547和LCW552的克隆的N端序列中第三和第四密码子的三个随机文库(参见实施例14的实验细节)。如所示的，将文库设计为第三和第四残基被修饰而使得允许的XTEN密码子的所有组合存在于这些位置。为了使每个文库包含所有这些允许的XTEN密码子，设计具有第三和第四残基密码子多样性的编码12个氨基酸的9对寡核苷酸、使其退火并连接到NdeI/BsaI限制酶消化的填充载体pCW0551(填充片段-XTEN_AM875-GFP)，并转化入大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得三个文库LCW0569、LCW0570和LCW0571的菌落。
图28示出如实施例15所述优化步骤之后针对前75个克隆的GFP荧光信号的再测试的直方图，相对于基准CBD_AM875构建体。结果指示几个克隆目前优于基准克隆。
图29是为联合N端48个氨基酸的两个区域的密码子优化偏好而进行的重组方法的示意图(参见实施例16的实验细节)。该方法在XTEN蛋白的N端产生新的48mer，用于评估表达优化，所述表达优化得到可能是XTEN蛋白表达的解决方案的前导序列，其中XTEN在CF的N端。
图30示出证实获自XTEN N端密码子优化实验的优选密码子表达的SDS-PAGE凝胶，与在构建体序列的N端包含CBD前导序列的基准XTEN克隆相比较，如实施例17所述。
图31是XTEN的组装、产生和评估中代表性步骤的示意流程图。
图32是编码融合蛋白的CFXTEN多核苷酸构建体组装中代表性步骤的示意流程图。单个寡核苷酸501被退火成序列基序502，例如12氨基酸基序(“12-mer”)，其随后与含有BbsI和KpnI限制性位点503的寡聚体连接。来自文库的其它序列基序被退火成12-mer，直到获得期望长度的XTEN基因504。将XTEN基因克隆到填充载体。在这种情况下，该载体编码任选的Flag序列506，随后是两侧具有BsaI、BbsI和KpnI位点的终止序列507和FVII基因508，得到编码XTEN-FVII融合蛋白的基因500。
图33是在编码包含CF和XTEN的融合蛋白的基因的组装、其表达和作为融合蛋白回收、及其作为候选CFXTEN产物的评估中代表性步骤的示意流程图。
图34是使用不同的加工策略设计CFXTEN表达载体的示意图。图34A示出编码与FVII编码序列3′端融合的XTEN的表达载体。注意，该载体中不需要额外的前导序列。图7B描绘了编码与FVII编码序列5′端融合的XTEN的表达载体，其具有CBD前导序列和TEV蛋白酶位点。图7C描绘了图7B中CBD和TEV加工位点被优化的N端前导序列(NTS)所替代的表达载体。图7D描绘了编码NTS序列、XTEN、VFII编码序列和第二个XTEN编码序列的表达载体。
图35示出根据已知分子量的蛋白质标准品测量的胰高血糖素-XTEN构建体样本的尺寸排阻色谱分析结果，其中图形输出为吸光度对保留体积，如实施例37所述。胰高血糖素-XTEN构建体是1)胰高血糖素-Y288；2)胰高血糖素Y-144；3)胰高血糖素-Y72；和4)胰高血糖素-Y36。结果指示表观分子量随着XTEN部分长度的增加而增加。
图36示出天然FIX、天然FVII和FVII-FIX序列杂种部分间的序列比对，这些序列具有加入跨EGF2和Pro结构域分子部分的AP结构域不同部分。该图例提供了构建体名称。单独序列中的空位(破折号)表示FIX的非同源性延伸，但是为连续的、连接的序列。加下划线的氨基酸是FIX-衍生序列。
发明详述
在描述本发明实施方案之前，要理解，这些实施方案仅作为例子而提供，并且可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。本领技术人员现在将可以想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法和材料。冲突时，以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是示例说明性的而不旨在限制。本领技术人员现在会想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。
定义
除非另外规定，如本文使用的以下术语具有归属于它们的含义。
除非上下文另外清楚地指明，说明书和权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或分支的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其间可以插入非氨基酸。这些术语还包括例如通过二硫键形成、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作(例如与标记组分偶联)而被修饰的氨基酸聚合物。
本文使用的术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准的单字母或三字母密码指定氨基酸。
术语“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光异构体形式：甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
应用于序列并在本文使用的术语“非天然存在的”指没有哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列的对应物、与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不互补、或与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，适当比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共享不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更低的氨基酸序列同一性。
术语“亲水性”和“疏水性”指物质具有的与水的亲和力程度。亲水性物质对水具有强亲和力，易于溶解于水、与水混合或被水润湿，而疏水性物质基本缺乏对水的亲和力，易于排斥水并不吸收水并且不易于溶解于水或与水混合或被水润湿。氨基酸可以根据其疏水性来表征。已经发展了许多量表。一个实例是由Levitt，M等，J Mol Biol(1976)104：59发展的量表，其列于Hopp，TP等，Proc Natl Acad Sci U S A(1981)78：3824。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别关注的亲水性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
“片段”是保留至少一部分治疗活性和/或生物活性的天然生物活性蛋白的截短形式。“变体”是与天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质，保留了生物活性蛋白的至少一部分治疗活性和/或生物活性。例如，变体蛋白可以与参考生物活性蛋白相比共享至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“生物活性蛋白部分”包括例如通过定点诱变、插入而有意修饰或通过突变而意外修饰的蛋白质。
如本文使用的，“内部XTEN”指已插入凝血因子序列中的XTEN序列。内部XTEN可以通过XTEN序列插入例如FIX或FVII的凝血因子的序列中，通过在凝血因子的两个相邻氨基酸之间、或结构域之间插入、或其中XTEN替代凝血因子的部分、内源性序列而构建。
如本文使用的，“末端XTEN”指已与凝血因子的N端或C端融合的、或融合入其中的，或与蛋白水解性裂解序列在凝血因子的N或C端融合的XTEN序列。末端XTEN可以与凝血因子的天然末端融合。或者，末端XTEN可以替代凝血因子的末端序列。
术语“XTEN释放位点”指CFXTEN融合蛋白中可以被哺乳动物蛋白酶识别和裂解，引起XTEN或XTEN的部分从CFXTEN融合蛋白中释放的序列。如本文使用的，“哺乳动物蛋白酶”意指正常存在于哺乳动物的体液、细胞或组织中的蛋白酶。XTEN释放位点可以设计为由各种哺乳动物蛋白酶(又称为“XTEN释放蛋白酶”)裂解，例如FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17、MMP-20、或在凝血事件期间存在的任何蛋白酶。
适用于本文提供的CFXTEN多肽的形式的“活性”，指保留天然凝血因子的生物活性，其中“生物活性”指体外或体内生物学功能或效应，包括但不限于受体或配体结合的酶促活性、或凝血因子对本领域通常已知的凝血因子的效应。
适用于形成本文提供的CFXTEN多肽的形式的“治疗效应”指生理效应，包括但不限于人或其它动物中疾病或病症的治愈、缓和、逆转、缓解或预防、或指以其它方法增强人或动物的生理或精神状态。“治疗有效量”意指有效预防、减轻、逆转或缓解疾病或病症的症状(例如，出血事件)或延长所治疗受试者的存活的化合物的量。治疗有效量的测定完全是在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。
“宿主细胞”包括可以是或已经是主题载体的受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于天然、意外或有意的突变，后代不一定与原始亲代细胞完全相同(形态方面或者总DNA互补体的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。
当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”指已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是通常会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。对于本领域技术人员明显的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以使之与其天然存在的对应物相区分。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在对应物相区分，因为浓度或每体积的分子数目一般大于其天然存在的对应物。一般而言，通过重组方式制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
“分离的”多核苷酸或多肽编码核酸或其它多肽编码核酸是从所述多肽编码核酸的天然来源中正常伴随的至少一种污染核酸分子鉴定和分离的核酸分子。分离的多肽编码核酸不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的多肽编码核酸分子可与天然细胞中存在的特定多肽编码核酸分子相区分。然而，分离的多肽编码核酸分子包括正常表达所述多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分子，此时，例如，核酸分子处于不同于天然细胞核酸分子的染色体内或者染色体外位置。
“嵌合”蛋白含有至少一个融合多肽，包含与天然存在不同的序列位置的区域。所述区域可以正常存在于不同的蛋白质中并且在融合多肽中汇集在一起；或者它们可以正常存在于相同的蛋白质中但在融合多肽中处于新的排列。嵌合蛋白可以通过例如化学合成或者通过产生并翻译其中肽区域以期望关系编码的多核苷酸来产生。
“偶联的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文可互换使用。这些术语指通过包括化学偶联或重组方式在内的任何方式使两个或多个化学元素或组分结合在一起。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述序列是可操作连接的。一般而言，“可操作连接”表示被连接的DNA序列是连续的，并且在阅读相内或框内。“框内融合”指两个或多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF正确阅读框的方式结合形成连续更长的ORF。因此，得到的重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或多个片段的单个蛋白质(所述片段通常本质上不会如此结合)。
多肽上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中以氨基端至羧基端方向的氨基酸顺序，序列中彼此邻接的残基在多肽一级结构中是连续的。“部分序列”是已知在一个或两个方向包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。
“异源的”指衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。例如，从其天然编码序列取出并可操作连接至不同于天然序列的编码序列的富含甘氨酸序列是异源的富含甘氨酸序列。术语“异源的”应用于多核苷酸、多肽时指所述多核苷酸或多肽衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合体形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以发挥已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、通过连锁分析确定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸序列中可以插入非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分的偶联。
术语“多核苷酸的互补体”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子，使得互补体可以与具有完全保真性的参考序列杂交。
“重组的”应用至多核苷酸时指该多核苷酸是体外克隆、限制酶消化和/或连接步骤以及产生可能在宿主细胞中表达的构建体的其它程序的各种组合的产物。
术语“基因”和“基因片段”在本文可互换使用。它们指含有能够在被转录和翻译之后编码特定蛋白质的至少一个开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要该多核苷酸含有至少一个开放阅读框，该开放阅读框可以涵盖整体编码区或其片段。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸构成的基因。
“同源性”或“同源的”指两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用例如BestFit等程序来测定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵例如blosum45或blosum80来优化同一性、相似性或同源性评分。优选地，同源的多核苷酸是在本文定义的严格条件下杂交的那些序列并且与那些序列相比具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％、更优选97％、更优选98％和甚至更优选99％序列同一性。
“连接”指在两个核酸片段或基因之间形成磷酸二酯键而使它们连接在一起的过程。为了使DNA片段或基因连接在一起，DNA末端必须彼此相容。在一些情况下，末端在核酸内切酶消化之后即是相容的。然而，可能必须首先将通常由核酸内切酶消化后产生的交错末端转化成平末端以使它们适合连接。
术语“严格的条件”或“严格的杂交条件”包括提及多核苷酸将以比其它序列可检测地更大程度(例如，超过背景至少2倍)与其靶序列杂交的条件。一般而言，杂交的严格性部分地参考进行洗涤步骤的温度和盐浓度来表示。通常，严格条件是如下条件：其中pH 7.0至8.3下的盐浓度小于约1.5M Na离子、通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的多核苷酸(例如，10至50个核苷酸)是至少约30℃并且对于长的多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60℃一例如，“严格的条件”可以包括在37℃下50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在0.1×SSC/1％SDS中于60℃下至65℃下三次洗涤，每次15分钟。可选地，可以使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以从约0.1至2×SSC变化，其中SDS以约0.1％存在。这种洗涤温度通常被选择为比确定离子强度和pH下特定序列的热力学熔点低约5℃至20℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。计算Tm的方程和核酸杂交条件是熟知的并且可以参见Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.；特别参见第2卷第9章。通常，使用阻断试剂来阻断非特异性杂交。这种阻断试剂包括例如约100-200μg/ml的经剪切和变性的鲑鱼精子DNA。在特定情况下，例如对于RNA:DNA杂交，还可以使用有机溶剂，例如浓度约35-50％v/v的甲酰胺。对这些洗涤条件的有用改变对于本领域普通技术人员而言是明显的。
术语“同一性百分比”和“同一性％”应用于多核苷酸序列时指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。这种算法可以标准化且可重复的方式在被比较的序列中插入空位以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。可以对整体确定的多核苷酸序列长度测量百分比同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多核苷酸序列的片段长度测量百分比同一性，所述片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附图或序列表中示出的序列所支持的任何片段长度可以被用来描述可被测量百分比同一性的长度。
有关本文鉴定的多肽序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为：比对序列并引入空位(如果必要)以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，询问序列中与另一个参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比。旨在测定百分比氨基酸序列同一性的比对可以本领域技术中的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括对被比较的序列的全长实现最大比对所需的任何算法。可以对整体确定的多肽序列长度测量百分比同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多肽序列的片段长度测量百分比同一性，所述片段例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附图或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可以被用来描述可被测量百分比同一性的长度。
本文多肽上下文中使用的术语“非重复性”指在肽或多肽序列中缺乏或有限程度的内部同源性。例如，术语“基本上非重复的”可以指例如序列中很少或没有四个连续氨基酸是相同的氨基酸类型，或者多肽具有10或更小的子序列评分(下文定义)，或者没有构成多肽序列的序列基序从N端至C端顺序的模式。本文多肽上下文中使用的术语“重复性”指肽或多肽序列中内部同源性程度。相反，“重复的”序列可以含有短氨基酸序列的多个相同拷贝。例如，目标多肽序列可以被分成n-mer序列，并且相同序列的数目可以被计数。高度重复的序列含有大比例的相同序列，而非重复的序列含有很少的相同序列。在多肽上下文中，序列可以含有确定或可变长度的较短序列或基序的多个拷贝，其中基序本身具有非重复序列，使全长多肽是基本上非重复的。其中测量非重复性的多肽长度可以是3个氨基酸至约200个氨基酸、约6至约50个氨基酸、或约9至约14个氨基酸。多核苷酸序列的上下文中使用的“重复性”指序列内部同源性程度，例如，给定长度的相同核苷酸序列的频率。重复性可以例如通过分析相同序列的频率来测量。
“载体”是优选在适当宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供不止一种上述功能的载体。“表达载体”是被引入适当宿主细胞时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含可以用于产生期望的表达产物的表达载体的适合的宿主细胞。
“血清降解抗性”应用于多肽时指多肽在血液或其组分中抵抗降解的能力，血清或血浆中通常包括蛋白酶。血清降解抗性可以通过使蛋白质与人(或视情况为小鼠、大鼠、猴)血清或血浆通常在约37℃混合通常一定天数(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)来测量。可对这些时间点的样本进行蛋白质印迹分析，并使用抗体检测蛋白质。抗体可以针对蛋白中的标签。如果蛋白质在印迹(western)上显示单条带，其中蛋白质大小与注射蛋白质大小相同，则没有发生降解。在该示例性方法中，通过蛋白质印迹或等效技术判断50％蛋白被降解的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
本文使用的术语“t1/2”指终末半衰期，计算为ln(2)/Kel。Kel是通过log浓度对时间曲线的终末线性部分的线性回归而计算的终末消除速率常数。半衰期通常指活生物体中储存的施用物质的半数被正常生物过程代谢或消除所需的时间。术语“t1/2”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文可互换使用。
“主动清除”指下述机制：通过该机制将CF从循环中移除，除了通过过滤或凝血以外，且该机制包括从CF的细胞、受体、代谢或降解介导的循环中移除。
“表观分子量因子”和“表观分子量”是相关术语，指特定氨基酸序列表现出的表观分子量的相对增加或降低的量度。表观分子量使用尺寸排阻色谱(SEC)和类似方法与球状蛋白标准品相比较来测定，并且以“表观kD”单位来度量。表观分子量因子是表观分子量和实际分子量之间的比率；后者通过基于氨基酸组成而加合组成中每种氨基酸的计算分子量，或通过对比SDS电泳凝胶中的分子量标准评估来预测。
术语“流体动力学半径”或“Stokes半径”是分子在溶液中的有效半径(Rh，以nm计)，通过假设它是穿过溶液并受溶液粘性抵抗的主体来测量。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径测量与‘表观分子量因子’相关联，表观分子量因子是更直观的量度。蛋白质的“流体动力学半径”影响其在水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径由其分子量以及其结构(包括形状和致密度)决定。测定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，例如通过使用尺寸排阻色谱(SEC)，如美国专利No.6,406,632和No.7,294,513所述。大多数蛋白质具有球形结构，这是蛋白质在最小流体动力学半径下可以具有的最致密的三维结构。一些蛋白质具有随机和开放的非结构化或‘线性’构象，因此与类似分子量的典型球形蛋白质相比具有大得多的流体动力学半径。
“生理条件”指活宿主中的一组条件以及模拟活受试者那些条件的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经确立了用于体外分析的许多生理相关条件。一般而言，生理缓冲液包含生理浓度的盐并且被调节至中性pH，范围从约6.5至约7.8，并且优选约7.0至约7.5。许多生理缓冲液列于Sambrook等(1989)。生理相关温度范围从约25℃至约38℃并且优选约35℃至约37℃。
“反应基”是可以与另一反应基偶联的化学结构。反应基的实例是氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应基可以被活化以促进与另一反应基的偶联。活化的非限制性实例是羧基与碳二亚胺反应，羧基转化为活化的酯，或者羧基转化为叠氮化物官能。
“控释剂”、“缓释剂”、“贮库制剂”和“持续释放剂”可互换使用，指与多肽在缺乏这些物质而施用时的释放持续时间相比能够延长本发明多肽释放持续时间的物质。本发明的不同实施方案可以具有不同的释放速率，导致不同的治疗量。
术语“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文可互换使用，指抗体片段或基于抗体片段的治疗剂与之结合或对之具有特异性的结构或结合决定簇。
本文使用的术语“有效负载”指具有生物活性或治疗活性的蛋白质或肽序列；小分子药效团的对应物。有效负载的实例包括但不限于细胞因子、酶、激素和血液和生长因子。有效负载还可以包含基因融合或化学偶联的部分，例如化疗剂、抗病毒化合物、毒素或造影剂。这些偶联部分可以通过连接子连接至多肽其余部分，所述连接子可以是可裂解的或不可裂解的。
本文使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鉴定多肽拮抗剂的方法可以包括使天然多肽与候选拮抗剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。在本发明上下文中，拮抗剂可以包括蛋白质、核酸、糖类、抗体或降低生物活性蛋白效应的任何其它分子。
术语“激动剂”以最广泛的含义使用并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。适合的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小有机分子等。用于鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。
“活性”出于本文目的指融合蛋白组分与相应的天然生物活性蛋白一致的作用或效应，其中“生物活性”指体外或体内生物功能或效应，包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性或细胞或生理反应。
本文使用的“治疗(treatment)”或“治疗(治疗)”或“减轻(palliating)”或“缓解(ameliorating)”在本文可互换使用。这些术语指获得包括但不限于治疗益处和/或预防益处的有益或期望结果的方法。所谓治疗益处是指被治疗的潜在疾患的消除或缓解。而且，随着与潜在疾患相关的一种或多种生理症状的消除或缓解使得在受试者中观察到改善而实现治疗益处，尽管受试者可能依然受累于所述潜在疾患。为了预防益处，组合物可以被施用给处于发展特定疾病风险的受试者或者报告了疾病的一种或多种生理症状的受试者，尽管可能还未做出该疾病的诊断。
本文使用的“治疗效应”指生理效应，包括但不限于人或其它动物中疾病的治愈、缓和、缓解或预防，或者指除此以外增强人或动物的生理或精神状态，这是由本发明融合多肽而非诱导生成针对生物活性蛋白具有的抗原表位的抗体的能力引起的。治疗有效量的确定在本领域技术人员能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
本文使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的量，所述生物活性蛋白一次或重复剂量施用给受试者时能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益效应。这种效应不一定绝对是有益的。
本文使用的术语“治疗有效剂量方案”指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的连续施用的多个剂量(即，至少两个或更多个)的计划表，其中所述剂以治疗有效量给予以对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征产生持续有益的效应。
I).一般技术
除非另外指出，本发明实践采用本领域技术范围内的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。参见Sambrook，J.等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001；“Current protocols in molecularbiology”，F.M.Ausubel等编辑，1987；系列“Methods in Enzymology，”Academic Press，San Diego，CA.；“PCR 2：a practical approach”，M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑，Oxford University Press，1995；“Antibodies，a laboratory manual”Harlow，E.和Lane，D.编辑，Cold SpringHarbor Laboratory，1988；“Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，”第11版，McGraw-Hill，2005和Freshney，R.I.，“Culture ofAnimal Cells：A Manual of Basic Technique，”第4版，John Wiley & Sons，Somerset，NJ，2000，这些参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文。
II).凝血因子
本发明部分涉及包含凝血因子(CF)的融合蛋白组合物。如本文使用的，“凝血因子”或“CF”指因子IX(FIX)、因子VII(FVII)、FVII和FIX的序列组合、或其模拟物、序列变体以及截短形式。
(a)因子IX
“因子IX”或“FIX”指凝血因子蛋白及其种类和序列变体，并且包括但不限于人FIX前体多肽(“前原”)的461单链氨基酸序列和成人FIX的415单链氨基酸序列。FIX包括具有血液凝血因子IX的典型特征的因子IX分子的任何形式。如本文使用的“因子IX”和“FIX”意欲包含多肽，其包含结构域Gla(含有γ-羧基谷氨酸残基的区域)、EGF1和EGF2(含有与人表皮生长因子同源的序列区域)、活化肽(由成熟FIX的残基R136-R180形成)，以及C端蛋白酶结构域(“前”)、或本领域已知结构域的同义密码子，或可以是截短片段或保留天然蛋白质生物活性的至少一部分的序列变体。FIX或序列变体已被克隆，如美国专利No.4,770,999、7,700,734中所述，并且人因子IX的cDNA编码已被分离、表征并克隆至表达载体(参见，例如Choo等人，Nature299：178-180(1982)；Fair等人，Blood 64：194-204(1984)；和Kurachi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.79：6461-6464(1982))。
人因子IX(FIX)由位于X-染色体q27.1处的单拷贝基因编码。人FIXmRNA由5’非翻译区的205个碱基、前原因子IX的1383个碱基、终止密码子和3’非翻译区的1392个碱基组成。FIX多肽为55kDa，合成为由以下三个区组成的前原多肽链：28个氨基酸的信号肽、18个氨基酸的前肽(其对于谷氨酸残基的γ羧化是必需的)和415个氨基酸的成熟因子IX。所述前肽是N端连接γ羧基谷氨酸盐结构域的18-氨基酸残基序列。该前肽结合维生素K依赖性γ羧化酶，然后通过内源性蛋白酶(最可能是PACE(成对的碱性氨基酸裂解酶)，还被称为弗林蛋白酶或PCSK3)从FIX的前体多肽裂解。在没有γ羧化酶的前提下，Gla结构域不能结合钙，以设定需将蛋白质锚定于带负电荷的磷脂表面所需的正确的构象，由此使因子IX无功能。即使它被羧化，该Gla结构域也取决于正确功能的前肽的裂解，因为保留的前肽干扰了与钙和磷脂优化结合所需的Gla结构域的构象变化。在人中，生成的成熟因子IX由肝细胞分泌至血流中作为无活性酶原，一种含有按重量计约17％碳水化合物的415个氨基酸残基的单链蛋白(Schmidt，A.E.等人(2003)Trends CardiovascMed，13：39)。成熟因子IX由在N端至C端构型中如下的若干结构域组成：Gla结构域、EGF1结构域、EGF2结构域、活化肽(AP)结构域和蛋白酶(或催化的)结构域。FIX含有分别由R145-A146和R180-V181形成的两种活化肽。随后的活化，单链FIX变成2链分子，其中这两条链由连接酶和Gla结构域的二硫键连接。可通过替代它们的活化肽、形成改变的活化特异性，来设计CF。在哺乳动物中，成熟FIX必定由活化因子XI活化，以得到因子IXa。一旦FIX活化为FIXa，该蛋白酶结构域提供了FIX的催化活性。活化因子VIII(FVIIIa)是用于完全表达FIXa活性的特异性辅因子。
涉及凝血的蛋白质包括因子I、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、蛋白质C和组织因子(“凝血蛋白”)。多数凝血蛋白以酶原形式存在，其在活化时表现出促凝蛋白酶活性以活化其它凝血蛋白，促进内源性或外源性凝血途径和血块形成。在凝血级联的内源性途径中，FIX与活化因子VIII、因子X、钙和磷脂复合物相关。在该复合物中，FIX由因子XIa活化。因子IX的活化由从分子(Bajaj等人，Human factor IX and factor IXa，in METHODS INENZYMOLOGY.1993)中两步移除活化肽(Ala 146-Arg 180)实现。通过因子XIa或因子VIIa/组织因子在Arg145-Ala146位点进行第一次裂解。第二次和限速裂解在Arg 180-Val 181处进行。活化移除了35个残基。活化的人因子IX以C端重链(28kDa)和N端轻链(18kDa)(通过连接酶和Gla结构域的一个二硫键结合在一起)的异源二聚体存在。因子Ixa与活化的因子VIII一起轮流活化因子X。或者，因子IX和X都可以通过与脂化组织因子复合的因子VIIa活化，经由外源性途径产生。因子Xa随后参与最终共同途径，由此凝血酶原转变为凝血酶，并且凝血酶依次使纤维蛋白原转变为纤维蛋白以形成凝块。
凝血过程缺陷可导致出血疾患，在该疾患中血块形成的时间延长。这种缺陷可能是天生的或后天的。例如，血友病A和B是特征在于分别缺乏因子VIII(FVIII)和FIX的遗传疾病。用这些蛋白质(通常制备为重组蛋白质)的补充疗法可以用于治疗性干预血友病B(Christmas病)和因子IX-相关的出血疾患。因子IX可以用于治疗这两种病症。然而，在某些情况下，患者发展了抗所施用蛋白质的抗体，所述抗体降低或取消了治疗效应。
本发明考虑在CFXTEN组合物中加入与FIX序列具有同源性的FIX序列、例如来自人、非人灵长类动物、哺乳动物(包括家养动物)的天然的序列片段、以及保留了FIX的至少一部分生物活性或生物学功能和/或用于预防、治疗、调节或缓解凝血因子相关的疾病、缺乏、疾患或病症(例如，与凝血因子缺乏的创伤、手术相关的出血事件)的非天然序列变体。与人FIX同源的序列可以通过标准同源性检索技术例如NCBI BLAST来发现。
在一个实施方案中，加入主题组合物的FIX是具有对应于天然存在蛋白质的序列的重组多肽。在另一实施方案中，FIX是天然序列的序列变体、片段、同源物或模拟物，保留了相应天然FIX的至少一部分生物活性。表1提供了本发明CFXTEN融合蛋白所涵盖的、FIX氨基酸序列的非限制性列表。待加入融合蛋白组合物的任何FIX序列或同源衍生物可以通过改组表1的氨基酸序列之间的个体突变而构建，并评估其活性。保留天然FIX的至少一部分生物活性的FIX序列或同源衍生物可用于本发明的融合蛋白组合物。可加入CFXTEN融合蛋白的FIX包括与选自表1的氨基酸序列相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的蛋白质。
表1：FIX氨基酸和核酸序列
Figure BPA00001545838400371
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Figure BPA00001545838400391
Figure BPA00001545838400401
(b)因子VII
“因子VII”或“FVII”指凝血因子蛋白及其种类和序列变体，并且包括但不限于人FVII的406单链氨基酸序列和前体蛋白质的444氨基酸序列的未活化形式和活化形式(除非相反地指明)。如本文使用的，因子VII和FVII涵盖多肽，该多肽包含结构域Gla(含有γ羧基谷氨酸残基的区域)、EGF1和EGF2(含有与人表皮生长因子同源的序列的区域)、跨EGF2和Pro结构域之间的序列的活化肽结构域、以及催化或肽酶S1结构域(含有丝氨酸蛋白酶催化triad的“前”区)、或本领域已知这些结构域的同义密码子，或可以是截短片段或保留天然蛋白质至少一部分生物活性的序列变体。因子VII(FVII)，由肝产生的维生素K依赖性血浆蛋白，最初作为酶原在血液中循环。因子VII的主要作用是与组织因子(TF)一起启动凝血过程。一旦血管损伤，组织因子就暴露于血液和循环因子VII。一旦结合TF，FVII就会被不同蛋白酶活化变为因子VII的活化形式(FVIIa)，所述不同蛋白酶中有凝血酶(因子IIa)、因子Xa、因子IXa、因子XIIa和复合物FVIIa-TF自身。FVII酶原通过蛋白水解性裂解在单个位点(Arg152-Ile153)活化，形成由单个双硫键连接的双链蛋白酶(FVIIa)。FVIIa结合其辅因子、组织因子(TF)，形成可以将因子X(FX)活化为FXa的复合物，由此启动凝血级联，其导致纤维蛋白形成并止血。已知人因子VII的完整的核苷酸和氨基酸序列，并且已克隆了人FVII或序列变体，如美国专利No.4,784,950、5,833,982、6911323和7,026,524中所述。
虽然存在因子VII目前的治疗应用，但在治疗表现出因子VII、因子VIII、或因子IX缺乏的个体和患有具有FVIIa形成的VonWillebrand病的个体中可能存在问题。更具体地是，经常在补充疗法中接受因子VIII和IX的个体发展了对这些蛋白的抗体。由于存在这些抗体，持续治疗极为困难。经历这些问题的患者通常会用活化的凝血酶原复合物进行治疗，该复合物已知由活性和无活性的凝血酶(包括因子VIIa)组成。FVII还与失控出血(例如创伤)的治疗联合使用，并且认为在未与组织因子结合的前提下因子VIIa能够将因子X活化为因子Xa，并认为这种活化反应主要发生于活化的血小板上(Hedner等人.Blood Coagulation & Fibrinolysis，2000：11：107-111)。
因子VII的序列变体，无论是否表现出与野生型因子VII基本上相同的或比其更好的生物活性，或者，可选地表现出与野生型因子VII相关的基本上修饰的或降低的生物活性，都包括具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与野生型因子VII序列的不同之处在于插入、缺失或替换一个或多个氨基酸。这类FVII变体为本领域已知的，包括美国专利和申请No.6,960,657、7,176,288、7414022、7,700,733、20060205036A1、20080318276A1和20090011992A1中所述的那些FVII变体，所述美国专利和申请通过引用并入本文。
重组FVIIa已被批准用于治疗具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或B患者，并且还用于终止出血事件或预防与创伤和/或手术相关的出血。重组FVIIa还被批准用于治疗患有先天FVII缺陷的患者，并且逐渐用于标示外用途，例如治疗血友病或非血友病患者中与其它先天或后天出血疾患、创伤和手术相关的出血。
本发明考虑在CFXTEN组合物中加入与用于预防、治疗、调节或缓解CF相关的疾病、缺乏、疾患或病症并且保留了FVIIa的至少一部分生物活性或生物学功能的FVII序列、序列片段、模拟物以及非天然序列变体具有同源性的序列。而且，由于包含FVII的CFXTEN相对长的半衰期，包含FVII的无活性形式(可以由哺乳动物内源性蛋白酶(下文更完全地描述)活化或经受自体活化)的组合物代表了治疗患有某种形式的慢性凝血紊乱的受试者的方法，所用的实质上就是FVII的“前药”形式。表2提供了本发明的CFXTEN融合蛋白所涵盖的FVII序列的列表。FVII序列或通过改组物种家族之间的个体突变而构建的并且保留了天然CF的至少一部分生物活性的同源衍生物可用于本发明的融合蛋白。可加入CFXTEN融合蛋白中的FVII包含与选自表2的序列相比表现出至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的蛋白质。
表2：因子VII氨基酸序列
Figure BPA00001545838400421
Figure BPA00001545838400431
Figure BPA00001545838400441
Figure BPA00001545838400451
III).凝血因子融合蛋白组合物
本发明提供了包含凝血因子(CF)的融合蛋白组合物。增加治疗蛋白质循环半衰期的一种方法是降低该蛋白质的肾清除。这可以通过将该蛋白质与能够赋予该蛋白质增加的分子大小(或流体动力学半径)的聚合物偶联实现，并因此降低肾清除。因此，本发明的一个目的是提供具有更长的循环、或终末半衰期(由此减少需要施用的次数)并且保留天然凝血因子的至少一部分活性的改善的FIX或FVII(或FVIIa)分子，由此更有效地治疗凝血缺乏和失控出血。一方面，本发明提供了CF分离的单体融合蛋白，其包含与延伸重组多肽(“XTEN”或“XTENs”)共价连接的CF全长序列或序列变体，例如FIX或FVII。如下文更全面地描述，该融合蛋白任选地包括间隔区序列，所述间隔区序列还包括裂解序列以当通过蛋白酶作用时从融合蛋白释放CF。
一方面，本发明提供了分离的融合蛋白，包含与一个或多个延伸重组多肽(“XTEN”)共价连接的至少第一生物活性凝血因子蛋白，得到融合蛋白组合物(下文“CFXTEN”)。本文使用的术语“CFXTEN”意在涵盖包含一个或多个有效负载区和至少一个其它区的融合多肽，每个有效负载区包括介导与凝血因子相关的一种或多种生物活性或治疗活性的生物活性CF，所述其它区包含用作载体的至少第一XTEN多肽。在一个实施方案中，凝血因子是FIX或FIX的序列变体，如上所公开的(包括与表1序列具有同源性的序列)。在另一实施方案中，凝血因子是FVII，其包括FVII的活化形式、或FVII的序列变体，如上所公开的(包括与表2序列具有同源性的序列)。在包含FVII的本发明CFXTEN组合物情况下，FVII组分的活化可以通过暴露于活化因子X、通过自体活化、或根据本领域已知的程序，例如由Osterud等人，Biochemistry11：2853-2857(1972)；Thomas，美国专利No.4,456,591；Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841(1983)；或Kisiel和Fujikawa，Behring Inst.Mitt.73：29-42(1983)所公开的程序而进行。或者，因子VII可以经由将其通过离子交换色谱柱(参见，例如，Bjoern等人.Research Disclosure(1986)269：564-565)，例如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)或相似的色谱树脂而被活化。
主题组合物的CF，特别是表1和2中公开的那些，以及其相应的核酸和氨基酸序列是本领域熟知的，并且描述和序列可获自公开数据库例如Chemical Abstracts Services Databases(例如，CAS登记)、GenBank、TheUniversal Protein Resource(UniProt)和订购数据库例如GenSeq(例如，Derwent)。多核苷酸序列可以是编码给定CF的野生型多核苷酸序列(例如，全长或成熟的)，或者在一些情况下，序列可以是野生型多核苷酸序列的变体(例如，编码野生型生物活性蛋白的多核苷酸，其中多核苷酸的DNA序列已经例如为在特定物种中表达而被优化；或者编码野生型蛋白变体的多核苷酸，例如定点突变体或等位基因变体。技术人员完全有能力使用本领域公知的方法和/或结合本文提供以及在实施例中更全面描述的指导和方法利用CF的野生型或共有的cDNA序列或密码子优化变体来产生本发明涵盖的CFXTEN构建体。
纳入本发明CFXTEN的CF包括在施用给受试者时用于调节或预防或缓解与出血疾患、凝血因子缺乏或凝血因子缺陷相关的疾病、疾患或病症的凝血因子或序列变体。特别关注的是CFXTEN融合蛋白组合物，寻求其与天然CF相比提高的药代动力学参数、增加的溶解度、增加的稳定性或一些其它增强的药学性质，或者增加终末半衰期将提高效力、安全性或导致减少给药频率和/或改善患者依从性。因此，考虑各种目的而制备CFXTEN融合蛋白组合物，包括通过以下方式提高生物活性CF的治疗效应：例如与未连接XTEN的CF相比，在施用给受试者时，增加体内暴露或CFXTEN在治疗窗内维持的时长。
在一个实施方案中，加入主题组合物的CF可以是具有对应于天然存在蛋白质的序列的重组多肽。在另一实施方案中，CF是天然序列的序列变体、片段、同源物或模拟物，保留了天然CF的至少一部分生物活性。在非限制性实例中，CF是与选自表1或选自表2的蛋白质序列具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含与单个XTEN连接的单个CF分子(例如，下文更全面描述的XTEN)。在另一实施方案中，CFXTEN包含第一个CF和相同CF的第二个分子，得到包含两个CF的融合蛋白，该融合蛋白与选自表6的N端至C端构型的一个或多个XTEN连接。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含与第一和第二XTEN连接的单个CF分子，其中CF是与选自表1或选自表2的蛋白质序列相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性的序列，并且第一和/或第二XTEN是与选自表4的序列相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性的序列。
本发明主题CFXTEN表现出与天然CF相比的一个或多个药代动力学参数的增强。具有增强的药代动力学参数的CFXTEN允许较低频率的给药或增强的药理效应，包括但不限于使生物活性CFXTEN维持在最低有效剂量或血药浓度(Cmin)与最大耐受剂量或血药浓度(Cmax)之间的治疗窗内持续与未连接XTEN的CF相比更长的时间。在这种情况下，CF与包含选定XTEN序列的融合蛋白的连接可以导致这些性质的改善，使得它们作为治疗剂或预防剂与未连接XTEN的CF相比更有效。在一些实施方案中，本发明的主题CFXTEN具有在CF和XTEN之间加入的裂解序列，并且CF组分的生物活性通过由内源性蛋白酶裂解裂解序列使CF从融合蛋白释放而得以增强，如下文所述。
