CN1091447C - 4,7－二烷氧基n－乙酰基神经氨酸衍生物及其在临床样本中检测流行性感冒a型和b型病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通式(I)的显色和荧光的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是显色或荧光基团。这些底物可用来检测临床样本中的流行性感冒A型和B型。更具体的是，这些4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物可用来区分有神经氨酸酶反应活性的各种病毒。这样，流行性感冒A型和B型病毒可用本发明的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸衍生物来区分副流行性感冒1型、2型、3型和4型及腮腺炎病毒。本发明也提供了用这些底物来识别临床样本中的流行性感冒A型和B型病毒并与有神经氨酸酶反应活性的其它病毒区分的诊断方法。

Description

4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸衍生物及其在临床样本中 检测流行性感冒A型和B型病毒的方法
本发明提供了显色和荧光的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，它可在临床样本中用来检测流行性感冒A型和B型病毒。更具体的是，本发明提供了可用来区分具有神经氨酸酶反应活性的各种病毒的4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸底物。这样，流行性感冒A型和B型病毒可用本发明的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸衍生物来区分于副流行性感冒病毒1、2、3和4型和流行性腮腺炎病毒。
发明背景
感染疾病是人们最通常看内科医生的原因。病毒比所有其它组合微生物更多地导致这些感染。在所有由于病毒产生的各种感染中，呼吸道病毒(流行性感冒A和B；副流行性感冒1、2、3和4；呼吸道合胞(syncytial)病毒和腺病毒)最为流行。人们早已于公元前430年雅典的瘟疫发现了流行性感冒病毒的致死性(Langmuir等，New Engl.J.Medicine，313(1985)1027)。流行性感冒是导致急性呼吸道疾病的首位原因和美国第六位的年死亡因素(每月死亡统计报告(MonthlyVital Statistics Report)，43卷，第6号(1995))。结果，开发出病毒和病毒感染的诊断方法越来越变得重要。
快速诊断病毒感染也已成为行医优良的一个整体部分。一些病毒对于其产生的抗体具有可定义的抗原。因此，免疫分析被广泛地用于测量病毒粒子是否存在。若需要测量病毒粒子较宽的分类，可以检测病毒特定的组份。例如，流行性感冒病毒表达了有神经氨酸酶(唾液酸酶)活性的表面糖蛋白。含2-酮苷连接的N-乙酰基神经氨酸的神经氨酸酶酶水解底物(Neu5Ac，也称为唾液酸)。Neu5Ac由9个碳原子、一个羧基和一个N-乙酰基的骨架构成。下面显示了其一般结构以及用来指出碳原子的编号系统。
Figure C9719131300051
当具有神经氨酸酶活性的病毒粒子与显色或/灵荧光Neu5Ac糖苷培养时，酶会使显色或荧光的糖苷配基从底物上裂解下来，该反应产物指示有病毒粒子的存在。在本说明书中，与上式中的5-位碳连接的N-乙酰基被称为AcHN。
美国专利5,252,458揭示了通过使酶与酶的显色底物反应检测病毒存在的一个方法，在此并入供参考。Yolken等(传染病杂志(J.Infectious Diseases)，142(1980)516-523)开发了直接测量流行性感冒神经氨酸酶的分析方法。Yolken等使用Neu5Ac的4-甲基7-羟基香豆素基-2-酮苷作为荧光的底物在制备含少量培养的病毒以及一些从感染流行性感冒病毒的志愿者的鼻洗液样本的制剂中测量神经氨酸活性。Yolken等提示“成功地开发出用于检测流行性感冒神经氨酸酶的荧光度量酶分析方法，由此提供了能足够快地让合适的防治介入的诊断流行性感冒的实用的手段”根据Yolken等的方法，光量分析对临床应用灵敏度不足。相反，Yolken等注意到荧光分析可适用于检测出临床样本的流行性感冒神经氨酸酶。
Pachucki等(临床微生物学杂志(J.Clinical Microbiology)，26(1988)2664-2666)等试验了Neu5Ac的4-甲基7-羟基香豆素基(umbelliferyl)-2-酮苷对从流行性感冒病人收集到的临床样本的作用。由于其灵敏度低，分析没有在临床样本中直接迅速地检测到神经氨酸酶。但是，该分析在组织培养物培养25小时后识别出了91％的病毒阳性分离物。
使用修饰的Neu5Ac底物会增加神经氨酸酶分析的特异性。在唾液酸中，4-位碳(C-4)被报道在酶底物交互作用中起重要的作用。再者，由于唾液细菌酶有神经氨酸酶活性(Varki等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，258(1983)12465-12471)，必须消除这些不需要的交互作用。现已显示4-甲氧基-Neu5Ac的酮苷对某些细菌性唾液酸酶有耐受性，但，被某些病毒唾液酸酶快速地裂解(Beau等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.〕，106(1980)531-540)。
虽然对N-乙酰基神经氨酸的4-位修饰提供了特定病毒和特定细菌性神经氨酸酶反应活性之间的特异性，但仍然需要得到这样的底物：它让各种病毒的神经氨酸酶反应活性之间进一步有特异性或分化，同时保持病毒和细菌神经氨酸酶反应活性的特异性。例如，这类底物对特定类型的含神经氨酸酶病毒的特异性高，能有更好更多地直接治疗方式。这类底物也能更精确地监视病毒感染，得到更合适的集中医学治疗。本发明的显色和荧光4，7-改性的N-乙酰基神经氨酸底物使各种病毒神经氨酸酶反应活性之间有进一步的特异性或分化，同时保留了病毒和细菌神经氨酸酶之间的特异性。
发明综述
本发明涉及可用来检测和识别临床样本中流行性感冒病毒的显色和荧光4，7-改性的N-乙酰基神经氨酸底物。更具体的是，本发明涉及能用来检测和识别临床样本中流行性感冒病毒的显色和荧光4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸底物。这些4，7-改性的N-乙酰基神经氨酸底物可用于诊断试验来区分临床样本中流行性感冒A型和B型病毒与具有神经氨酸酶的其它病毒。本发明也涉及使用这类底物的的诊断方法。
本文使用的术语“显色或荧光基团”和“标志或报告性基团”包括，不限于，呈现吸收或发荧光的分子。术语“颜色”同样包括，不限于，吸收和发荧光分子。
本发明的一个目的是提供用于检测病毒的诊断方法的显色和荧光4，7-改性的N-乙酰基神经氨酸底物。本发明的另一个目的是提供检测临床样本中的流行性感冒A和B型病毒的实用、方便、节省费用的方法。本发明的另一个目是提供能区分临床样本中流行性感冒A和B型病毒和有一般神经氨酸反应活性的其它病毒的实用、方便、节省费用的诊断方法。
本发明的再一个目的是提供下列通式的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸：
其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基。较好的是，R1和R2是甲基。
本发明的另一个目的是提供下列通式的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物：其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是显色或荧光基团。较好的是，R1和R2是甲基，R3是显色基团。
本发明的另一个目的是提供对来自怀疑有呼吸道病毒感染的个体的临床样本检测流行性感冒A和B型病毒的方法，所述的方法包括：
(1)将临床样本与下列通式的显色或荧光4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸底物一起培养：
Figure C9719131300072
其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是当从底物或底物的盐上裂解下来后出现明显的和特殊颜色的显色或荧光基团；
(2)观察培养的临床样本以决定是否形成了明显和特殊的颜色，其中明显和特殊颜色的形成表示在临床样本中有流行性感冒A或B型病毒的存在。
本发明的另一个目的是提供对来自怀疑有呼吸道病毒感染的个体的临床样本检测流行性感冒A和B型病毒的方法，所述的方法包括：
(1)将临床样本分成第一部分和第二部分；