IV).延伸重组多肽
一方面，本发明提供了可用作连接CF的融合蛋白配偶体的XTEN多肽组合物，得到CFXTEN融合蛋白。XTEN一般是长度延伸的多肽，具有主要由小的亲水性氨基酸构成的非天然存在的、基本上非重复的序列，该序列在生理条件下具有低程度的二级或三级结构或者没有二级或三级结构。
XTEN可用作融合蛋白配偶体，因为它们用作“载体”，当连接至CF蛋白产生融合蛋白时赋予某些期望的药代动力学、物理化学和药学性质。这种期望的性质包括但不限于组合物的增强的药代动力学参数和溶解度特征以及本文描述的其它性质。如本文所述，这种融合蛋白组合物可用于治疗某些凝血因子相关的疾病、疾患或病症。本文使用的“XTEN”明确排除全抗体或抗体片段(例如单链抗体和Fc片段)。
在一些实施方案中，XTEN当作为载体使用时是具有大于约100至约3000个氨基酸残基的长多肽、或者当不止一个XTEN单元用于单个融合蛋白时是累积大于400至约3000个残基的长多肽。在其它实施方案中，当XTEN用作融合蛋白组分之间的连接子时，或者在不需要增加融合蛋白半衰期但希望增加CF融合配偶体组分的溶解度或一些其它理化性质时，短于100个氨基酸残基，例如约96、或约84、或约72、或约60、或约48或约36个氨基酸残基的XTEN序列被加入具有CF的融合蛋白组合物以影响所述性质。
要连接至用于产生本发明融合蛋白组合物的生物活性蛋白的XTEN的选择标准一般涉及XTEN的理化性质和构象结构属性，这些属性转而用于赋予融合蛋白组合物增强的药学和药代动力学性质。本发明的XTEN表现出以下优势性质的一种或多种：构象灵活性、增强的水溶解度、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合和增加的流体动力学(或Stokes)半径；使它们特别用作融合蛋白配偶体的性质。包含CF的融合蛋白被XTEN增强的性质的非限制性实例包括总溶解度和/或代谢稳定性增加、降低的对蛋白质水解的敏感性、降低的免疫原性、皮下或肌肉内施用时降低的吸收速率和增强的药代动力学性质例如较长的终末半衰期和增加的曲线下面积(AUC)、皮下或肌肉内注射后较慢的吸收(与通过类似途径施用的未连接XTEN的CF相比)，使得Cmax较低，这转而导致CF副作用降低，这共同导致施用给受试者的CFXTEN组合物的融合蛋白保持治疗活性的时段增加。
用于测定蛋白质理化性质的许多方法和分析是本领域已知的，所述蛋白质例如包含本发明XTEN的组合物。这类性质包括但不限于二级或三级结构、溶解度、蛋白聚集、熔解性质、污染和水含量。此类方法包括分析离心、EPR、离子交换HPLC、尺寸排阻HPLC、反相HPLC、光散射、毛细管电泳、圆二色性、差示扫描量热法、荧光、离子交换HPLC、尺寸排阻HPLC、IR、NMR、拉曼光谱、折射法和UV/可见光谱法。其它方法公开于Arnau等人，Prot Exprand Purif(2006)48，1-13。
在一个实施方案中，XTEN被设计为在生理条件下的行为类似变性的肽序列，不管聚合物延伸的长度。“变性的”描述肽在溶液中的状态，特征为肽骨架的大的构象自由度。大多数肽和蛋白质在高浓度变性剂存在下或者在升高的温度下具有变性的构象。变性构象的肽具有例如特征的圆二色(CD)谱，并且通过NMR测定特征为缺少远程相互作用。“变性的构象”和“非结构化构象”在本文同义使用。在一些实施方案中，本发明提供了在生理条件下类似大体没有二级结构的变性序列的XTEN序列。在其它情况下，XTEN序列在生理条件下基本没有二级结构。该上下文中使用的“大体没有”指，通过本文描述的方法测量或确定，XTEN序列的少于50％的XTEN氨基酸残基对二级结构有贡献。该上下文中使用的“基本没有”指，通过本文描述的方法测量或确定，XTEN的至少约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或至少约99％的XTEN氨基酸残基对二级结构没有贡献。
本领域已经确立了许多方法来辨别给定多肽中二级结构和三级结构的存在或不存在。具体说，二级结构可以分光光度法测量，例如通过“远UV”光谱区(190-250nm)的圆二色谱法。二级结构元件，例如α螺旋和β折叠，各自给出特征形状和CD光谱大小。还可以通过以下来预测多肽序列的二级结构：某些计算机程序或算法，例如熟知的Chou-Fasman算法(Chou，P.Y.等(1974)Biochemistry，13：222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson(“GOR”)算法(GarnierJ，Gibrat JF，Robson B.(1996)，GOR method for predicting protein secondarystructure from amino acid sequence，Methods Enzymol 266：540-553)，描述于美国专利申请公开No.20030228309A1。对于给定序列，所述算法可以预测是存在一定的二级结构还是根本不存在二级结构，表示为形成例如α螺旋或β折叠的序列残基总数和/或百分比或者被预测导致无规卷曲形成的序列残基百分比(其缺乏二级结构)。
在一些实施方案中，通过Chou-Fasman算法测定，用于主题融合蛋白组合物的XTEN序列可以具有范围从0％至小于约5％的α螺旋百分比。在其它情况下，通过Chou-Fasman算法测定，融合蛋白组合物的XTEN序列具有范围从0％至小于约5％的β折叠百分比。在一些实施方案中，通过Chou-Fasman算法测定，融合蛋白组合物的XTEN序列具有范围从0％至小于约5％的α螺旋百分比和范围从0％至小于约5％的β折叠百分比。在一些实施方案中，融合蛋白组合物的XTEN序列具有小于约2％的α螺旋百分比和小于约2％的β折叠百分比。在其它情况下，通过GOR算法测定，融合蛋白组合物的XTEN序列具有高度无规卷曲百分比。在一些实施方案中，通过GOR算法测定，XTEN序列具有至少约80％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％和最优选至少约99％的无规卷曲。
1.非重复序列
在一些实施方案中，组合物的XTEN序列是基本上非重复的。一般而言，重复的氨基酸序列具有聚集或形成高级结构的倾向，例如天然重复序列例如胶原蛋白和亮氨酸拉链所示例。这些重复氨基酸也可易于形成接触而导致结晶或假结晶结构。相反，非重复序列较低的聚集倾向允许设计具有相对低的带电氨基酸频率的长序列XTEN，否则如果序列是重复的则带电氨基酸可能会另外聚集。通常，CFXTEN融合蛋白包含大于约100至约3000个氨基酸残基的XTEN序列，其中所述序列是基本上非重复的。在一个实施方案中，XTEN序列具有大于约100至约3000个氨基酸残基，其中序列中没有三个连续氨基酸是相同的氨基酸类型，除非所述氨基酸是丝氨酸，在这种情况下，不超过三个连续氨基酸是丝氨酸残基。在前述实施方案中，XTEN序列是“基本上非重复的”。
多肽或基因的重复程度可以通过计算机程序或算法或通过本领域已知的其它方式来测量。多肽序列的重复性可以例如通过测定给定长度的较短序列在多肽中出现的次数来评估。例如，200个氨基酸残基的多肽具有192个重叠的9-氨基酸序列(或9-mer“框”)和198个3-mer框，但是独特的9-mer或3-mer序列的数目将取决于序列内的重复量。产生反应整体多肽序列中子序列重复程度的评分(下文“子序列评分”)。在本发明上下文中，“子序列评分”指每个独特的3-mer框在多肽的200连续氨基酸序列中出现的总和除以200氨基酸序列中独特3-mer子序列的绝对数。从重复和非重复多肽的前200个氨基酸得到的这种子序列评分的实例提供于实施例44。在一些实施方案中，本发明提供了CFXTEN，每一个包含一个或多个XTEN，其中XTEN具有小于12、更优选小于10、更优选小于9、更优选小于8、更优选小于7、更优选小于6和最优选小于5的子序列评分。在该段描述的上述实施方案中，子序列评分小于约10(即，9、8、7、等)的XTEN是“基本上非重复的”。
与具有重复序列的多肽相比，XTEN的非重复特征赋予CF融合蛋白更大的溶解度和较低的聚集倾向。这些性质有利于配制含有在某些情况下超过100mg/ml的极高药物浓度的含XTEN的药物制剂。
而且，实施方案的XTEN多肽序列被设计为具有低程度的内部重复性以减少或基本上消除施用给哺乳动物时的免疫原性。由主要限于三个氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸)的短重复基序构成的多肽序列可导致当施用给哺乳动物时相对高的抗体滴度，尽管这些序列中缺乏预测的T细胞表位。这可能是由多肽的重复性质引起的，因为已经显示具有重复表位的免疫原(包括蛋白质聚集物、交联免疫原和重复糖类)是高度免疫原性的，并且可以例如导致B细胞受体的交联而引起B细胞活化。(Johansson，J.等(2007)Vaccine，25：1676-82；Yankai，Z.等(2006)Biochem Biophys Res Commun，345：1365-71；Hsu，C.T.等(2000)Cancer Res，60：3701-5)；Bachmann MF等Eur JImmunol.(1995)25(12)：3445-3451)。
2.示例性序列基序
本发明涵盖包含多个单元的较短序列或基序的用作融合配偶体的XTEN，其中所述基序的氨基酸序列是非重复的。尽管利用了使用多聚体化产生XTEN序列的序列基序文库的“结构单元(building block)”方法，可以满足非重复标准。因此，虽然XTEN序列可以由少至四个不同类型的序列基序的多个单元组成，但因为基序本身一般由非重复氨基酸序列组成，所以使得整体XTEN序列是基本上是非重复的。
在一个实施方案中，XTEN具有约100至约3000个氨基酸残基的非重复序列，其中XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％或约100％由非重叠序列基序组成，其中每个基序具有约9至36个氨基酸残基。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％或约100％由非重叠序列基序组成，其中每个基序具有约9至14个氨基酸残基。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％或约100％由非重叠序列基序组成，其中每个基序具有12个氨基酸残基。在这些实施方案中，优选的是序列基序主要由小亲水性氨基酸组成，使得整体序列具有非结构化、灵活的特征。XTEN中包含的氨基酸的实例是例如精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。作为测试变量(诸如密码子优化、组装编码序列基序的多核苷酸、蛋白质表达、电荷分布和表达蛋白质的溶解度以及二级和三级结构)的结果，发现具有增强的特征的XTEN组合物主要包含甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基，其中序列被设计为是基本上非重复的。在一个实施方案中，XTEN序列主要具有选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)的4至6个类型的氨基酸，其以基本上非重复的顺序排列，长度大于约100至约3000个氨基酸残基，优选大于400至约3000个残基。在一些实施方案中，XTEN具有大于约100至约3000个氨基酸残基，其中序列的至少约80％由非重叠序列基序组成，其中每个基序具有9至36个氨基酸残基，其中每个基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4至6个类型的氨基酸组成，并且其中全长XTEN中任何一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％由非重叠序列基序组成，其中每个基序具有9至36个氨基酸残基，其中每个基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4至6个类型的氨基酸组成，并且其中全长XTEN中任何一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％由非重叠序列基序组成，其中每个基序具有由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4至6个类型的氨基酸组成的12个氨基酸残基，并且其中全长XTEN中任何一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由非重叠序列基序组成，其中每个基序具有由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成的12个氨基酸残基，并且其中全长XTEN中任何一种氨基酸类型的含量不超过30％。
在其它实施方案中，XTEN包含大于约100至约3000个氨基酸残基的非重复序列，其中序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％由9至14个氨基酸残基的非重叠序列基序组成，其中基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4至6个类型的氨基酸组成，并且其中任何一个基序中任何两个连续氨基酸残基的序列在序列基序中不重复超过两次。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％由12个氨基酸残基的非重叠序列基序组成，其中基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4至6个类型的氨基酸组成，并且其中任何一个序列基序中任何两个连续氨基酸残基的序列在序列基序中不重复超过两次。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％由12个氨基酸残基的非重叠序列基序组成，其中基序由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成，并且其中任何一个序列基序中任何两个连续氨基酸残基的序列在序列基序中不重复超过两次。在其它实施方案中，XTEN由12个氨基酸序列基序组成，其中氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，并且其中任何一个序列基序中任何两个连续氨基酸残基的序列在序列基序中不重复超过两次，并且其中全长XTEN中任何一种氨基酸类型的含量不超过30％。在本段描述的上述实施方案中，XTEN序列是基本上非重复的。
在一些实施方案中，本发明提供了包含大于约100至约3000个氨基酸残基的非重复XTEN序列的组合物，其中序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表3的氨基酸序列的两个或多个非重叠序列基序的多个单元组成。在一些实施方案中，XTEN包括非重叠序列基序，其中序列的约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表3的单基序家族的两个或多个非重叠序列组成，得到其中整体序列保持基本上非重复的“家族”序列。因此，在这些实施方案中，XTEN序列包含表3序列的AD基序家族、或AE基序家族、或AF基序家族、或AG基序家族、或AM基序家族、或AQ基序家族、或BC家族、或BD家族的非重叠序列基序的多个单元。在其它实施方案中，XTEN包含来自表3的基序家族的两个或多个基序序列。
表3：12个氨基酸的XTEN序列基序和基序家族
  基序家族*   基序序列
  AD   GESPGGS SGSES
  AD   GSEGSSGPGESS
  AD   GSSESGSSEGGP
  AD   GSGGEPSESGSS
  AE、AM   GSPAGSPTSTEE
  AE、AM、AQ   GSEPATSGSETP
  AE、AM、AQ   GTSESATPESGP
  AE、AM、AQ   GTSTEPSEGSAP
  AF、AM   GSTSESPSGTAP
  AF、AM   GTSTPESGSASP
  AF、AM   GTSPSGESSTAP
  AF、AM   GSTSSTAESPGP
  AG、AM   GTPGSGTASSSP
  AG、AM   GSSTPSGATGSP
  AG、AM   GSSPSASTGTGP
  AG、AM   GASPGTSSTGSP
  AQ   GEPAGSPTSTSE
  AQ   GTGEPSSTPASE
  AQ   GSGPSTESAPTE
  AQ   GSETPSGPSETA
  AQ   GPSETSTSEPGA
  AQ   GSPSEPTEGTSA
  BC   GSGASEPTSTEP
  BC   GSEPATSGTEPS
  BC   GTSEPSTSEPGA
  BC   GTSTEPSEPGSA
  BD   GSTAGSETSTEA
  BD   GSETATSGSETA
  BD   GTSESATSESGA
  BD   GTSTEASEGSAS
●表示当以各种排列变化一起使用时得到“家族序列”的个体基序序列
在其它实施方案中，CFXTEN组合物包含大于约100至约3000个氨基酸残基的非重复XTEN序列，其中序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表9-12的多肽序列的一个或多个的非重叠36个氨基酸序列基序组成。
在其中CFXTEN融合蛋白的XTEN组分的小于100％的氨基酸由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4至6个氨基酸组成，或者小于100％的序列由表3的序列基序组成，或者与表3的XTEN相比具有小于100％序列同一性的那些实施方案中，其它氨基酸残基选自14个天然L-氨基酸的任何其它氨基酸，但优先选自亲水性氨基酸，使得XTEN序列含有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％的亲水性氨基酸。非甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的XTEN氨基酸散布于整个XTEN序列，位于序列基序内或序列基序间，或者集中于一个或多个短的XTEN序列段。在其中CFXTEN的XTEN组分包含甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)以外的氨基酸的此类情况下，优选的是，氨基酸不是疏水性残基并且不会实质上赋予XTEN组分的二级结构。在XTEN构建中较不常用的疏水性残基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。此外，可以设计XTEN序列为含有少数(例如小于5％)或没有以下的氨基酸：半胱氨酸(为避免二硫化物形成和氧化)、甲硫氨酸(为避免氧化)、天冬酰胺和谷氨酰胺(为避免脱酰胺作用)。因此，在一些实施方案中，包含除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)以外的其它氨基酸的CFXTEN融合蛋白的XTEN组分通过Chou-Fasman算法测量具有小于5％的有助于α-螺旋和β-折叠的残基的序列，并且通过GOR算法测量具有至少90％、或至少约95％或更多的无规卷曲形成。
3.序列长度
在本发明的另一方面，本发明涵盖CFXTEN组合物，包含具有延伸长度序列的XTEN多肽的载体。本发明利用如下发现：增加非重复非结构化多肽的长度增强了XTEN的非结构化性质，并相应增强了包含XTEN载体的融合蛋白的生物性质和药代动力学性质。如实施例中更全面描述的，通过GOR算法测定，即使通过固定重复顺序的单一家族序列基序(例如，表3的四个AE基序)产生的XTEN长度的成比例增加导致与较短XTEN长度相比具有较高百分比的无规卷曲形成的序列。一般而言，如实施例所述，增加非结构化多肽融合配偶体的长度导致与具有较短序列长度的非结构化多肽配偶体的融合蛋白相比终末半衰期不成比例增加的融合蛋白。
考虑纳入本发明CFXTEN的XTEN的非限制性实例提供于下面的表4中。在一个实施方案中，本发明提供了CFXTEN组合物，其中融合蛋白的XTEN序列长度大于约100至约3000个氨基酸残基并且在一些情况下大于400至约3000个氨基酸残基，其中XTEN赋予CFXTEN比未连接XTEN的CF相比增强的药代动力学性质。在一些实施方案中，本发明的CFXTEN组合物的XTEN序列长度可以是约100、或约144、或约288、或约401、或约500、或约600、或约700、或约800、或约900、或约1000、或约1500、或约2000、或约2500或最多约3000个氨基酸残基。在其它情况下，XTEN序列长度可以是约100至150、约150至250、约250至400、401至约500、约500至900、约900至1500、约1500至2000、或约2000至约3000个氨基酸残基。在一个实施方案中，CFXTEN可以包含XTEN序列，其中该序列与选自表4的XTEN相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，通过在编码融合蛋白的基因的XTEN部分纳入优化N端前导序列(NTS)的编码核苷酸，XTEN序列为优化表达而被设计为CFXTEN的N端组分。在一个实施方案中，表达的CFXTEN的N端XTEN序列与AE48或AM48、AE624、或AE912或AM923的序列相比具有至少90％序列同一性。在另一实施方案中，XTEN具有实施例14-17中描述的N端残基。
在其它实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含第一和第二XTEN序列，其中XTEN序列中的累积总残基大于约400至约3000个氨基酸残基，并且XTEN的序列可以相同或可以不同。在前述实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含第一和第二XTEN序列，其中每个序列与选自表4的至少第一XTEN或另外第二XTEN相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。其中不止一个XTEN用于CFXTEN组合物的实例包括但不限于与具有连接到至少一个CF的N端和C端的XTEN的构建体。
如下文更全面描述的，本发明提供了其中通过选择XTEN的长度而设计CFXTEN以赋予施用给受试者的融合蛋白目标半衰期的方法。一般而言，加入CFXTEN组合物的长度大于约累积400个残基的XTEN导致与较短的累积长度(例如，短于约280个残基)相比更长的半衰期。然而，在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白被设计为包含具有更长序列长度的XTEN，选择该序列长度以另外赋予皮下或肌肉内施用给受试者之后较慢的全身吸收速率。在此类实施方案中，与类似剂量的未连接XTEN的CF相比，Cmax被降低，从而有助于保持CFXTEN在组合物的治疗窗内的能力。因此，除了本文描述的其它理化性质以外，XTEN还赋予施用的CFXTEN存储性质。
表4：XTEN多肽
Figure BPA00001545838400581
Figure BPA00001545838400591
Figure BPA00001545838400601
Figure BPA00001545838400611
Figure BPA00001545838400621
Figure BPA00001545838400641
Figure BPA00001545838400651
Figure BPA00001545838400661
4.XTEN片段
在一个实施方案中，本发明提供了分离的CFXTEN融合蛋白，其中XTEN组分的累积长度大于约100至约3000个氨基酸残基，含有选自表4、9、10、11、12和13的至少一个多肽序列片段，并且其中XTEN序列其余部分的至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％或至少约98％或更多含有亲水性氨基酸，并且XTEN的其余部分的小于约2％由疏水性或芳香族氨基酸或半胱氨酸组成。在一些实施方案中，XTEN含有多个片段，其中所述片段是相同或不同的。在另一实施方案中，本发明提供了分离的CFXTEN融合蛋白，其中XTEN组分的累积长度大于约100至约3000个氨基酸残基并且包含至少约100至约923、或至少约100至约875、或至少约100至约576、或至少约100至约288、或至少约100至约144个氨基酸残基的至少一个序列片段，其中所述序列片段由至少三种不同类型的氨基酸组成，并且所述序列片段中甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成序列片段总氨基酸序列的至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％，并且XTEN序列其余部分的至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％由亲水性氨基酸组成，并且XTEN的其余部分的小于约2％由疏水性或芳香族氨基酸或半胱氨酸组成。在另一实施方案中，本发明提供了分离的CFXTEN融合蛋白，其中XTEN组分的累积长度大于约100至约3000个氨基酸残基并且包含至少约200至约923、或至少约200至约875、或至少约200至约576、或至少约200至约288个氨基酸残基的至少一个序列片段，在所述序列片段中，甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基在序列片段中的总和构成序列片段总氨基酸序列的至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％，并且其中片段的子序列评分小于12、更优选小于10、更优选小于9、更优选小于8、更优选小于7、更优选小于6和最优选小于5，并且XTEN序列其余部分的至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％或至少约98％由亲水性氨基酸组成，并且XTEN序列的其余部分的小于约2％由疏水性或芳香族氨基酸或半胱氨酸氨基酸组成。
5.N端XTEN表达增强序列
在一些实施方案中，本发明提供了作为CFXTEN融合蛋白的N端部分加入的短长度XTEN序列。已经发现，在用包含加入编码结合融合蛋白的多核苷酸的优化N端前导多核苷酸序列(其编码N端XTEN)的适合表达载体转化的宿主细胞中，融合蛋白的表达被增强。如实施例14-17所述，用这种在结合融合蛋白基因中包含优化的N-端前导序列(NTS)的表达载体转化的宿主细胞导致与相应融合蛋白从不包含NTS的多核苷酸表达相比融合蛋白表达极大增强，并且不需要加入用于增强表达的非XTEN前导序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含NTS的CFXTEN融合蛋白，其中结合融合蛋白在宿主细胞中从编码基因的表达与不包含N端XTEN序列的CFXTEN融合蛋白(其中编码基因缺乏NTS)的表达相比被增强约50％、或约75％、或约100％、或约150％、或约200％或约400％。
在一个实施方案中，CFXTEN的N端XTEN多肽包含与AE48或AM48的氨基酸序列相比具有至少约80％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、更优选至少99％或100％序列同一性的序列，AE48或AM48各自的氨基酸序列如下：
AE48：MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS
AM48：MAEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS
在另一实施方案中，短长度N端XTEN连接至较长长度XTEN以形成CFXTEN融合蛋白的N端区，其中编码所述短长度N端XTEN的多核苷酸序列赋予在宿主细胞中增强表达的性质，并且其中表达的XTEN的长长度促进XTEN载体在融合蛋白中增强的性质，如上所述。在上文中，短长度XTEN连接至本文公开的XTEN的任何一个(例如，表3的XTEN)，并且得到的XTEN转而作为融合蛋白的组分连接至本文公开的CF的任何一个(例如，表1或表2的CF)的N端。可选地，编码短长度XTEN的多核苷酸(或其互补体)连接至编码本文公开的任何一个XTEN的多核苷酸(或其互补体)，得到的编码N端XTEN的基因转而连接至编码本文公开的任何一个CF的多核苷酸的5′端(或其互补体的3′端)。在一些实施方案中，具有长长度的N端XTEN多肽与选自由序列AE624、AE912和AM923组成的组的氨基酸序列相比具有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少99％或100％序列同一性。
在上文公开的前述N端XTEN实施方案的任何一个中，N端XTEN可以具有优选选自GESTPA的约1至约6个另外的氨基酸残基，以容纳用来将编码N端XTEN的核苷酸连接至编码融合蛋白的靶向部分的基因的限制内切核酸酶限制性位点。用于产生N端序列并加入本发明融合蛋白的方法在实施例中更全面描述。
6.净电荷
在其它实施方案中，XTEN多肽具有通过加入具有净电荷的氨基酸残基和/或减少XTEN序列中疏水性氨基酸的比例而赋予的非结构化特征。总的净电荷和净电荷密度通过改变XTEN序列中带电氨基酸含量来控制。在一些实施方案中，组合物的XTEN的净电荷密度可以高于+0.1或低于-0.1电荷/残基。本文蛋白质或肽的所谓“净电荷密度”指净电荷除以蛋白质或肽中的氨基酸总数。在其它实施方案中，XTEN的净电荷密度可以是约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、或约20％或更多。
因为人或动物中大多数组织和表面具有净负电荷，在一些实施方案中，XTEN序列被设计为具有净负电荷以最大程度减小包含XTEN的组合物与各种表面(诸如血管、健康组织或各种受体)之间的非特异性相互作用。不受特定理论束缚，由于单独携带净负电荷和分布于XTEN多肽序列的XTEN多肽的个体氨基酸之间的静电排斥，XTEN可以具有开放的构象。净负电荷在XTEN的延伸的序列长度中的这种分布可以造成非结构化构型，这转而可以导致流体动力学半径的有效增加。在优选的实施方案中，通过加入谷氨酸残基而带来负电荷。因此，在一个实施方案中，本发明提供了其中XTEN序列含有约8、10、15、20、25或甚至约30％谷氨酸的XTEN。一般而言，谷氨酸残基均匀分布于整个XTEN序列。在一些情况下，每个20kDa的XTEN可以含有约10-80、或约15-60或约20-50个谷氨酸残基，这可以导致具有非常相似的pKa的带电残基的XTEN，这可以增加产物的电荷均一性并锐化其等电点，增强得到的CFXTEN融合蛋白的理化性质，并因此而简化纯化程序。
本发明的组合物的XTEN一般没有或具有低含量的带正电荷氨基酸。在一些实施方案中，XTEN可以具有小于约10％的带正电荷的氨基酸残基、或小于约7％、或小于约5％、或小于约2％、或小于约1％的带正电荷的氨基酸残基。然而，本发明涵盖这样的构建体，其中有限数目的带正电荷的氨基酸例如赖氨酸被加入XTEN以允许赖氨酸的ε胺与肽上的反应基、连接子桥或待偶联至XTEN骨架的药物或小分子上的反应基之间偶联。在前述一个实施方案中，XTEN具有约1至约100个赖氨酸残基、或约1至约70个赖氨酸残基、或约1至约50个赖氨酸残基、或约1至约30个赖氨酸残基、或约1至约20个赖氨酸残基、或约1至约10个赖氨酸残基、或约1至约5个赖氨酸残基或可选地仅单个赖氨酸残基。使用前述含有赖氨酸的XTEN，构建了包含XTEN、凝血因子以及用于治疗生长相关的疾病或疾患的化疗剂的融合蛋白，其中加入XTEN组分的物质的最大分子数目由加入XTEN的赖氨酸或具有反应性侧链的其它氨基酸(例如，半胱氨酸)的数目确定。
在一些实施方案中，XTEN序列包含由其它残基(例如丝氨酸或甘酸)分隔的带电残基，导致更好的表达或纯化行为。基于净电荷，一些XTEN具有1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或甚至6.5的等电点(pI)。在优选的实施方案中，XTEN具有1.5至4.5的等电点。在这些实施方案中，加入本发明的CFXTEN融合蛋白组合物的XTEN在促进非结构化构型和XTEN组分与哺乳动物蛋白质和组织结合降低的生理条件下携带负电荷。
因为疏水性氨基酸赋予多肽以结构，本发明提供了XTEN中疏水性氨基酸含量通常将小于5％、或小于2％、或小于1％疏水性氨基酸含量。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白的XTEN组分中甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸含量通常小于5％或小于2％，并且最优选小于1％。在另一实施方案中，XTEN将具有含有小于10％的带正电荷的氨基酸残基、或小于约7％、或小于约5％或小于约2％的带正电荷的氨基酸残基的序列，甲硫氨酸和色氨酸残基的总和将小于2％，并且天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和将是总XTEN序列的小于10％。
7.低免疫原性
在另一方面，本发明提供了其中XTEN序列具有低程度免疫原性或者基本上无免疫原性的组合物。几种因素可以促成XTEN的低免疫原性，例如非重复序列、非结构化构型、高度溶解度、低度或缺乏自聚集、序列内低度或缺乏蛋白水解位点和XTEN序列中低度或缺乏表位。
构象表位由蛋白抗原的多个不连续氨基酸序列构成的蛋白质表面区域形成。蛋白质的精确折叠使这些序列成为明确稳定的空间构型或表位，可以被宿主体液免疫系统识别为“外来的”，导致产生针对该蛋白质的抗体或活化细胞介导的免疫应答。在后一情况下，个体中对蛋白质的免疫应答主要受T细胞表位识别影响，T细胞表位识别是该个体HLA-DR同种异型的肽结合特异性的功能。T细胞表面上同源T细胞受体对II类MHC肽复合物的结合，连同某些其它共同受体(例如CD4分子)的交叉结合，可以诱导T细胞内的活化状态。活化导致细胞因子释放，进一步活化其它淋巴细胞例如B细胞以产生抗体，或者活化T杀伤细胞作为完全的细胞免疫应答。
肽结合给定II类MHC分子以呈递在APC(抗原呈递细胞)表面上的能力取决于许多因素；最主要的是其一级序列。在一个实施方案中，通过设计在抗原呈递细胞中抵抗抗原加工的XTEN序列和/或选择不良好结合MHC受体的序列来达到低度的免疫原性。本发明提供了具有基本上非重复XTEN多肽的CFXTEN融合蛋白，设计该非重复XTEN多肽以减少与II类MHC受体的结合并避免形成T细胞受体表位或抗体结合，导致低度的免疫原性。避免免疫原性可以归因于，至少部分地是XTEN序列构象灵活性的结果；即，由于氨基酸残基的选择和顺序而缺乏二级结构。例如，特别关注的是在水溶液中或可能导致构象表位的生理条件下具有适应致密折叠构象的低倾向的序列。使用常规治疗实践和给药来施用包含XTEN的融合蛋白一般不会导致形成针对XTEN序列的中和抗体，而且还减少了CFXTEN组合物中CF融合配偶体的免疫原性。
在一个实施方案中，主题融合蛋白中使用的XTEN序列可以基本上不含由人T细胞识别的表位。之前已经公开了这种表位的消除以产生较低免疫原性蛋白；参见例如WO 98/52976、WO 02/079232和WO 00/3317，其在此通过引用并入。已经描述了对人T细胞表位的分析(Stickler，M.等(2003)JImmunol Methods，281：95-108)。特别关注的是可以被寡聚体化而不产生T细胞表位或非人序列的肽序列。这通过测试这些序列的同向重复中T细胞表位的存在和6至15-mer和特别是9-mer的非人序列的出现，然后改变XTEN序列的设计以消除或破坏表位序列来实现。在一些实施方案中，通过限制预测结合MHC受体的XTEN表位数目，XTEN序列是基本上非免疫原性的。随着能够结合MHC受体的表位数目的减少，伴随T细胞活化潜力以及T细胞辅助功能下降、减少的B细胞活化或上调以及减少的抗体生成。预测的T细胞表位的低程度可以通过表位预测算法例如TEPITOPE(Sturniolo，T.等(1999)Nat Biotechnol，17：555-61)来测定，显示于实施例45。蛋白质内给定的肽框的TEPITOPE评分是该肽框与多个最常见的人MHC等位基因结合的Kd(解离常数、亲和力、解离速率)的对数，公开于Sturniolo，T.等(1999)NatureBiotechnology 17：555)。该评分范围至少20log，从约10至约-10(对应于10e10Kd至10e-10Kd的结合常数)，并且可以通过避免在肽展示于MHC上的期间用作锚定残基的疏水性氨基酸例如M、I、L、V、F来减少。在一些实施方案中，加入CFXTEN的XTEN组分不具有TEPITOPE评分为约-5或更大、或-6或更大、或-7或更大、或-8或更大或者TEPITOPE评分为-9或更大的预测的T细胞表位。本文使用的“-9或更大”的评分将涵盖10至-9(包含性)的TEPITOPE评分，但是不涵盖-10的评分，因为-10小于-9。
在另一实施方案中，通过限制XTEN序列的已知蛋白水解位点，减少XTEN加工成可以结合II类MHC受体的小肽，使本发明的XTEN序列(包括加入主题CFXTEN融合蛋白的那些)基本上无免疫原性。在另一实施方案中，通过利用基本上没有二级结构的序列而使XTEN序列基本上无免疫原性，由于结构的高熵而赋予对许多蛋白酶的抗性。因此，降低的TEPITOPE评分和从XTEN消除已知的蛋白水解位点使得XTEN组合物(包括CFXTEN融合蛋白组合物的XTEN)基本上不能被哺乳动物受体(包括免疫系统的那些)结合。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白的XTEN可以对哺乳动物受体具有＞100nM Kd的结合，或者对哺乳动物细胞表面或循环多肽受体具有大于500nM Kd或大于1μM Kd的结合。
此外，非重复序列和相应的XTEN表位缺乏限制了B细胞结合XTEN或被XTEN活化的能力。重复序列被识别并且可以与甚至少数B细胞形成多价接触，并且由于多个T细胞独立受体的交联，可以刺激B细胞增殖和抗体生成。相反，虽然XTEN可以与许多不同B细胞在其延伸序列上接触，但由于缺乏序列重复性，每个个体B细胞仅可以使一个或少数与个体XTEN接触。不受任何理论束缚，XTEN通常具有小得多的刺激B细胞增殖和由此免疫应答的倾向。在一个实施方案中，CFXTEN与未融合XTENT的相应CF相比具有降低的免疫原性。在一个实施方案中，最多三个胃肠外剂量的CFXTEN施用给哺乳动物，导致以1∶100血清稀释而非1∶1000稀释时可检测的抗CFXTENIgG。在另一实施方案中，最多三个胃肠外剂量的CFXTEN施用给哺乳动物，导致以1∶100血清稀释而非1∶1000稀释时可检测的抗CF IgG。在另一实施方案中，最多三个胃肠外剂量的CFXTEN施用给哺乳动物，导致以1∶100血清稀释而非1∶1000稀释时可检测的抗XTEN IgG。在前述实施方案中，哺乳动物可以是小鼠、大鼠、兔或食蟹猴。
具有非重复序列的XTEN相对于具有高度重复性的序列的其它特征是非重复XTEN与抗体形成较弱接触。抗体是多价分子。例如，IgG具有两个相同的结合位点，并且IgM含有10个相同的结合位点。因此，针对重复序列的抗体可以与这种具有高亲合性的重复序列形成多价接触，这可以影响这种重复序列的效价和/或消除。相反，针对非重复XTEN的抗体可以产生单价相互作用，导致较小的免疫清除可能性，使得CFXTEN组合物可以在循环中保持增加的时段。
8.增加的流体动力学半径
在另一方面，本发明提供了其中XTEN多肽具有高流体动力学半径的XTEN，高流体动力学半径赋予包含XTEN的CFXTEN融合蛋白相应增加的表观分子量。如实施例38详细描述的，XTEN与CF序列(例如FIX或FVII序列)的连接产生CFXTEN组合物，其与未连接XTEN的CF相比可具有增加的流体动力学半径、增加的表观分子量和增加的表观分子量因子。例如，在其中期望延长半衰期的治疗应用中，其中具有高流体动力学半径的XTEN被加入包含CF的融合蛋白的组合物可以有效增大组合物的流体动力学半径而超过大约3-5nm的肾小球孔径(对应于约70kDA的表观分子量，其大于天然FIX和FVII)(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution性质ofpoly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev 55：1261-1277)，导致循环蛋白肾清除减少。蛋白质的流体动力学半径由其分子量及其结构确定，包括形状和致密度。不受特定理论束缚，由于肽个体电荷之间的静电排斥或缺少赋予二级结构潜力的序列中特定氨基酸赋予的固有灵活性，XTEN可以具有开放的构象。与具有二级结构和/或三级结构的类似序列长度和/或分子量的多肽(例如典型的球形蛋白)相比，XTEN多肽的开放、延伸和非结构化构象可以具有成比例更大的流体动力学半径。用于测定流体动力学半径的方法是本领域公知的，例如通过使用尺寸排阻色谱(SEC)，如美国专利No.6,406,632和No.7,294,513所述。实施例38的结果说明，增加长度的XTEN的添加导致流体动力学半径、表观分子量和表观分子量因子的参数成比例增加，允许修饰CFXTEN至期望的特征截留表观分子量或流体动力学半径。因此，在某些实施方案中，CFXTEN融合蛋白可以用XTEN构造，使得融合蛋白可以具有至少约5nm、或至少约8nm、或至少约10nm、或12nm或至少约15nm的流体动力学半径。在前述实施方案中，CFXTEN融合蛋白中XTEN赋予的大流体动力学半径可以导致所得融合蛋白的肾清除降低，导致相应的终末半衰期增加、平均保留时间增加和/或肾清除率降低。
在另一实施方案中，选定长度和序列的XTEN(例如，来自表4的序列或其序列变体)可以被选择性加入CFXTEN以产生在生理条件下具有至少约500kDa、或至少约800kDa、或至少约1000kDa、或至少约1500kDA、或至少约1800kDa、或至少约2000kDa、或至少约2300kDa或更大的表观分子量的融合蛋白。在另一实施方案中，选定长度和序列的XTEN可以被选择性连接至CF以产生在生理条件下具有至少4、可选地至少5、可选地至少6、可选地至少8、可选地至少10、可选地至少15的表观分子量因子，或至少20或更大的表观分子量因子的CFXTEN融合蛋白。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白在生理条件下具有相对于融合蛋白的实际分子量约4至约20、或约6至约15、或约8至约12或约9至约10的表观分子量因子。
V).CFXTEN变体、结构构型和性质
主题组合物的CF不限于天然的全长FIX或FVII多肽，还包括其重组形式以及具有序列变体的生物和/或药理活性形式、FVII和FIX序列的组合、或其片段。例如，要理解，可以在CF中进行各种氨基酸缺失、插入和取代以产生在CF的生物活性或药理性质方面不背离本发明精神的变体。多肽序列中氨基酸保守取代的实例示于表5。然而，在其中CF与本文公开的特定序列相比序列同一性小于100％的CFXTEN实施方案中，本发明涵盖其它19种天然L-氨基酸的任何一个取代给定CF(例如，FIX或FVII)的给定氨基酸残基，所述给定氨基酸残基可以在CF序列内的任何位置，包括相邻的氨基酸残基。如果任何一个取代导致不期望的生物活性变化，则可以采用可选氨基酸之一并通过本文描述的方法或使用例如美国专利No.5,364,934(其全部内容通过引用并入)中提出的关于保守和非保守突变的任何技术和指导或使用本领域公知的方法来评估构建体。此外，变体可以包括例如其中在CF的全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或缺失一个或多个氨基酸残基并且保留天然肽的一定的(如果不是全部)生物活性的多肽；例如能够活化另一个凝血因子和/或参与凝血级联反应的能力，导致纤维蛋白形成并止血。
在一个实施方案中，加入CFXTEN融合蛋白的因子IX与来自表1的序列相比具有表现出至少约80％序列同一性、可选地与来自表1的序列相比具有至少约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，加入CFXTEN融合蛋白的因子VII与来自表2的序列相比具有表现出至少约80％序列同一性，可选地与来自表2的序列相比具有至少约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性的序列。
表5：示例性保守氨基酸取代
原始残基 示例性取代
  Ala(A)   val；leu；ile
  Arg(R)   lys；gln；asn
  Asn(N)   gin；his；lys；arg
  Asp(D)   Glu
  Cys(C)   Ser
  Gln(Q)   Asn
  Glu(E)   Asp
  Gly(G)   Pro
  His(H)   asn：gin：lys：arg
  xIle(I)   leu；val；met；ala；phe：正亮氨酸
  Leu(L)   正亮氨酸：ile：val；met；ala：phe
  Lys(K)   arg：gin：asn
  Met(M)   leu；phe；ile
  Phe(F)   leu：val：ile；ala
  Pro(P)   Gly
  Ser(S)   Thr
  Thr(T)   Ser
  Trp(w)   Tyr
  Tyr(Y)   Trp：phe：thr：ser
  Val(V)   Ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸
1.内部XTEN序列
本发明涵盖包含位于CF序列内部的一个或多个XTEN序列的CFXTEN。所述一个或多个内置的XTEN可以为36至≥1000个氨基酸残基的序列长度。在一些实施方案中，CFXTEN可以具有1个或2个或3个或4个或更多XTEN序列，该XTEN序列与选自表4、9、10、11、12和13的一个或多个XTEN相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性，其中所述XTEN序列位于CF序列内部。在前述的一个实施方案中，具有一个或多个内部XTEN的CFXTEN具有位于融合蛋白N端或C端的另外的XTEN，该另外的XTEN与选自表4的一个或多个XTEN相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。在另一实施方案中，本发明提供了具有内部XTEN的CFXTEN(如下文详述的)，其还包含通过裂解序列(例如，表7的裂解序列)与CF连接的C端XTEN，以使当通过蛋白酶起作用时，XTEN可以被释放。XTEN通过裂解序列的连接在下文和实施例中更完全地描述。