(2)使第一部分与下式的显色或荧光4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸第一底物培养：
Figure C9719131300073
其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是当从第一底物或第一底物的盐上裂解下来后出现明显和特殊颜色的第一显色或荧光基团；
(3)观察培养的第一部分以决定是否形成了第一明显和特殊的颜色，其中第一明显和特殊颜色的形成表示在临床样本中有流行性感冒A或B型病毒的存在；
(4)使第二部分与下式的显色或荧光4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸第二底物培养：
Figure C9719131300081
其中R4是含1-4个碳原子的烷基，R5是当从第二底物或第二底物的盐上裂解下来后出现明显和特殊第二种颜色的第二显色或荧光基团；
(5)观察培养的第二部分以决定是否形成了第二种明显和特殊的颜色，其中第二明显和特殊颜色的形成表示在临床样本中有流行性感冒A或B型病毒的存在；
其中第一和第二颜色的存在表示在临床样本中有流行性感冒A型或B型病毒单独存在或有与非流行性A型或B型病毒的神经氨酸酶反应活性病毒组合存在；
其中有第二颜色但没有第一颜色表示在临床样本中有非流行性感冒A型和B型病毒的神经氨酸酶反应活性病毒；和
没有第一和第二颜色表示临床样本中没有神经氨酸酶反应活性病毒。
本发明的其它目的、优点、特性和特征在考虑了以下叙述和增补的 书中变得更为明显。
发明详述
本发明涉及下列通式的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸：
Figure C9719131300082
其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基。R1和R2可为相同或不同的烷基。较高级的烷基(即，R含3-4个碳原子)包括直链和支链异构体。较好的是R1和R2是含1或2个碳原子的烷基；更好的是R1和R2都是甲基。
本发明4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸可用下列一般反应式来制备：
如美国专利5,556,963(1996，9，17颁布，申请号为08/286,573，申请日199，8，5)的一般揭示从Neu5Ac中制备起始物质1(Neu5Ac的8，9-O-异亚丙基-甲基酯-甲基酮苷衍生物)，这里并入供参考。Neu5Ac可购得(MediHerb Inc.，4540 S.Navajo #1，Englewood，Co.80110)。也可用Kim等，J.Am.Chem.Soc.，110(1988)6481所述的过程从N-乙酰基-D-甘露糖胺与丙酮酸进行酶合成，这在下式中显示：
酶反应可用薄层层析(TLC)来检测，产物可用离子交换层析来纯化。
如美国专利5,556,963所述，Neu5Ac首先被转化为下式的烷基酯烷基酮苷：
Figure C9719131300101
通过用有效量的丙酮和酸催化剂处理形成缩酮(1)来保护该甲基酯甲基酮苷的C-8和C-9处邻近的羟基。合适的酸催化剂包括对-甲苯磺酸、如吡啶鎓盐(PPTS)和其它盐的对-甲苯磺酸盐、ZnCl2、FeCl3等。较好的酸催化剂是非吸湿性的对-甲苯磺酸吡啶鎓盐。
被保护的甲酯甲基酮苷(1)然后被烷基化，形成在4-位有烷氧基的化合物2和在4-位和7-位都有烷氧基的化合物3的混合物。在C-4和C-7处的羟基烷基化可为甲基化、乙基化、丙基化或丁基化，从而在2中C-4的羟基被转化为-OR基团，3中的C-4和C-7处的羟基被转化为-OR基团，其中R是含1-4个碳原子的烷基。较好的是，C-4和/或C-7的烷基化是甲基化或乙基化，从而得到4-甲氧基或4-乙氧基衍生物或4，7-二甲氧基或4，7-二乙氧基衍生物。更好的是，C-4和/或C-7处的烷基化是甲基化，从而得到4-甲氧基或4，7-二甲氧基衍生物。在C-4和C-7位处引入较高级烷基一般比甲基化反应慢，得率较低。此外具有较高级烷基的显色底物对于酶裂解不如4，7-二甲氧基-Neu5Ac易受影响，结果其分析灵敏度差。不论怎样，对于某些特定的使用和分析，这类C-4和C-7处较高级烷基可能是有用的，甚至更好。
下面揭示了通过控制反应条件使C-7处立体位阻较大的羟基烷基化。根据该方法，用过量(一般大于约1.5摩尔当量)的烷化剂在约80％氢化钠的分散液中处理中间体1。烷化剂选自硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丙酯和硫酸二丁酯。反应通常在约0-30℃温度下进行约10分钟到约48小时。较好的反应温度范围为约0-22℃。当在4-和7-位处形成较高级的烷氧基时一般优选地需要较长的反应时间。在本发明较好的技术方案中，在约0-30℃，较好的是约0-22℃下在C-4和C-7位形成甲氧基的甲基化反应进行约10分钟到约30分钟。在本发明另一个较好的技术方案中，在约0-30℃，更好地是在约0-22℃下在C-4和C-7位形成乙氧基的乙氧化反应进行约1-24小时。
用过量烷化剂(如硫酸二甲酯)处理保护的甲酯甲基酮苷1产生了在4-位含烷氧基的化合物2和在4-和7-位同时含烷氧基的化合物3的混合物。一般使用约1.5摩尔当量过量的烷化剂。较好的是使用约1.5-2.0摩尔当量烷化剂。一般所需化合物3的量相应于化合物2，随着烷化剂的增加而增加。从这类处理得到的反应混合物一般含4-烷氧基化合物2作为主要产物，和10-20重量％的4，7-二烷氧基化合物3。两者可分离，例如可通过柱色谱层析，然后用丙酮-己烷混合物结晶可优选地除去4-烷氧基化合物2来部分分离化合物2和3。所得的残留物含丰富的4，7-二烷氧基物质的两个化合物的混合物；一般两个化合物的摩尔比增加到至少约1∶1。
通过用约80％乙酸处理从合物3以从中除去缩酮基团。乙酸水解也可使C-9位羟基的部分乙酰化。因此，可用甲醇钠处理水解产物来除去任何在C-9上的乙酸酯基团。用碱处理使4最后去保护，接着用酸水解得到最终的4，7-二烷氧基-Neu5Ac产物(5)。当然，存在在混合物中的4-烷氧基化合物2也可用相似的方法处理以得到相应的4-烷氧基-Neu5Ac化合物。
所得的4，7-二烷氧基-Neu5Ac可进一步通过与任何合适的标志或报告性的基团，包括，例如显色或荧光标志基团，偶合来使用。优选的标志或报告性基团是显色基团，包括，如4-氯-1-萘醇、6-溴-1-萘醇和5-溴-4-氯-吲哚。显色改性的4，7-二烷氧基-Neu5Ac可引入神经氨酸酶分析以用来检测来自临床样本中的流行性感冒A型和B型的病毒神经氨酸酶活性。合成和在病毒分析中使用这类4，7-位改性显色的N-乙酰基神经氨酸底物类似于PCT公开号WO91/09972；Yolken等，传染病杂志(J.Infectious Diseases)，142(1980)516-523；和Pachucki等临床微生物学杂志(J.Clinical Microbiology)，26(1988)2664-2666中揭示的相关的4-位改性底物，这里并入供参考。当然，目前的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸可用来形成其它含显色和荧光的衍生物，并可用于其它的病毒分析。
一般显色或以荧光标志基团可用下列反应式掺入4，7-二烷氧基-Neu5Ac(5)(用5-溴-3-吲哚基作为举例型的标志基团)：
Figure C9719131300121
流程2
通过用浓三氟乙酸和甲醇处理可首先将化合物5转化为相应的甲酯衍生物，该酯然后与过量乙酰氯反应形成4，7-二烷氧基-Neu5Ac(6)的氯乙酸甲酯衍生物。6与5-溴-3-吲哚基偶合得到5-溴-吲哚-3-醇-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-乙氧基甲酯(7)。通过用甲醇中的甲醇钠处理使7去乙酰化得到化合物8，接着用氢氧化钠处理得到5-溴-3-吲哚基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸(9)钠盐。当然，混合物中的4-烷氧基-Neu5Ac进行相似的偶合反应以形成5-溴-3-吲哚基-4-甲氧基-N-乙酰基神经氨酸盐。
偶合的4，7-二烷氧基衍生物9然后通过高效液相色谱(HPLC)，例如用C18反相板硅胶柱从两个偶合化合物(即4-烷氧基和4，7-二烷氧基衍生物)中分离出偶合的4，7-二烷氧基衍生物9。偶合产物的混合物可溶于水并装载到柱上。产物通过具有甲醇组份逐渐增加的梯度洗脱进行分离，收集并汇合。所得的纯化的5-溴-3-吲哚基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸(9)可被干燥并储存到使用。一般来说，所得的产物基本没有4-甲氧基衍生物。混合物中基本没有4-甲氧基衍生物是很重要的，因为它与腮腺炎病毒和其它含神经氨酸酶病毒的反应性很高。