在一些实施方案中，如图2所示以及在实施例中更完全地描述，XTEN可以位于FIX序列的结构域之间；例如，在Gla和EGF1之间、或在EGF1和EGF2之间、或在EGF2和活化肽之间、或在AP的R145-A146和R180-V181活化肽残基之间的活化肽序列内(即，在序列TVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDF的任何两个氨基酸之间)、或在EGF2和活化肽之间、或在活化肽和蛋白酶结构域之间、或前述的任何组合。在其它实施方案中，如图2所示并且在实施例中更完全地描述，XTEN可以插入FIX序列的单个结构域内存在的环状序列内，以使1)XTEN形成在结构域外的环状结构，并且不破坏结构域的正常构造；和2)XTEN可以通过加入裂解位点的裂解而释放。
在另一实施方案中，本发明提供了包含FVII的CFXTEN，其加入位于FVII序列的结构域之间的一个或多个XTEN，例如，在Gla和EGF1之间、或在EGF1和EGF2之间、或在EGF2和活化肽之间、或在活化肽和蛋白酶结构域之间、或前述任何组合。XTEN可以为36至＞1000个氨基酸残基的序列，该序列包括但不限于与选自表4、8、9、10、11、12和13的序列相比具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％或更多序列同一性的序列。在一个实施方案中，如图5和图6所示，在EGF2结构域和残基Arg152-Ile153的单个水解性裂解位点之间加入XTEN。在其它实施方案中，如图5和图6所示以及在实施例中更完全地描述，XTEN可以插入FVII序列的单个结构域内存在的环状序列内，以使1)XTEN形成在结构域外的环状结构，并且不破坏结构域的正常构造；和2)XTEN可以通过加入的裂解位点的裂解而释放。
2.因子VII-FIX杂种序列变体
本发明提供了包含至少一个异源序列的分离的因子VII多肽，该异源序列可被未活化野生型因子VII的促凝蛋白酶裂解，其中一旦裂解异源序列，因子VII多肽就被活化。例如，具有因子VII-因子IX杂种序列变体的CFXTEN加入或取代该序列部分、来自因子IX的活化肽结构域(AP)序列的因子VII构建体部分，形成可以活化为凝血级联的内源性系统部分的杂种组合物。加入作为融合蛋白CF组分的这类因子VII-因子IX序列变体的CFXTEN允许向受试者施用组合物(在该组合物中CF组分未被活化)，并可以以较高的量给药，因为它作为主要通过蛋白酶抑制剂抵抗失活直到被内源性凝血级联触发或被自体活化(后者是慢过程)的惰性、循环的贮库保留。FVII/FIX杂种序列的非限制性实例示于图36中，其示出杂种氨基酸序列中与天然FIX和FVII的氨基酸序列具有同源性的那些部分。在一些实施方案中，CFXTEN包含因子VII-因子IX序列变体，该序列变体用FVII序列的一个或两个FIX AP裂解位点取代FIX活化肽序列的部分或全部直至FVII蛋白酶结构域的N端侧；即，朝向N端，始于全长前体多肽的位置212的精氨酸或位置213的异亮氨酸。在一个实施方案中，因子VII-因子IX序列CF加入全长FIXAP结构域加上至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个、或至少约6个、或至少约7个、或至少约8个、或至少约9个、或至少约10个、或至少约11个、或至少约12个氨基酸，该氨基酸侧连在FIX的R145-A146和R180-V181裂解位点的一侧或两侧上的相邻氨基酸残基(例如在12个侧翼氨基酸在N端侧而5个侧翼氨基酸在C端侧的情况中，序列RVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE)。在另一实施方案中，CFXTEN包含加入AP部分的因子VII-因子IX序列变体，该AP部分包括位于R145-A146AP裂解位点的侧翼的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个氨基酸的序列(例如，在6个侧翼氨基酸在裂解位点任一侧的情况中，序列TSKLTRAETVFP)。在另一实施方案中，CFXTEN包含引入AP部分的因子VII-因子IX序列变体，该AP部分包含位于R180-V181AP裂解位点的一侧或两侧的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个氨基酸的序列(例如，在来自FIX的裂解位点的4个氨基酸在N端侧和缬氨酸为C端的情况中的序列和DFTRV)。在另一实施方案中，CFXTEN包含本段的任何前述实施方案的因子VII-因子IX序列变体，该序列变体还包括与在FVII组分C端和融合蛋白的XTEN组分之间的连接子相同的AP序列；例如，FVII变体-AP序列-XTEN的N端至C端构型，由此允许因子VII-因子IX序列变体组分从CFXTEN融合蛋白通过与FVII向FVIIa转变的内源性凝血因子相同的内源性凝血因子而释放。在另一实施方案中，CFXTEN包含本段的任何前述实施方案的因子VII-因子IX序列变体，该序列变体还包含作为在FVII变体序列和XTEN之间的连接子的因子XI裂解序列KLTRAET，由此允许因子VII-因子IX序列变体组分从CFXTEN融合蛋白通过启动内源性凝血级联而释放。期望的是，随XTEN从因子VII-因子IX序列变体的释放，活化因子VII-因子IX序列变体与完整的CFXTEN相比半衰期更短，由此增加该组合物在受试者中的安全范围和耐受性。在本段的实施方案中，活化因子VII-因子IX序列变体分子可以如天然FVIIa具有至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％的生物活性，如由本文公开的任何适当的测定或参数所测定的(例如，PT或出血时间测定)。
在又一个实施方案中，本发明提供了不含连接的XTEN的本段前述实施方案的因子VII-因子IX序列变体，允许它们作为可被内源性或外源性凝血级联活化的因子VII-因子IX杂种的循环贮库施用给受试者。在一个实施方案中，本发明提供了具有因子VII-因子IX序列变体的CFXTEN，该序列变体具有加入的FIX-衍生序列，其具有与来自表43的序列相比表现出至少约80％序列同一性、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的全部序列。在另一实施方案中，本发明提供了因子VII-因子IX序列变体，该序列变体具有加入的FIX-衍生裂解序列(不含XTEN)，其具有与来自表43无XTEN序列相比表现出至少约80％序列同一性、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的序列。
包含因子VII-因子IX序列变体的CFXTEN的生物活性可以使用如本文所述的测定或体内参数评估(例如，在血友病模型中的体外凝血测定或药效效应)，并且与相应的天然FVII序列相比保留至少约40％、或约50％、或约55％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％或更多活性的那些序列被认为适合于包含在主题CFXTEN中。发现保留适合水平活性的CF可以与在上文所述的一种或多种XTEN多肽连接。在一个实施方案中，发现保留适合水平活性的CF可以与一种或多种与选自表4的序列具有至少约80％序列同一性，可选地与表4序列相比具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％序列同一性的XTEN多肽连接，形成嵌合的融合蛋白。
3.CFXTEN融合蛋白构型
本发明提供了具有以特定的N端至C端构型连接的CF和XTEN组分的CFXTEN融合蛋白组合物。在一些实施方案中，在使用或不使用间隔区的情况下，一个或多个CF在N端或C端连接至一个或多个XTEN，以形成嵌段共聚物，并且CFXTEN融合蛋白中CF和XTEN的顺序排列与嵌段共聚物化学中已知的构型一样。当存在不止一个CF、XTEN或间隔区时，CF、XTEN或间隔区的每一个具有相同或不同的序列，并且CF和/或XTEN连续或交替(规则或不规则)连接。因此，在本文提供的所有式中，当存在不止一个CF、XTEN或间隔区时，CF、XTEN或间隔区的每一个相同或不同。在一些实施方案中，CFXTEN是单聚体融合蛋白，具有与一个XTEN多肽连接的CF。在其它实施方案中，CFXTEN是单聚体融合蛋白，具有与两个或多个XTEN多肽连接的CF。在其它实施方案中，CFXTEN是单聚体融合蛋白，具有与一个XTEN多肽连接的两个或多个CF。在其它实施方案中，CFXTEN是单聚体融合蛋白，具有与两个或多个XTEN多肽连接的两个或多个CF。在又一个实施方案中，CFXTEN是具有单个CF的单聚体融合蛋白，其中XTEN位于CF序列内(例如，在诸如在如图2和5所示的一个或多个结构域之间的FIX序列内)。表6提供了本发明CFXTEN融合蛋白所涵盖的构型的非限制性实例；许多其它变化对于普通技术人员是明显的，包括本文公开或本领域已知的间隔区和裂解序列的加入。
表6：CFXTEN构型
Figure BPA00001545838400801
Figure BPA00001545838400811
*特征为为单个(对于1种组分)或为多个(对于2种或多种组分)
**反映生长因子和XTEN组分的N端至C端构型
本发明涵盖CFXTEN融合蛋白组合物，包含但不限于以表6所示构型的选自表1或表2的单个或多个CF(或其片段或序列变体)、选自表4的单个或多个XTEN(或其片段或序列变体)。含有与单个XTEN连接的单个CF的融合蛋白的序列的非限制性实例示于表41中。在一个实施方案中，CFXTEN组合物包含与来自表41的CFXTEN相比具有至少约80％序列同一性、可选地来自表41的CFXTEN相比至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％序列同一性的融合蛋白。一般而言，得到的CFXTEN保留未连接XTEN的相应CF的至少一部分生物活性。本段描述的上述融合蛋白中，CFXTEN融合蛋白可进一步包含来自表7的裂解序列；该裂解序列位于CF和XTEN之间或在相邻的CF之间(如果一个以上CF包含在CFXTEN中)。在一些情况下，包括裂解序列的CFXTEN也将具有在CF和裂解序列之间或XTEN和裂解序列之间的一个或多个间隔区序列氨基酸，以便于接近蛋白酶；包含任何天然氨基酸(包括作为优选氨基酸的甘氨酸和丙氨酸的间隔区氨基酸。包括CF、XTEN、裂解序列和间隔区氨基酸的CFXTEN的非限制性实例示于表42中。然而，本发明也涵盖表1和2的任何CF序列替换表42的CF序列，表4的任何XTEN序列替换表42的XTEN序列，以及表7的任何裂解序列替换表42的裂解序列。在具有一个或多个裂解序列的CFXTEN实施方案中，CF组分在其通过裂解序列的裂解而从XTEN释放时变得具有生物活性或活性增加，如下文更全面描述。
在CFXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供了式I的融合蛋白：
(XTEN)x-CF-(XTEN)y    I
其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式II的融合蛋白：
(XTEN)x-(CF)-(S)y-(XTEN)y  II
其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子a；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中所述的融合蛋白是式III：
(XTEN)x-(S)x-(CF)-(S)y-(XTEN)y  III
其中对于每次出现独立地，CF是凝血因子；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式IV的分离的融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(XTEN)w-(AP)-(XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z    IV
其中对于每次出现独立地，Gla是FIX的Gla结构域；EGF1是FIX的EGF1结构域；EGF2是FIX的EFG2结构域；AP是FIX的激活肽；PRO是FIX的蛋白酶结构域；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；u是0或1；v是0或1；x是0或1；y是0或1，z是0或1，条件是u+v+x+z≥1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式V的分离的融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(AP1)-(XTEN)w-(AP2)-(XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z    V
其中对于每次出现独立地，Gla是FIX的Gla结构域；EGF1是FIX的EGF1结构域；EGF2是FIX的EFG2结构域；AP1是FIX激活肽结构域的N端序列部分，其包括AP结构域的第一天然裂解序列；AP2是FIX激活肽结构域的C端序列部分，其包括AP结构域的第二天然裂解序列；PRO是FIX的蛋白酶结构域；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，条件是u+v+w+x+z≥1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供了式VI的分离的融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(XTEN)w-(Pro)-(S)x-(XTEN)y VI
其中对于每次出现独立地，Gla是FVII的Gla结构域；EGF1是FVII的EGF1结构域；EGF2是FVII的EFG2结构域；PRO是FVII的蛋白酶结构域；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；u是0或1；v是0或1；x是0或1；y是0或1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在CFXTEN组合物的另-实施方案中，本发明提供了式VII的分离的融合蛋白：
(Gla)-(XTEN)t-(EGF1)-(XTEN)u-(EGF2)-(AP1)v-(XTEN)w-(AP2)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z VII
其中对于每次出现独立地，Gla是FVII的Gla结构域；EGF1是FVII的EGF1结构域；EGF2是FVII的EFG2结构域；PRO是FVII的蛋白酶结构域；AP1是FIX激活肽结构域的N端序列部分，其包括天然裂解序列；AP2是FIX激活肽结构域的C端序列部分，其包括天然裂解序列；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包括裂解序列；t是0或1；u是0或1；v是0或1；x是0或1；y是0或1；z是0或1；并且XTEN是延伸重组多肽。在该实施方案中，因子VII变体包括可以包括来自因子IX的激活肽结构域的一个或两个裂解序列；例如，位于R145-A146裂解位点侧翼的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个氨基酸的序列(例如，在5个侧翼氨基酸的情况中，序列TSKLTRAETVFP)和位于R180-V181裂解位点侧翼的至少约2个、或至少约3个、或至少约4个、或至少约5个氨基酸的序列(例如，在5个侧翼氨基酸的情况中，序列FNDFTRVVGGED)，如上文更完全描述的。本发明还涵盖表7的任何其它裂解序列替换因子VII变体的AP序列。
式V和VI的实施方案分别涵盖因子IX和因子VII的CFXTEN构型，其中长度为约36个氨基酸至≥1000个氨基酸(例如，选自表4和9-13的序列)的一个或多个XTEN分别在因子IX或因子VII序列的相邻结构域之间插入并连接。本发明涵盖XTEN插入FIX或FVII的结构域之间的所有可能的排列，另外的XTEN任选与FIX或FVII的C端连接，任选地经由选自表7的另外的裂解序列，形成CFXTEN组合物；其非限制性实例描绘于图2、5和6中。本段描述的上述实施方案中，使用本文所公开的任何适当的体外测定(例如，表40的测定或实施例中描述的测定)可以评估CFXTEN融合蛋白的生物活性保留(包括在裂解任何加入的XTEN-释放裂解位点之后)，以测定该构型用作治疗剂在治疗凝血因子相关的疾病、疾患或病症中的适用性。
在一些实施方案中，治疗有效量的式I-VII之一的融合蛋白施用于需要其的受试者，导致融合蛋白的终末半衰期增加至以类似量施用给受试者的未连接XTEN的相应CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少100倍。在一些实施方案中，治疗有效量的式I-VII之一的融合蛋白施用于需要其的受试者，导致在融合蛋白治疗窗内维持的时间增加至以类似量施用给受试者的未连接XTEN的相应CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少100倍或更多。在其它实施方案中，治疗有效剂量的式I-VII之一的融合蛋白施用给有相应需要的受试者可以导致与以类似剂量施用的未连接XTEN的CF相比，维持治疗有效血药浓度的融合蛋白所必需的连续剂量之间的时间的增加至连续剂量之间的至少48h、或至少72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约7天、或至少约14天、或至少约21天。
任何间隔区序列基团任选地引入本发明涵盖的主题融合蛋白。提供间隔区以增强融合蛋白从宿主细胞的表达或降低空间位阻，使得CF组分可以采取其期望的三级结构和/或适当地与其靶底物相互作用。关于间隔区和鉴定期望间隔区的方法参见例如George等(2003)Protein Engineering 15：871-879，明确地通过引用的方式并入。在一个实施方案中，间隔区包含长度为1-50个氨基酸残基或者长度为约1-25个残基或约1-10个残基的一个或多个肽序列。除去裂解位点，间隔区序列可以包含20种天然L氨基酸的任何一个，并且将优选地包含无空间位阻的亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸可以包括但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。在一些情况下，间隔区可以是多聚甘氨酸或多聚丙氨酸，或者主要是甘氨酸和丙氨酸残基组合的混合物。除去裂解序列，间隔区多肽大部分基本上没有二级结构；例如通过Chou-Fasman和/或GOR算法测定小于约10％或小于约5％。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白组合物中间隔区序列还包含相同或不同的一个或多个裂解序列，其中所述裂解序列可以受蛋白酶作用以从融合蛋白释放CF。
在一些实施方案中，设计裂解序列加入CFXTEN以允许在从XTEN释放时变得有活性或活性更强的CF的释放；例如，CF组分的酶活性增加。在前述的一个实施方案中，在释放后变得具有活性的CF是FIX或其序列变体。在前述的另一实施方案中，在释放后变得具有活性的CF是FVII或其序列变体。裂解序列位于与CF序列足够近，一般在CF序列末端的18、或12、或6、或2个氨基酸之内，使得与CF连接的任何其余残基在裂解之后不明显干扰CF的活性(例如，诸如结合至配体或底物)，而提供对蛋白酶的足够接近以能够实现裂解序列的裂解。在一些实施方案中，裂解位点是可通过哺乳动物受试者内源性蛋白酶裂解的序列，使得CFXTEN可以在施用给受试者之后被裂解。在此类情况下，CFXTEN可以用作CF的前药或循环贮库。在一个实施方案中，从融合蛋白通过裂解序列裂解而释放的CF对其天然底物的酶活性与完整的CFXTEN融合蛋白相比表现出至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍的增加。
本发明涵盖的裂解位点的实例包括但不限于可被哺乳动物内源性蛋白酶或被非哺乳动物蛋白酶裂解的多肽序列，所述哺乳动物内源性蛋白酶选自FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20，所述非哺乳动物蛋白酶例如TEV、肠激酶、PreScissionTM蛋白酶(鼻病毒3C蛋白酶)和分选酶A。已知被前述蛋白酶和其它蛋白酶裂解的序列是本领域已知的。示例性的裂解序列和序列内切割位点及其序列变体提供于表7。例如，凝血酶(活化的凝血因子II)作用于序列LTPRSLLV[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]，其可以在序列中位置4的精氨酸之后被切割。活性FIIa通过FXa在磷脂和钙存在下裂解FII而产生并且在凝结途径中因子IX的下游。一旦被活化，其在凝结中的天然作用是裂解纤维蛋白原，然后转而开始血块形成。FIIa活性被严格控制并且仅在凝结是适当止血所必要的时候发生。然而，因为凝结在哺乳动物中是持续的过程，通过将LTPRSLLV序列加入CF与XTEN组分之间并将其连接的CFXTEN，当生理上需要凝结时，XTEN将从结合的CF去除，同时活化外在或内在的凝结途径，从而随时间释放CF。类似地，将由内源性蛋白酶(具体地是易受表7所列的活化的凝血蛋白质影响的那些蛋白酶)作用的其它裂解序列加入CFXTEN将提供CF的持续释放，这在CFXTEN的某些实施方案中提供了从CFXTEN完整形式释放的CF组分的更高程度的活性。在一个实施方案中，本发明提供了包含可操作定位一个或多个裂解序列的CFXTEN，以在裂解时从融合蛋白释放CF，其中所述一个或多个裂解序列对选自表7的序列具有至少约86％、或至少约92％或更大的序列同一性。在另一实施方案中，包括裂解序列的CFXTEN与选自表42的序列相比具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性。
在一些实施方案中，切割位点两侧仅两个或三个氨基酸(共计4至6个氨基酸)被加入裂解序列，该裂解序列反过来加入实施方案的CFXTEN中。在其它实施方案中，已知的裂解序列具有针对已知序列中任何一个或两个或三个氨基酸的一个或多个缺失或插入或一个或两个或三个氨基酸取代，其中所述缺失、插入或取代导致对蛋白酶减少或增加的易感性而非易感性缺乏，导致修改的CF从XTEN释放的速率的能力。示例性取代示于表7。
表7：蛋白酶裂解序列
Figure BPA00001545838400881
↓指示裂解位点    NA：不适用
*斜杠之前、之间或之后的多个氨基酸的列表指示在该位置可以被取代的可选氨基酸；“-”指示任何氨基酸可以取代中间列中指示的相应氨基酸。
(a)CFXTEN的药代动力学性质
本发明提供了与未连接XTEN的CF相比具有增强的药代动力学的CFXTEN融合蛋白。CF的药代动力学性质，可以通过将给定XTEN连接至CF增强，所述的性质包括但不限于，终末半衰期、曲线下面积(AUC)、Cmax、分布容量和生物利用度；在治疗凝血因子相关的疾患、疾病和相关病症中提供增强的效用的性质。由于增强的性质，CFXTEN，当通过本文描述的方法以确定适用于组合物的剂量和剂量方案使用时，可以实现导致所需的药理效应的循环浓度，而与类似剂量的未连接XTEN的CF相比保持在组合物的生物活性组分的安全范围内延长的时段。在此类情况下，以类似量施用给受试者的与未连接XTEN的CF相比CFXTEN在融合蛋白组合物的治疗窗内保持延长的时段。本文使用的“类似剂量”指以类似方式施用给受试者的活性CF药效团(例如，FIX或FVII)的相等摩尔/kg的剂量。在本领域应理解，“类似剂量”的CFXTEN融合蛋白将代表更大重量的物质，但在施用的融合蛋白剂量中具有基本上相同的摩尔当量的CF。
在一些实施方案中，具有增强的药代动力学性质的CFXTEN可以是与选自表41、42或43任意之一的蛋白质序列相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在另一实施方案中，具有增强的药代动力学性质的CFXTEN可以含有与来自表1或来自表2的序列相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或约99％序列同一性的CF序列，其连接与来自表4的序列相比具有至少约80％序列同一性、或可选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或约99％序列同一性的一个或多个XTEN。对于本发明的组合物，为了使患者更方便，通常优选具有更长终末半衰期的CFXTEN，以增加用药间的间隔，并降低实现持续效应所需的药物量。本段描述的上述实施方案中，使用与以类似单位剂量或剂量方案施用于受试者的未连接融合蛋白的相应CF组分相比较低的以摩尔计的单位剂量的融合蛋白，施用该融合蛋白导致改善了参数(本文所公开如用于评估受试者疾病、病症或疾患)的至少一个。在前述实施方案中，实现改善所施用的以摩尔计的总剂量为未连接融合蛋白的相应CF组分的至少约1/3、或至少约1/4、或至少约1/5、或至少约1/6、或至少约1/8、或至少约1/10。
如实施例中对包含XTEN的融合蛋白的药代动力学特征更全面描述的，观察到增加XTEN序列的长度带来包含XTEN的融合蛋白终末半衰期不成比例的增加。因此，本发明提供了包含XTEN的CFXTEN融合蛋白，其中XTEN被选择为施用给受试者的CFXTEN组合物提供目标半衰期。在一些实施方案中，本发明提供了包含XTEN的单聚体融合蛋白，其中选择XTEN为施用给受试者的CFXTEN带来与以类似剂量施用的未连接融合蛋白的相应CF相比终末半衰期的增加，其中增加是增加至未连接融合蛋白的CF的终末半衰期的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少80倍、或至少100倍或更高。已经报道外源施用的因子IX在人中具有约18-24小时的终末半衰期(Morfini，M.Blood Transfus.(2008)6(s2)：s21-s25)，并且已经报道外源施用的因子VII具有约4-6小时的终末半衰期(Klitgaard T，Br J Clin Pharmacol(2008)65(1)：3-11)，而如实施例所述，实验施用给动物的本文公开的各种CFXTEN组合物已导致终末半衰期值相当长。在一个实施方案中，本发明提供了CFXTEN融合蛋白与以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的相应CF相比可以表现出至少约50％、或者至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约150％、或至少约200％、或至少约300％、或至少约500％、或至少约1000％、或至少约2000％的AUC增加。CFXTEN的药代动力学参数可以通过标准方法测定，包括给药、以时间间隔取血样和使用ELISA、HPLC、放射性分析或本领域已知或本文描述的其它方法分析蛋白，随后标准计算数据以推导半衰期和其它PK参数。
与未连接XTEN的CF相比，提高的PK参数考虑到CFXTEN组合物减少的剂量。在一些实施方案中，在需要维持止血的剂量方案下，施用未连接XTEN的相应CF的约1/2、或约1/3、或约1/4、或约1/5、或约1/6、或约1/8、或约1/10或更少的更小摩尔量的融合蛋白，并且融合蛋白实现了与相应摩尔量的未连接XTEN的CF类似的曲线下面积。在其它实施方案中，融合蛋白与每日施用其它相同剂量的未连接XTEN的相应CF相比具有更低频率的施用方案，为向受试者约每2天、约每7天、约每14天、约每21天或约每月施用融合蛋白，并且融合蛋白实现了与未连接XTEN的相应CF类似的曲线下面积。在其它实施方案中，在需要维持止血的剂量方案下，向受试者施用与相应摩尔量的未连接XTEN的CF相比约5％、或约10％、或约20％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％更少的累积更小摩尔量的融合蛋白，并且融合蛋白实现了与未连接XTEN的相应CF至少类似的曲线下面积。累积较小摩尔量测量至少约1周、或约14天、或约21天、或约1个月的时间。
本发明还提供了包含由一个或多个裂解序列(例如，来自表7的序列)从XTEN序列间隔的CF分子的CFXTEN。在一些实施方案中，完整的CFXTEN组合物与未连接XTEN的相应CF相比具有较低活性而以其完整形式的半衰期却较长，但是被设计为在施用给受试者时，CF组分通过裂解在裂解序列处被内源性蛋白酶从融合蛋白逐渐释放，由此CF组分表现出活性，即有效地与其靶凝血蛋白底物结合并将其活化的能力。在非限制性实施例中，具有裂解序列的CFXTEN与来自表42的序列相比具有约80％序列同一性，或与来自表42的序列相比具有约85％、或约90％、或约95％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性。因此，本段前述的实施方案的CFXTEN用作前药或循环贮库，导致与未连接XTEN的CF相比更长的终末半衰期。在这类情况中，可以向受试者施用与未连接XTEN的相应CF相比更高浓度的CFXTEN，因为更小比例的循环组合物是活化的。
(b)CFXTEN的药理学和药学性质
本发明提供了包含与XTEN共价连接的CF的CFXTEN组合物，与未连接XTEN的CF相比，XTEN可具有增强的性质，还提供了增强该组合物的两个CF组分各自的治疗活性和/或生物活性或效应的方法。此外，本发明提供了与含有白蛋白、免疫球蛋白多肽配偶体、较短长度的多肽和/或具有重复序列的多肽配偶体的那些本领域已知融合蛋白相比具有增强的性质的CFXTEN组合物。此外，CFXTEN融合蛋白提供了超越化学偶联物例如聚乙二醇化构建体的显著优势，值得注意的事实是，重组CFXTEN融合蛋白可以在细菌细胞表达系统中制备，这可以减少产物的研发和生产阶段的时间和花费，并且得到与聚乙二醇化的偶联物相比更均一确定的产物，该产物和CFXTEN代谢物具有更低的毒性。
作为治疗剂，CFXTEN具有优于不包含XTEN的治疗剂的许多优势，包括以下非限制性示例性增强性质的一个或多个：增加的溶解度、增加的热稳定性、减少的免疫原性、增加的表观分子量、减少的肾清除、减少的蛋白水解、减少的代谢、增强的治疗效力、较低的有效治疗剂量、增加的生物利用率、增加的能够维持血药水平在CF治疗窗内的剂量间的时间、当皮下或肌内施用时“修改的”吸收率、增强的冻干稳定性、增强的血清/血浆稳定性、增加的终末半衰期、增加的血流溶解度、降低的中和抗体的结合、降低的主动清除、减少的副作用、底物结合亲和力的保留、降解稳定性、冻融稳定性、对蛋白酶的稳定性、对遍在蛋白化的稳定性、容易施用、与其它药物赋形剂或载体的相容性、在受试者中的持久性、增加的存储稳定性(例如，增加的半衰期)、生物体或环境中减少的毒性等。增强的性质的净效应在于使用CFXTEN组合物在施用给凝血因子相关的疾病或疾患的受试者时可以导致与未连接XTEN的CF相比增强的治疗效应和/或生物效应，或导致改善的患者依从性。
用于测量被表达的蛋白质的物理和结构性质的具体测定和方法是本领域已知的，包括用于测定如下性质的方法：蛋白聚集、溶解度、二级和三级结构、熔解性质、污染和水含量等。此类方法包括分析离心、EPR、离子交换HPLC、尺寸排阻HPLC、反相HPLC、光散射、毛细管电泳、圆二色性、差示扫描量热法、荧光、离子交换HPLC、尺寸排阻HPLC、IR、NMR、拉曼光谱、折射法和UV/可见光谱法；它们中的几个适用于如实施例中所述的本发明的CFXTEN。其它方法公开于Arnau等，Prot Expr and Purif(2006)48，1-13。这些方法应用以阐明本发明组合物增强的性质在本领域技术人员能力范围内。
在一个实施方案中，XTEN作为融合配偶体增加了CF有效负载的溶解度。因此，当期望增强CF的药学或物理化学性质例如水溶解度或稳定性的程度时，加入融合蛋白的XTEN序列的长度和/或基序家族组成可以各自被选择为赋予各自融合蛋白不同的溶解度和/或稳定性程度，使得CFXTEN组合物的整体药学性质被增强。CFXTEN融合蛋白可以使用本文所述的方法构建并分析以确认物理化学性质，并且按需要调整XTEN以得到期望的性质。在一个实施方案中，选择CFXTEN的XTEN序列为使融合蛋白的水溶解度比未连接融合蛋白的CF大至少约25％，或者比未连接融合蛋白的相应CF大至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约100％、或至少约200％、或至少约300％、或至少约400％、或至少约500％、或至少约1000％。
本发明提供了从宿主细胞制备并回收与未连接XTEN的CF相比具有增强的溶解度并容易回收的表达的CFXTEN。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：用编码具有累积序列长度大于约200、或大于约400、或大于约600、或大于约800个氨基酸残基的一个或多个XTEN组分的CFXTEN的多核苷酸转化真核宿主细胞，在宿主细胞中表达CFXTEN融合蛋白，并以溶解形式再生表达的融合蛋白。在本段描述的上述实施方案中，CFXTEN融合蛋白的XTEN可以与选自表4的一个或多个XTEN相比具有至少约80％序列同一性、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％序列同一性，并且CF可以与选自表1或表2的CF相比具有至少约80％序列同一性、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或100％序列同一性，并且CFXTEN组分可以是选自式I-VII的N端至C端构型。
在一个实施方案中，本发明提供了CFXTEN组合物和制备该组合物的方法，该组合物与类似剂量的未连接XTEN的相应CF相比可以使CF组分在治疗窗内维持更长的时段。在本领域应理解，“类似剂量”的CFXTEN融合蛋白代表更大重量的物质，但在融合蛋白剂量中具有近似相同的摩尔当量的CF，和/或相对于CF具有相同的近似摩尔浓度。制备可使CF组分在治疗窗内维持的组合物的方法包括以下步骤：鉴于给定剂量和剂量方案来选择适合偶联至CF的XTEN以提供期望的药代动力学性质，向需要其的受试者施用CFXTEN，随后通过测定确认药代动力学性质、CFXTEN融合蛋白的活性和施用组合物的安全性。通过所述方法，本文提供的CFXTEN通过使CF循环浓度在治疗窗内维持延长的时段而实现施用组合物提高的效力。本文使用的“治疗窗”表示作为血液或血浆浓度范围的药物或生物制剂的量，其提供针对疾病或病症的随时间的效力或期望的药理效应而无不可接受的毒性，即，实现任何积极治疗效应的最小量与导致即将对受试者产生毒性(以更高剂量或浓度)的应答的最大量之间的循环血药浓度范围。此外，治疗窗一般涵盖时间方面；导致期望的随时间的药理效应的最大浓度和最小浓度，不导致不可接受的毒性或不良事件。保留在受试者治疗窗内的剂量组合物还可以被称为在“安全范围内”。
本发明CFXTEN组合物的特征(包括功能特征或生物和药理活性以及所得到的参数)可以通过本领域已知用于测量期望特征的任何适合的筛选测定来确定。本发明提供了测定不同组成或构型的CFXTEN融合蛋白的方法以提供具有期望程度的生物和/或治疗活性以及安全性特征的CFXTEN。使用特定的体内和离体生物测定来评估每种构型的CFXTEN和/或待加入CFXTEN的CF组分的活性，包括但不限于实施例的测定、表40的那些测定、以及以下测定或本领域已知用于测定CF性质和效应的其它此类测定。可以进行功能测定以允许确定凝血活性，例如凝血酶原(PT)和活化部分凝血酶原(aPTT)测试(Belaaouaj AA等人，J.Biol.Chem.(2000)275：27123-8：Diaz-Collier JA.Haemost(1994)71：339-46)、凝血时间(WBCT)、血栓弹力描记术或出血时间测定。其它可能的测定可以确定CFXTEN对相应CF靶底物的结合亲和力，可以使用结合或竞争性结合测试来测定，例如美国专利5,534,617中描述的使用芯片结合受体或结合蛋白的Biacore测定或ELISA测定、本文实施例中描述的测定、放射性受体测定、或本领域已知的其它测定。前述测定也可以用于评价CF序列变体(作为单个组分或作为CFXTEN融合蛋白来测定)并可以与天然CF相比，以确定它们是否具有与天然CF或其某些部分相同的生物活性程度，使得它们适合纳入CFXTEN；例如，与天然CF相比具有至少约60％，或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的活性。
剂量优化对于所有药物是重要的，特别是对于具有窄治疗窗的那些药物。例如，标准化的单剂量CF对于具有多样症状或异常临床参数的所有患者不总是有效的。这些因素的考虑完全在普通技术人员能力范围内，目的是确定CFXTEN的治疗或药理学有效量以及会导致不可接受的毒性和安全范围以外的量或者不足效价而无法实现临床改善的量。
在许多情况下，CF在不同年龄或疾病程度的受试者中的治疗窗已经被确立并可获自公开的文献或陈述于含有CF的批准产品的药物标签上。在其它情况下，可为新组合物确立治疗窗，包括本公开内容的那些CFXTEN。为给定组合物确立治疗窗的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Goodman &Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第11版，McGraw-Hill(2005))。例如，通过在具有目标疾病或疾患的受试者中使用剂量放大研究来确定效力或期望的药理效应、不良事件的出现并测定循环血药水平，可以针对给定受试者或受试者群测定给定药物或生物制剂、或生物制剂或药物的组合的治疗窗。剂量放大研究可以通过在受试者或受试者群中监测生理或生化参数的代谢研究来评估CFXTEN的活性，如本领域已知或本文描述的有关以下的参数：与代谢疾病或疾患有关的一个或多个参数，或与特定适应症的有益结果有关的临床参数，以及确定无效剂量、不良事件、最大耐受剂量等的观察和/或测量参数，以及确立测定或推导的循环血药水平的药代动力学参数的测量。然后可以将结果与符合前述测定参数或效应水平的治疗剂的施用剂量和血药浓度相关联。通过这些方法，一系列剂量和血药浓度可以与发生期望效应和即将发生毒性的最小有效剂量及最大剂量和血药浓度相关联，从而确立给药治疗剂的治疗窗。高于最大值的融合蛋白(或通过CF组分测量)的血药浓度被认为在治疗窗或安全范围以外。因此，通过前述方法，确立Cmin血药水平和Cmax血药水平，低于Cmin血药水平时，CFXTEN融合蛋白将不具有期望的药理效应，而Cmax血药水平代表达到下述浓度之前的最高循环浓度：将引发不可接受的副作用、毒性或不良事件，使之处于CFXTEN的安全范围以外。随着此类浓度的确立，给药频率和剂量可以通过测量Cmax和Cmin来进一步确定，以提供适合的剂量和给药频率以保持融合蛋白在治疗窗内。
通过本文描述的方式或通过本领域已知的其它方法，本领域技术人员可以确认施用的CFXTEN在治疗窗内维持期望的间隔时间或者需要调整剂量或XTEN的长度或序列。而且，确定保持CFXTEN在治疗窗内的适当剂量和给药频率确立了治疗有效剂量方案；使用治疗有效剂量的融合蛋白对给有相应需要的受试者施用多个连续剂量的计划表导致连续的Cmax峰和/或Cmin谷，其保持在治疗窗内并且导致与目标疾病、疾患或病症相关的至少一个测量参数的改善。在一些情况下，以适当剂量施用给受试者的CFXTEN导致CFXTEN融合蛋白的血药浓度在治疗窗内维持的时段是以类似剂量施用的未连接XTEN的相应CF的至少约2倍；可选地是以类似剂量施用的未连接XTEN的相应CF的至少约3倍；可选地为至少约4倍；可选地为至少约5倍；可选地为至少约6倍；可选地为至少约7倍；可选地为至少约8倍；可选地为至少约9倍或为至少约10倍或更长。本文使用的“适当剂量”指当药物或生物制剂施用给受试者时会导致期望的治疗或药理效应和/或在治疗窗内血药浓度的剂量。
在一个实施方案中，以治疗有效剂量方案施用的CFXTEN导致融合蛋白的血药水平的至少两个连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至使用类似剂量方案施用给受试者的未连接至融合蛋白的融合蛋白的相应生物活性蛋白的至少约3倍；可选地至少约4倍；可选地至少约5倍；可选地至少约6倍；可选地至少约7倍；可选地至少约8倍；可选地至少约9倍或至少约10倍。在另一实施方案中，以治疗有效剂量方案施用的CFXTEN导致与使用CF的治疗有效剂量方案施用给受试者的未连接至融合蛋白的相应生物活性蛋白相比，在使用药物组合物的融合蛋白的较低频率给药或较低总剂量(以摩尔计)时实现一个或两个或三个或更多测量参数的类似改善。所述测量参数包括本文公开的临床、生化或生理参数、或者本领域已知用于评估患有凝血因子相关疾患的受试者的其它参数。
在一些实施方案中，就已知的体外生物活性或药理效应或与在治疗和预防凝血因子相关的疾病、疾患和病症中使用天然CF相关的体外生物活性或药理效应而言，本发明CFXTEN融合蛋白保留了未连接融合蛋白的相应CF的生物活性的至少约0.05％、或约0.1％、或约1％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约98％、或约99％。可以被测定以评估CFXTEN融合蛋白的保留活性的参数或生理效应的非限制性实例包括凝血酶原时间(PT)、活化的部分促凝血酶原时间(aPTT)、出血时间、全血凝固时间(WBCT)和血栓弹力描记术。在一些实施方案中，CF组分的活性通过完整CFXTEN融合蛋白显现，而在其它情况下，CF组分的活性主要在CF从融合蛋白裂解和释放时显现，所述裂解和释放是通过作用于加入CFXTEN融合蛋白的裂解序列的蛋白酶的作用，其实施方案是在上文公开。在前述中，CFXTEN被设计为CF组分在连接至XTEN时对凝血底物的结合亲和力降低，但是在通过裂解加入CFXTEN序列的裂解序列从XTEN释放时恢复或增加亲和力，如上文更全面地描述。在前述的一个实施方案中，本发明提供了包含通过裂解序列连接XTEN的FIX的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白在裂解之前是基本上无活性的，并且其中通过在裂解序列处的蛋白水解性裂解从融合蛋白释放的FIX，与不连接XTEN的天然FIX活性相比具有至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约95％的生理活性。
在其它情况下，CFXTEN可以被设计为，在仍然保留生物活性的同时降低CFXTEN的主动清除，以增加施用给受试者的CFXTEN的终末半衰期。然而将CF从循环中移除的清除机制已被完全阐明。CF的吸收、消除和失活可以发生在循环系统中以及血管外的空间中。凝血因子是复合蛋白质，其与大量其它蛋白质、脂类和受体相互作用，并且许多这些相互作用可促进CF从循环消除。例如，FVII(一种异源糖基化蛋白)的清除机制可以包括通过肝的清除。已使用灌注肝模型研究了γ羧基谷氨酸(Gla)结构域和蛋白质的唾液酸含量对FVIIa的清除效应，结果提示碳水化合物受体(例如，唾液酸糖蛋白受体，ASGPR)可以在FVIIa清除中起作用。(Appa，R.S.等人ThrombHaemost.(2010，epub May 27)104(2))。此外，CF可通过外渗和快速主动清除而损失，这反映在静脉内施用的凝血因子例如因子VIIa通常弱的生物利用度上(参见NovoSeven包装说明书)。应认为，本发明的CFXTEN具有相对更高的生物利用度，其通过减少主动清除和/或通过减少外渗(通过将非结构化XTEN加至凝血因子增加流体力学半径、或分子的表观尺寸)实现。在一个实施方案中，本发明提供了CFXTEN，其通过将一个或多个XTEN与融合蛋白的CF组分连接减少了融合蛋白的清除，其中该融合蛋白的表观分子量因子增加至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约12倍、或至少约15倍，并且其中CFXTEN的终末半衰期当施用给受试者时与未连接XTEN的相应CF相比增加至少约2倍、或至少约4倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约30倍、或至少约40倍、或至少约50倍、或至少约60倍、或至少约70倍、或至少约80倍或更多。在前述实施方案中，其中至少2个XTEN分子被加入CFXTEN中，XTEN可以是相同或它们可以是不同的序列组合物(和净电荷)或长度。前述实施方案的非限制性实例(连接单个FVII的2个XTEN)示于图6中，并包括构建体(使用FVII结构域表达)Gla-EGF1-EGF2-AE144-蛋白酶-AE864或Gla-EGF1-AE288-EGF2-蛋白酶-AE864(其中由于加入谷氨酸，AEXTEN组分具有约17％的净电荷)、Gla-EGF1-EGF2-AG144-蛋白酶-AG864或Gla-EGF1-AG144-EGF2-蛋白酶-AE864(其中AG XTEN组分几乎没有净电荷)。不受特定理论约束，如上文所述，期望具有较高净电荷的CFXTEN组合物的XTEN与多种负电荷的表面(例如血管、组织或多种受体)具有较少的非特异性相互作用，其将有助于进一步减少主动清除。相反，期望具有低(或无)净电荷的CFXTEN组合物的XTEN具有与所述表面更高程度的相互作用，在促进主动清除的同时，可以加强与凝血因子相关的活性，赋予细胞(例如，血小板)和血管表面对凝血过程和凝血因子活化强度已知的贡献(Zhou，R.等人，Biomaterials(2005)26(16)：2965-2973；London，F.等人Biochemistry(2000)39(32)：9850-9858)。因此，本发明提供了CFXTEN，其中效能度、生物利用度和半衰期可以在CFXTEN组合物中通过选择和配置XTEN的类型和长度而修改。因此，本发明涵盖了组合物(其中CF来自表1或来自表2，并且XTEN来自表4)替换前述实施例的各组分，并且制备为例如，来自表6或来自式I-VII的构型，以使构建体与各组分可选的构型相比具有降低的清除。在一些实施方案中，用于增加终末半衰期的前述方法提供了构造的CFXTEN，其在不降低主动清除的情况下可以导致终末半衰期与第二种构型中CFXTEN的半衰期相比增加至少约30％、或约50％、或约75％、或约100％、或约150％、或约200％、或约300％、或约400％或更多。本发明进一步利用了下列事实：不管CF、XTEN或间隔区序列中的另一分子是否导致结合降低，可通过阻断N-端或C-端以及使用该端作为与组合物的另一多肽的连接来实现某些配体与清除受体的结合的降低(由于减少的结合速率或增加的解离速率)。CFXTEN融合蛋白特定构型的选择降低了与清除受体结合的程度，以实现主动清除率下降。
在其中期望降低主动清除但还期望保留至少一部分生物活性的情况下，CFXTEN设计为对完整分子保留足够的活性。因此，在一个实施方案中，本发明提供了构造的CFXTEN，使得CFXTEN的生物活性为相应天然凝血因子的生物活性的约0.01％-40％、或约0.01％-30％、或约0.01％-20％、或约0.01％-10。因此，该构造的CFXTEN的生物活性与其中在类似条件下测定的未连接XTEN的相应天然凝血因子的生物活性相比降低至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％、或至少约99.99％。在前述实施方案中，该构造的CFXTEN与未连接XTEN的相应天然CF相比，对靶受体的生物活性是“基本上降低的”。因此，本发明提供了具有降低的生物活性但半衰期增加的组合物和通过构造在上文提供实例的CFXTEN而产生这种组合物的方法，以能够提供期望的体内生物应答而避免了主动清除机制。与未连接XTEN的CF相比或与其中融合蛋白易受凝血因子清除机制影响的CFXTEN构型相比，增加的半衰期允许更高的剂量和降低的给药频率。
VI).本发明组合物的用途
另一方面，本发明提供了用于在出血疾患和/或在由FIX或FVII介导的凝血因子相关的疾病、疾患或病症中获得有益效应的方法。如本文使用的，“凝血因子相关的疾病、病症或疾患”意欲包括但不限于，通过向受试者施用FIX或FVII可以缓解或纠正的出血疾患(例如，血小板功能缺乏、血小板减少症或von Willebrand病)、凝血紊乱(凝血的任何疾患，包括凝血因子缺乏)、血友病B(又称为Christmas病)、因子IX相关的出血疾患、因子VII缺乏、血友病A、血管损伤、未患血友病的受试者失控出血、创伤或手术引起的出血、由于抗凝治疗引起的出血、以及由于肝病或病症引起的出血。本发明克服了使用具有相对短的终末半衰期和/或窄治疗窗的因子IX或因子VII制剂的其它治疗方法的缺点和/或限制。
在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有凝血因子相关的疾病、疾患或病症的受试者(例如人)的方法，包括向受试者施用治疗上或预防上有效量的CFXTEN的步骤，其中所述施用导致与凝血因子相关的疾病、疾患或病症有关的一个或多个生物化学或生理参数或临床终点的改善。在前述一个实施方案中，CFXTEN包含FVII。在前述另一实施方案中，CFXTEN包含FIX。有效量产生了有益的效应，有助于治疗(例如，治愈或降低严重性)或预防(例如，降低出现的可能性或严重性)凝血因子相关的疾病、疾患或病症。如本文使用的“治疗”指施用药物或生物制剂(例如，CFXTEN)，以实现存在的疾病、疾患或病症的改善或预防疾病、疾患或病症的发生(包括预防法)。治疗有效量的CFXTEN融合蛋白可以是组合物当作为单次或多次剂量施用于受试者时导致改善或缓解潜在的疾病、疾患或病症，或改善与潜在疾病、疾患或病症有关的征兆或症状或生理参数的量。
止血受多种蛋白因子的调节，并且此类蛋白及其类似物已经用于治疗凝血因子相关的疾病、疾患和病症。然而，可商购获得的凝血因子的使用在管理罹患此类疾病、疾患和病症的受试者中未达到最佳成功。具体说，剂量优化和给药频率对于凝血因子用于治疗或预防在凝血因子相关的疾病、疾患、或症状、或未患血友病的受试者失控出血中的出血事件是重要的。凝血因子具有短半衰期的事实需要频繁给药以实现临床益处，这导致在此类患者管理中的困难。
本发明提供了治疗方法，其包括向患有或处于发展凝血因子相关的疾病、疾患或病症风险的受试者施用CFXTEN组合物，其中所述施用导致与该病症有关的一个或多个生物化学或生理学参数或临床终点改善。在一个实施方案中，该治疗方法包括向患有血友病A的受试者施用治疗有效量的CFXTEN组合物，其中所述施用导致与该病症有关的一个或多个生物化学或生理学参数或临床终点改善。在另一实施方案中，该治疗方法包括向患有血友病B的受试者施用治疗有效量的CFXTEN组合物，其中所述施用导致与该病症有关的一个或多个生物化学或生理学参数或临床终点改善。在另一实施方案中，该治疗方法包括向患有因子VII缺乏的受试者施用治疗有效量的CFXTEN组合物，其中所述施用导致与该病症有关的一个或多个生物化学或生理学参数或临床终点改善。在另一实施方案中，该治疗方法包括向患有或处于发展失控出血风险的受试者施用治疗有效量的CFXTEN组合物，其中所述施用导致与该病症有关的一个或多个生物化学或生理学参数或临床终点改善。在大多数情况下，利用包含FVII的CFXTEN的公开治疗方法的实施方案是其中FVII已经活化(即，FVIIa)的组合物。然而，本发明还涵盖了其中FVII未经活化的CFXTEN组合物。由于包含FVII的CFXTEN半衰期相当长，所以应相信，包含可由哺乳动物内源性蛋白酶(因为它们包括一个或多个裂解序列；例如，表7的序列)活化的无活性形式的FVII或融合蛋白的组合物经受了自体活化，使得1)固定量的FVII活化形式可通过由已启动的内源性凝血级联的凝血蛋白活化而获得；或2)持续量的FVII活化形式可通过由持续或短暂存在于循环中的蛋白酶活化而获得；例如，MMP-12、MMP-17等。
因此，本发明提供了治疗患有凝血因子相关的疾病、疾患或病症的受试者的方法，其包括施用包含FVII变体的CFXTEN(如上文所述)，其中所述FVII并未活化但具有一个或多个裂解序列，当通过内源性蛋白酶裂解时，FVII组分就被转化为活化形式。在前述的一个实施方案中，该方法利用了终末半衰期为至少约12h、或至少约24h、或至少约48h、或至少约48h、或至少约96h、或至少约144h、或至少约160h的CFXTEN组合物。因此，所述方法代表了治疗患有某种形式的慢性凝血紊乱的受试者的方法，所用的实质上就是FVII的“前药”形式。
在一些实施方案中，向受试者施用CFXTEN导致生物化学、生理学或临床参数一个或多个的改善，改善幅度大于使用相同的试验所测定或基于测量的临床参数的未连接XTEN的相应CF组分导致的改善幅度。在其它实施方案中，使用治疗有效剂量方案对受试者施用CFXTEN导致生化、生理或临床参数的一个或多个的活性的持续时间比使用相同的试验所测定或基于测量的临床参数的未连接XTEN的相应CF组分的活性持续更长。在一个实施方案中，向受试者施用治疗有效量的包含FVII的CFXTEN，导致在施用后约2-7天受试者中的凝血酶原时间与在施用未连接XTEN的FVII类似剂量后类似时间内受试者中的凝血酶原时间相比降低了至少约5％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或更多。在另一实施方案中，使用治疗有效量向受试者施用包含FVII的CFXTEN，导致维持受试者凝血酶原时间在正常的30％以内的时间是以类似剂量方案施用于受试者的未连接XTEN的FVII的至少2倍、或约3倍、或至少约4倍。在另一实施方案中，向受试者施用治疗有效量的包含FIX的CFXTEN，导致在施用后约2-7天受试者中的活化部分凝血酶原时间与在施用未连接XTEN的FIX类似剂量后类似时间内受试者中的活化部分凝血酶原时间相比下降至少约5％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或更多。在另一实施方案中，使用治疗有效量向受试者施用包含FIX的CFXTEN，导致维持受试者活化的部分凝血酶原时间在正常的30％以内的时间是以类似剂量方案施用于受试者的未连接XTEN的FIX的至少2倍、或至少约3倍、或至少约4倍。在另一实施方案中，使用治疗有效量向受试者施用包含FVII的CFXTEN，导致维持受试者出血时间(在出血时间测定中)在正常的30％以内的时间是以类似剂量方案施用于受试者的未连接XTEN的FVII的至少2倍、或约3倍、或至少约4倍。在另一实施方案中，使用治疗有效量向受试者施用包含FIX的CFXTEN，导致维持受试者出血时间(在出血时间测定中)在正常的30％以内的时间是以类似剂量方案施用于受试者的未连接XTEN的FIX的至少2倍、或约3倍、或至少约4倍。
由于本文描述的CFXTEN增强的PK参数，使用与未连接XTEN的相应CF相比更长的剂量之间的间隔施用CF，以预防、治疗、减轻、逆转或缓解凝血因子相关的疾病、疾患和病症的症状或临床异常或延长受治疗的受试者的存活。在具体的应用中，包含FVII的CFXTEN在治疗血友病A和血友病B中有效。
已观察到，以高浓度施用的FVIIa可以充当旁路试剂(bypassing agent)，甚至在没有FIX或FVIII的情况下形成FX活化。为了充当旁路试剂，FVIIa必须以超过健康人FVIIa水平约100倍的浓度施用。这些水平通常是安全的，因为在没有FVII结合的组织因子(TF)的情况下FVIIa的活性低。组织因子在受损组织上释放或存在，其经外源系统触发凝血。FVIIa的循环半衰期部分受到抗凝血酶(AT)使其失活的限制。抗凝血酶不可与FVII结合而仅仅与FVIIa结合。因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过施用包含FVII活化形式的CFXTEN的量治疗血友病A或B的方法，其中维持活化受试者循环中的FX的能力的时间是以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的FVII的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍。本发明还提供了包含连接XTEN的FVII的CFXTEN融合蛋白，该连接XTEN的FVII在其活化为FVIIa-XTEN之前超过约5％不可被AT活化。在一个实施方案中，本发明提供了包括施用具有未被活化的FVII组分的CFXTEN的治疗方法，其中所述CFXTEN充当了循环贮库，其中活化为FVIIa且不与AT复合的FVII的曲线下面积是以类似剂量施用的未连接XTEN的FVII的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍。
在治疗方法的一些实施方案中，(i)在其他相同的剂量方案下，施用与未连接XTEN的相应CF相比较少摩尔量的(例如，约1/2、或约1/3、或约1/4、或约1/5、或约1/6、或约1/8、或约1/10或更少)融合蛋白，且该融合蛋白实现了与未连接XTEN的相应CF类似的治疗效应；(ii)在其他相同的剂量下，与未连接XTEN的相应CF相比以更少的频率施用融合蛋白(例如，每2天、约每7天、约每14天、约每21天、或约每月)，且该融合蛋白实现了与未连接XTEN的相应CF类似的治疗效应；或(iii)在其他相同的剂量方案下，施用与未连接XTEN的相应CF相比累积较小摩尔量(例如，约5％、或约10％、或约20％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％或更少)的融合蛋白，该融合蛋白实现了与未连接XTEN的相应CF类似的治疗效应。测量累积较小摩尔量至少约1周、或约14天、或约21天、或约1个月的时间。治疗效应可以通过本文所述的测定参数或临床终点确定。
本发明方法包括施用连续剂量的治疗有效量的CFXTEN，持续足以实现和/或维持期望参数或临床效应的时段，并且这种连续剂量的治疗有效量确立了CFXTEN的治疗有效剂量方案；即，融合蛋白组合物的连续施用剂量的计划表，其中剂量以治疗有效量给予以导致对包括但不限于本文描述的那些凝血因子相关的疾病状态或病症的任何临床体征或症状、方面、测量参数或特征的持续有益效应。在一个实施方案中，所述方法包括对有相应需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包括含有与XTEN序列连接的CF的CFXTEN融合蛋白组合物和至少一种药学可接受的载体，导致与通过施用包含以类似剂量施用的未连接XTEN的CF的药物组合物介导的效应相比，由CF组分介导的至少一个参数、生理状况或临床结果(非限制性实例如上所述)的更大改善。在一个实施方案中，所述药物组合物以治疗有效剂量施用。在另一实施方案中，所述药物组合物使用利用治疗有效剂量方案(如上所述)的多个连续剂量施用给药期的时段。
CFXTEN的治疗有效量根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及施用的融合蛋白在所述个体中引发期望反应的能力而变化。治疗有效量也是其中CFXTEN的治疗有益效应超过任何毒性或有害效应的量。预防有效量指实现期望预防结果所需的时段所需的CFXTEN的量；例如，延缓出血事件发生。在该治疗方法中，根据受试者的体重和病症的严重性，作为负荷剂量和维持剂量，施用于受试者的CFXTEN剂量的范围(对于70kg受试者)是约0.5mg至1000mg/剂、或约1mg至400mg/剂、或约10mg至约300mg/剂。
治疗方法包括使用治疗有效剂量方案施用CFXTEN以实现与凝血因子疾病、疾患或病症相关的一个或多个参数的改善。在一些实施方案中，对受试者施用CFXTEN导致生化、生理或临床参数的一个或多个的改善，改善幅度大于使用相同的试验所测定或基于测量的临床参数的未连接XTEN的相应CF组分导致的改善幅度。在其它实施方案中，使用治疗有效剂量方案对受试者施用CFXTEN导致生化、生理或临床参数的一个或多个的活性的持续时间比使用相同的试验所测定或基于测量的临床参数的未连接XTEN的单个CF组分之一的活性持续更长。在前述一个实施方案中，使用治疗有效剂量方案对受试者施用CFXTEN导致与以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的CF相比，受试者中凝血酶原时间或活化部分促凝血酶原激酶时间提高至少约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约100％或更多。在前述另一实施方案中，使用治疗有效剂量方案给受试者施用CFXTEN导致与以类似剂量方案施用给受试者的未连接XTEN的CF相比，受试者出血情况减少至少约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％或更多。
本发明还涵盖根据本文提供的方法使用的CFXTEN与其它治疗方法和组合物(例如，其它凝血蛋白)组合施用，所述其它治疗方法和药物组合物用于治疗凝血因子相关的疾病、疾患和病症、或凝血因子是其联合疗法的病症；例如，由损伤或手术引起的出血事件。
另一方面，本发明提供了设计具有期望的药理或药学性质的CFXTEN组合物的方法。考虑到各种目的(与未连接融合蛋白的CF组分相比)来设计和制备CFXTEN融合蛋白，包括提高用于治疗凝血因子相关的疾病、疾患和病症的治疗效力，与CF相比增强融合蛋白的药代动力学特征，降低实现药理效应所需的剂量或给药频率，增强药学性质，和增强CF组分在治疗窗内维持延长时段的能力。
一般而言，如图31-33所示，设计和制备融合蛋白和本发明组合物的步骤包括：(1)选择CF(例如，天然蛋白质、表1和2的序列、具有活性的类似物或衍生物)以治疗特定疾病、疾患或病症；(2)选择将对得到的CFXTEN赋予期望的PK和理化特征的XTEN(例如，将CFXTEN组合物施用给受试者导致融合蛋白与未连接XTEN的CF相比在治疗窗内维持更长时段)；(3)确立CFXTEN的期望的N端至C端构型，以达到期望的效力或PK参数；(4)确立编码所构造的CFXTEN的表达载体的设计；(5)用该表达载体转化适合的宿主；和(6)表达和回收得到的融合蛋白。对于期望半衰期增加(大于24h)或治疗窗内维持时段增加的那些CFXTEN，当将单个XTEN加入CFXTEN时，所选择用于加入的XTEN一般具有至少约100、或约144、或约288、或约432、或约576、或约864、或约875、或约912、或约923个氨基酸残基。在另一实施方案中，CFXTEN包含前述长度的第一XTEN和约36、或约72、约144、或约288、或约576、或约864、或约875、或约912、或约923个氨基酸残基的至少第二XTEN。
在其它实施方案中，当不需要半衰期增加但期望药学性质(例如，溶解度)改善时，CFXTEN被设计为包含较短长度的XTEN。在前述一些实施方案中，CFXTEN包含与具有至少约24、或约36、或约48、或约60、或约72、或约84、或约96个氨基酸残基的XTEN连接的CF，其中融合蛋白在生理条件下的溶解度是未连接XTEN的相应CF的至少3倍，或可选地是未连接XTEN的CF的至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少50倍、或至少60倍或更多。在前述一个实施方案中，CF是因子IX。在另一实施方案中，CF是因子VII。在另一实施方案中，XTEN是与来自表4和9-13序列相比具有至少约80％、或约90％、或约95％序列同一性的序列。
另一方面，本发明提供了制备CFXTEN组合物以与天然CF相比改善生产容易度、导致增加的稳定性、增加的水溶解度和/或配制容易度的方法。在一个实施方案中，本发明包括增加CF的水溶解度的方法，包括使CF与一个或多个XTEN连接的步骤，使得可以实现与未融合状态的CF相比得到的CFXTEN的可溶形式在生理条件下更高的浓度。XTEN在加入融合蛋白时赋予CF增加的水溶解度的性质的促进因素包括XTEN融合配偶体的高溶解度和溶液中XTEN分子之间较低程度的自聚集。在一些实施方案中，所述方法产生CFXTEN融合蛋白，其中在生理条件下的水溶解度比未融合的CF大至少约20％、或至少约30％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约150％、或至少约200％、或至少约400％、或至少约600％、或至少约800％、或至少约1000％、或至少约2000％、或至少约4000％、或至少约6000％。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白的XTEN是与来自表4和9-13的序列相比具有至少约80％、或约90％、或约95％序列同一性的序列。
在另一实施方案中，本发明包括增加CF存储期限的方法，包括使CF与选定的一个或多个XTEN连接的步骤，使得与未融合状态的CF相比，得到的CFXTEN的存储期限延长。本文使用的存储期限指溶液或某种其它存储制剂中CF或CFXTEN的功能活性保持稳定而无过度活性损失的时段。本文使用的“功能活性”指本领域已知的药理效应或生物活性，例如结合受体或配体或底物的能力、或酶促活性、或表现与CF相关的一种或多种已知功能活性。降解或聚集的CF一般与保持在溶液中的CF相比具有降低的功能活性或降低的生物利用率。本方法延长CF加入融合蛋白时的存储期限的能力的促进因素包括XTEN融合配偶体的增加的水溶解度、溶液中降低的自聚集和增加的热稳定性。具体说，XTEN的低聚集倾向有利于配制含有较高药物浓度的CF的药物制剂的方法，并且XTEN的热稳定性促进CFXTEN融合蛋白在延长的时段维持可溶和功能活性的性质。在一个实施方案中，所述方法产生具有“延长的”或“延伸的”存储期限的CFXTEN融合蛋白，其相对于经历相同存储和处理条件的标准品而言表现出更高的活性。所述标准品可以是未融合的全长CF。在一个实施方案中，所述方法包括用一种或多种药学上可接受的赋形剂配制分离的CFXTEN的步骤，所述赋形剂增强了XTEN维持其非结构化构象以及CFXTEN在制剂中比相应未融合CF维持更长时间的可溶性的能力。在一个实施方案中，所述方法包括使CF连接至一个或多个选自表4和9-13的XTEN以产生CFXTEN融合蛋白，得到的溶液当经历与标准品相同的存储和处理条件并在给定时间点比较时，保留标准品功能活性的大于约100％、或标准品功能活性的大于约105％、110％、120％、130％、150％或200％，从而增加了其存储期限。
存储期限还可以根据存储后保留的功能活性来评估，标准化为存储开始时的功能活性。具有由延长或延伸的功能活性表现的延长或延伸的存储期限的本发明CFXTEN融合蛋白与经受相同条件下相同时段的未连接XTEN的等同CF相比保留约50％更多的功能活性、或约60％、70％、80％、或90％更多的功能活性。例如，包含与一个或多个选自表4和9-13的XTEN序列融合的凝血因子的本发明CFXTEN的融合蛋白在各种温度条件下在溶液中维持其原始活性约80％或更多，持续多达2周、或4周、或6周或更长的时段。在一些实施方案中，当在80℃加热10分钟时，CFXTEN在溶液中保留其原始活性的至少约50％、或约60％、或至少约70％、或至少约80％、和最优选至少约90％或更多。在其它实施方案中，当在37℃加热或维持约7天时，CFXTEN在溶液中保留其原始活性的至少约50％、优选至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或可选地至少约90％或更多。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白在约1小时至约18小时的时段暴露于约30℃至约70℃的温度后保留其功能活性的至少约80％或更多。在本段描述的上述实施方案中，在给定时间点，CFXTEN的保留活性是未连接融合蛋白的相应CF的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍。
VII).本发明的核酸序列
本发明提供了编码CFXTEN嵌合融合蛋白的分离的多核酸以及与编码CFXTEN嵌合融合蛋白的多核酸互补的序列，包括其同源变体。另一方面，本发明涵盖产生编码CFXTEN嵌合融合蛋白的多核酸以及与编码CFXTEN嵌合融合蛋白的多核酸互补的序列(包括其同源变体)的方法。一般而言，如图4-6所示，产生编码CFXTEN融合蛋白的多核苷酸序列并表达得到的基因产物的方法包括组装编码CF和XTEN的核苷酸，框内连接这些组分，将编码基因加入适合宿主细胞的表达载体，用该表达载体转化适合的宿主细胞，并在引起或允许融合蛋白在转化的宿主细胞中表达的条件下培养宿主细胞，从而产生生物活性的CFXTEN多肽，其作为分离的融合蛋白通过本领域已知的标准蛋白质纯化方法回收。使用分子生物学中标准的重组技术来制备本发明的多核苷酸和表达载体。
根据本发明，使用编码CFXTEN的核酸序列(或其互补体)来产生指导CFXTEN融合蛋白在适当的宿主细胞中表达的重组DNA分子。多种克隆策略适合进行本发明，其中许多用来产生包含本发明的CFXTEN组合物的融合蛋白的编码基因或其互补体的构建体。在一些实施方案中，所述克隆策略用来产生编码包含至少第一CF和至少第一XTEN多肽的单聚体CFXTEN的基因或其互补体。在前述一个实施方案中，所述基因包含编码hCF的序列或序列变体。在其它实施方案中，所述克隆策略用于产生编码单聚体CFXTEN的基因，该基因包含编码至少第一分子的CF的核苷酸或其互补体和编码第一和至少另一个XTEN的核苷酸或其互补体，该基因用于转化宿主细胞以表达CFXTEN组合物的融合蛋白。在该段描述的上述实施方案中，基因还可以包含编码间隔区序列的核苷酸，其也编码裂解序列。
在设计期望的XTEN序列时发现，尽管在产生XTEN编码序列时使用“结构单元”分子方法，实现了本发明组合物的XTEN的非重复性质。这通过使用编码上述肽序列基序的多核苷酸文库来实现，所述多核苷酸然后被连接和/或多聚化以产生编码XTEN序列的基因(参见图4和5和实施例)。因此，虽然表达的融合蛋白的XTEN可以由少达四个不同序列基序的多个单元组成，但是因为基序本身由非重复氨基酸序列组成，所以使得整体XTEN序列是非重复的。因此，在一个实施方案中，XTEN编码多核苷酸包括框内可操作连接的编码非重复序列或基序的多个多核苷酸，并且其中得到的表达的XTEN氨基酸序列是非重复的。
在一个方法中，首先制备含有对应于CFXTEN融合蛋白的DNA序列的构建体。编码组合物的CF的DNA获自cDNA文库，该cDNA文库使用标准方法从被认为加工CF mRNA并以可检测的水平表达它的组织或分离细胞制备。使用常规分子生物学技术，用含有例如约20至100个碱基的探针筛选文库，所述探针被设计为通过杂交鉴定目标CF基因。探针的最佳候选物是代表与凝血因子高度同源的序列的那些，并且应该足够长并足够明确以使假阳性最小化，但是可以在一个或多个位置是简并性的。如果必要，编码序列可以使用描述于Sambrook等，同上的常规引物延伸方法获得，以检测可能未反向转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间体。然后可以利用聚合酶链式反应(PCR)方法来扩增靶DNA或RNA编码序列以获得足以制备含有CF基因的CFXTEN构建体的材料。然后可以进行试验以证实杂交全长基因是期望的CF基因。通过这些常规方法，DNA可以常规获自从这些来源制备的cDNA文库。CF编码基因也获自基因组文库或通过本领域已知的标准合成方法(例如，自动核酸合成，使用例如Engels等(Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28：716-7341989)描述的方法之一)产生，利用从公开可获得的数据库、专利或参考文献获得的DNA序列。此类方法是本领域熟知的并且详细描述于科学文献和专利文献中。例如，序列可以获自Chemical Abstracts Services(CAS)登记号(由AmericanChemical Society公开)和/或可通过ncbi.nlm.nih.gov万维网可用的NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)网页获得的GenBank登记号(例如，Locus ID，NP_XXXXX和XP_XXXXX)Model Protein标识符，对应于含有目标蛋白质或蛋白质片段或变体的氨基酸序列的CAS Registry或GenBank数据库中的条目。对于本文提供的此类序列标识符，与这些CAS和GenBank和GenSeq登记号的每一个相关的提要页以及引用的杂志出版物(例如，PubMedID号(PMID))各自的全部内容通过引用的方式并入，特别是关于其中描述的氨基酸序列。在一个实施方案中，CF编码基因编码表1或表2任何一个的蛋白质或其片段或变体。
在包含单个CF的表达的融合蛋白的情况下，编码主题CFXTEN蛋白质的CF部分的基因或多核苷酸则被克隆入构建体，所述构建体是质粒或其它载体，受控于为了在生物系统中高水平蛋白质表达的适当转录和翻译序列。在后一步骤中，通过与编码CF的基因邻近和框内克隆到构建体，编码XTEN的第二基因或多核苷酸基因与编码CF基因的N端和/或C端融合的核苷酸。该第二步骤通过连接或多聚化步骤发生。在该段描述的上述实施方案中，要理解，产生的基因构建体可以可选地是编码各个融合蛋白的各个基因的互补体。
可以一步或多步制备编码XTEN的基因，通过完全合成或者通过与酶促过程组合的合成，所述酶促过程例如限制酶介导的克隆、PCR和重叠延伸，包括在实施例中更全面描述的方法。可以使用本文公开的方法来例如将编码XTEN的多核苷酸短序列连接成具有期望长度和序列的更长的XTEN基因。在一个实施方案中，该方法连接编码约9至14个氨基酸、或约12至20个氨基酸、或约18至36个氨基酸、或约48至约144个氨基酸、或约144至约288或更长、或前述基序或片段长度范围的任意组合的XTEN基序或片段序列的两个或多个密码子优化的寡核苷酸。
可选地，使用公开的方法使XTEN编码序列多聚化成具有期望长度的更长序列；例如，编码36个氨基酸的XTEN的基因可以被二聚化成编码72个氨基酸的基因，然后144，然后288等。即使使用多聚化，通过设计为使用的最短单元的基序所选择的密码子，XTEN多肽可以被构建为使得XTEN编码基因具有低或基本上无重复性，这可以降低编码基因在转化宿主中的重组并增加稳定性。使用标准的基因合成技术，从寡核苷酸组装编码具有非重复序列的XTEN的基因。可以使用优化密码子使用和氨基酸组成的算法进行基因设计。在本发明的一个方法中，如图4和5所示，产生然后组装相对短的XTEN编码多核苷酸构建体的文库。这可以是纯密码子文库，使得每个文库成员具有相同的氨基酸序列，但是许多不同的编码序列是可能的。此类文库可以从部分随机化的寡核苷酸组装并用于产生包含序列基序的XTEN片段的大文库。可以优化随机化方案来控制每个位置的氨基酸选择以及密码子使用。实现上述的示例性方法公开于实施例。
多核苷酸文库
另一方面，本发明提供了编码XTEN序列的多核苷酸的文库，其用于组装编码期望长度和序列的XTEN的基因。
在某些实施方案中，XTEN编码文库构建体包含编码固定长度的多肽片段的多核苷酸。作为初始步骤，可以组装编码9-14个氨基酸残基的基序的寡核苷酸文库。在一个优选实施方案中，组装编码12个氨基酸的基序的寡核苷酸文库。
可以使XTEN编码序列片段二聚化或多聚化成更长的编码序列。二聚化或多聚化可以通过连接、重叠延伸、PCR组装或本领域已知的类似克隆技术来进行。该过程可以重复多次，直至得到的XTEN编码序列达到序列组织和期望长度，从而提供XTEN编码基因。将理解，可以使编码例如12个氨基酸的基序的多核苷酸的文库二聚化和/或连接成编码36个氨基酸的多核苷酸文库。本发明涵盖编码不同长度基序的文库；例如9-14个氨基酸的基序，产生编码27至42个氨基酸的文库。反过来，编码27至42个氨基酸和优选36个氨基酸(如实施例所述)的文库可以顺序二聚化成含有依次更长的多核苷酸的文库，所述多核苷酸编码期望长度的XTEN序列，用于加入编码本文公开的CFXTEN融合蛋白的基因。在一些实施方案中，文库由编码限于特定序列XTEN家族的氨基酸的多核苷酸组装；所述家族例如表3的AD、AE、AF、AG、AM或A0序列。在其它实施方案中，文库包含编码表3的基序家族序列的两个或多个的序列。编码36mer的文库的代表性非限制性多核苷酸序列的名称和序列提供于表9-12，并且用于产生它们的方法在各自的实施例中更全面描述。在其它实施方案中，编码XTEN的文库从以随机顺序连接的编码氨基酸的多核苷酸密码子片段构建，其中所述密码子的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％选自由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)氨基酸的密码子组成的组。文库可转而用于顺序二聚体化或连接以实现编码48、72、144、288、576、864、875、912、923、1318个氨基酸、或多至约3000个氨基酸的总长度以及中间长度的XTEN序列的多核苷酸序列文库，其中编码的XTEN作为CFXTEN融合蛋白的组分表达时可以具有本文公开的性质的一种或多种。在一些情况下，多核苷酸文库序列还可以包含用作“测序岛”的其它碱基，如下文更全面描述。
图5是本发明实施方案中XTEN多核苷酸构建体和CFXTEN多核苷酸构建体组装中的代表性非限制性步骤的示意性流程图。将个体寡核苷酸501退火成序列基序502，例如12氨基酸基序(″12-mer″)，其随后与含有BbsI和KpnI限制性位点的寡聚体503连接。来自文库的其它序列基序与12-mer退火，直到获得期望长度的XTEN基因504。将XTEN基因克隆到填充载体。该载体任选地编码Flag序列506，随后是两侧具有BsaI、BbsI和KpnI位点的填充序列507和在这种情况下单个CF基因(该实例中编码FIX)508，得到编码包含单个CF的CFXTEN的基因500。编码XTEN和前体序列的多核苷酸的XTEN名称的非详尽性列表提供于表8。
表8：XTEN和前体序列的DNA序列
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可以将XTEN编码基因的文库克隆到本领域已知的一个或多个表达载体。为了有利于鉴定良好表达的文库成员，可以构建与报告蛋白融合的文库。适合的报告基因的非限制性实例是绿色荧光蛋白、荧光素酶(luciferace)、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。通过筛选，可以鉴定可在选择的宿主生物体中高浓度表达的短XTEN序列。随后，可以产生随机XTEN二聚体的文库并且重复针对高水平表达的筛选。随后，可以针对许多性质例如表达水平、蛋白酶稳定性或结合至抗血清来筛选得到的构建体。
本发明一个方面提供了编码融合蛋白的组分的多核苷酸序列，其中该序列的产生经历了密码子优化。特别关注的是目标为提高多肽组合物表达和改善编码基因在生产宿主中遗传稳定性的密码子优化。例如，密码子优化对于富含甘氨酸或者具有高度重复的氨基酸序列的XTEN序列是特别重要的。密码子优化使用计算机程序进行(Gustafsson，C.等(2004)Trends Biotechnol，22：346-53)，一些计算机程序最大程度减少核糖体中止(Coda Genomics Inc.)。在一个实施方案中，可以通过构建密码子文库进行密码子优化，其中文库的所有成员编码相同的氨基酸序列但是其中密码子使用不同。可以针对高度表达和遗传稳定的成员来筛选此类文库，所述成员特别适合大规模产生含有XTEN的产物。当设计XTEN序列时，可以考虑许多性质。可以使编码DNA序列中的重复性最小化。此外，可以避免或最大程度减少生产宿主很少使用的密码子的使用(例如，在大肠杆菌中的AGG和AGA精氨酸密码子和一个亮氨酸密码子)。在大肠杆菌的情况下，两个甘氨酸密码子GGA和GGG很少在高表达蛋白质中使用。因此，编码XTEN序列的基因的密码子优化可能是非常期望的。具有高水平甘氨酸的DNA序列倾向于具有可导致不稳定性或低表达水平的高GC含量。因此，可能时，优选选择密码子以使XTEN编码序列的GC含量适合用于产生XTEN的生产生物体。
任选地，编码全长XTEN的基因包含一个或多个测序岛。在该上下文中，测序岛是短延伸序列，其不同于XTEN文库构建体序列并且包含全长XTEN编码基因中不存在或期望存在的限制性位点。在一个实施方案中，测序岛是如下序列
5’-AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGT-3’。在另一实施方案中，测序岛是序列
5’-AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGT-3’。
在一个实施方案中，多核苷酸文库用公开的方法构建，其中文库的所有成员编码相同的氨基酸序列，但是其中序列中各个氨基酸的密码子使用是不同的。可以针对高度表达和遗传稳定的成员来筛选此类文库，所述成员特别适合大规模产生含有XTEN的产物。
任选地，可以对文库中的克隆测序以消除含有某些不期望的序列的分离物。短XTEN序列的初始文库允许氨基酸序列的某种改变。例如，可以使一些密码子随机化以使许多亲水性氨基酸可以出现在特定位置。在反复多聚化的过程中，除了针对高水平表达筛选以外，可以针对其它特征例如溶解度或蛋白酶抗性来筛选得到的文库成员。
一旦选择编码期望长度和性质的XTEN的基因，通过将它克隆入邻近构建体中和编码CF的基因框内、或者编码CF邻近结构域的核苷酸之间、或者编码给定CF结构域的序列内、或者编码连接末端XTEN的间隔区/裂解序列的核苷酸框内，使它与编码CF基因的核苷酸在期望位置基因融合。根据待编码的CFXTEN，本发明提供了前述的各种排列。例如，编码例如上述式VI所示的包含CF和两个XTEN的CFXTEN融合蛋白的基因，该基因将具有编码CF、编码两个XTEN的多核苷酸，所述两个XTEN在组成和序列长度上可以相同或不同。在前述的一个非限制性实施方案中，CF多核苷酸将编码凝血因子，并且编码C端XTEN的多核苷酸将编码AE864，并且编码邻近EGF2C端的内部XTEN的多核苷酸将编码AE144。将CF基因克隆到XTEN构建体的步骤可以通过连接或多聚化步骤而发生，如图32所示。可将编码CFXTEN融合蛋白的构建体设计为组分XTEN、CF和间隔区序列的不同构型，例如式I-VI的构型。在一个实施方案中，构建体包含编码以下顺序(5′至3′)：CF和XTEN的组分的单聚体多肽的多核苷酸序列或与其互补的多核苷酸序列。在另一实施方案中，构建体包含编码以下顺序(5′至3′)：CF、间隔区序列和XTEN的组分的单聚体多肽的多核苷酸序列或与其互补的多核苷酸序列。间隔区多核苷酸可以任选地包含编码裂解序列的序列。对于本领域技术人员明显的是，前述的其它排列或多聚体也是可能的。
本发明还涵盖包含XTEN编码多核苷酸变体的多核苷酸，其与以下相比具有高百分比的序列同一性：(a)表8的多核苷酸序列，或(b)与(a)的多核苷酸互补的序列。具有高百分比的序列同一性的多核苷酸是与前述(a)或(b)相比具有至少约80％核酸序列同一性、可选地至少约81％、可选地至少约82％、可选地至少约83％、可选地至少约84％、可选地至少约85％、可选地至少约86％、可选地至少约87％、可选地至少约88％、可选地至少约89％、可选地至少约90％、可选地至少约91％、可选地至少约92％、可选地至少约93％、可选地至少约94％、可选地至少约95％、可选地至少约96％、可选地至少约97％、可选地至少约98％和可选地至少约99％核酸序列同一性或者可以在严格条件下与靶多核苷酸或其互补体杂交的多核苷酸。
核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列类似性或序列同一性还可以通过使用已知软件或计算机程序例如BestFit或Gap成对比较程序(GCG WisconsinPackage，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.53711)来常规测定。BestFit利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances inApplied Mathematics.1981.2：482-489)来发现两个序列之间同一性或类似性的最佳片段。Gap进行总体比对：所有的一个序列与所有的另一个类似序列，利用Needleman和Wunsch的方法(Journal of Molecular Biology.1970.48：443-453)。当使用序列比对程序例如BestFit来测定序列同源性、类似性或同一性的程度时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵来优化同一性、类似性或同源性评分。
“互补的”核酸序列是能够根据标准的Watson-Crick互补规则碱基配对的那些。如本文使用的术语“互补序列”指基本上互补的核酸序列，可以通过上文列出的相同核苷酸比较来评估，或者定义为能够在严格条件(例如本文描述的那些严格条件)下与编码CFXTEN序列的多核苷酸杂交。
然后可以将得到的编码CFXTEN嵌合融合蛋白的多核苷酸单独克隆到表达载体。核酸序列通过多种方法插入载体。一般而言，使用本领域已知的技术将DNA插入适当的限制内切酶位点。载体组分一般包含但不限于一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有这些组分的一个或多个的适合载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。此类技术是本领域熟知的并且详细描述于科学文献和专利文献中。
各种载体是公开可获得的。载体可以例如是质粒、黏粒、病毒粒子或噬菌体的形式，其可方便地经受重组DNA操作，并且载体的选择常取决于它所引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即，载体作为染色体外的实体存在，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒。或者，载体可以是这样一种载体：当引入宿主细胞时，整合入宿主细胞基因组中，并与它已整合入的染色体一起复制。
本发明提供了含有复制和控制序列的质粒载体的使用，所述复制和控制序列与宿主细胞相容并被宿主细胞识别，并且与CFXTEN基因可操作连接以用于CFXTEN融合蛋白的控制表达。载体通常带有复制位点以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。对于许多细菌、酵母和病毒，此类载体序列是熟知的。可以使用的有用的表达载体包括例如染色体、非染色体和合成DNA序列的片段。“表达载体”指DNA构建体，其包含与适合的控制序列可操作连接的DNA序列，所述控制序列能够影响编码融合蛋白的DNA在适合的宿主中的表达。要求是这些载体在宿主细胞的选择中可复制并可存活。可以根据需要使用低拷贝数或高拷贝数的载体。
其它适合的载体包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物以及已知的细菌质粒例如col EI、pCR、pBR322、pMa1-C2、pET、pGEX(描述于Smith等，Gene 57：31-40(1988))、pMB9及其衍生物、质粒例如RP4、噬菌体DNA例如噬菌体I的许多衍生物例如NM989，以及其它噬菌体DNA例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母噬菌体例如2μm质粒或2μm质粒的衍生物，以及着丝粒和整合型酵母穿梭载体；用于真核细胞的载体，例如用于昆虫和哺乳动物细胞的载体；由质粒和噬菌体DNA组合产生的载体，例如被修饰具有噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等等。也可用于本发明的酵母表达系统包括但不限于非融合的pYES2载体(Invitrogen)，融合pYESH是A、B、C(Invitrogen)、pRS载体等。
载体的控制序列包括影响转录的启动子、控制这类转录的任选的操纵序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终点的序列。所述启动子可以是任何DNA序列，所述DNA序列在选择宿主细胞中示出转录活性，并可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
用于指导哺乳动物细胞中编码CF多肽变体的DNA转录的适合启动子的实例是SV40启动子(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1(1981)，854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等人，Science 222(1983)，809-814)、CMV启动子(Boshart等人，Cell 41：521-530，1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol，2：1304-1319，1982)。载体也可以携带例如UCOE(具有遍在染色质开放表达元件)的序列。
用于丝状真宿主细胞的适合的启动子的实例是，例如ADH3启动子或tpiA启动子。其它有用的启动子的实例是来自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α淀粉酶、黑曲霉耐酸α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米黑根毛脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶基因的那些。优选的是TAKA淀粉酶和gluA启动子。
适合用于原核宿主表达载体的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等，Nature，275：615(1978)；Goeddel等，Nature，281：544(1979)]，碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic Acid Res.，8：4057(1980)；EP 36,776]，和杂合启动子，例如tac启动子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]，都与编码CFXTEN多肽的DNA可操作连接。用于细菌系统的启动子还可以含有与编码CFXTEN多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
本发明涵盖使用其它表达系统，包括例如杆状病毒表达系统，可以使用非融合转移载体和融合转移载体，所述非融合转移载体例如但不限于pVL941(Summers等，Virology 84：390-402(1978))、pVL1393(Invitrogen)、pVL1392(Summers等，Virology 84：390-402(1978)和Invitrogen)和pBlueBacIII(Invitrogen)，所述融合转移载体例如但不限于pAc700(Summers等，Virology 84：390-402(1978))、pAc701和pAc70-2(等同于pAc700，具有不同的阅读框)、pAc360 Invitrogen)和pBlueBacHisA、B、C(；Invitrogen)。
用于指导哺乳动物细胞中编码CF多肽变体的DNA转录的适合启动子的实例是CMV启动子(Boshart等人，Cell 41：521-530，1985)、SV40启动子(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1(1981)，854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等人，Science 222(1983)，809-814)、腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman and Sharp，Mol.Cell.Biol，2：1304-1319，1982)。载体也可以携带例如UCOE(具有遍在染色质开放表达元件)的序列。
用于丝状真宿主细胞的适合的启动子的实例是，例如ADH3启动子或tpiA启动子。
编码CFXTEN的DNA序列如果需要也可以与适合的终止子可操作地连接，例如hGH终止子(Palmiter等人，Science 222，1983，pp.809-814)或TPI1终止子(Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1，1982，pp.419-434)或ADH3(McKnight等人，The EMBO J.4，1985，pp.2093-2099)。表达载体还可以含有位于来自启动子的下游和来自CFXTEN序列自身的插入位点的上游的一组RNA剪接位点，包括由腺病毒获得的剪接位点。表达载体中还含有的是位于插入位点的下游的多腺苷酸化信号。特别优选的多腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，同上)、来自腺病毒5E1b域的多腺苷酸化信号、hGH终止子(DeNoto等人.Nucl.Acids Res.9：3719-3730，1981)。表达载体还可以包含非编码的病毒前导序列，例如位于启动子和RNA剪接位点之间的腺病毒2三联前导序列；和增强序列，例如SV40增强子。
为指导本发明的CFXTEN引入宿主细胞的分泌途径，分泌信号序列(又称为，前导序列、前原序列、或前序列)可以包含在重组载体中。该分泌信号序列与编码CFXTEN的DNA序列可操作地连接，通常置于编码CFXTEN融合蛋白的DNA序列的5′位。所述分泌信号序列通常可以与蛋白质相关或可以是来自编码另一个分泌蛋白质的基因。非限制性实例包括用于大肠杆菌(E.coli)表达的OmpA、PhoA和DsbA，用于酵母表达的ppL-α、DEX4、转化酶信号肽、酸性磷酸酶信号肽、CPY或INU1，以及用于哺乳动物表达的IL2L、SV40、IgGκ和IgGλ。信号序列在转位和分泌过程期间通常从蛋白质中蛋白水解性移除，生成定义的N端。方法公开于Amau等人，Protein Expression andPurification 48：1-13(2006)中。