如上所述，本发明显色或荧光的4，7-二烷氧基衍生物具有下式：
Figure C9719131300131
其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是显色或荧光基团。R1和R2可为相同或不同的烷基。较好的是，R1和R2都是甲基，R3是显色基团。更好的是，R3是4-甲基7-羟基香豆素基、3-氰基7-羟基香豆素基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-试卤灵、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮间苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基或6-溴-2-萘基。更好的是，R3是4-甲基7-羟基香豆素基、5-溴-4-氯-3-吲哚基或5-溴-3-吲哚基。更好的R3是5-溴-3-吲哚基。也可使用这些底物的简单盐，如Na+K+和NH4 +。
上式范围中的4，7-二烷氧基显色Neu5Ac衍生物的例子包括4-甲基-7-羟基香豆素基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、2-硝基苯基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、4-硝基苯基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、3-氰基-7-羟基香豆素基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、3-试卤灵-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、5-溴-3-吲哚基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、3-吲哚基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、2-[4-(4-硝基苯基偶氮)苯基]-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、2-[4-(4-硝基苯基偶氮)间苯二酚基]-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、3-甲氧基苯基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、3-二甲基氨基苯基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、6-溴-2-萘基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、4-氯-1-萘基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸-α-酮苷、及其相应的4，7-二乙氧基、4，7-二丙基和4，7-二丁基衍生物。一般来说，优选的是4，7-二甲氧基衍生物。需要时，可使用“混合的”4，7-二烷氧基衍生物(如，4-甲氧基-7-乙氧基)。
显色或荧光4，7-二烷氧基衍生物可用于临床样本中流行性感冒A型和B型病毒的诊断试验。在本发明中被试验的临床样本典型的是从患者或怀疑患有感冒的病人的咽、鼻或呼吸道收集的分泌物，诸如洗、拭抹或吐痰出来的样本。洗出、吐痰或拭抹出的样本在与底物混合前最好与含稳定剂的水性缓冲溶液混合。缓冲溶液一般含有将pH保持在约4-7，较好的是约5.5-6.5的缓冲剂，任选地有约0.1-10重量％非离子型洗涤剂、少量(1-20mM)碱土金属阳离子(Ca，Mg，优选的是Ca)和足量选自alditol、单糖、二糖的稳定剂以增加样本中神经氨酸的热稳定性。