用于连接分别编码CFXTEN、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列的DNA序列，以及用于将它们插入含有复制所需信息的适合的载体中的操作为本领域技术人员熟知(比照，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
在其它情况下，本发明提供了包含优化表达的多核苷酸序列的构建体和制备所述构建体的方法，所述多核苷酸序列编码具有XTEN特征的至少约20至约60个氨基酸，其可以纳入XTEN载体编码序列的N端(换言之，编码20-60编码优化氨基酸的多核苷酸与编码CF的N端的XTEN组分的多核苷酸在框内连接)，以促进翻译起始，以允许蛋白质N端的XTEN融合物在不存在辅助结构域的情况下表达。前述一个优势是，序列不需要随后裂解，从而减少了产生含有XTEN组合物的步骤的数目。如在实施例中更详细描述的，优化的N端序列具有非结构化蛋白质的属性，但是可以包含编码为其促进翻译起始和增强表达的能力而选择的氨基酸的核苷酸碱基。在前述的一个实施方案中，优化的多核苷酸编码与AE912相比具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在前述的另一实施方案中，优化的多核苷酸编码与AM923相比具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在前述的另一实施方案中，优化的多核苷酸编码与AE48相比具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在前述的另一实施方案中，优化的多核苷酸编码与AM48具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在一个实施方案中，优化的多核苷酸NTS包括与选自以下的序列或其互补体相比具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％序列同一性的序列：
AE 48：5’-
ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTACCCCG
GGTAGCGGTACTGCTTCTTCCTCTCCAGGTAGCTCTACCCCTTCTGGTGC
AACCGGCTCTCCAGGTGCTTCTCCGGGCACCAGCTCTACCGGTTCTCCA
-3’
和
AM 48：5’-
ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTGCATCC
CCGGGCACCAGCTCTACCGGTTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCTGGTG
CTACCGGCTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCTGGTGCTACTGGCTCTCC
A-3’
以这种方式，在构建体内产生编码单聚体CFXTEN融合蛋白的嵌合DNA分子。任选地，可将该嵌合DNA分子转移或克隆到另一构建体，该构建体是更适合的表达载体。此时，可以用该嵌合DNA分子转化能够表达嵌合DNA分子的宿主细胞。
用于本发明的哺乳动物细胞系的实例是COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、BHK-21(ATCC CCL 10))和BHK-293(ATCC CRL1573；Graham等人，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)、BHK-570细胞(ATCC CRL10314)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、CHO-S(Invitrogen 11619-012)和293-F(Invitrogen R790-7)。tk-ts13BHK细胞系也可从ATCC以登录号CRL1632得到。此外，许多其它的细胞系可用于本发明，包括大鼠Hep I(大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II(大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCCCCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、CHO(ATCCCCL 61)和DUKX细胞(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，1980)。
适合的酵母细胞的实例包括酵母菌属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)的细胞，具体的是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)菌株。用异源DNA转化酵母细胞和从其产生异源多肽的方法描述于，例如，美国专利No.4,599,311、美国专利No.4,931,373、美国专利No.4,870,008、5,037,743和美国专利No.4,845,075中，其全部由此通过引用并入。转化细胞通过由可选标记确定的表型来选择，所述转化细胞通常是抗药性或在缺乏特定营养物(例如，亮氨酸)时能够生长。用于酵母的优选载体是POT1载体，其公开于美国专利No.4,931,373中。编码CFXTEN的DNA序列可以在单一序列和任选地前导序列之前，例如，如上文所述。适合的酵母细胞的其它实例是克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、汉逊酵母属(Hansenula)菌株例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)、或毕赤酵母属(Pichia)菌株例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)(比照，Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132，1986，pp.3459-3465；美国专利No.4,882,279)。其它真菌细胞的实例是丝状真菌的细胞，例如曲霉菌属(Aspergillus spp)、链孢霉属(Neurospora spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)或木霉属(Trichoderma spp.)，具体的是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉的菌株。用于蛋白质表达的曲霉菌属的用途描述于例如，EP 272 277、EP 238 023、EP 184 438中。尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的转化可以例如如Malardier等人，1989，Gene 78：147-156所述进行。木霉属的转化可以例如如EP 244234中所述进行。
可用于本发明的其它适合的细胞包括但不限于原核宿主细胞菌株，例如大肠杆菌(例如，菌株DH5-α)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，或者假单胞杆菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Streptomyces)的菌株。适合的原核生物的非限制性示例包括以下属的那些：游动放线菌属(Actinoplanes)；古生物球菌属(Archaeoglobus)；蛭弧菌属(Bdellovibrio)；包柔氏螺旋体属(Borrelia)；绿屈挠菌属(Chloroflexus)；肠球菌属(Ehterococcus)；埃希氏菌属(Escherichia)；乳酸杆菌属(Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；海洋杆菌属(Oceanobacillus)；副球菌属Paracoccus)；假单胞杆菌属(Pseudomonas)；葡萄球菌属(Staphylococcus)；链球菌属(Streptococcus)；链霉菌属(Streptomyces)；热原体属(Thermoplasma)；和弧菌属(Vibrio)。
转染哺乳动物细胞和表达引入细胞中的DNA序列的方法描述于例如，Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.159(1982)，601-621；Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)，422-426；Wigler等人，Cell 14(1978)，725；Corsaro and Pearson，Somatic CellGenetics 7(1981)，603，Graham and van der Eb，Virology 52(1973)，456；以及Neumann等人，EMBO J.1(1982)，841-845中。
将克隆的DNA序列通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等人，Cell14：725-732，1978；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603-616，1981；Graham and Van der Eb，Virology 52d：456-467，1973)、用许多商购试剂(例如FuGENEG Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)或lipofectamine(Invitrogen)的转染或通过电穿孔(Neumann等人，EMBO J.1：841-845，1982)引入培养的哺乳动物细胞中。为了鉴定和选择表达外源DNA的细胞，通常将赋予可选表型(可选标记)的基因连同感兴趣的基因或cDNA一起引入细胞中。优选的可选标记包括对药物(例如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、博来霉素以及甲氨蝶呤)赋予抗性的基因。可选标记可以是扩增可选标记。优选的扩增可选标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。可选标记的其它实例为本领域技术人员熟知，并且包括报道基因例如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、β半乳糖酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。可选标记由Thilly综述(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.，通过引用并入本文)。本领域的技术人员将容易地选择适合的可选标记。可以使用任何已知的可选标记，只要其能够用编码基因产物的核酸同时表达。
可选标记可以与感兴趣的基因同时引入单独质粒上的细胞中，或可以将它们引入相同的质粒上。如果是在相同的质粒上，那么该可选标记和感兴趣的基因可以受不同启动子或相同启动子的控制，后者排列产生双顺反子信息。这种类型的构建体为本领域已知(例如，Levinson和Simonsen，美国专利No.4,713,339)。其也可能有利于将另外的DNA(被称为“载体DNA”)加入被引入细胞中的混合物中。
细胞容纳DNA后，它们将在适当的生长培养基中生长，通常为1-2天，从而开始表达感兴趣的基因。如本文使用的术语“适当的生长培养基”指含有细胞生长和表达感兴趣的CFXTEN所需的营养物和其他组分的培养基。培养基通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖类、维生素、盐、磷脂、蛋白质和生长因子。为了产生γ羧化蛋白，培养基将含有维生素K，优选的是浓度为约0.1μg/ml至约5μg/ml。然后选择药物用于选择以稳定方式表达可选标记的细胞的生长。对于已用扩增可选标记转染的细胞，可以增加药物浓度，以选择克隆序列增加的拷贝数，由此增加表达水平。然后针对感兴趣的CF多肽变体的表达筛选稳定转染的细胞的克隆。
然后将转化或转染的宿主细胞在允许CF多肽变体表达的条件下、在适合的营养培养基中培养，此后可以将得到的肽从培养物中回收。用于培养该细胞的培养基可以是适用于生长宿主细胞的任何常规培养基，例如含有适当补体的最小或复合培养基。适合的培养基可由商购获得或可根据公开的调配法制备(例如，在American Type Culture Collection目录中)。例如温度、pH等培养条件是之前用于为表达而选择的宿主细胞的那些，并且对于普通技术人员将是明显的。
基因表达可以在样本中直接测量，例如通过常规的Southern印迹、Northern印迹，以定量mRNA的转录[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、斑点印迹(DNA分析)、或使用适当标记的探针原位杂交，基于本文提供的序列。可选地，可以使用可以识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体。所述抗体转而可以被标记并且可以进行测定，其中双链体结合至表面，使得双链体在表面形成时，可以检测结合至双链体的抗体的存在。
可选地，基因表达可以通过荧光方法的免疫学来测量，例如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定或选择标记的检测，以直接定量基因产物的表达。用于免疫组织化学染色和/或样本流体测定的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以在任何哺乳动物中制备。适当地，抗体可以针对天然序列CF多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与CF融合并编码特异抗体表位的外源序列来制备。选择标记的实例是本领域技术人员熟知的并且包括报告分子，例如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
表达的CFXTEN多肽产物可以通过本领域已知的方法或通过本文公开的方法纯化。可以使用诸如凝胶过滤、亲和纯化(例如，使用抗CF抗体柱)、盐分级分离、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、羟基磷灰石吸附色谱、疏水性相互作用色谱和凝胶电泳等程序；每一种被修改以回收和纯化由各自的宿主细胞产生的融合蛋白。另外的纯化可以通过常规化学纯化方法实现，例如高效液相色谱法。一些表达的CFXTEN可能需要在分离和纯化期间重折叠。纯化方法描述于Robert K.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Charles R.Castor(编著)，Springer-Verlag 1994，和Sambrook等，同上。多步纯化分离还描述于Baron等人，Crit.Rev.Biotechnol.10：179-90(1990)andBelow等人，J.Chromatogr.A.679：67-83(1994)。为了治疗目的，优选本发明的CFXTEN融合蛋白是基本上纯的。因此，在本发明优选的实施方案中，本发明的CFXTEN被纯化为至少约90至95％均一性，优选至少约98％均一性。纯度可以通过例如，凝胶电泳、HPLC和氨基端氨基酸测序评估。
VIII).药物组合物
本发明提供了包含CFXTEN的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含CFXTEN融合蛋白和至少一种药学上可接受的载体。本发明的CFXTEN多肽可以根据已知方法配制，以制备药学上有用的组合物，由此多肽与药学上可接受的载体媒介物(例如水溶液或缓冲液、药学可接受的悬液和乳液)混合。非水溶剂的实例包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。通过将具有期望纯度的活性成分与任选的Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中描述的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备以冻干制剂或水溶液形式存储的治疗性制剂。
药物组合物可以通过口服、鼻内、胃肠外或通过吸入疗法来施用，并且可以采取片剂、锭剂、颗粒、胶囊、丸剂、安瓿剂、栓剂或气溶胶形式的形式。它们还可以采取活性成分在水或非水稀释剂中的悬液、溶液和乳液、糖浆、颗粒或粉末的形式。此外，药物组合物还可以含有其它药物活性化合物或多种本发明化合物。
更具体说，本发明药物组合物可以通过任何适合途径施用以用于治疗，所述途径包括口服、直肠、鼻、局部(包括经皮、气溶胶、口腔和舌下)、阴道、胃肠外(包括皮下、通过输注泵的皮下、肌肉内、静脉内和皮内)、玻璃体内和肺。还要理解，优选的途径将根据接受者的情况和年龄以及待治疗的疾病而变化。
在一个实施方案中，药物组合物经皮下施用。在该实施方案中，组合物可以作为冻干粉末提供，在施用前重建。组合物还可以液体形式提供，其可以直接施用给患者。在一个实施方案中，组合物作为在预填充注射器中的液体提供，使得患者可以容易地自我施用该组合物。
用于本发明的延长释放制剂可以是口服制剂，包含基质和包衣组合物。适合的基质材料可以包括蜡(例如，棕榈蜡(camauba)、蜂蜡、石蜡、地蜡、紫胶蜡、脂肪酸和脂肪醇)、油、硬化油或脂肪(例如，硬化菜籽油、蓖麻油、牛脂、棕榈油和大豆油)和聚合物(例如，羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素和聚乙二醇)。其它适合的基质制片材料是微晶纤维素、粉末纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素以及其它载体和填充剂。片剂还可以含有颗粒、包衣粉剂或小丸。片剂还可以是多层的。当活性成分具有显著不同的药代动力学特征时，多层片剂是特别优选的。任选地，成品片剂可以是包衣或未包衣的。
包衣组合物可以包含不溶性基质聚合物和/或水溶性材料。水溶性材料可以是聚合物，例如聚乙二醇、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或单聚体材料例如糖(例如，乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖醇等)、盐(例如，氯化钠、氯化钾等)、有机酸(例如，富马酸、琥珀酸、乳酸和酒石酸)及其混合物。任选地，可将肠溶聚合物加入包衣组合物。适合的肠溶聚合物包括羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素、酞酸酯、聚醋酸乙烯酞酸酯、醋酸纤维素酞酸酯、偏苯三甲酸酯、紫胶、玉米醇溶蛋白和含有羧基的聚甲基丙烯酸酯。包衣组合物可以通过添加适合的增塑剂来增塑，所述增塑剂例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸酯、聚乙二醇、甘油、乙酰化甘油酯、乙酰化柠檬酸酯、二丁基癸二酸酯和蓖麻油。包衣组合物还可以包含填充剂，其可以是不溶性材料，例如二氧化硅、二氧化钛、滑石、高岭土、氧化铝、淀粉、粉末纤维素、MCC或聚克立林钾。包衣组合物可以作为在有机溶剂或水溶剂或其混合物中的溶液或胶乳来应用。可以使用溶剂，诸如水、低级醇、氯化低级烃、酮或其混合物。
本发明组合物可以使用多种赋形剂配制。适合的赋形剂包括微晶纤维素(例如，Avicel PH102、Avicel PH101)、聚甲基丙烯酸酯、聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵)(例如Eudragit RS-30D)、羟丙基甲基纤维素(Methocel K100M，Premium CR Methocel K100M，MethocelE5，Opadry
Figure BPA00001545838401441
)、硬脂酸镁、滑石、柠檬酸三乙酯、乙基纤维素水分散液(Surelease
Figure BPA00001545838401442
)和硫酸鱼精蛋白。缓释剂还可以包括载体，其可以包括例如溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂。药学上可接受的盐也可以用于这些缓释剂，例如矿物盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。组合物还可以含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇，以及诸如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂等物质。脂质体也可用作载体。
在另一实施方案中，本发明组合物包封于脂质体中，已经表明脂质体在以受控方式经延长时段递送有益活性剂的效用。脂质体是含有内陷水容积的闭合双层膜。脂质体还可以是具有单个膜双层的单层小囊泡或具有多个膜双层的多层小囊泡，每个膜双层与下一个膜双层由水层隔开。得到的膜双层的结构使得脂质的疏水性(非极性)尾部朝向双层中心，而亲水性(极性)头部朝向水相。在一个实施方案中，脂质体可以用柔性的水溶性聚合物包被，该聚合物避免被单核吞噬细胞系统的器官(主要是肝和脾)摄取。用于包裹脂质体的适合的亲水性聚合物包括但不限于PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟基丙基甲基丙烯酸酯、聚羟基丙烯酸酯、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列，如美国专利No.6,316,024；No.6,126,966；No.6,056,973；No.6,043,094中描述的，这些专利的全部内容通过引用的方式并入。
脂质体可以由本领域已知的任何脂质或脂质组合构成。例如，如美国专利No.6,056,973和No.5,874,104所公开，形成小囊泡的脂质可以是天然存在的或合成的脂质，包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。还如美国专利No.6,056,973所公开，形成小囊泡的脂质还可以是糖脂、脑苷脂或阳离子脂质，例如1，2-二油烯基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2，3，-双十四烷基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；N-[1[(2，3，-二油烯基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)；N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)；3[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)；或二甲基双十八烷基铵(DDAB)。如美国专利No.5,916,588和No.5,874,104所公开，胆固醇可以适当范围存在以赋予小囊泡稳定性。
其它脂质体技术描述于美国专利No.6,759,057；No.6,406,713；No.6,352,716；No.6,316,024；No.6,294,191；No.6,126,966；No.6,056,973；No.6,043,094；No.5,965,156；No.5,916,588；No.5,874,104；No.5,215,680；和No.4,684,479，其内容通过引用的方式并入本文。这些描述脂质体和脂质包衣的微泡及其生产方法。因此，本领域技术人员考虑本发明公开内容和这些其它专利的公开内容，能够生产用于本发明多肽延长释放的脂质体。
对于液体制剂，期望的性质是制剂可以如下形式提供：可以穿过25、28、30、31、32号针头以静脉内、肌肉内、关节内或皮下施用。
透皮制剂的施用可以使用本领域已知的方法进行，包括大体上例如在美国专利No.5,186,938和No.6,183,770、No.4,861,800、No.6,743,211、No.6,945,952、No.4,284,444和WO 89/09051中描述的那些，这些专利的全部内容以引用的方式并入本文。透皮贴剂对于具有吸收问题的多肽是特别有用的实施方案。贴剂可以被制备为控制可穿透皮肤的活性成分经12小时、24小时、3天和7天的时段释放。在一个实例中，将2倍每日过量的本发明多肽放入非挥发性流体。本发明组合物以粘稠非挥发性液体的形式提供。特定制剂经皮肤的穿透可以通过本领域标准方法来测量(例如，Franz等，J.Invest.Derm.64：194-195(1975))。适合的贴剂的实例是被动转移皮肤贴剂、离子电渗皮肤贴剂或具有微针的贴剂例如Nicoderm。
在其它实施方案中，组合物可以经由鼻内、口腔或舌下途径递送至脑，以实现活性剂通过嗅觉通道转移到CNS并减少全身施用。常用于该施用途径的装置包括于美国专利No.6,715,485。通过该途径递送的组合物可以实现增加的CNS给药或降低的全身负荷量，这减少了与某些药物相关的系统性毒性风险。以皮肤下可植入装置递送的药物组合物的制备可以使用本领域已知方法进行，例如美国专利No.3,992,518；No.5,660,848；和No.5,756,115中描述的那些。
渗透泵可以在片剂、丸剂、胶囊或可植入装置中用作缓释剂。渗透泵是本领域熟知的，并且对于本领域技术人员可容易地从在提供用于延长释放药物递送的渗透泵方面有经验的公司获得。实例有ALZA的DUROSTM；ALZA的OROSTM；Osmotica Pharmaceutical的OsmodexTM系统；Shire Laboratories的EnSoTrolTM系统；和AlzetTM。描述渗透泵技术的专利是美国专利No.6,890,918；No.6,838,093；No.6,814,979；No.6,713,086；No.6,534,090；No.6,514,532；No.6,361,796；No.6,352,721；No.6,294,201；No.6,284,276；No.6,110,498；No.5,573,776；No.4,200,0984；和No.4,088,864，这些专利的内容以引用的方式并入本文。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其它专利的公开内容，能够生产用于本发明多肽的延长释放的渗透泵。
注射器泵也可用作缓释剂。此类装置描述于美国专利No.4,976,696；No.4,933,185；No.5,017,378；No.6,309,370；No.6,254,573；No.4,435,173；No.4,398,908；No.6,572,585；No.5,298,022；No.5,176,502；No.5,492,534；No.5,318,540；和No.4,988,337，这些专利的内容以引用的方式并入本文。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其它专利的公开内容，能够生产用于本发明组合物的延长释放的注射器泵。
IX).药物试剂盒
另一方面，本发明提供了有利于CFXTEN多肽使用的试剂盒。该试剂盒包括本文提供的药物组合物、标识该药物组合物的标签和关于所述药物组合的存储、重建和/或施用给受试者的说明。在一些实施方案中，试剂盒优选地包括：(a)在施用给有相应需要的受试者时足以治疗疾病、病症或疾患的量的CFXTEN融合蛋白组合物；和(b)一定量的药学上可接受的载体；一起形成即时注射或用无菌水、缓冲液或葡萄糖重建的制剂；还有标识CFXTEN药物和存储和操作条件的标签，以及认可的该药物的适应症的插页，关于用于预防和/或治疗认可的适应症的CFXTEN药物的重建和/或施用的说明，适当剂量和安全性信息，以及标识该药物批号和有效期的信息。前述另一实施方案中，试剂盒可以包括可以携带CFXTEN组合物的适合稀释剂的第二容器，使用其将为使用者提供适当浓度的待递送给受试者的CFXTEN。
实施例
实施例1：XTEN_AD36基序片段的构建
以下实施例描述了编码36个氨基酸的基序序列的密码子优化基因的集合的构建。作为第一步，基于pET载体构建填充载体pCW0359，其包含T7启动子。pCW0359编码纤维素结合结构域(CBD)和TEV蛋白酶识别位点，随后是两侧具有BsaI、BbsI和KpnI位点的填充序列。插入BsaI和BbsI位点，使得它们在消化之后产生相容的突出端。填充序列之后是截短形式的GFP基因和His标签。填充序列含有终止密码子，因此携带填充质粒pCW0359的大肠杆菌细胞形成非荧光的菌落。用BbsI和KpnI消化填充载体pCW0359以除去填充片段，并且得到的载体片段通过琼脂糖凝胶纯化来分离。该序列被称为XTEN_AD36，反映了基序的AD家族。其片段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GESPGGSSGSES、GSEGSSGPGESS、GSSESGSSEGGP或GSGGEPSESGSS。通过将以下对的磷酸化的合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AD1正向：AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC
AD1反向：ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC
AD2正向：AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC
AD2反向：ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT
AD3正向：AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC
AD3反向：ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA
AD4正向：AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC
我们还退火磷酸化的寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化的寡核苷酸pr_3KpnIstopper反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI片段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0401的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AD36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AD36序列具有良好的表达水平。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0401筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的片段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AD36片段的39个克隆。这些片段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表9。
表9：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001545838401491
Figure BPA00001545838401501
Figure BPA00001545838401521
Figure BPA00001545838401531
实施例2：XTEN_AE36片段的构建
构建了编码长度为36个氨基酸的XTEN序列的密码子文库。XTEN序列被称为XTEN_AE36。其片段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GSPAGSPTSTEE、GSEPATSGSE TP、GTSESA TPESGP或GTSTEPSEGSAP。通过将以下对的磷酸化合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AE1正向：
AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA
AE1反向：
ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT
AE2正向：
AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC
AE2反向：
ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT
AE3正向：
AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC
AE3反向：
ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT
AE4正向：
AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC
AE4反向：
ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT
我们还退火磷酸化寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopper反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI片段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0402的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AE36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AE36序列显示良好表达。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0402筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的片段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AE36片段的37个克隆。这些片段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表10。
表10：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001545838401551
Figure BPA00001545838401561
Figure BPA00001545838401571
Figure BPA00001545838401581
实施例3：XTEN_AF36片段的构建
构建了编码长度为36个氨基酸的序列的密码子文库。所述序列被称为XTEN_AF36。其片段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GSTSESPSGTAP、GTSTPESGSASP、GTSPSGESSTAP或GSTSSTAESPGP。通过将以下对的磷酸化合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AF1正向：AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC
AF1反向：ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA
AF2正向：AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC
AF2反向：ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT
AF3正向：AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC
AF3反向：ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT
AF4正向：AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC
AF4反向：ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA
我们还退火磷酸化寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstoPPer反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI片段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0403的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AF36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AF36序列显示良好的表达。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0403筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的片段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AF36片段的44个克隆。这些片段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表11。
表11：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001545838401591
Figure BPA00001545838401601
Figure BPA00001545838401611
Figure BPA00001545838401621
实施例4：XTEN_AG36片段的构建
构建了编码长度为36个氨基酸的序列的密码子文库。所述序列被称为XTEN_AG36。其片段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GTPGSGTASSSP、GSSTPSGATGSP、GSSPSASTGTGP或GASPGTSSTGSP。通过将以下对的磷酸化合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AG1正向：
AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC
AG1反向：
ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT
AG2正向：
AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC
AG2反向：
ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT
AG3正向：
AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC
AG3反向：
ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA
AG4正向：
AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC
AG4反向：
ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC
我们还退火磷酸化寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopper反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI片段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0404的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AG36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AG36序列显示良好表达。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0404筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的片段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AG36片段的44个克隆。这些片段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表12。
表12：36-mer基序的DNA和氨基酸序列
Figure BPA00001545838401651
Figure BPA00001545838401671
Figure BPA00001545838401691
实施例5：XTEN_AE864的构建
由XTEN_AE36的连续二聚化成AE72、144、288、576和864来构建XTEN_AE864。从37个不同的XTEN_AE36片段构建XTEN_AE72片段的集合。将携带所有37个不同的36-氨基酸片段的大肠杆菌的培养物混合并分离质粒。用BsaI/NcoI消化该质粒库以产生小片段作为插入序列。用BbsI/NcoI消化相同的质粒库以产生大片段作为载体。将插入序列和载体片段连接，导致长度倍增，并且将连接混合物转化到BL21Gold(DE3)细胞以获得XTEN_AE72的菌落。
将XTEN_AE72片段的该文库称为LCW0406。对来自LCW0406的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE144的文库LCW0410。对来自LCW0410的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE288的文库LCW0414。从文库随机选取两个独立克隆LCW0414.001和LCW0414.002并进行测序以证实同一性。对来自LCW0414的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE576的文库LCW0418。我们针对高水平的GFP荧光从文库LCW0418筛选了96个独立克隆。对通过PCR具有正确大小的插入序列和强荧光的8个独立克隆进行测序，并且基于测序和表达数据选择2个独立克隆(LCW0418.018和LCW0418.052)将来使用。
使用如上所述相同的二聚化过程，通过组合XTEN_AE576的LCW0418.018和XTEN_AE288的LCW0414.002构建XTEN_AE864的特定克隆pCW0432。
实施例6：XTEN_AM144的构建
从37个不同的XTEN_AE36片段、44个XTEN_AF36片段和44个XTEN_AG36片段开始构建XTEN_AM144片段的集合。
将携带所有125个不同的36-氨基酸片段的大肠杆菌培养物混合并分离质粒。用BsaI/NcoI消化该质粒库以产生小片段作为插入序列。用BbsI/NcoI消化相同的质粒库以产生大片段作为载体。将插入序列和载体片段连接，导致长度倍增，并且将连接混合物转化到BL21Gold(DE3)细胞以获得XTEN_AM72的菌落。
将XTEN_AM72片段的该文库称为LCW0461。对来自LCW0461的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到文库LCW0462。针对蛋白质表达筛选来自文库LCW0462的1512个独立克隆。将个体菌落转移至96孔板并培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜自动诱导培养基并培养20-30h。使用在395nm激发和在510nm发射的荧光分析仪测量表达。192个独立克隆显示了高水平表达，并且进行DNA测序。文库LCW0462中大多数克隆显示了良好表达和类似的理化性质，表明大多数XTEN_AM36片段的组合产生有用的XTEN序列。选择来自LCW0462的30个独立克隆作为XTEN_AM144片段的优选集合，用于构建含有多个XTEN片段的多功能蛋白质。这些片段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表13。
表13：AM144片段的DNA和氨基酸序列
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实施例7：XTEN_AM288的构建
将整个文库LCW0462如实施例6所述二聚化，得到被称为LCW0463的XTEN_AM288克隆文库。使用实施例6中描述的方案筛选来自文库LCW0463的1512个独立克隆。对176个高表达的克隆进行测序，并且选择40个优选的XTEN_AM288片段来构建含有具有288个氨基酸残基的多个XTEN片段的多功能蛋白质。
实施例8：XTEN_AM432的构建
通过重组来自XTEN_AM144片段文库LCW0462的片段和来自XTEN_AM288片段文库LCW0463的片段，产生了XTEN_AM432片段的文库。该新的XTEN_AM432片段文库被称为LCW0464。从分别携带LCW0462和LCW0463的大肠杆菌的培养物分离质粒。使用实施例6描述的方案筛选来自文库LCW0463的1512个独立克隆。对176个高表达克隆进行测序，并且选择39个优选的XTEN_AM432片段来构建更长的XTEN并构建含有具有432个氨基酸残基的多个XTEN片段的多功能蛋白质。
同时，我们使用XTEN_AM144和XTEN_AM288的优选片段构建了XTEN_AM432片段的文库LMS0100。筛选该文库产生了选择用于进一步构建的4个独立克隆。
实施例9：XTEN_AM875的构建
用BsaI和KpnI消化填充载体pCW0359以去除填充片段，并且得到的载体片段通过琼脂糖凝胶纯化来分离。