与样本结合的缓冲溶液的体积通常为0.1-2毫升。缓冲剂可为有机的或元机的。合适的缓冲剂包括，例如有机酸和其盐的常规缓冲剂，如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、乙酸盐缓冲剂(如乙酸-乙酸钠混合物)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(如，酒石酸-酒石酸盐混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物)、葡糖酸盐缓冲剂(如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)、乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)、马来酸盐缓冲剂(如，D，L-马来酸-马来酸二钠混合物)、磷酸盐缓冲剂(如，磷酸一钠-磷酸二钠混合物、磷酸一钠-氢氧化钠混合物、磷酸三钠-盐酸混合物等)、2-(N-吗啉代)乙磺酸、[二-(2-羟乙基)亚氨基]三(羟甲基)甲烷、N-2-乙酰氨基亚氨基二乙酸、1，3-双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷、哌嗪-N，N’-2-乙磺酸、N-2-乙酰氨基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、2-[三(羟甲基)甲基氨基]乙磺酸、N-2-羟乙基哌嗪-N，N’-2-乙磺酸、3-[三-(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸。
用于缓冲溶液的非离子洗涤剂包括，例如，普卢兰尼克(Pluronics)，诸如聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80、Triton X-100、NP-40，烷基葡萄糖苷，如C8和C9烷基葡萄糖苷。洗涤剂是任选的组份，可使神经氨酸酶从病毒包壳中释放出来。用于缓冲溶液的稳定剂包括，如，三元羟基物或高级alditol，诸如，甘油、赤藓醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、己糖型葡萄糖和果糖和二糖。这些稳定剂可单独使用或组合使用。为了稳定含神经氨酸酶病毒的活性，加入液体制剂/赋形剂系统的稳定剂量为0.2M-2.1M，较好的是0.6M-2.0M。一旦与缓冲溶液混合，样本可较好地在2-8℃下储存很长的时间而不会明显失落神经氨酸酶的活性。
底物一般以0.05mM-0.5mM的量加入缓冲的、稳定的样本中。使混合物在室温到生理温度(即约18-40℃)下培养足以使样本中的神经氨酸酶与底物反应的时间。时间范围通常为1分钟到4小时，一般是5-120分钟，更普通的是30-60分钟。若样本中有神经氨酸酶活性，标志性或报告性基团从底物中释放出来，释放的标志性或报告性沉淀物使混合物出现特征性的颜色。对于光量衍生物，所得的反应混合物较好地被转移到含多孔膜滤器和吸附垫的收集装置里以吸去溶液。这类收集装置在我们的共同待批申请08/479,789(1995，6，7提交)中述及，在此并入供参考。在流行性感冒A型和B型神经氨酸酶的存在下，4，7-改性的Neu5Ac上的报告性基团通过神经氨酸酶的作用释放，所得的报告性分子作为有色的沉淀物在多孔滤膜上得以收集。这类有颜色的产物的存在表示流行性感冒A型和B型阳性诊断；没有这类有颜色的产物表示流行性感冒A型B型的诊断为阴性。浓缩或汇集有颜色的沉淀物增加了诊断试验的灵敏度。但是，这类收集装置不是实施本发明必不可少的。
下表指出了当神经氨酸酶与各种显色或荧光4，7-改性Neu5Ac衍生物反应和释放报告性分子时产生的特征颜色。释放的报告性分子     检测类型             颜色5-溴-4-氯-3-吲哚醇     光量/肉眼     在硝基蓝四唑鎓存在下为蓝色/紫色5-溴-3-吲哚醇          光量/肉眼     在硝基蓝四唑鎓存在下为蓝色/紫色3-吲哚醇               光量/肉眼     在硝基蓝四唑鎓存在下为蓝色/紫色4-甲基-7-甲基香豆素    荧光度量      在360nm处激发后荧光在454nm处发射3-氰基-7-甲基香豆素    荧光度量      在415nm处激发后荧光在454nm处发射试卤灵                光量/肉眼      粉红/红色2-硝基苯酚            光量/肉眼      黄色4-硝基苯酚            光量/肉眼      黄色硝基苯酚-偶氮苯酚     光量/肉眼      橙色硝基苯酚偶氮间苯二酚  光量/肉眼      蓝绿色(有Mg++存在)3-甲氧基苯酚          光量/肉眼      与重氮化盐反应后为红色到蓝色3二甲基氨基苯酚       光量/肉眼      与重氮化盐反应后为红色到蓝色4-氯-1-萘酚           光量/肉眼      与重氮化盐反应后为红色到蓝色6-溴-2-萘酚           光量/肉眼      与重氮化盐反应后为红色到蓝色