我们退火磷酸化寡核苷酸BsaI-AscI-KpnI正向引物：AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸BsaI-AscI-KpnI反向：CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCCGTGCTTGGCGCGCCGCTTGCGCTTGC，以引入编码氨基酸GASASGAPSTG并且内部具有限制酶AscI识别核苷酸序列GGCGCGCC的测序岛A(SI-A)。将退火的寡核苷酸对与上述制备的BsaI和KpnI消化的填充载体pCW0359连接，以产生含有SI-A的pCW0466。然后，我们使用实施例5描述的相同二聚化方法通过在C端重组来自实施例8的43个优选的XTEN_AM432片段和来自pCW0466的SI-A片段而产生XTEN_AM443片段文库。将该新的XTEN_AM443片段文库称为LCW0479。
我们使用实施例5描述的相同的二聚化方法，通过重组来自XTEN_AM443片段的文库LCW0479的片段和来自实施例8的43个优选的XTEN_AM432片段而产生XTEN_AM875片段文库。将该新的XTEN_AM875片段文库称为LCW0481。
实施例10：XTEN_AM1318的构建
我们退火磷酸化寡核苷酸BsaI-FseI-KpnI正向引物：AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸BsaI-FseI-KpnI反向：CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTCTGG，以引入编码氨基酸GPEPTGPAPSG并且内部具有限制酶FseI识别核苷酸序列GGCCGGCC的测序岛B(SI-B)。将退火的寡核苷酸对与如实施例9使用的BsaI和KpnI消化的填充载体pCW0359连接，以产生含有SI-B的pCW0467。然后，我们使用实施例5描述的相同二聚化方法，通过在C端重组来自实施例8的43个优选的XTEN_AM432片段和来自pCW0467的SI-B片段而产生XTEN_AM443片段文库。将该新的XTEN_AM443片段文库称为LCW0480。
我们使用实施例5描述的相同的二聚化方法，通过重组来自XTEN_AM443片段文库LCW0480的片段和来自XTEN_AM875片段文库LCW0481的片段而产生XTEN_AM1318片段文库。将该新的XTEN_AM1318片段文库称为LCW0487。
实施例11：XTEN_AD864的构建
使用几轮连续的二聚化，我们从实施例1所列XTEN_AD36片段开始组装XTEN_AD864序列的集合。将这些序列如实施例5所述来组装。评估了来自XTEN_AD864的几个独立克隆并发现在生理条件下显示良好的表达和优良的溶解度。对XTEN_AD576的一个中间构建体进行测序。在PK实验中对该克隆在食蟹猴中评估并测量半衰期为约20h。
实施例12：XTEN_AF864的构建
使用几轮连续的二聚化，我们从实施例3所列XTEN_AF36片段开始组装XTEN_AF864序列的集合。将这些序列如实施例5所述来组装。评估了来自XTEN_AF864的几个独立克隆并发现在生理条件下显示良好的表达和优良的溶解度。对XTEN_AF540的一个中间构建体进行测序。在PK实验中对该克隆在食蟹猴中评估并测量半衰期为约20h。XTEN_AF864的全长克隆具有优良溶解度，并且显示在食蟹猴中超过60h的半衰期。将第二组XTEN_AF序列组装为包括实施例9所述的测序岛。
实施例13：XTEN_AG864的构建
使用几轮连续的二聚化，我们从实施例1所列XTEN_AD36片段开始组装XTEN_AG864序列的集合。将这些序列如实施例5所述来组装。评估了来自XTEN_AG864的几个独立克隆并发现在生理条件下显示良好的表达和优良的溶解度。XTEN_AG864的全长克隆具有优良的溶解度，并且显示在食蟹猴中超过60h的半衰期。
实施例14：XTEN-构建的N端延伸的构建和12mer附加文库的筛选
本实施例详细描述了在XTEN蛋白的N端优化中促进转录起始的步骤以允许XTEN融合物在无辅助结构域存在下在融合蛋白N端表达。历史上，在N端具有XTEN的蛋白质的表达差，产生在GFP荧光测定中基本不可检测的值(＜具有N端CBD辅助结构域的表达的25％)。为了产生密码子水平上的多样性，选择七个氨基酸序列并用多种密码子制备。设计具有密码子多样性的编码12个氨基酸的七对寡核苷酸、退火并连接到NdeI/BsaI限制酶消化的填充载体pCW0551(填充片段-XTEN_AM875-GFP)，并转化到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得七个文库的菌落。得到的克隆具有与XTEN_AM875-GFP在框内融合的N端XTEN 12mer，以允许使用GFP荧光筛选表达。挑取来自七个产生的文库的个体菌落并过夜生长至在96深孔板中500μl超级肉汤培养基中饱和。挑取的菌落数范围是文库理论多样性的大约一半至三分之一(参见表14)。
表14：12mer附加文库的理论多样性和取样数目。具有随机化密码子的氨基 酸残基加下划线。
  文库   基序家族   氨基酸序列   理论多样性   筛选数目
  LCW546   AE12   MASPAGSPTSTEE   572   2个板(168)
  LCW547   AE12   MATSESATPESGP   1536   5个板(420)
  LCW548   AF12   MATSPSGESSTAP   192   2个板(168)
  LCW549   AF12   MESTSSTAESPGP   384   2个板(168)
  LCW552   AG12   MASSTPSGATGSP   384   2个板(168)
  LCW553   AG12   MEASPGTSSTGSP   384   2个板(168)
  LCW554   (CBD-样)   MASTPESGSSG   32   1个板(84)
饱和的过夜培养物用于将新鲜500μl培养物接种于在其中于26℃下生长过夜的自诱导培养基中。然后使用荧光酶标仪(激发395nm，发射510nm)测定这些表达培养物，以测定存在的GFP报告分子的量(表达测定的结果参见图28)。结果表明，虽然中值表达水平是″基准″CBD N端辅助结构域表达水平的大约一半，但来自文库的最佳克隆非常接近于基准，表明围绕那些序列的进一步优化是有保证的。这与之前的＜CBD N端基准表达水平的25％的XTEN形式不同。结果还显示，从氨基酸MA开始的文库具有比ME开始的文库更好的表达水平。这在考察最佳克隆时是最明显的，最佳克隆更接近基准，因为它们大部分开始于MA。在CBD-AM875基准的33％内的176个克隆中，87％开始于MA，其中因为文库中仅75％的序列开始于MA，明显超过最高表达水平的开始于MA的克隆的代表。对96个最佳克隆进行测序以确认同一性，选择12个序列(参见表15)进一步优化，4个来自LCW546，4个来自LCW547，并且4个来自LCW552。
表15：提出的12mer DNA核苷酸序列
  克隆   DNA核苷酸序列
  LCW546_02   ATGGCTAGTCCGGCTGGCTCTCCGACCTCCACTGAGGAAGGTACTTCTACT
  LCW546_06   ATGGCTAGTCCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTACTTCTACT
  LCW546_07   ATGGCTAGTCCAGCAGGCTCTCCTACCTCCACCGAGGAAGGTACTTCTACT
  LCW546_09   ATGGCTAGTCCTGCTGGCTCTCCGACCTCTACTGAGGAAGGTACTTCTACT
  LCW547_03   ATGGCTACATCCGAAAGCGCAACCCCTGAGTCCGGTCCAGGTACTTCTACT
  LCW547_06   ATGGCTACATCCGAAAGCGCAACCCCTGAATCTGGTCCAGGTACTTCTACT
  LCW547_10   ATGGCTACGTCTGAAAGCGCTACTCCGGAATCTGGTCCAGGTACTTCTACT
  LCW547_17   ATGGCTACGTCCGAAAGCGCTACCCCTGAATCCGGTCCAGGTACTTCTACT
  LCW552_03   ATGGCTAGTTCTACCCCGTCTGGTGCAACCGGTTCCCCAGGTACTTCTACT
  LCW552_05   ATGGCTAGCTCCACTCCGTCTGGTGCTACCGGTTCCCCAGGTACTTCTACT
  LCW552_10   ATGGCTAGCTCTACTCCGTCTGGTGCTACTGGTTCCCCAGGTACTTCTACT
  LCW552_11   ATGGCTAGTTCTACCCCTTCTGGTGCTACTGGTTCTCCAGGTACTTCTACT
实施例15：XTEN-构建的N端延伸的构建和优化密码子3和4的文库的筛选
本实施例详细描述了在XTEN蛋白的N端优化中促进转录起始的步骤以允许XTEN融合物在无辅助结构域存在下在蛋白质的N端表达。对已确立的前两个密码子的偏好(参见以上实施例)，对第三和第四密码子进行随机化以确定偏好。基于来自LCW546、LCW547和LCW552的最佳克隆，设计了第三和第四残基被修饰的三个文库，使得可允许的XTEN密码子的所有组合存在于这些位置(参见图29)。为了使每个文库包括所有可允许的XTEN密码子，设计第三核第四残基具有密码子多样性的编码12个氨基酸的九对寡核苷酸、退火并连接到NdeI/BsaI限制酶消化的填充载体pCW0551(填充片段-XTEN_AM875-GFP)，并转化到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得三个文库LCW0569-571的菌落。对于24个XTEN密码子，每个文库的理论多样性是576个独特克隆。挑取来自三个产生的文库的总计504个单独菌落并过夜生长至在96深孔板中500μl超级肉汤培养基中饱和。这提供了足够的覆盖以理解相对文库性能和序列偏好。饱和的过夜培养物用于将新鲜500μl培养物接种在其中于26℃下生长过夜的自诱导培养基中。然后使用荧光酶标仪(激发395nm，发射510nm)测定这些表达培养物，以测定存在的GFP报告分子的量。对来自筛选的前75个克隆进行测序并测试GFP报告分子表达，与基准样本相比(参见图28)。52个克隆产生了可用的测序数据，并用于随后分析。结果通过文库分解，并且表明LCW546是优良的文库。结果提供于表16。出人意外的是，最佳克隆的基线荧光读数是～900AU，而CBD N端基准仅为～600AU。这表明，该文库已经确立了相对于来自之前文库的最佳克隆大约33％的提高，之前文库的最佳克隆的表达大约等于CBD N端基准(实施例14)。
表16：第三和第四密码子优化文库比较
  LCW569   LCW570   LCW571
  N   21   15   16
  平均荧光(AU)   628   491   537
  SD   173   71   232
  CV   28％   15％   43％
数据中发现其它趋势，显示对第三和第四位置特定密码子的偏好。在LCW569文库内，第三位置的谷氨酸密码子GAA和苏氨酸密码子ACT与较高的表达相关，如表17所见。
表17：LCW569中优选的第三和第四密码子
3＝GAA   其它   4＝ACT   其它
  N 8   13   4   17
  平均荧光(AU) 749   554   744   601
  SD 234   47   197   162
  CV 31％   9％   26％   27％
此外，前75个克隆的再测试表明这几个目前优于基准克隆。
实施例16：XTEN-构建的N端延伸的构建和组合12mer和36mer文库的筛选
本实施例详细描述了在XTEN蛋白的N端优化中促进转录起始的步骤以允许XTEN融合物在无辅助结构域存在下在蛋白质N端的的表达。对已确立的前两个密码子的偏好(参见以上实施例)，通过以组合方式组合在最N端的12个选定的12mer序列(参见以上实施例)和随后125个之前构建的36mer片段(参见以上实施例)，以更宽范围检验N端。这在XTEN蛋白的N端产生新的48mer，并使能够评估N端更长范围相互作用对更长序列表达的影响(图29)。类似于用于组装36mer的二聚化程序(参见以上实施例)，用限制酶BbsI/NcoI消化含有125个选定36mer片段的质粒，并凝胶纯化适合的片段。也用BsaI/NcoI消化来自克隆AC94的质粒(CBD-XTEN_AM875-GFP)并凝胶纯化适合的片段。将这些片段连接在一起并转化入大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得文库LCW0579的菌落，其还可以用作载体以在最N端克隆12个选定的12mer。用NdeI/EcoRI/BsaI消化LCW0579的质粒并凝胶纯化适当的片段。设计编码12个选定的12mer序列的12对寡核苷酸、退火并与NdeI/EcoRI/BsaI消化的LCW0579载体连接，并转化到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得文库LCW0580的菌落。根据1500个独特克隆的理论多样性，挑取总共1512个来自产生文库的个体菌落并过夜生长至在96深孔板中500μl超级肉汤培养基中饱和。这提供了足够的覆盖以理解相对文库性能和序列偏好。饱和的过夜培养物用于将新鲜500μl培养物接种于在其中于26℃下生长过夜的自诱导培养基中。然后使用荧光酶标仪(激发395nm，发射510nm)测定这些表达培养物，以测定存在的GFP报告分子的量。对前90个克隆进行测序并再测试GFP报告分子表达。83个克隆产生了可用的测序数据，并用于随后分析。测序数据用于确定每个克隆中存在的前导12mer，并且评估每个12mer对表达的影响。克隆LCW546_06和LCW546_09突显作为优良的N端(参见表18)。
表18：以LCW546_06和LCW459_09开始的克隆的相对性能
  LCW546_06   所有其它   LCW546_09   所有其它
  N   11   72   9   74
  平均荧光(AU)   1100   752   988   775
  SD   275   154   179   202
  CV   25％   20％   18％   26％
测序和再测试也揭示了产生类似结果的数据中相同序列的独立复制子的几种情况，由此增加测定的置信度。此外，具有6个独特序列的10个克隆优于基准克隆。它们提供于表19。应注意，这些是这些序列的唯一出现，并且绝不是这些序列出现之一，并且未能击败基准克隆。提出这六个序列用于进一步优化。
表19：优于基准克隆的组合的12mer和36mer克隆
Figure BPA00001545838401901
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Figure BPA00001545838401931
实施例17：XTEN-构建的N端延伸的构建和XTEN-AM875和XTEN-AE864组合12mer和36mer文库的筛选
本实施例详细描述了在XTEN蛋白的N端优化中促进转录起始的步骤以允许XTEN融合物在无辅助结构域存在下在蛋白质N端的表达。根据已确定的对前四个密码子(参见以上实施例)及N端12mer和36mer最佳配对(参见以上实施例)的偏好，进行组合的方法以检验这些偏好的联合。这在XTEN蛋白的N端产生新的48mer，并使能够检测之前结论的影响。此外，通过将该新的48mer置于XTEN-AE864和XTEN-AM875两者之前，来评估这些前导序列成为所有XTEN蛋白的通用解决方案的能力。用NdeI/EcoRI/BsaI消化来自组合文库中具有最佳GFP表达的36mer片段的6个选定克隆的质粒并将合适的片段凝胶纯化，而不是使用36mer片段的所有125个克隆。用NdeI/EcoRI/BsaI消化来自克隆AC94(CBD-XTEN_AM875-GFP)和AC104(CBD-XTEN_AE864-GFP)的质粒并将合适的片段凝胶纯化。将这些片段连接在一起，并且转化到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞中以获得文库LCW0585(-XTEN_AM875-GFP)和LCW0586(-XTEN_AE864-GFP)的菌落，其还可用作用于进一步克隆在最N端的8个选定12mer的载体。用NdeI/EcoRI/BsaI消化质粒LCW0585和LCW0586并将合适的片段凝胶纯化。在之前(第二代)的筛选中，设计编码具有最佳GFP表达的8个选定12mer序列的8对寡核苷酸、退火，再与用NdeI/EcoRI/BsaI消化过的LCW0585和LCW0586载体连接，并转化到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得最终文库LCW0587(XTEN_AM923-GFP)和LCW0588(XTEN_AE912-GFP)的菌落。根据48个独特克隆的理论多样性，在96深孔板中，挑取总共252个来自构建的文库的个体菌落并使其过夜生长至在96深孔板中500μl超级肉汤培养基中饱和。这提供了足够的覆盖范围以理解相对文库性能和序列偏好。饱和的过夜培养物用于将新鲜500μl培养物接种于在其中于26℃下生长过夜的自诱导培养基中。然后使用荧光酶标仪(激发395nm，发射510nm)测定这些表达培养物，以测定存在的GFP报告分子的量。对前36个克隆进行测序并再测试GFP报告分子的表达。36个克隆产生了可用的测序数据，并且这36个用于随后分析。测序数据确定了克隆中存在的12mer、第三个密码子、第四个密码子和36mer，并且揭示许多克隆是相同序列的独立复制子。此外，这些克隆的再测试结果在数值上相近的，说明该筛选方法是强大的。发现了在N端的某种组合的偏好，并且一致地产生比基准对照高约50％的较高荧光值(参见表20和表21)。这些数据支持了这样一个结论：在融合蛋白基因纳入编码已优化的N端XTEN的序列使融合蛋白表达显著增强。
表20：XTEN-AM875的优选N端组合
  克隆名称   复制子数目   12mer   36mer   均值   SD   CV
  CBD-AM875   NA   NA   NA   1715   418   16％
  LCW587_08   7   LCW546_06_3＝GAA   LCW404_40   2333   572   18％
  LCW587_17   5   LCW546_09_3＝GAA   LCW403_64   2172   293   10％
表21：XTEN-AE864的优选N端组合
  克隆名称   复制子数目   12mer   36mer   均值   SD   CV
  AC82   NA   NA   NA   1979   679   24％
  LCW588_14   8   LCW546_06_opt3   LCW404_31   2801   240   6％
  LCW588_27   2   LCW546_06_opt34   LCW404_40   2839   556   15％
很明显，XTEN-AM875的优选N端组合与XTEN-AE864的优选组合是不同的，说明从起始位点超过150个碱基的更加复杂的相互作用影响表达水平。表22中列出优选的核苷酸序列，并且通过SDS-PAGE分析优选的克隆以独立确认表达(参见图30)。挑选出XTEN_AM923和XTEN_AE912的完整序列以作进一步分析。
表22：N端XTEN-AM875和XTEN-AE864的前48个氨基酸残基的优选DNA 核苷酸序列
Figure BPA00001545838401951
实施例18：产生和评估CFXTEN的方法；XTEN-CF作实例
用于产生和评价CFXTEN组合物的一般方案示于图33，并且构成本实施例的一般描述的基础。使用已公开的方法和本领域普通技术人员已知的方法，结合示例性实施例中提供的指导，技术人员可以构建并且评估包含XTEN、CF和本领域已知的CF变体的一系列CFXTEN融合蛋白。因此，本实施例将被解释为仅仅是示例性的，而不是以任何方式限制所述方法；许多变化对于普通技术人员是明显的。在本实施例中，构建连接至基序AE家族的XTEN的凝血因子的CFXTEN。
图31和图32提供了用于产生编码XTEN的多核苷酸的一般方案。图32是在本发明一个实施方案中XTEN多核苷酸构建体的组装的代表性步骤的示意流程图。将个体寡核苷酸501退火为序列基序502，如12氨基酸基序(“12-mer”)，它随后与含有BbsI和KpnI限制性位点503的寡核苷酸连接。基序文库可限制为特定的序列XTEN家族；例如表3中的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。在这种情况下，AE家族的基序作为基序文库使用，其退火为12mer以构建“结构单元”长度；例如，编码36个氨基酸的片段。可以通过“结构单元”的连接和多聚化来组装编码XTEN序列的基因，直至达到XTEN基因504的期望长度。如图32所示，该例中XTEN的长度是48个氨基酸残基，但通过该方法可以达到更长的长度。例如，多聚化可以借助连接、重叠延伸、PCR组装或本领域已知的类似克隆技术来进行。可将XTEN基因克隆到填充载体。在如图32中显示的实施例中，载体可以编码flag序列506，其后为两侧带有BsaI、BbsI和KpnI位点507的填充序列和CF基因(如，FVII)508，得到编码CFXTEN 500的基因，其在该例中编码构型为N到C端XTEN-FVII的融合蛋白。如本领域技术人员显而易见的，该方法可以用于创建可选构型的且具有变化XTEN长度的构建体。
编码CF的DNA序列可以方便地通过本领域中已知标准程序从适合细胞来源制备的cDNA文库得到，从基因组文库得到，或可以使用可公开获得的数据库、专利或参考文献中得到的DNA序列以合成的方式来构建(如，自动化核酸合成)。然后，将编码蛋白质的CF部分或其补体的基因或多核苷酸能够克隆到构建体，例如本文描述的那些构建体，它们可以是质粒，或者是在生物系统中为高水平蛋白质表达而受控于合适的转录和翻译序列的其它载体。通过连接或多聚化步骤，可将编码XTEN部分或其补体(在示例为具有48个氨基酸残基的XTEN的图32的情况下)的第二基因或多核苷酸与编码CF基因的末端的核苷酸进行基因融合，方式是将其与编码CF的基因相邻且在框内克隆到构建体。以这种方式，一种编码(或互补于)CFXTEN融合蛋白的嵌合DNA分子在构建体中再产生。任选地，编码第二XTEN的基因被插入并框内连接至编码CFXTEN基因的相反端的核苷酸或可插入CF编码的区域内。此构建体可被设计成不同构型，以编码作为单体多肽的融合配偶体的多种排列变化。例如，此基因能够被构建成编码具有以下顺序(N到C端)的融合蛋白：CF-XTEN；XTEN-CF；CF-XTEN-CF；XTEN-CF-XTEN；以及前述的多聚体。任选地，这种嵌合DNA分子被转移或克隆到作为更加适合的表达载体的构建体。在这一点上，能够表达嵌合DNA分子的宿主细胞被嵌合DNA分子转化。如上所述，可将含有目标DNA片段的载体根据细胞宿主的类型通过已知的方法转移到合适的宿主细胞。
在酌情改进用于激活启动子的常规营养培养基中培养含有XTEN-CF表达载体的宿主细胞。培养条件，比如温度、pH等，是之前用于所选择用于表达的宿主细胞并对于普通技术人员是显然的那些条件。此融合蛋白表达之后，收集培养基肉汤并从细胞群分离，保留得到的粗提取物用于纯化融合蛋白。
在样本中直接测定基因表达，例如，通过常规的Southern印迹、定量mRNA的转录的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、斑点印迹(DNA分析)或原位杂交，根据在本文提供的序列使用适当标记探针。或者，通过免疫荧光的方法，比如细胞免疫组织化学染色以直接定量基因产物的表达，来测量基因表达。用于免疫组织化学染色和/或样本液体测定的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可以利用基于本文提供的序列的合成肽制备针对CF序列多肽的抗体，或者是针对与CF融合并编码特定抗体表位的外源序列的抗体。选择性标记的实例是本领域技术人员熟知的，并且包括报告分子如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。
经本领域已知的方法纯化CFXTEN多肽产物。程序，如凝胶过滤、亲和纯化、盐分级分离、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、羟磷灰石吸附色谱、疏水作用色谱或凝胶电泳，都是可在纯化中使用的技术。在Robert K.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Charles R.Castor编著，Springer-Verlag 1994和Sambrook等(同上)中描述了具体的纯化方法。在Baron等，Crit.Rev.Biotechnol.10：179-90(1990)和Below等，J.Chromatogr.A.679：67-83(1994)中也描述了多步纯化分离。
如图33所示，分离的CFXTEN融合蛋白然后根据它们的化学与活性性质来表征。使用该领域已知的标准方法对于例如序列、纯度、表观分子量、溶解度和稳定性对分离的融合蛋白进行表征。然后评估符合预期标准的融合蛋白的活性，这可以通过使用一种或多种本文公开的测定或使用实施例或表40的测定测量本文描述的凝血因子相关参数之一而在体外或体内进行测量。
此外，将XTEN-CF融合蛋白施用给一种或多种动物种以确定标准药代动力学参数和药效学性质，如实施例30-33中所述。
通过生产、表达和回收CFXTEN构建体的反复过程，随后使用本文公开的方法或本领域已知的其它方法对其表征，包含CF和XTEN的CFXTEN组合物可以由本领域普通技术人员制备和评估以确认预期特性，如增强的溶解度、增强的稳定性、改进的药代动力学和降低的免疫原性，导致与相应的未融合CF相比总体增强的治疗活性。对于不具有期望特性的那些融合蛋白，可通过这些方法构建、表达、分离和评估不同的序列以获得具有这些特性的组合物。
实施例19：FVII-XTEN的表达质粒的构建
FVII-TEV-XTEN_864表达载体的构建
从OriGene购得含有编码FVII的基因的克隆载体(SC109205)。进行PCR反应以去除FVII编码区中的BbsI和BsaI限制性位点。然后使用分别在5’和3，端处引入NheI和TEV-BsaI序列的引物扩增所得的FVII编码区。使消化的FVII片段与BsaI/HindIII消化的XTEN_AE864片段融合并且插入到NheI/HindIII消化的pSecTag2C表达载体。使连接DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。最终的构建体是编码FVII-TEV-XTEN_AE864蛋白的pCW0647.001(表23)。
FVII-XTEN_864表达载体的构建
用pCW0647.001作为模板扩增FVII。PCR引物在5’和3’端处分别引入NheI和BsaI限制酶识别序列并删除TEV位点。使NheI/BsaI消化的FVII片段与BsaI/HindIII消化的XTEN_AE864片段融合并且插入到NheI/HindIII消化的pSecTag2C表达载体。使连接DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。最终的构建体是编码FVII-XTEN_AE864蛋白的pCW0645.001(表23)。
使用Millipore质粒构建编码FVII-XTEN_864基因的表达载体
用NheI和SalI消化表达载体pCW0645.001。所得的4091bp片段包括编码FVII-XTEN_AE864蛋白的核苷酸。此片段与NheI/SalI消化的CET1019-AS-puro、CET1019-HS-puro、SC AS-puro或DC HS-puro(从Millipore获得许可)连接。这些载体的特征是CMV启动子位于基因插入位点的上游，并且CET1019载体还含有启动子的UCOE元件上游。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。所得的表达载体是AC397(pBC0013，SC ASpuro-FVII-XTEN_AE864)、AC402(pBC0014，SC HS puro-FVII-XTEN_AE864)、AC403(pBC0015，CET1019 AS puro-FVII-XTEN_AE864)和AC404(pBC0016，CET1019 HS puro-FVII-XTEN_AE864)。
编码FVII-XTEN_288基因的表达载体的构建
用BsaI和HindIII消化表达载体pCW0645.001。使所得的6400bp片段与BsaI/HindIII消化的XTEN_AE288片段连接。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。所得的表达载体是pBC0019(pSecTag2C-FVII-XTEN_AE288)。
用NheI和SalI消化表达载体pBC0019。所得的2363bp片段包括编码FVII-XTEN_AE288蛋白的核苷酸。此片段与NheI/SalI消化的CET1019-AS-puro或CET1019-HS-puro(从Millipore获得许可)连接。这些载体的特征是CMV启动子和UCOE元件位于基因插入位点的上游。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。所得的表达载体是AC405(pBC0017，CET1019 AS puro-FVII-XTEN_AE288)和AC398(pBC0018，CET1019 HSpuro-FVII-XTEN_AE288)(表23)。
表23：FVII氨基酸和核酸序列
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实施例20：FIX-XTEN的表达质粒的构建
FIX-XTEN_864基因和载体的构建
从OriGene购得含有编码FIX的基因的克隆载体(SC126517)。进行PCR反应以去除FIX编码区中的两个BbsI限制性位点。然后使用分别在5’和3’端处引入NheI和BsaI限制酶识别序列的引物来扩增所得的FIX编码区。使消化的FIX片段与BsaI/HindIII消化的XTEN_AM864、AE864、AF864或AG864片段融合并且插入到NheI/HindIII消化的pSecTag2C表达载体。最终的构建体是AC282(pCW0562，FIX-XTEN_AM864)、AC283(pCW0563，FIX-XTEN_AE864)、pCW0564(FIX-XTEN_AF864)和pCW0565(FIX-XTEN_AG864)(表24)。
FIX辅助基因的表达载体的构建
从OriGene购得含有编码PC5的基因的克隆载体(SC310051)。使用引入NotI和BstBI限制酶识别序列的引物来扩增PC5编码区。使NotI/BstBI消化的PC5片段与NotI/BstBI消化的CET1019-HD-puro或DC-HD-puro载体连接。CET1019-HD-puro和DC-HD-puro的特征是双表达盒，其中CMV启动子位于基因插入位点的上游，CET1019-HD-puro也含有启动子的UCOE元件上游。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。所得的表达载体是pBC0037(DC-HD-puro-PC5)和pBC0038(CET1019 HD-puro-PC5)。
FIX-XTEN和PC5双表达载体的构建
pBC0037和pBC0038构建体用NheI和SalI消化并且与NheI/SalI消化的FIX-XTEN_AE864连接。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。所得的表达载体是pBC0035(DC-HD-puro-FIX-XTEN_AE864-PC5)和pBC0036(CET1019-HD-puro-FIX-XTEN_AE864-PC5)。
表24：FIX氨基酸和核酸序列
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实施例24：FIX-/FXI/-XTEN的构建
FIX-TEV-XTEN_AE864基因和载体的构建
从OriGene购得含有编码FIX的基因的克隆载体(SC126517)。进行PCR反应以去除FIX编码区中的两个BbsI限制性位点。然后使用分别在5’和3’端处引入NheI和SfiI-TEV-BsaI序列的引物来扩增所得的FIX编码区。使消化的FIX片段与BsaI/HindIII消化的XTEN_AE864片段融合并且插入到NheI/HindIII消化的pSecTag2C表达载体。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。最终的构建体是编码FIX-TEV-XTEN_AE864蛋白的pCW0648.001(表25)。
FIX-/FXI/-XTEN_AE864基因和载体的构建
通过用SfiI和BsaI消化pCW0648表达载体去除TEV位点。使含有编码SfiI-KLTRAET-BsaI、SfiI-DFTRVVG-BsaI或SfiI-/FXI/-BsaI的序列的寡核苷酸(Oligos)退火且与消化的pCW0648载体连接。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。所得的表达载体编码FIX-KLTRAET-XTEN_AE864(pCW0735)、FIX-DFTRVVG-XTEN_AE864(pCW0736)和FIX-/FXI/-XTEN_AE864(pCW0737)。
使用Millipore质粒构建编码FIX-/FXI/-XTEN_AE864基因的表达载体
用NheI和SalI消化表达载体pCW0735。所得的4181bp片段包括编码FIX-KLTRAET-XTEN_AE864蛋白的核苷酸。此片段与NheI/SalI消化的CET1019-HD-puro(Millipore)或DC HD-puro(Millipore)连接。CET1019-HD-puro和DC-HD-puro的特征是双表达盒，其中CMV启动子位于基因插入位点的上游，CET1019-HD-puro也含有启动子的UCOE元件上游。使连接的DNA混合物电穿孔到XL1-Blue细菌细胞内。通过DNA小量制备筛选转化体并且通过DNA测序确认所需的构建体。所得的表达载体是pBC0033(DC-HD-puro-FIX-KLTRAET-XTEN_AE864)和pBC0034(CET1019-HD-puro-FIX-KLTRAET-XTEN_AE864)(表25)。
表25：具有裂解序列的FIX-XTEN：氨基酸和核酸序列
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实施例25：FVII-XTEN和FIX-XTEN的表达
哺乳动物细胞的瞬时转染
发现哺乳动物细胞(包括CHO-K1、BHK、COS-7和HEK293)当转染时表达使用不同XTEN长度的FVII-XTEN或FIX-XTEN。以下详细描述用于通过瞬时转染表达各种FVII-XTEN和FIX-XTEN融合蛋白构建体的方法。
转染的前一天将HEK293细胞涂板，在12-孔板中在含有10％FBS、1XPen/Strep和5mg/ml维生素K的培养基中1X 105/孔。对于细胞涂板后第二天的转染，将稀释于OptiMEM(共计25μl)中的质粒DNA(0.6μg)与稀释的FuGENE6(22.9μl OptiMEM中的2.1μl FuGENE6)混合并且在加入细胞之前在室温下孵育30min。在转染后第3天或第4天收集培养基，在室温下500x g离心5min，且然后在ELISA中测试FVII-XTEN或FIX-XTEN的表达或在凝固测定(对于FVII活性为PT和对于FIX活性为aPTT)中测试性能之前使用0.2μm过滤器过滤上清液。结果呈现于表26。
应注意，通过PT测定(活性FVII蛋白)测量的FVII-XTEN的滴度比通过ELISA(总FVII蛋白)测量的滴度高，虽然对于此的确切原因仍有待阐明，其可能归因于(1)由于XTEN的表位屏蔽低估了FVII-XTEN环境中的FVII，(2)高估了通过PT测定的凝固活性，或(1)和(2)的组合。还应注意由于未知原因通过aPTT测定的FIX的滴度比通过ELISA(总FIX蛋白)测量的滴度仅低约20％，但是原因之一可能是前肽加工不足，该现象报道了在CHO或其它哺乳动物细胞中制备的重组FIX。通过aPTT测定的FIX-XTEN的滴度比通过ELISA测定的单独的FIX的滴度甚至相应地更低，表明FIX的活性可能通过与XTEN融合而降低，该假定通过经TEV处理由质粒构建体转染的细胞产生的材料后分析蛋白质的活性和ELISA滴度而确认，所述质粒构建体编码FVII-XTEN但在之间插入TEV裂解位点。
表26：FVII、FVII-XTEN_AE864、FIX和FIX-XTEN_AE864的表达
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产生FVII-XTEN的CHO-K1稳定库和细胞系的生成
细胞：将从ATCC(Cat.CCL-61，Lot 58078551)购得的CHO-K1细胞在完全培养基(F-12K，10％FBS和1X P/S，Appendix 1)中复苏并且传代4代，然后将多个小瓶在具有5％DMSO的完全培养基中冷冻。将一个小瓶在与完全培养基类似但具有5％FBS的培养基中复苏且在转染前再传代一次。
稳定库的生成：上述实施例中已描述了分别编码FVII-AE864、FVII-AE864和FVII-AE288的质粒pBC0014、pBC0016和pBC0018的构建。两个质粒pBC0016和pBC0018也携带UCOE。首先用PvuII将质粒线性化且然后用FuGENE6转染试剂转染到上述CHO-K1细胞的各自的T25烧瓶中，6.5x 105个细胞/烧瓶，3.6μg质粒DNA。两天后将细胞转移到T75且在选择培养基(具有10μg/ml嘌呤霉素和5μg/ml维生素K的完全培养基)中培养。每2-3天将烧瓶中的培养基更换为新鲜的选择培养基。转染两周后，将来自T75烧瓶的细胞冷冻作为稳定库。
克隆的选择：对于初级筛选，将冷冻的稳定库细胞复苏且以0.5个细胞/孔的目标密度接种于6个96孔板。接种后约1周，通过ELISA测试来自具有单细胞团(如显微镜下观察)的孔的废培养基的FVII的表达。在通过ELISA的初级筛选中测试的克隆的数量是：对于pBC0014为154个，对于pBC0016为210和对于pBC0018为135个。显著数量的克隆不表达或表达不可检测水平的FVII(图9，黑条，表示为ng/ml)，但是15-20％的克隆表达高于3-8倍的FVII，然后选择这些克隆用于进一步筛选和选择，对于pBC0014为20个，对于pBC0016为30个和对于pBC0018为20个。对这些孔中的细胞团的大小评分为1-10，其中1是最小的细胞团且10为最大的细胞团；结果在图9中示为灰条。这些克隆的细胞团大小的分布与相似变体的所有克隆的相似，表明选择它们不仅因为它们生长最快。
对于另外轮次的筛选，将标准化数量的细胞接种于多孔板中。接种后2-3天收获废培养基且通过ELISA测试FVII浓度，通过PT测试凝固活性；还从板上收获细胞且使用Vi-Cell计数。通过以下对克隆分级：(1)根据ELISA和凝固测定的FVII滴度；(2)ELISA滴度/细胞计数和凝固滴度/细胞计数的比率；及(3)通过蛋白质印迹测量的由克隆产生的产物的完整性和均一性。以下分别描述对构建体pBC0014、pBC0016和pBC0018中的每一个的克隆的选择。
pBC0014：对于第二轮筛选，将96-孔板中从初级筛选选择的前20个克隆的细胞在T25烧瓶中扩增且然后接种于24-孔板，一式两份，一份培养2天且另一份培养3天。从板上收集废培养基用于FVII ELISA且通过Vi-Cell收获和计数细胞。根据通过ELISA和凝固测定的滴度、ELISA滴度/细胞和凝固滴度/细胞计数比率来选择14个克隆且进一步筛选。制备9个克隆1F10、2F7、6H4、1A3、6F10、5C2、5F1、3H2、4C8的冷冻小瓶。在14个克隆之中，根据通过ELISA和凝固测定的滴度、ELISA滴度/细胞计数和凝固滴度/细胞计数的比率以及通过蛋白质印迹测量的产物完整性和均一性对1F10、1F4、2F7、4C8、6H4和6G1重新筛选和分级(图10-12)。克隆6G1表达比全长产物显著小的产物且将其丢弃。制备克隆1F10、2F7、6H4和4C8的另外的冷冻瓶。测试克隆4C8用于在滚瓶中生成FVII-AE864。
pBC0016：对于第二轮筛选，将96-孔板中从初级筛选选择的前30个克隆的细胞转移到12-孔板且然后T25，并且通过根据ELISA和凝固测定的滴度、ELISA滴度/细胞计数和凝固滴度/细胞计数的比率分级。对于第三轮筛选，测试15个克隆(包括1D4、1G2、1G6、2C11、2H6、3A2、3B1、3C7、3F2、3H1、3H6、3H10、4G8、5E12、6F11)，根据上述标准和蛋白质印迹进行分级(图13)并且制备所有15个克隆(除3H6之外)的冷冻细胞。选择8个克隆(包括1G2、2C11、3B1、3C7、3F2、3H10、4G8、5E12)作为最好的克隆并且为它们制备另外的冷冻瓶。选择克隆3H10用于在滚瓶中大规模生成。
pBC0018：对于第二轮筛选，首先将96-孔板中从初级筛选选择的前20个克隆的细胞在T25烧瓶中进行扩增且然后接种于24-孔板。从板上收集废培养基用于FVII ELISA且通过Vi-Cell收获和计数细胞。根据通过ELISA和凝固测定的滴度、ELISA滴度/细胞和凝固滴度/细胞计数比率来选择12个克隆且进一步筛选。制备9个克隆2C3、2D5、3B2、3B10、3G2、3G12、5A12、6A3和6E7的冷冻瓶。在9个克隆之中，根据通过ELISA和凝固测定的滴度、ELISA滴度/细胞和凝固滴度/细胞计数的比率以及通过蛋白质印迹测量的产物完整性和均一性对2D5、3B2、3G2、3G12、5A12、6A3和6E7重新筛选和分级(图14)。克隆3B2表达在蛋白质印迹展示多条带的产物且将其丢弃。制备克隆2D5、3G2、3G12、5A12、6A3、6E7的另外的冷冻瓶。克隆3G12和6E7用于在滚瓶中生成FVII-AE288。
在滚瓶中在细胞培养基中分泌的FVII-XTEN的生成
在T175中扩增CHO-K1细胞稳定库或克隆，35ml选择培养基/烧瓶。细胞通过胰蛋白酶消化来收获并且用于在第0天接种于滚瓶(1700cm2表面积/瓶)，对于每个滚瓶为具有来自1-2个T175烧瓶的细胞的300ml选择培养基。在第3天(或第4天)去除废培养基/条件培养基并且重新装入300ml新鲜的选择培养基。在第5天(或第6天)去除废培养基/条件培养基且丢弃(或如果此培养基中的XTEN融合蛋白可被纯化则收获)并且向每个滚瓶中加入300ml过渡培养基(含有1％FBS、0.1％Ex-Cyte、5mg/ml维生素K和1X Pen/Step的UltraCHO)。在第7天(或第8天)去除废培养基且丢弃(或如果如果此培养基中的XTEN融合蛋白可被纯化则收获)并加入表达载体(含有0.1％Ex-Cyte、1％ITS-A、5mg/ml维生素K和1X Pen/Strep的OptiMEM)，300ml/瓶或其它体积，取决于来自最优化的结果。条件培养基可每天收获一次，或每2天或3天或4天收获一次，取决于产物滴度和所需的质量。为了收获，将条件培养基倒入离心瓶中，并且加入新鲜的表达培养基，300ml/瓶或其它体积，取决于来自最优化的结果。收获废培养基和再装入新鲜培养基的生产可持续2-4周，直至认为滴度或/和产物质量太低，这时停止滚瓶。然后在4-8℃在台式离心机中3500rpm将条件培养基离心10min。然后使用0.2mm过滤器过滤上清液。将滤液立即处理或通过切向流过滤处理以用于纯化之前贮存于-80℃冰箱中。
实施例26：FVII-XTEN构建体的纯化和表征
通过切向流过滤和渗滤对FVII-XTEN_AE864浓缩和缓冲液更换
使用Cuno ZetaPlus Biocap过滤器或Cuno BioAssure胶囊式过滤器过滤来自表达FVII-AE864(AC404)的稳定CHO细胞系的上清液批次S279、S281、S282和S287(体积共计10.7L)。然后通过使用具有30,000Da MWCO的Millipore Pellicon 2微型滤芯将滤液浓缩约20倍。使用相同的切向流过滤滤芯用具有5体积缓冲液交换的10mM tris pH 7.5，1mM EDTA渗滤样品。将样品分为50ml等份并且冷冻于-80℃。在来自过滤的渗透部分中没有可检测的FVII活性并且在浓缩的缓冲液交换材料中发现约～75％活性恢复。
通过BaSO 4 吸附纯化FVII-XTEN_AE864
将含有上清液的FVII-AE864(AC404)浓缩且缓冲液交换至10mM tris pH7.5，1mM EDTA。然后，将5ml此样品在PBS中稀释10倍，加入另外的NaCl至50mM，且然后加入BaSO4至20mg/ml。于室温在章动器上使样品结合30分钟。然后使样品以3000rpm离心5分钟以沉淀BaSO4。丢弃上清液并且将沉淀重悬浮于5ml 200mM醋酸钠中且在室温下章动30分钟。将此重复两次以上。洗涤三次后将沉淀重悬浮于0.8ml 100mM枸橼酸钠(pH 7.0)中并且在室温下章动30分钟。将此重复一次。进行Bradford测定以确定样品中的蛋白质总量并且用Innovin作为活化促凝血酶原激酶在基于PT的因子测定中测定FVII活性(表27)。活性与总蛋白的比率证实在该纯化步骤～12倍的净纯化。
表27：通过BaSO4吸附纯化的FVII-AE864的表
Figure BPA00001545838402441
通过Gla亲和色谱纯化FVII-XTEN_AE864
将与FVII的GLA结构域以钙依赖方式结合的单克隆抗体(克隆IDCaFVII-22)偶联到来自Pierce的Ultralink珠子上。通过将含10mg抗体的PBS加入到1.25树脂且用偶联缓冲液(100mM MOPS，700mM枸橼酸钠，pH 8.0)将终体积加至15ml。这生成10ml树脂浆液和1mg∶1ml比率的抗体质量∶珠浆液体积。将浆液在室温孵育2小时且然后将珠子用偶联缓冲液洗涤。BCA测定显示～70％抗体偶联到珠子上。然后在室温下将珠子用1M tris pH 8.0淬灭2小时。将珠子在10mM tris pH 7.5和10mM CaCl2中平衡且5.5ml珠子与10mM tris pH 7.5和～10mM CaCl2中的50ml浓缩的缓冲液交换的FVII-AE864(AC404)上清液。将样品在4℃在章动器上孵育过夜以使FVII-XTEN与树脂结合。第二天将珠子用45ml 10mM tris、500mM NaCl、10mM CaCl2(pH 7.5)洗涤三次并且用20ml 10mM tris、100mM EDTA(pH 7.5)洗脱。SDS-PAGE分析显示纯度超过90％(图15)。
FVII-XTEN_AE864和FVII-XTEN_AE288的活化
通过加入FXa将亲和纯化的FVII-AE864(AC404)和FVII-AE288(AC398)活化为FVIIa-AE864和FVIIa-AE288。通过在Amicon ultra 10,000Da MWCO浓缩器中进行几轮重复浓缩和随后稀释使FVII-XTEN蛋白缓冲液交换到10mM Tris、10mM CaCl2(pH7.5)中。终体积为1ml，～0.4mg/ml。加入来自Novagen的FXa以使终浓度为10单位/ml并且将样品在4℃孵育过夜。与表现为丧失来自分子的轻链(仅在活化后可能发生)的非还原样品相比，还原SDS-PAGE显示通过在具有DTT的顶端带中向下迁移FVII-XTEN蛋白完全转化为FVIIa-XTEN蛋白(图16)。另外，可以看到轻链在凝胶的较低位置显现并且与对照FVIIa的轻链运行在相同的位置，这进一步证实FVII结构域从FVII转移到FVIIa。在相似的缓冲条件下，通过加入凝血酶、FIXa、FXIIa或任何其它能够选择性切除R152和I153之间的肽键的蛋白酶使FVII-XTEN融合物活化为FVIIa-XTEN。
FVII-XTEN_AE864和FVII-XTEN_AE288的自动活化
通过将样品在4℃孵育1周使亲和纯化的FVII-AE864(AC404)和FVII-AE288(AC398)活化为FVIIa-AE864和FVIIa-AE288。通过在Amicon ultra10,000Da MWCO浓缩器中进行几轮重复浓缩和随后稀释使FVII-XTEN蛋白缓冲液交换至10mM Tris、10mM CaCl2(pH7.5)。孵育后通过SDS-PAGE测定蛋白质并且与表现为丧失来自分子的轻链(仅在活化后可能发生)的非还原样品相比，顶端带显示具有DTT的顶端带特征性向下迁移(图17)。另外，可以看到轻链在凝胶的较低位置显现，与两组FXa活化材料在相同的位点，这进一步证实了蛋白质自动活化为FVIIa-XTEN的结论。
通过阴离子交换色谱纯化FVII-XTEN_AE864
将含有上清液的FVII-AE864(AC404)的样品浓缩且缓冲液交换到10mMtris pH 7.5、1mM EDTA中且然后加入1M CaCl2调节至终浓度～5mM CaCl2。将样品加载到2ml macrocap Q柱在Akta色谱系统中平衡。用超过20柱体积0-100％线性梯度的缓冲液B洗脱蛋白质。缓冲液A包含20mM MES、5mMCaCl2pH 6.0，并且缓冲液B包含20mM MES、5mM CaCl2 pH 6.0和500mMNaCl。使用以Innovin作为活化促凝血酶原激酶的基于PT的因子测定测定组分的FVII活性。在47.9至52.4ml或23.2至27.8mS/cm洗脱时看到活性单峰(表19)。进行Bradford测定以确定加载和洗脱级分中蛋白质的总量。活性与总蛋白质的比率表明来自柱的～5倍净纯化。
通过疏水作用色谱纯化FVII-XTEN_AE864
将含有上清液的FVII-AE864(AC404)的样品浓缩且缓冲液交换到10mMtris pH 7.5、1mM EDTA中且然后加入1M CaCl2调节至终浓度～5mM CaCl2。将样品加载到2ml toyopearl phenyl柱在Akta色谱系统中平衡。用超过20柱体积0-100％线性梯度的缓冲液B洗脱蛋白质。缓冲液A包含10mM Tris、5mM CaCl2、3M NaCl(pH 7.5)，并且缓冲液B包含10mM Tris、5mM CaCl2(pH7.5)。使用以Innovin作为活化促凝血酶原激酶的基于PT的因子测定测定组分的FVII活性。在1M至2M NaCl洗脱时看到活性单峰(表20)。进行Bradford测定以确定加载和洗脱级分中蛋白质的总量。活性与总蛋白质的比率表明来自柱的～5倍净纯化。
用阴离子交换色谱去除单体FVII-AE864中的聚集蛋白
通过以1ml缓冲液∶10ml样品的比率加入200mM MES、210mM CaCl2pH 6.0将加载的亲和纯化的FVII-AE864(AC404)调节至pH 6.0。使用2mlmacrocap Q柱使用Akta FPLC系统纯化样品。将柱在缓冲液A(20mM MES，1mM CaCl2，pH 6.0)中平衡且加载样品。使用超过20柱体积30％至80％线性梯度的缓冲液B(20mM MES，1mM CaCl2，pH 6.0+500mM NaCl)洗脱样品。215nm色谱显示在洗脱图谱中有两个峰(图21A)。汇集对应于前峰和后峰的组分且通过体积排除色谱法(SEC)用60cm BioSep G4000柱分析。前峰含有具有单体AE864蛋白的特征性流体力学半径(10.1nm或表观MW为1.9MDa)的单分散群(图21B)。后峰含有两个群，较小的单体峰证实了前峰中不存在聚集物。并且在柱空隙体积(22ml)中的较早洗脱的较大峰具有聚集蛋白的特征。
FVII-AE864和FVII-AE288的SEC分析
通过亲和色谱法和阴离子交换色谱法纯化FVII-AE864(AC404)和FVII-AE288(AC398)且表征。用60cm BioSep G4000柱的体积排除色谱法显示了具有单体AE864蛋白(10.1nm或对于15.2的表观分子量因子，表观MW为1.9MDa)或单体AE288蛋白(8.2nm或对于9.0的表观分子量因子，表观MW为650kDa)的特征性流体力学半径的单分散群(图18)。在每个样品中看到最小聚集。SDS-PAGE显示＞90％纯度蛋白质，具有最小宿主细胞蛋白污染。
脂质化组织因子引发的FVII-AE864和FVII-AE288的凝固活性分析
通过基于PT的因子VII测定如以下测定活性：通过用FVII缺乏的血浆将正常血浆稀释10倍和然后用因子VII缺乏的血浆再进行4次5倍连续稀释来制成标准曲线。由此产生在100、20、4、0.8和0.16mUnits/ml活性处具有点的标准曲线，其中一个单位的活性定义为1ml正常人血浆中的FVII活性的量。还包括FVII缺乏的血浆以确定在空白血浆中活性的本底水平。通过以1∶10的体积比加入FVII-XTEN∶FVII缺乏的血浆来制备样品。将样品在分子装置酶标仪分光光度计中在37℃下孵育3分钟，在此时加入2体积促凝血酶原激酶(Dade Innovin，B4212-50)/1体积样品来引发凝固反应。在450nm监测浊度5分钟以产生反应图谱。将PT时间、凝固活性开始的时间定义为第一时间，其中在OD405nm比整个基线提高了0.06。产生log-线性标准曲线，其中log活性与PT时间线性相关。由此确定板孔中的样品的活性且然后通过乘以11以说明在缺乏FVII的血浆中的稀释来确定样品的活性。基于一式四份的测量，FVII-AE864(AC404)融合物的活性为30Units/ml且FVII-AE288(AC398)为15U/ml。另外，凝固的脂化组织因子活化用于在凝固测定以及更精确读数的测定如凝血酶生成测定、TEG测定、rotem测定及其它包括通过底物转化、机械凝固形成或光学照相凝固检测来检测凝血酶功能的体外/离体测定中测定FVII-XTEN融合物的活性。
可溶性组织因子引发的FVII-AE864和FVII-AE288的凝固活性分析
在FVII-AE288(AC398)活化为FVIIa-AE288后，通过可溶性组织因子(sTF)诱导的凝固测量活性。该测定使用Stago STA-Clot FVIIa活性测定试剂盒进行。简言之，用结合和提高FVIIa活性但不将FVII转化为FVIIa的sTF孵育样品，将在无FVII的血浆中诱导凝固的时间定义为第一时间，其中当用分子装置酶标仪监测时在OD405nm在整个基线提高了0.06。将该时间与含有加入到无FVII血浆的已知量的FVIIa的标准曲线比较，并且计算活性数。FVIIa-AE288样品含有相当于112U/ml FVIIa活性的活性。另外，凝固的可溶性组织因子活化用于在凝固测定以及更精确读数的测定如凝血酶生成测定、TEG测定、rotem测定及其它包括通过底物转化、机械凝固形成或光学照相凝固检测来检测凝血酶功能的体外/离体测定中测定FVII-XTEN融合物的活性。
基于ELISA的FVII-AE864和FVII-AE288的浓度测定
使用ELISA测定用亲和纯化的多克隆羊抗人FVII抗体测定FVII-XTEN融合物浓度，其中未修饰形式的抗体用于捕获蛋白质并且HRP偶联形式用于检测蛋白质。将捕获抗体涂布在高度结合96孔测定板(Corning 3690)上在4℃过夜。在室温下用3％PBS中的BSA封闭板1小时。用洗板机在PBST中洗涤板6次。然后使在PBST稀释过的样品或标准物在室温下结合到合适的孔中2小时。标准曲线的范围是10ng/ml至＜1pg/ml并且通过连续稀释在PBST中已知浓度的源自商购血浆的FVII(Abcam Cat#ab62386)来制成。使用洗板机用PBST再洗涤板6次。然后使用在37℃结合1小时的检测抗体来检测FVII-XTEN。使用洗板机用PBST再洗涤板6次并且另外用水洗涤一次。然后用TMB底物形成信号并且通过在分子装置酶标仪分光光度计上在405nm读数来定量。然后对标准物进行四参数拟合并且通过与标准曲线比较来确定样品的浓度。
通过荧光底物的直接转化来评价FVII-AE864和FVII-AE288活性
通过监测底物D-FPR-6-氨基-1-萘磺酰胺(D-FPR-ANSN)中的肽键的裂解来测定FVII-XTEN融合物活性，其中DFPR部分是与ANSH部分的仲胺连接的肽链。当精氨酸残基和ANSH部分之间的键被FVII催化结构域的丝氨酸蛋白酶活性裂解时，ANSH释放并且变成强荧光团。在20mM tris pH 8.0、135mM NaCl中酶浓度范围为50pM至1μM并且底物浓度范围为50μM至100μM时测量FVII-XTEN活性。通过监测随着时间推移ANSN荧光(激发352nm，发射470nm)的变化可以确定FVIIa酶结构域的活性。此活性可以与源自FVIIa的标准曲线比较以确定样品中FVIIa等价物的量，或可确定动力学性质例如kcat和Km。
通过FXa偶联的显色底物测定评价FVII-AE864和FVII-AE288活性
当在磷脂和钙存在下与组织因子(TF)复合时，FVII和FVII-XTEN使因子X活化为因子Xa。Biophen因子VII是用于测试因子VII活性的显色测定。因子VII与兔促凝血酶原激酶提供的组织因子形成酶复合体。它然后将因子X(在测定中以恒定浓度存在并且过量)活化为因子Xa。通过fFXa对特异性因子Xa显色底物(SXa-11)的活性精确测量f FXa的浓度。因子Xa裂解底物且生成pNA。生成的pNA的量直接与因子Xa活性成比例。最终，通过释放的pNA的量的测量，通过在405nm下显色测定，测定样品中因子VII活性的量与生成的因子Xa活性之间存在直接关系。通过比较来自未知样品的信号与来自已知FVII活性的标准曲线的信号，可能计算出未知样品中FVII活性的量。
实施例27：用于FIX-XTEN浓度测定的ELISA测定
使用ELISA测定用特异性配对的抗体对测定FIX-XTEN浓度，其中检测抗体与HRP以简化检测(Affinity Biologicals cat#FIX-EIA)。将捕获抗体涂布于高度结合96孔测定板(Corning 3690)上在4℃过夜。在室温下用3％PBS中的BSA封闭板。用洗板机在PBST中洗涤板6次。然后使在PBST稀释的样品或标准物在室温下结合到合适的孔中2小时。标准曲线的范围是25ng/ml至＜1pg/ml并且通过连续稀释在PBST中已知浓度的源自商购血浆的FIX(Abcam Cat#ab62544)来制成。使用洗板机用PBST再洗涤板6次。然后使用在37℃结合1小时的检测抗体来检测FIX。使用洗板机用PBST再洗涤板6次并且另外用水洗涤一次。然后用TMB底物形成信号并且通过在分子装置酶标仪分光光度计上在405nm读数来定量。然后对标准物进行四参数拟合并且通过与标准曲线比较来确定样品的浓度。
实施例28：用于FIX-XTEN活性测定的基于aPTT的分析
在内源性或接触活化的凝血途径中FIX-XTEN将取代FIX而起作用。使用活化部分促凝血酶原激酶时间测定(aPTT)评价此凝血途径的活性。特别如下测量FIX活性，通过用FIX缺乏的血浆(cat#100900)将标准对照血浆(PacificHemostasis cat# 100595)稀释两倍且然后再用因子IX缺乏的血浆进行6次4倍连续稀释来制成标准曲线。由此产生在500、130、31、7.8、2.0、0.5和0.1mUnit/ml活性处具有点的标准曲线，其中一个单位活性定义为1ml正常人血浆中的FIX活性的量。还包括FIX缺乏的血浆以确定在空白血浆中活性的本底水平。通过以1∶10的体积比加入FIX-XTEN∶FIX缺乏的血浆来制备样品。使用如下所述的aPTT测定来测试样品。将样品在分子装置酶标仪分光光度计中在37℃下孵育2分钟，在此时加入等体积的aPTT试剂(Pacific Hemostasiscat# 100402)并且在37℃下另外孵育3分钟。孵育后通过加入1体积氯化钙(Pacific Hemostasis cat# 100304)活化测定。在450nm监测浊度5分钟以产生反应图谱。将aPTT时间、凝固活性开始的时间定义为第一时间，其中在OD405nm比基线提高了0.06。产生log-线性标准曲线，其中log活性与aPTT时间线性相关。由此确定板孔中的样品的活性且然后通过乘以11以说明在FIX缺乏的血浆中的稀释来确定样品的活性。
实施例29：FIX/cFXI/XTEN与FIX-XTEN相比具有提高的活性
使FIX(pCW0596)、FIX-XTEN(pCW0597)、FIX/cFXI1/XTEN(pCW0735)、FIX/cFXI2/XTEN(pCW0736)和FIX/cFXI3/XTEN(pCW0737)在CHO-K1细胞中瞬时表达。使瞬时转染上清液在30,000MWCO浓缩器中浓缩约15倍。通过ELISA确定浓缩的和未浓缩的样品的浓度。使用基于aPTT的因子测定确定浓缩样品的凝固活性。由于存在FXIc裂解位点，含有活性的XTEN显著地改变。在所有三种情况下FXI裂解位点的存在使凝固活性提高30倍以上(参见图22和表28)。相对一致的ELISA测量表明这是特异性活性的提高，而非滴度的改变。另外，FXI裂解位点构建体的活性测量与ELISA浓度的比率目前与FIX的比率类似，表明FIX-FXIc-XTEN含有具有与在不存在XTEN时表达的FIX结构域相似的性质的FIX结构域。
表28：FIX/cFXI/XTEN构建体的活性
Figure BPA00001545838402511
实施例30：大鼠-FVII-XTEN_AE864中CFXTEN融合多肽的药物动力学分析
在Sprague-Dawley中测试CFXTEN FVII-XTEN_AE864与单独的FVII相比的药物动力学。以3μg/大鼠将FVII-XTEN_AE864和FVII通过颈静脉导管IV施用给雌性Sprague-Dawley大鼠(n＝3)。在预剂量、0.08、0.5、1、2、4、8、24、48、72小时时间点采集血样(0.2mL)到预冷的肝素化管中，并处理血浆。通过使用用于捕获和检测的抗FVII抗体的ELISA测定来进行测试品的定量。在所有时间点均包括在拟合中的WinNonLin中进行非房室模型分析以测定PK参数。
药物动力学结果总结于表29和图23。数据显示与单独的FVII相比，XTEN可以极大地延长作为CFXTEN融合蛋白的FVII的半衰期；与FVII的1小时相比，FVII-XTEN具有大约38小时的半衰期。另外，大鼠中FVII-XTEN限制在血流内，其中经计算体积分布为50.8mL，表明少量溢出到细胞外间隙。
表29：大鼠中FVII测试品的半衰期
  测试品(构建体)   T1/2(小时)
  FVII-XTEN(AP315)   37.9
  FVII(P318)   1.0
实施例31：大鼠-FIX-XTEN_AE864中CF XTEN融合多肽的药物动力学分析
在Sprague-Dawley大鼠(n＝3)中测试macrocap Q纯化的FIX-XTEN_AE864的药物动力学并与未纯化的FIX-XTEN、裂解的FIX-XTENTEV(通过使用TEV蛋白酶从融合蛋白中除去XTEN的制品)和商购的FIXBenefix比较。以3μg/大鼠通过颈静脉导管将化合物IV施用给雌性Sprague-Dawley大鼠。在预剂量、0.08、0.5、1、2、4、8、24、48、72小时时间点采集血样(0.2mL)到预冷的肝素化管中，并处理血浆。通过使用用于捕获和检测的抗FIX抗体的ELISA测定来进行测试品的定量。在所有时间点均包括在拟合中的WinNonLin中进行非房室模型分析以测定PK参数。
药物动力学结果总结于表30和图24。数据显示与FIX-XTEN TEV裂解的或FIX Benefix相比，XTEN可以大大地延长作为CFXTEN融合蛋白的FIX的半衰期；与FIX Benefix的4.6小时相比，FIX-XTEN具有34.7小时的半衰期。另外，大鼠中FIX-XTEN限制在血流内，其中经计算体积分布为38mL，表明少量溢出到细胞外间隙。
表30：大鼠中FIX测试品的半衰期
  测试品(构建体)   T1/2(小时)
  FIX-XTEN macro cap Q   34.7
  (AP316a)
  FIX-XTEN(AP316)   33.1
  FIX-XTEN TEV(AP316b)   1.5
  FIX Benefix   3.3
实施例32：FVIIa-XTEN_AE864在动物模型中的药效学评价
使用各种出血的临床前期模型来评价FVIIa-XTEN构建体的体内药理学活性，这些出血包括但不限于血友症、手术、外伤、血小板减少症/血小板机能失调、氯吡格雷/肝素诱导的出血和流体动力注射。可以使用相当于其它FVIIa方法所使用和公布的那些方法在包括小鼠、大鼠、兔和狗的多种物种中开发这些模型。以与体内施用相容的水性缓冲液(例如：磷酸盐缓冲盐水或Tris-缓冲盐水)来提供FVIIa-XTEN组合物。如对特定模型所优化的那样，以适当的剂量、施用频率、施用时间表和施用途径来施用组合物。效果测定包括FVIIa活性、前凝血酶时间(PT)、活化部分凝固活酶时间(aPTT)、出血时间、全血凝固时间(WBCT)、血栓弹性描记图(TEG或ROTEM)等的测量。
在PD模型的一个实例中，将FVIIa-XTEN和FVII施用给遗传缺陷的或实验诱导的HemA或HemB小鼠。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FVIIa和FVIIa-XTEN的水平，通过商购的FVIIa活性试剂盒测量FVIIa和FVIIa-XTEN的活性并通过PT测定来测量克隆时间。总的来说，结果可表明与FVIIa相比，FVIIa-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FVIIa等同。
在小鼠出血激发PD模型中，将FVIIa-XTEN和FVIIa施用给遗传缺陷的或实验诱导的HemA或HemB小鼠，并测量对止血激发的效果。止血激发可包括尾处理(tail transaction)激发、关节积血(hemarthropthy)激发、关节出血或隐静脉激发等。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FVII和FVIIa-XTEN的水平，通过商购的FVIIa活性试剂盒测量FVII和FVIIa-XTEN的活性，通过PT测定来测量出血时间和测量凝固时间。总的来说，结果可表明与FVIIa相比，VIIa-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FVIIa等同。
在狗PD模型中，将FVIIa-XTEN和FVII施用给遗传缺陷的患血友病的狗。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FVIIa和FVIIa-XTEN的水平，通过商购的FVIIa活性试剂盒测量FVIIa和FVIIa-XTEN的活性并通过PT测定来测量凝固时间。总的来说，结果可表明与FVIIa相比，FVIIa-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FVIIa等同。
在狗出血激发PD模型中，将FVIIa-XTEN和FVIIa施用给遗传缺陷的患血友病的狗，并测量对止血激发的效果。止血激发可包括表皮出血时间等。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FVII和FVIIa-XTEN的水平，通过商购的FVIIa活性试剂盒测量FVII和FVIIa-XTEN的活性，通过PT测定来测量出血时间和测量凝固时间。总的来说，结果可表明与FVIIa相比，FVIIa-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FVIIa等同。
另外的出血临床前期模型包括但不限于血友症、手术、外伤、血小板减少症/血小板机能失调、氯吡格雷/肝素诱导的出血和流体动力注射。可使用相当于其它FVIIa方法所使用和公布的那些方法在包括小鼠、大鼠、兔和狗的许多物种中开发这些模型。总的来说，结果可表明与FVIIa相比，FVIIa-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FVIIa等同。
实施例33：FIX-XTEN_AE864在动物模型中的药效学评价
使用各种出血的临床前期模型来评价FIX-XTEN构建体的体内药理学活性，这些出血包括但不限于血友症、手术、外伤、血小板减少症/血小板机能失调、氯吡格雷/肝素诱导的出血和流体动力注射。可以使用相当于其它FVIIa方法所使用和公布的那些方法在包括小鼠、大鼠、兔和狗的许多物种中开发这些模型。以与体内施用相容的水性缓冲液(例如：磷酸盐缓冲盐水或Tris-缓冲盐水)来提供FIX-XTEN组合物。如对特定模型所优化的那样，以适当的剂量、施用频率、施用时间表和施用途径来施用组合物。效果读出包括FIX活性、PT、aPTT、出血时间、全血凝固时间(WBCT)、血栓弹性描记图(TEG或ROTEM)等的测量。
在PD模型的一个实例中，将FIX-XTEN和FIX施用给遗传缺陷的或实验诱导的HemA或HemB小鼠。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FIX和FIX-XTEN的水平，通过商购的FIX活性试剂盒测量FIX和FIX-XTEN的活性并通过aPTT测定来测量凝固时间。总的来说，结果可表明与FIX相比，FIX-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FIX等同。
在小鼠出血激发PD模型中，将FIX-XTEN和FIX施用给遗传缺陷的或实验诱导的HemA或HemB小鼠，并测量对止血激发的效果。止血激发可包括尾处理激发、关节积血激发、关节出血或隐静脉激发等。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FIX和FIX-XTEN的水平，通过商购的FIX活性试剂盒测量FIX和FIX-XTEN的活性，通过aPTT测定来测量出血时间和测量凝固时间。总的来说，结果可表明与FIX相比，FIX-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FIX等同。
在狗PD模型中，将FIX-XTEN和FIX施用给遗传缺陷的患血友病的狗。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FIX和FIX-XTEN的水平，通过商购的FIX活性试剂盒测量FIX和FIX-XTEN的活性并通过aPTT测定来测量凝固时间。总的来说，结果可表明与FIX相比，FIX-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FIX等同。
在狗出血激发PD模型中，将FIXa-XTEN和FIX施用给遗传缺陷的患血友病的狗，并测量对止血激发的效果。止血激发可包括表皮出血时间等分析。在施用后的各时间点，通过ELISA测量FIX和FIX-XTEN的水平，通过商购的FIX活性试剂盒测量FIX和FIX-XTEN的活性，通过aPTT测定来测量出血时间和测量凝固时间。总的来说，结果可表明与FIX相比，FIX-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FIX等同。
另外的出血临床前期模型包括但不限于血友症、手术、外伤、血小板减少症/血小板机能失调、氯吡格雷/肝素诱导的出血和流体动力注射。可使用相当于其它FIX方法所使用和公布的那些方法在包括小鼠、大鼠、兔和狗的许多物种中开发这些模型。总的来说，结果可表明与FIX相比，FIX-XTEN构建体可更有效地抑制出血，和/或在较小频率或更适当的施用间隔的情况下效能与相当剂量的FIX等同。
实施例34：具有裂解序列的CFXTEN
由FXIa可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点裂解序列可并入含有被FXIa蛋白酶(EC 3.4.21.27，Uniprot P03951)所识别和裂解的氨基酸序列的FIX-XTEN中。具体地，氨基酸序列KLTRAET在序列的精氨酸后面被FXIa蛋白酶切割。FXI是在内源性或接触活化的凝血途径中在FIX之前即刻定位的前凝血蛋白酶。活性FXIa通过FXIIa引起的蛋白水解性裂解酶原由FXI产生。一旦活化，其在凝血中的天然作用是通过在FIX的R191和R226位置切割该蛋白而从酶原切除肽来活化FIX，然后其开启凝血途径。FXIa的产生受到严格控制，并且仅当凝血对适当止血来说需要时才发生。因此，通过并入KLTRAET裂解序列，XTEN结构域将只有在与内源性凝血途径活化的同时和当生理上需要凝固时才被从FIX除去。这就产生了FIX-XTEN融合蛋白在内源性途径活化的过程中以另外的一种方式来进行的情况。除了通过FXIa在FIX结构域的R191和R226处发生的天然裂解之外，在XTEN释放位点还将发生第三裂解，其将从XTEN蛋白中解耦刚活化的FIXa。在本发明组合物的期望特征中，这产生了FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化(此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的游离FIXa)的情况。
由FXIIa可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，XTEN释放位点序列可包含被FXIIa蛋白酶(EC 3.4.21.38，Uniprot P00748)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列TMTRIVGG在序列位置4处的精氨酸后面被切割。FXII是在内源性或接触活化的凝血途径中在FIX之前定位的前凝血蛋白酶。活性FXIIa通过与非自身表面接触并通过由激肽释放酶的裂解从FXII产生。一旦活化，其在凝固中的天然作用是通过酶原的蛋白水解性裂解而活化FXI(图3)，然后其反过来开启凝血途径。FXIIa的产生受到严格控制，并且只有当凝固对适当止血来说需要时才发生。因此，通过并入TMTRIVGG裂解序列，XTEN结构域将只有在与内源性凝血途径活化的同时和当生理上需要凝固时才被从FIX除去。这就产生了FIX-XTEN融合在内源性途径活化的过程中以另外的一种方式来进行的情况。除了通过FXIa在FIX结构域的R191和R226处发生的天然裂解之外，在XTEN释放位点还将发生第三裂解，其将从XTEN蛋白中解耦刚活化的FIXa。在本发明组合物的期望特征中，这产生了FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化(此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的游离FIXa)的情况。
由激肽释放酶可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，XTEN释放位点序列可包含被激肽释放酶蛋白酶(EC 3.4.21.34，Uniprot P03952)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列SPFRVVG在序列位置4处的精氨酸后面被切割[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]。激肽释放酶是在内源性或接触活化的凝血途径中在FIX之前定位的前凝血蛋白酶。活性激肽释放酶通过与非自身表面的接融由血浆激肽释放酶产生。一旦活化，其在凝固中的天然作用是通过酶原的蛋白水解性裂解来活化FXII(图3)，其然后反过来开启凝血途径。激肽释放酶的产生受到严格控制，并且只有当凝固对适当止血来说需要时才发生。因此，通过并入SPFRVVGG裂解序列，XTEN结构域将只有在与内源性凝血途径活化的同时和当生理上需要凝固时才被从FIX除去。这就产生了FIX-XTEN融合在内源性途径活化的过程中以另外的一种方式来进行的情况。除了通过FXIa在FIX结构域的R191和R226处发生的天然裂解之外，在XTEN释放位点还将发生第三裂解，其将从XTEN蛋白中解耦刚活化的FIXa。在本发明组合物的期望特征中，这产生了FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化(此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的游离FIXa)的情况。
由FVIIa可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点序列包括被FVIIa蛋白酶(EC 3.4.21.21，Uniprot P08709)所识别和裂解的氨基酸序列[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]。具体地，序列LQVRIVGG在序列位置4处的精氨酸后面被切割。FVIIa是在外源性或细胞损伤活化的凝血途径中在FIX之前定位的前凝血蛋白酶。活性FVIIa在通过结合到组织因子、磷脂和钙的辅助的自身催化过程中由FVII产生。一旦活化，其在凝固中的天然作用是通过酶原的蛋白水解性裂解而活化FIX和FX(图3)，其然后反过来开启凝血途径。FVIIa活性受到严格控制，并且只有当凝固对适当止血来说需要时才发生。因此，通过并入LQVRIVGG裂解序列，XTEN结构域将只有在与内源性凝血途径活化的同时和当生理上需要凝固时才被从FIX除去。这就产生了FIX-XTEN融合在内源性途径活化的过程中以另外的一种方式来进行的情况。除了通过FVIIa在FIX结构域的R191和R226处发生的天然裂解之外，在XTEN释放位点还将发生第三裂解，其将从XTEN蛋白中解耦刚活化的FIXa。在本发明组合物的期望特征中，这产生了FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化(此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的游离FIXa)的情况。
由FIXa可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点裂解序列包括被FIXa蛋白酶(EC 3.4.21.22，Uniprot P00740)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列PLGRIVGG[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在序列位置4处的精氨酸后面被切割。通过在磷脂和钙存在下由FXIa或FVIIa裂解FIX来产生活化的FIXa。一旦活化，其在凝固中的天然作用是通过酶原的蛋白水解性裂解来活化FX(图3)，其然后反过来开启凝血途径。FIXa活性受到严格控制，并且只有当凝固对适当止血来说需要时才发生。因此，通过并入PLGRIVGG序列，XTEN结构域将只有在与外源性或内源性凝血途径活化的同时和当生理上需要凝固时才被从FIX除去。这就产生了FIX-XTEN融合在内源性途径活化的过程中以另外的一种方式来进行的情况。除了在FIX结构域R191和R226处通过FVIIa或FXIa而发生的天然裂解之外，在XTEN释放位点还将发生第三裂解，其将从XTEN蛋白中解耦刚活化的FIXa。在本发明组合物的期望特征中，这产生了FIX-XTEN将作为前药而完整保留直至凝血活化(此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的游离FIXa)的情况。
由FXa可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点包括被FXa蛋白酶(EC3.4.21.6，Uniprot P00742)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列IEGRTVGG[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在序列位置4处的精氨酸后面被切割。活性FXa通过在磷脂和钙的存在下由FIXa裂解FX来产生，并且是凝血途径中自因子IX紧接的下游步骤。一旦活化，其在凝固中的天然作用是通过酶原的蛋白水解性裂解来活化FII(图3)，其然后反过来开启凝血途径。FXa活性受到严格控制，并且只有当凝固对适当止血来说需要时才发生。因此，通过并入IEGRTVGG序列，XTEN结构域将只有在与外源性或内源性凝血途径活化的同时和当生理上需要凝固时才被从FIX除去。这就产生了FIX-XTEN融合在凝血活化过程中以另外的一种方式来进行的情况。除了通过FXIa在FIX结构域的R191和R226处发生的天然裂解之外，在XTEN释放位点还将发生第三裂解，其将从XTEN蛋白中解耦刚活化的FIXa。在本发明组合物的期望特征中，这产生了FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化(此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的游离FIXa)的情况。
由FIIa(凝血酶)可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点包括被FIIa蛋白酶(EC3.4.21.5，Uniprot P00734)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列LTPRSLLV[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在序列位置4处的精氨酸后面被切割。活性FIIa通过在磷脂和钙的存在下由FXa裂解FII来产生，并且是凝血途径中因子IX的下游。一旦活化，其在凝固中的天然作用是裂解纤维蛋白原(fibrinogin)(图3)，其然后反过来开始凝固的形成。FIIa活性受到严格控制，并且只有当凝固对适当止血来说需要时才发生。因此，通过并入LTPRSLLV序列，XTEN结构域将只有在与外源性或内源性凝血途径活化的同时和当生理上需要凝固时才被从FIX除去。这就产生了FIX-XTEN融合在凝血活化过程中以另外的一种方式来进行的情况。除了通过FVIIa或FXIa在FIX结构域的R191和R226处发生的天然裂解之外，在XTEN释放位点还将发生第三裂解，其将从XTEN蛋白中解耦刚活化的FIXa。在本发明组合物的期望特征中，这产生了FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化(此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的游离FIXa)的情况。
由弹性蛋白酶-2可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点包括被弹性蛋白酶-2(EC3.4.21.37，Uniprot P08246)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列LGPVSGVP[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在序列中位置4处的后面被切割。弹性蛋白酶由中性粒细胞组成性表达，并在循环中的所有时间存在。其活性受到丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)的严格控制，并因此多数时间具有最小化活性。因此，随着长寿命的FIX-XTEN循环，其部分被裂解，产生用于凝固的较短寿命的FIX的库(pool)。在本发明组合物的期望特征中，这产生稳定释放预防量的FIX的循环前药贮库。
由MMP-12可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点包括被MMP-12蛋白酶(EC3.4.24.65，Uniprot P39900)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列GPAGLGGA[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在序列的位置4后面被切割。MMP-12在全血中组成性表达。因此，随着长寿命的FIX-XTEN循环，其部分被裂解，产生用于凝固的较短寿命的FIX的库。在本发明组合物的期望特征中，这产生稳定释放预防量的FIX的循环前药贮库。
由MMP-13可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点包括被MMP-13蛋白酶(EC3.4.24.-，Uniprot P45452)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列GPAGLRGA[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在位置4的后面被切割。MMP-13在全血中组成性表达。因此，随着长寿命的FIX-XTEN循环，其部分被裂解，产生用于凝固的较短寿命的FIX的库。在本发明组合物的期望特征中，这产生稳定释放预防量的FIX的循环前药贮库。
由MMP-17可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点包括被MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-，Uniprot Q9ULZ9)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列APLGLRLR[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在序列位置4的后面被切割。MMP-17在全血中组成性表达。因此，随着长寿命的FIX-XTEN循环，其部分被裂解，产生用于凝固的较短寿命的FIX的库。在本发明组合物的期望特征中，这产生稳定释放预防量的FIX的循环前药贮库。
由MMP-20可释放的C-末端XTEN
如图2F所示，可产生由融合到FIXC末端的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白，具有置于FIX和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列。示例性序列提供于表42中。在这种情况中，释放位点包括被MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-，Uniprot O 60882)所识别和裂解的氨基酸序列。具体地，序列PALPLVAQ[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.，36：D320]在位置4(由箭头所示)的后面被切割。MMP-20在全血中组成性表达。因此，随着长寿命的FIX-XTEN循环，其部分被裂解，产生用于凝固的较短寿命的FIX的库。在本发明组合物的期望特征中，这产生稳定释放预防量的FIX的循环前药贮库。
C-末端XTEN的释放速率的优化
可以产生其中C-末端XTEN的释放速率被改变的上述实施例的变体。由于XTEN通过XTEN释放蛋白酶的释放的速率依赖于XTEN释放位点的序列，所以通过改变在XTEN释放位点的氨基酸序列可以控制XTEN释放的速率。许多蛋白酶的序列特异性是本领域所熟知的，并记载于若干数据库中。在这种情况中，使用底物的组合文库[Harris，J.L.等人(2000)Proc Natl AcadSci U S A，97：7754]或通过如[Schellenberger，V.等人(1993)Biochemistry，32：4344]中所示在裂解底物混合物后来绘制蛋白酶的氨基酸特异性图谱。一种选择是通过噬菌体展示来鉴定最佳的蛋白酶裂解序列[Matthews，D.等人(1993)Science，260：1113]。用变体序列产生构建体并使用用于检测XTEN多肽的标准测定来测定XTEN释放。
实施例35：XTEN内部与CF序列的整合
进入KNSADK环的内部XTEN融合
如图2F所示，可以产生由插入FIX环的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白。具体地，作为融合物将XTEN序列插入到EGF2结构域(残基146-152)的KNSADNK环，其没有已知的血友病B突变，并且在FIX晶体结构中不是高度构建的。在这种情况中，通过在环序列的SA键处分开天然序列并将XTEN序列融合到间隙来进行插入。这将产生环序列KNS-XTEN-ADNK。在本发明组合物的期望特征中，这产生FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化((此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的FIXa-XTEN)的情况。
进入LAEN环的内部XTEN融合
如图2F所示，可以产生由插入FIX环的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白。具体地，作为融合物将XTEN序列插入到EGF2结构域(残基163-166)的LAEN环，其没有已知的血友病B突变，并且在FIX晶体结构中不是高度构建的。在这种情况中，通过在序列的AE键处分开天然序列并将XTEN序列融合到间隙来进行插入。这将产生环序列LA-XTEN-EN。在本发明组合物的期望特征中，这产生FIX-XTEN将作为前药完整保留直至凝血活化((此时处理分子以在需要其的受试者中产生重构或增强凝固功能的FIXa-XTEN)的情况。
进入活化肽的内部XTEN融合
如图2D所示，可产生由插入FIX环的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白。具体地，将XTEN融合物置于活化肽(残基192-226)，从而使两个天然的FXIa裂解位点没有一个被破坏。通过在序列的T209-I210键处分开原序列，并将XTEN序列融合到间隔来进行插入。这产生在残基188处开始的KLTRAETVFPDVDYVNSTEAET-XTEN-ILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE的序列。FXI是在内源性或接触活化的凝血途径中在FIX之前即刻定位的前凝血蛋白酶。活性FXIa通过FXIIa蛋白水解性裂解酶原由FXI产生。一旦活化，其在凝固中的天然作用是通过在位置R191和R226处切割蛋白而从FIX酶原切除活化肽来激活FIX(图4)。这些切割位点由箭头所示，并且将序列设计为保持P4-P4’位点不变，从而允许在凝固级联反应过程中的天然裂解活性。因此，只有在内源性凝血途径内才将XTEN结构域从FIX除去作为正常活化过程的一部分。
FIX EGF结构域之间的内部XTEN融合
如图2C所示，可产生由插入FIX环的XTEN蛋白组成的FIX-XTEN融合蛋白。具体地，将XTEN融合置于FIX的两个EGF样结构域之间(残基129和130之间的连结点)。通过在E129-L130键处分开天然序列并将XTEN序列融合到间隔来进行插入。这将产生在残基121处开始的FGFEGKNCE-XTEN-LDVTCNIKNGR的序列。实际上，这产生了FIX-XTEN将循环完整直至凝血活化(此时处理分子以产生重构或增加个体内凝固功能的FIXa-XTEN)的情况。
实施例36：用于评价包括FVIIa的CFXTEN的人临床试验设计
NovoSeven
Figure BPA00001545838402641
是重组的人凝血因子VIIa(rFVIIa)，其用来通过活化凝血级联反应的外源性途径来促进止血。由于其半衰期短，每2小时至每6小时静脉内施用NovoSeven直至实现止血。XTEN与FVII的融合改善蛋白质的半衰期，因此，能够降低使用这种含FVII的融合蛋白组合物的施用频率。
可设计临床试验使得FVIIa-XTEN相对于NovoSeven的效力和优点可在人类中得到验证。例如，如对于NovoSeven所进行的那样，可将FVIIa-XTEN用于治疗出血的临床试验。这样的研究将包括三期。首先，进行成年患者中的I期安全性和药物动力学研究，以确定人类中的最大耐受剂量和药物动力学以及药效学(任一正常受试者或血友症患者)，以及定义在将来的研究中跟踪的潜在毒性和副作用。进行施用单剂量递增的FVIIa-XTEN组合物的研究，并测量生化、PK和临床参数。这将允许测定最大耐受剂量以及确定剂量的阈值和最高浓度，并且使构成各组分的治疗窗的药物循环。之后，在患有疾病、疾患或病症的患者中进行临床试验。
临床试验可在患有其中期望NovoSeven可提供临床益处的任何疾病的患者进行。例如，这样的情况包括在血友病A或B、具有对因子VIII或因子IX的抑制剂的患者以及具有获得性血友症的患者中的出血事件、在具有对因子VIII或因子IX的抑制剂的血友病A或B患者和在具有获得性血友症的患者中的外科手术或侵入过程中预防出血、在具有先天性FVII缺陷的患者中治疗出血事件以及在具有先天性FVII缺陷的患者中的外科手术或侵入过程中预防出血。还表明可将FVIIa-XTEN用于另外的患者群体。除了收集与副作用相关的安全性数据以外，还测量参数和临床终点作为融合蛋白组合物的剂量函数，产生适于随后的III期临床的关于剂量的剂量-范围信息。PK参数与建立治疗窗的生理性、临床和安全参数数据以及用于FVII-XTEN组合物的治疗剂量方案相关，从而允许临床医师建立组合物的适当剂量范围。最后，进行III期功效研究，其中以剂量方案给患者施用FVII-XTEN组合物，并且使用认为适当给出各组合物的药物动力学和药效学性能的给药时间表来施用阳性对照(例如商购的NovoSeven)或安慰剂，所有试剂施用适当延长的时间期限以实现研究终点。监测的参数包括PT测定、出血时间分析、出血事件的控制或自发性出血事件的发生；相对于安慰剂或阳性对照组来跟踪的参数。使用标准统计方法测定效力结果。在该研究中还追踪毒性和副作用标记物以验证当以所述方式使用时化合物是安全的。
实施例37：用于评价包括FIX的CFXTEN的人临床试验设计
表明BeneFIX(凝血因子IX(重组体))用于控制和预防患有血友病B(先天性因子IX缺陷或Christmas病)的患者中的出血事件，包括控制和预防外科手术背景中的出血。所有因子IX产品的治疗的剂量和持续时间取决于因子IX缺乏的严重度、出血的部位和程度以及患者的临床病症、年龄和因子IX的恢复。XTEN与FIX的融合改善蛋白质的半衰期，因此，能够降低给药频率。
可设计临床试验使得FIX-XTEN相对于其它因子IX临床产品的效力和优点可在人类中得到验证。例如，如对于Benefix进行的那样，FIX-XTEN可用于治疗出血事件的临床试验。这样的研究将包括三期。首先，进行成年患者中的I期安全性和药物动力学研究，以确定人类中的最大耐受剂量和药物动力学以及药效学(任一正常受试者或血友症患者)，以及定义在将来的研究中跟踪的潜在毒性和副作用。进行施用单剂量递增的FVIIa-XTEN组合物的研究，并测量生化、PK和临床参数。这将允许测定最大耐受剂量以及确定剂量的阈值和最高浓度，并且使构成各组分的治疗窗的药物循环。之后，在患有疾病、疾患或病症的患者中进行临床试验。
可在患有期望因子IX提供临床益处的任何疾病的患者中进行临床试验。例如，这样的情况包括控制和预防患有血友病B(先天性因子IX缺陷或Christmas病)的患者中的出血事件，包括控制和预防外科手术背景中的出血。还表明可将FIX-XTEN用于另外的患者群体。除了收集与副作用相关的安全性数据以外，还测量参数和临床终点作为融合蛋白组合物的剂量函数，产生关于适用于随后的III期临床的剂量的剂量-范围信息。PK参数与建立治疗窗的生理性、临床和安全参数数据以及用于FIX-XTEN组合物的治疗剂量方案相关，从而允许临床医师建立组合物的适当剂量范围。最后，进行III期效力研究，其中以剂量方案给患者施用FIX-XTEN组合物，并且使用认为适当给出各组合物的药物动力学和药效学性能的给药时间表来施用阳性对照(例如商购的BeneFIX)或安慰剂，所有试剂施用适当延长的时间期限以实现研究终点。监测的参数包括aPTT测定、出血时间测定、出血事件的控制或自发性出血事件的发生；相对于安慰剂或阳性对照组来跟踪的参数。使用标准统计方法测定效力结果。在该研究中还追踪毒性和副作用标记物以验证当以所述方式使用时化合物是安全的。
实施例38：具有不同有效负载的XTEN融合蛋白的分析型尺寸排阻色谱
对包含各种治疗蛋白和增加长度的非结构化重组蛋白的融合蛋白进行尺寸排阻色谱分析。示例性的测定使用TSKGel-G4000 SWXL(7.8mm×3cm)柱，其中在20mM磷酸盐(pH 6.8)、114mM NaCl中以0.6ml/min的流速分离浓度为1mg/ml的40μg的纯化胰高血糖素融合蛋白。用OD214nm和OD280nm监测色谱曲线。使用BioRad的尺寸排阻校准标准来进行所有分析的柱校准；分子量标准包括甲状腺球蛋白(670kDa)，牛γ-球蛋白(158kDa)，鸡卵清蛋白(44kDa)，马肌红蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。胰高血糖素-Y288、胰高血糖素-Y144、胰高血糖素-Y72、胰高血糖素-Y36的代表性色谱曲线在图35中重叠显示。数据显示每种化合物的表观分子量是和连接的XTEN序列的长度成比例。然而，数据也显示了每种构建体的表观分子量显著大于对球状蛋白质所预期的表观分子量(如通过与在相同测定中运行的标准蛋白质相比较所显示)。根据包括CFXTEN组合物在内的被评价的所有构建体的SEC分析，表观分子量、表观分子量因子(用表观分子量与计算分子量的比值表示)和流体动力学半径(RH，以nm计)示出在表31中。结果表明，576个氨基酸或更大的不同XTEN的加入赋予融合蛋白以约339kDa至760的表观分子量，并且864个氨基酸或更大的XTEN赋予融合蛋白以大于约800kDA的表观分子量。表观分子量与实际分子量成比例增加的结果符合用来自几个不同基序家族(即，AD、AE、AF、AG和AM)的XTEN构建的融合蛋白增加至少4倍，比例高达约17倍。此外，具有576个氨基酸或更多的XTEN融合配偶体加入具有各种有效负载的融合蛋白(在与Y288融合的胰高血糖素的情况下为288个残基)，导致7nm或者更大的流体动力学半径；远远超出了大约3-5nm的肾小球孔径。因此，相对于相应的未融合生物有效负载蛋白，预期包含生长激素和XTEN的融合蛋白具有降低的肾脏清除率，有助于增加终末半衰期和提高治疗或生物效应。
表31：各种多肽的SEC分析
  构建体名称  TEN或融合配偶体   治疗蛋白   实际MW(kDa)  表观MW(kDa)   表观分子量因子   RH(nm)
  C14  Y288   胰高血糖素   28.7  370   12.9   7.0
  C28  Y144   胰高血糖素   16.1  117   7.3   5.0
  C34  Y72   胰高血糖素   9.9  58.6   5.9   3.8
  AC33  Y36   胰高血糖素   6.8  29.4   4.3   2.6
  C89  AF120   胰高血糖素   14.1  76.4   5.4   4.3
  AC88  AF108   胰高血糖素   13.1  61.2   4.7   3.9
  C73  AF144   胰高血糖素   16.3  95.2   5.8   4.7
  C53  AG576   GFP   74.9  339   4.5   7.0
  C39  AD576   GFP   76.4  546   7.1   7.7
  C41  AE576   GFP   80.4  760   9.5   8.3
  AC52   AF576   GFP   78.3   526   6.7   7.6
  AC398   AE288   FVII   76.3   650   8.5   8.2
  AC404   AE864   FVII   129   1900   14.7   10.1
  AC85   AE864   Exendin-4   83.6   938   11.2   8.9
  AC114   AM875   Exendin-4   82.4   1344   16.3   9.4
  AC143   AM875   CF   100.6   846   8.4   8.7
  AC227   AM875   IL-lra   95.4   1103   11.6   9.2
  AC228   AM1318   IL-lra   134.8   2286   17.0   10.5
实施例39：与GFP融合的延伸多肽在食蟹猴中的药代动力学
在食蟹猴中测试GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_Y576和XTEN_AD836-GFP的药代动力学以确定非结构化多肽的组成和长度对PK参数的影响。在注射后的各个时间分析血样，并且使用用于捕获的针对GFP的多克隆抗体和用于检测的相同多克隆抗体的生物素化制品，通过ELISA测量血浆中的GFP浓度。结果总结于图25。结果显示半衰期随XTEN序列的增长而出人意外的增加。例如，测定GFP-XTEN_L288(在XTEN中具有288个氨基酸残基)的半衰期为10小时。使非结构化的多肽融合配偶体的长度加倍至576个氨基酸，使多种融合蛋白构建体(即，GFP-XTEN_L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_Y576)的半衰期增加至20-22h。进一步增加非结构化的多肽融合配偶体长度至836个残基，导致XTEN_AD836-GFP的半衰期为72-75h。因此，使聚合物长度从288个残基增加288个残基到576个残基，使体内半衰期增加约10h。然而，使多肽长度从576个残基增加260个残基到836个残基，使半衰期增加多于50h。这些结果显示非结构化的多肽长度存在一个令人惊奇的阈值，这导致体内半衰期超比例增加。因此，与较短长度的多肽相比，包含延伸的非结构化多肽的融合蛋白预期具有增强的药代动力学的性质。
实施例40：XTEN的血清稳定性
使含有与GFP的N端融合的XTEN_AE864的融合蛋白在食蟹猴血浆和大鼠肾脏裂解物中在37℃下孵育7天。在时间0，第1天和第7天取样并通过SDS PAGE分析，随后用Western分析检测并用针对GFP的抗体检测，如图26所示。XTEN_AE864的序列在血浆中经7天显示可忽略的降解迹象。然而，XTEN_AE864在大鼠肾脏裂解物中经3天迅速降解。在血浆样本中检测融合蛋白的体内稳定性，其中如上所描述对GFP_AE864进行免疫沉淀并通过SDS PAGE分析。注射后长达7天所取的样本显示了非常少的降解迹象。结果证明了CFXTEN对血清蛋白酶引起的降解的抗性；这是CFXTEN融合蛋白药代动力学性质增强的一个因素。
实施例41：通过连接至XTEN而增加肽有效负载的溶解度和稳定性
为了评估XTEN增强溶解度和稳定性的物理/化学性质的能力，制备和评估胰高血糖素加较短长度XTEN的融合蛋白。在pH为中性的Tris缓冲盐水中制备测试物质，并通过反相HPLC和尺寸排阻色谱法表征Gcg-XTEN溶液以确定蛋白质在溶液中是均质和非聚集的。数据列于表32。为了比较的目的，测量了在相同的缓冲液中60μM(0.2mg/mL)的未修饰胰高血糖素的溶解极限，并且结果证明对于添加的所有长度的XTEN，实现了溶解度的明显增加。重要的是，在大多数情况下，制备胰高血糖素-XTEN融合蛋白来达到目标浓度，但没有评估以确定给定构建体的最大溶解极限。然而，在胰高血糖素连接到AF-144XTEN的情况下，测定了溶解极限，其中结果实现了溶解度增加至未连接XTEN的胰高血糖素的60倍。另外，评估了胰高血糖素-AF144CFXTEN的稳定性，发现液体制剂在冷冻条件下稳定至少六个月，而37℃下稳定大约一个月(数据未显示)。
该数据支持的结论是：使较短长度的XTEN多肽连接到生物活性蛋白例如胰高血糖素，能够通过得到的融合蛋白而显著地增强蛋白质的溶解度，也赋予了较高蛋白质浓度下的稳定性。
表32：胰高血糖素-XTEN构建体的溶解度
  测试物质 溶解度
  胰高血糖素 60μM
  胰高血糖素-Y36 ＞370μM
  胰高血糖素-Y72 ＞293μM
  胰高血糖素-AF108 ＞145μM
  胰高血糖素-AF120 ＞160μM
  胰高血糖素-Y144 ＞497μM
  胰高血糖素-AE144 ＞467μM
  胰高血糖素-AF144 ＞3600μM
  胰高血糖素-Y288 ＞163μM
实施例42：XTEN融合蛋白二级结构的表征
通过某些计算机程序或算法，例如熟知的Chou-Fasman算法(Chou，P.Y.等(1974)Biochemistry，13：222-45)和Gainier-Osguthorpe-Robson或“GOR”方法(Garnier J，Gibrat JF，Robson B.(1996)，GOR method for predicting proteinsecondary structure from amino acid sequence.Methods Enzymol.MethodsEnzymol 266：540-553)可以评估氨基酸序列的二级结构。对于给定的序列，此算法可以预测是存在一些二级结构还是根本不存在二级结构，表示为形成例如α-螺旋或β-折叠的序列残基的总数和/或百分比，或表示为被预测导致无规卷曲形成的序列的残基的百分比。
已经使用两种算法工具Chou-Fasman和GOR方法评估了来自XTEN“家族”的几种代表性的序列以评估这些序列中的二级结构水平。Chou-Fasman工具由William R.Pearson和弗吉尼亚大学提供在2009年6月19日存在的，“Biosupport”互联网网站，万维网上定位URL在.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝misc1。GOR工具由Pole Informatique Lyonnai提供在2008年6月19日存在的网络蛋白序列分析互联网站，万维网上定位URL在.npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.p1。
在分析的第一步，用这两种算法分析单个XTEN序列。AE864组合物是由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的四种12个氨基酸序列基序的多个拷贝构建的具有864个氨基酸残基的XTEN。序列基序特征在于以下事实：基序中和整个序列中存在有限的重复，因为任何两个连续氨基酸的序列在任意一个12个氨基酸基序中重复不超过2次，而且全长的XTEN中没有3个连续氨基酸是相同的。通过Chou-Fasman和GOR算法(后者需要17个氨基酸的最小长度)分析AF 864序列从N端开始逐渐增长的部分。通过将FASTA格式序列输入预测工具并运行分析来分析序列。分析的结果提供于表33。
结果显示，经Chou-Fasman计算，AE家族的4种基序(表1)不具有α-螺旋或β-折叠。多达288个残基的序列都被类似地发现不具有α-螺旋或β-折叠。预测432个残基的序列具有少量二级结构，其中仅2个氨基酸有助于形成α-螺旋，总百分比为0.5％。全长AF864多肽具有相同的有助于形成α-螺旋的2个氨基酸，总百分比为0.2％。对无规卷曲形成的计算揭示，随着长度增加，无规卷曲形成的百分比增加。此序列中前24个氨基酸具有91％的无规卷曲形成，其随长度增加而增加，全长序列的值达到99.77％。
还分析了来自其它基序家族的500个氨基酸或更长的许多XTEN序列，并揭示大多数存在超过95％的无规卷曲形成。例外的是具有一处或多处三个连续丝氨酸残基的那些序列，这导致预测的β-折叠形成。然而，即使这些序列仍存在近99％的无规卷曲形成。
相反，限于A、S和P氨基酸的84个残基的多肽序列用Chou-Fasman算法评估，其预测了高水平的预测α-螺旋。具有多个重复的“AA”和“AAA”序列的序列的α-螺旋结构的总体预测百分比为69％。GOR算法预测了78.57％的无规卷曲形成；远低于在本实施例中分析的由氨基酸G、S、T、E、P组成的12个氨基酸序列基序组成的任意序列。
此分析支持了以下结论：1)由具有有限重复的连续氨基酸的G、G、S、T、E、P和A的多个序列基序构建的XTEN被预测存在极低量的α-螺旋和β-折叠；2)增加XTEN的长度不明显增加α-螺旋或β-折叠形成的概率；和3)通过增加由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的非重复12-mer来逐渐增加XTEN序列的长度，导致无规卷曲形成百分比的增加。相反，具有较高程度内部重复的由限于A、S和P的氨基酸构建的多肽被预测具有高百分比的α-螺旋(如通过Chou-Fasman算法所确定)以及无规卷曲形成。基于由这些方法评估的众多序列，得到的结论是从具有有限重复(定义为在任意一个基序中不超过2个相同的连续氨基酸)的G、S、T、E、P和A的序列基序构建的长度大于约400个氨基酸残基的XTEN被预测具有非常有限的二级结构。除了含有三个连续丝氨酸的基序之外，相信表3的序列基序的任意顺序或组合可被用来构建长度大于约400个残基的XTEN多肽，这导致XTEN序列基本没有二级结构。预期这种序列具有在本文公开的本发明的CFXTEN实施方案中所述的特征。
表33：多肽序列的CHOU-FASMAN和GOR预测计算
Figure BPA00001545838402721
Figure BPA00001545838402731
Figure BPA00001545838402751
Figure BPA00001545838402761
Figure BPA00001545838402771
Figure BPA00001545838402781
Figure BPA00001545838402801
Figure BPA00001545838402811
Figure BPA00001545838402821
Figure BPA00001545838402831
Figure BPA00001545838402841
Figure BPA00001545838402851
Figure BPA00001545838402871
*H：α-螺旋E：β-折叠
实施例43：多肽序列重复性分析
通过定量较短序列在整个多肽中出现的次数来评估多肽氨基酸序列的重复性。例如，200个氨基酸残基的多肽有192个重叠的9-氨基酸子序列(或9-mer“框”)，但是独特的9-mer子序列的数量将取决于在此序列内重复的数量。在本分析中，通过加合每个3-氨基酸框的全部独特3-mer子序列在聚合物部分的前200个氨基酸中的出现，除以所述200个氨基酸序列内的独特3-mer子序列的绝对数目，来评估不同序列的重复性。得到的子序列评分是多肽内的重复程度的反映。
示于表34的结果表明，由2或3个氨基酸类型组成的非结构化多肽具有高子序列评分，而具低水平的内部重复性的由6个氨基酸G、S、T、E、P和A的12氨基酸基序组成的多肽的子序列评分小于10，并且在一些情况下小于5。例如，L288序列具有两个氨基酸类型，并具有短的高重复序列，致使子序列评分为50.0。多肽J288具有3个氨基酸类型，但也有短的重复序列，致使子序列评分为33.3。Y576也有3个氨基酸类型，但不是由内部重复序列组成，反映在前200个氨基酸的子序列评分为15.7。W576由4个类型的氨基酸组成，但具有较高的内部重复水平，例如，“GGSG”，致使子序列评分为23.4。AD576由四个类型的12个氨基酸基序组成，每个基序由4个类型的氨基酸组成。由于个体基序的低内部重复水平，前200个氨基酸的总体子序列评分是13.6。相反，由4个基序组成的XTEN含有6个类型的氨基酸，每个基序都具有低内部重复水平，因此具有较低的子序列评分；即，AE864(6.1)、AF864(7.5)和AM875(4.5)。
结论：结果表明每个由基本上非重复的4至6个氨基酸类型组成的12个氨基酸子序列基序组合成较长的XTEN多肽，得到非重复的整体序列。即使在此序列中每个子序列基序都可能被多次使用，情况也一样。相反，由较少数目的氨基酸类型构建的聚合物导致较高子序列评分，尽管可修改实际序列以降低重复水平而得到较低的子序列评分。
表34：多肽序列的子序列评分计算
Figure BPA00001545838402891
Figure BPA00001545838402901
Figure BPA00001545838402911
Figure BPA00001545838402921
Figure BPA00001545838402931
Figure BPA00001545838402941
Figure BPA00001545838402951
Figure BPA00001545838402961
Figure BPA00001545838402971
实施例44：TEPITOPE评分的计算
9mer肽序列的TEPITOPE评分可以通过如Sturniolo[Sturniolo，T.等(1999)Nat Biotechnol，17：555]所描述的增加口袋潜能来计算。在本实施例中，为个体HLA等位基因计算单独的TEPITOPE评分。作为实例，表35显示在高加索人群中高频率出现的HLA*0101B的口袋潜能。为了计算具有序列P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9的肽的TEPITOPE评分，添加了表35中相应的个体口袋潜能。具有序列FDKLPRTSG的9mer肽的HLA*0101B评分是0、-1.3、0、0.9、0、-1.8、0.09、0、0的总和。
为了评估长肽的TEPITOPE评分，可以对序列的所有9mer子序列重复该过程。此过程可对其它HLA等位基因编码的蛋白质进行重复。表36-39给出了在高加索人群中高频率出现的HLA等位基因的蛋白质产物的口袋潜能。
通过该方法计算的TEPITOPE评分范围从大约-10至+10。然而，在P1位置缺乏疏水性氨基酸的9mer肽(FKLMVWY)具有从-1009到-989范围内的计算的TEPITOPE评分。此数值在生物学上是无意义的，并且反映如下事实：疏水性氨基酸作为HLA结合的锚定残基，而且认为在P1缺乏疏水性残基的肽不结合HLA。因为大多数XTEN序列缺乏疏水性残基，9mer子序列的所有组合都将具有-1009至-989范围内的TEPITOPE。此方法证实XTEN多肽可能具有很少或没有预测的T细胞表位。
表35：HLA*0101B等位基因的口袋电势
表36：HLA*0301B等位基因的口袋电势
Figure BPA00001545838403001
表37：HLA*0401B等位基因的口袋电势
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
  A   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  C   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  D   -999   -1.3   -1.3   1.4   -   -1.1   -0.3   -   -1.7
  E   -999   0.1   -1.2   1.5   -   -2.4   0.2   -   -1.7
  F   0   0.8   0.8   -0.9   -   -1.1   -1   -   -1
  G   -999   0.5   0.2   -1.6   -   -1.5   -1.3   -   -1
  H   -999   0.8   0.2   1.1   -   -1.4   0   -   0.08
  I   -1   1.1   1.5   0.8   -   -0.1   0.08   -   -0.3
  K   -999   1.1   0   -1.7   -   -2.4   -0.3   -   -0.3
  L   -1   1   1   0.8   -   -1.1   0.7   -   -1
  M   -1   1.1   1.4   0.9   -   -1.1   0.8   -   -0.4
  N   -999   0.8   0.5   0.9   -   1.3   0.6   -   -1.4
  P   -999   -0.5   0.3   -1.6   -   0   -0.7   -   -1.3
  Q   -999   1.2   0   0.8   -   -1.5   0   -   0.5
  R   -999   2.2   0.7   -1.9   -   -2.4   -1.2   -   -1
  S   -999   -0.3   0.2   0.8   -   1   -0.2   -   0.7
  T   -999   0   0   0.7   -   1.9   -0.1   -   -1.2
  V   -1   2.1   0.5   -0.9   -   0.9   0.08   -   -0.7
  W   0   -0.1   0   -1.2   -   -1   -1.4   -   -1
  Y   0   0.9   0.8   -1.6   -   -1.5   -1.2   -   -1
表38：HLA*0701B等位基因的口袋电势
  氨基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9
  A   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  C   -999   0   0   0   -   0   0   -   0
  D   -999   -1.3   -1.3   -1.6   -   -2.5   -1.3   -   -1.2
  E   -999   0.1   -1.2   -1.4   -   -2.5   0.9   -   -0.3
  F   0   0.8   0.8   0.2   -   -0.8   2.1   -   2.1
  G   -999   0.5   0.2   -1.1   -   -0.6   0   -   -0.6
  H   -999   0.8   0.2   0.1   -   -0.8   0.9   -   -0.2
  I   -1   1.1   1.5   1.1   -   -0.5   2.4   -   3.4
  K   -999   1.1   0   -1.3   -   -1.1   0.5   -   -1.1
  L   -1   1   1   -0.8   -   -0.9   2.2   -   3.4
  M   -1   1.1   1.4   -0.4   -   -0.8   1.8   -   2
  N   -999   0.8   0.5   -1.1   -   -0.6   1.4   -   -0.5
  P   -999   -0.5   0.3   -1.2   -   -0.5   -0.2   -   -0.6
  Q   -999   1.2   0   -1.5   -   -1.1   1.1   -   -0.9
  R   -999   2.2   0.7   -1.1   -   -1.1   0.7   -   -0.8
  S   -999   -0.3   0.2   1.5   -   0.6   0.4   -   -0.3
  T   -999   0   0   1.4   -   -0.1   0.9   -   0.4
  V   -1   2.1   0.5   0.9   -   0.1   1.6   -   2
  W   0   -0.1   0   -1.1   -   -0.9   1.4   -   0.8
  Y   0   0.9   0.8   -0.9   -   -1   1.7   -   1.1
表39：HLA*1501B等位基因的口袋电势
Figure BPA00001545838403011
Figure BPA00001545838403021
表40：示例性生物活性、示例性测定和优选适应症
Figure BPA00001545838403022
表41：包含CF和单个XTEN的示例性CFXTEN
Figure BPA00001545838403041
Figure BPA00001545838403051
Figure BPA00001545838403061
Figure BPA00001545838403071
Figure BPA00001545838403081
Figure BPA00001545838403101
Figure BPA00001545838403111
Figure BPA00001545838403121
Figure BPA00001545838403131
Figure BPA00001545838403141
Figure BPA00001545838403151
Figure BPA00001545838403161
Figure BPA00001545838403171
Figure BPA00001545838403181
Figure BPA00001545838403191
Figure BPA00001545838403201
Figure BPA00001545838403211
Figure BPA00001545838403221
Figure BPA00001545838403231
Figure BPA00001545838403241
Figure BPA00001545838403251
Figure BPA00001545838403261
Figure BPA00001545838403271
Figure BPA00001545838403291
Figure BPA00001545838403301
Figure BPA00001545838403311
Figure BPA00001545838403321
Figure BPA00001545838403331
Figure BPA00001545838403341
Figure BPA00001545838403351
Figure BPA00001545838403361
Figure BPA00001545838403371
Figure BPA00001545838403381
Figure BPA00001545838403391
Figure BPA00001545838403401
Figure BPA00001545838403421
Figure BPA00001545838403431
Figure BPA00001545838403441
Figure BPA00001545838403461
Figure BPA00001545838403471
Figure BPA00001545838403481
Figure BPA00001545838403491
Figure BPA00001545838403501
Figure BPA00001545838403511
Figure BPA00001545838403521
*序列名称反映凝血因子和XTEN组分的N端至C-端构型
表42：包合CF、裂解序列和XTEN序列的示例性CFXTEN
Figure BPA00001545838403522
Figure BPA00001545838403541
Figure BPA00001545838403551
Figure BPA00001545838403561
Figure BPA00001545838403571
Figure BPA00001545838403581
Figure BPA00001545838403591
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Figure BPA00001545838403621
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Figure BPA00001545838404091
*序列名称反映CF、裂解序列和XTEN组分的N端至C-端构型
表43：引入FIXAP序列、裂解序列和XTEN**的示例性FVII变体
Figure BPA00001545838404092
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Figure BPA00001545838404241
*序列名称反映FVII变体(Gla-EGF2结构域)、FIX AP裂解序列、FVII蛋白酶结构域、XTEN裂解序列和XTEN组分(后者当被包括时)的N端至C-端构型
**并非所有序列引入XTEN
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种分离的因子VII多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)，所述XTEN包含至少36个氨基酸残基，其中所述因子VII多肽当施用给受试者时表现出大于约12小时的终末半衰期。
2.权利要求1所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽当最佳比对时与选自表1的序列相比表现出至少90％序列同一性。
3.权利要求1或2所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII在其C-端与所述XTEN连接。
4.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其与XTEN经由可由哺乳动物蛋白酶裂解的裂解序列连接，所述哺乳动物蛋白酶选自由因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子VIIa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20组成的组。
5.权利要求4所述的分离的因子VII多肽，其中通过哺乳动物蛋白酶引起的在所述裂解序列处的裂解从所述因子VII多肽释放所述XTEN。
6.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN在所述因子VII中包含的任何两个相邻结构域之间引入，其中所述两个相邻结构域选自由Gla、EGF1、EGF2、活化肽(AP)和肽酶S1(Pro)组成的组。
7.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN的特征在于：
(a)XTEN氨基酸残基的累计总数大于200至约3000个氨基酸残基；
(b)天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的10％；
(c)蛋氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的2％；
(d)所述XTEN序列具有小于10的亚序列得分；
(e)通过GOR算法确定，所述XTEN序列具有大于90％的无规卷曲形成；和
(f)通过Chou-Fasman算法确定，所述XTEN序列具有小于2％的α螺旋和2％的β折叠。
8.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其表现出至少约4的表观分子量因子。
9.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN表现出与类似长度的选自表4、表9、表10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
10.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其根据式VII来构建：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(AP1)-(XTEN)w-(AP2)-(XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z  VII
其中对于每次出现独立地，
(a)Gla是因子VII的Gla结构域；
(b)EGF1是因子VII的EGF1结构域；
(c)EGF2是因子VII的EFG2结构域；
(d)AP1是因子VII的激活肽结构域的一部分；
(e)AP2是包括至少第一裂解序列的因子IX的激活肽结构域的一部分；
(f)PRO是因子VII的蛋白酶结构域；
(g)S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选包括裂解序列；
(h)XTEN是延伸重组多肽，所述延伸重组多肽表现出与类似长度的选自表4、表9、表10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
(i)u是0或1；
(j)v是0或1；
(k)x是0或1；
(l)y是0或1；且
(m)z是0或1，条件是u+V+x+y+z≥1。
11.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含一个以上的XTEN。
12.一种分离的因子VII多肽，其包含至少一个异源序列，所述异源序列可被未活化野生型因子VII的促凝蛋白酶裂解，其中在裂解异源序列后，因子VII多肽就被活化。
13.权利要求12所述的分离的因子VII多肽，其可在不存在组织因子的情况下活化。
14.权利要求12或13所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列可被活化因子XI裂解。
15.权利要求12-14中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含至少两个异源序列，所述异源序列的每一个可被相同或不同的促凝蛋白酶裂解。
16.权利要求12-15中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)。
17.权利要求12-16中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中在裂解所述至少一个异源序列后，XTEN也被裂解。
18.权利要求12-17中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列表现出与序列KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRV具有至少90％序列同一性。
19.权利要求12-18中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列当最佳比对时表现出与选自TSKLTRAETVFP和FNDFTRV的序列具有至少90％序列同一性。
20.权利要求12-19中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽不包含选自由聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗体和抗体片段组成的组的组分。
21.权利要求12-10中任一项所述的分离的因子VII多肽，其表现出至少约4的表观分子量因子。
22.一种治疗受试者的凝血紊乱的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的因子VII的组合物。
23.权利要求22所述的方法，其中所述凝血紊乱是血友病A或血友病B。
24.权利要求22或23所述的方法，其中所述治疗有效量的因子VII足以回避外源性施用因子VIII和/或因子IX的需要以产生类似的治疗效应。
25.一种治疗受试者的出血事件的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述的因子VII的组合物。
26.一种治疗受试者的凝血蛋白不足的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述的因子VII的组合物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述凝血蛋白替换野生型因子VII、因子IX或因子XI。
28.权利要求1所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN包含至少100个氨基酸残基。
29.一种分离的因子VII多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)，所述XTEN的特征在于：
(a)所述XTEN包含至少36个氨基酸残基；
(b)URP中所含的甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和组成XTEN的总氨基酸序列的至少80％；
(c)所述XTEN序列是基本上非重复的以使(i)所述XTEN序列不包含三个相同的连续氨基酸，除非所述氨基酸是丝氨酸，或(ii)所述XTEN序列的至少约80％包括非重叠序列基序，每个所述序列基序包含约9至约14个氨基酸残基，其中任何两个连续氨基酸残基在每个所述序列基序中出现不超过两次；
(d)当通过TEPITOPE算法分析时，所述XTEN序列缺少预测的T细胞表位，其中所述TEPITOPE算法对所述XTEN序列中表位的预测是基于-9的评分；
(e)通过GOR算法确定，所述XTEN序列具有大于90％的无规卷曲形成；和
(f)通过Chou-Fasman算法确定，所述XTEN序列具有小于2％的α螺旋和2％的β折叠。

Claims (27)

1.一种分离的因子VII多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)，所述XTEN包含至少200个氨基酸残基，其中所述因子VII多肽当施用给受试者时表现出大于约12小时的终末半衰期。
2.权利要求1所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽当最佳比对时与选自表2的序列相比表现出至少90％序列同一性。
3.权利要求1或2所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII在其C-端与所述XTEN连接。
4.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其与XTEN经由可由哺乳动物蛋白酶裂解的裂解序列连接，所述哺乳动物蛋白酶选自由因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20组成的组。
5.权利要求4所述的分离的因子VII多肽，其中通过哺乳动物蛋白酶引起的在所述裂解序列处的裂解从所述因子VII多肽释放所述XTEN。
6.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN在所述因子VII中包含的任何两个相邻结构域之间引入，其中所述两个相邻结构域选自由Gla、EGF1、EGF2、活化肽(AP)和肽酶S1(Pro)组成的组。
7.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN的特征在于：
(a)XTEN氨基酸残基的累计总数大于200至约3000个氨基酸残基；
(b)天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的10％；
(c)蛋氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN的总氨基酸序列的2％；
(d)所述XTEN序列具有小于10的亚序列得分；
(e)通过GOR算法确定，所述XTEN序列具有大于90％的无规卷曲形成；和
(f)通过Chou-Fasman算法确定，所述XTEN序列具有小于2％的α螺旋和2％的β折叠。
8.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其表现出至少约4的表观分子量因子。
9.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述XTEN表现出与类似长度的选自表4、表9、表10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
10.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其根据式VII来构建：
(Gla)-(XTEN)u-(EGF1)-(XTEN)v-(EGF2)-(AP1)-(XTEN)w-(AP2)-(XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z   VII
其中对于每次出现独立地，
(a)Gla是因子VII的Gla结构域；
(b)EGF1是因子VII的EGF1结构域；
(c)EGF2是因子VII的EFG2结构域；
(d)AP1是因子VII的激活肽结构域的一部分；
(e)AP2是包括至少第一裂解序列的因子IX的激活肽结构域的一部分；
(f)PRO是因子VII的蛋白酶结构域；
(g)S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选包括裂解序列；
(h)XTEN是延伸重组多肽，所述延伸重组多肽表现出与类似长度的选自表4、表9、表10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
(i)u是0或1；
(j)v是0或1；
(k)x是0或1；
(l)y是0或1；且
(m)z是0或1，条件是u+v+x+y+z≥1。
11.前述权利要求中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含一个以上的XTEN。
12.一种分离的因子VII多肽，其包含至少一个异源序列，所述异源序列可被未活化野生型因子VII的促凝蛋白酶裂解，其中在裂解异源序列后，因子VII多肽就被活化。
13.权利要求12所述的分离的因子VII多肽，其可在不存在组织因子的情况下活化。
14.权利要求12或13所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列可被活化因子XI裂解。
15.权利要求12-14中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含至少两个异源序列，所述异源序列的每一个可被相同或不同的促凝蛋白酶裂解。
16.权利要求12-15中任一项所述的分离的因子VII多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)。
17.权利要求12-16中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中在裂解所述至少一个异源序列后，XTEN也被裂解。
18.权利要求12-17中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列表现出与序列KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRV具有至少90％序列同一性。
19.权利要求12-18中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述异源序列当最佳比对时表现出与选自TSKLTRAETVFP和FNDFTRV的序列具有至少90％序列同一性。
20.权利要求12-19中任一项所述的分离的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽不包含选自由聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗体和抗体片段组成的组的组分。
21.权利要求12-10中任一项所述的分离的因子VII多肽，其表现出至少约4的表观分子量因子。
22.一种治疗受试者的凝血紊乱的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的因子VII的组合物。
23.权利要求22所述的方法，其中所述凝血紊乱是血友病A或血友病B。
24.权利要求22或23所述的方法，其中所述治疗有效量的因子VII足以回避外源性施用因子VIII和/或因子IX的需要以产生类似的治疗效应。
25.一种治疗受试者的出血事件的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述的因子VII的组合物。
26.一种治疗受试者的凝血蛋白不足的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述的因子VII的组合物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述凝血蛋白替换野生型因子VII、因子IX或因子XI。
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