本发明的显色和荧光4，7-二烷氧基Neu5Ac衍生物仅在流行性感冒A型和B型病毒存在时显示出特征颜色。它们在副流行性感冒1型、2型、3型和4型病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒和/或腺病毒存在时不显示特征性的颜色(即不释放报告性分子)。此外，显色和荧光的4，7-二烷氧基Neu5Ac衍生物不显示出细菌神经氨酸酶反应活性。为了保持所需的选择性程度，4，7-二烷氧基Neu5Ac衍生物应当基本没有相应的4-烷氧基Neu5Ac衍生物。使选择性可接受的4-烷氧基Neu5Ac衍生物的最大水平可用各种类型病毒的已知菌株进行实验测定。一般来说，4-烷氧基Neu5Ac衍生物的水平应当低于约5重量％，最好低于约0.5重量％。
在单个试验中通过组合存在的显色和荧光4，7-二烷氧基Neu5Ac衍生物和显色和荧光4-烷氧基Neu5Ac衍生物的神经氨酸酶反应活性和选择性可得到更富信息性的诊断试验。在这类系统中，临床样本被划分成两个部分，它们依次分别与4，7-二烷氧基和4-烷氧基Neu5Ac衍生物培养。在两个培养样本中存在和/或没有特征颜色可用来更准确地决定病毒类型是否在临床样本中存在。若临床样本中只存在流行性感冒A型或B型病毒，则4-烷氧基和4，7-二烷氧基衍生物都显示出其报告性分子的特征颜色。如流行性感冒A型或B型病毒和非流行性感冒A型和B型病毒的神经氨酸酶反应活性病毒都存在时，每个部分都显示出其报告性分子的特征颜色。若只有非流行性感冒A型和B型病毒的神经氨酸酶反应活性病毒在临床样本中存在，则只有4-烷氧基衍生物显示出其报告性分子的特征颜色。若临床样本中没有神经氨酸酶反应活性病毒存在，则两个部分都没有其报告性分子的特征颜色存在。
因此，本发明提供了用来选择性诊断流行性感冒，特别是A型和B型，的简单和快速技术，它可在病房里或医生的办公室里进行，使医生能给予合适的方案来治疗传染病和/或对与传染病患者密切接触的人给予合适的预防性处理。
下列实施例仅用来叙述本发明。
实施例1
用流程1显示的反应来合成4，7-二甲氧基-Neu5Ac。异亚丙烷衍生物1(1.2克)在约10毫升无水乙腈中的冰冷溶液(冰浴温度)用氮气饱和。加入氢化钠(270毫克；80％在油中的分散液)，让混合物搅拌20分钟。加入硫酸二甲酯(1毫升)，再搅拌10分钟，用冰浴冷却混合物。所得的混合物经硅藻土过滤，沉淀用无水乙腈洗涤。蒸发滤液，干燥残留物，用丙酮萃取。过滤后，再蒸发滤液。干燥所得的残留物，在硅胶上经色谱层析。用二氯甲烷/甲醇(25∶1)洗脱以除去一些副产物。继续用相同的溶剂系统洗脱得到含2和3的浆状物，用丙酮-己烷结晶。收集到晶体2(177毫克)。滤液含2和3(约1∶1)的混合物，但3的比例比原始混合物的高。
含3(1.22克)的滤液用80％乙酸水溶液(15毫升)在85℃下处理一小时。蒸发混合物并与水共蒸发。残留物经色谱层析。用二氯甲烷/甲醇(5∶1)洗脱以除去少量副产物。继续用相同的溶剂系统洗脱得到部分去保护的产物4(0.87克；80％得率)。
在室温下用1M在甲醇(5毫升)和水(5毫升)中的氢氧化钠(3毫升)处理4，7-二甲氧基甲酯甲基酮苷(4)(0.87克)达1小时。混合物用Dowex 50(H+)树脂中和；经过滤除去树脂并用甲醇洗涤。蒸发合并的滤液。残渣用在0.025M盐酸中的Dowex 50(H+)树脂(1.5克)在100℃下处理两小时。过滤除去树脂，收集和蒸发滤液。残留物经真空干燥得到基本纯的4，7-二甲氧基-Neu5Ac(5)(0.71克；88％得率)。
实施例2
根据反应流程2所示的反应合成5-溴-3-吲哚基-4，7-二甲氧基-Neu5Ac。用在甲醇(25毫升)中的三氟乙酸(0.2毫升)在室温下对化合物5(1.0克)处理过夜。蒸发混合物。干燥残留物，用在二氯甲烷(5毫升)中的乙酰氯(5毫升)处理。反应混合物在室温下搅拌过夜，然后蒸发。干燥残留物得到粗制的氯化物6(1.36克)。粗制物6由于其不稳定性而不经进一步纯化。
粗制物6(0.7克)和1-乙酰基-5-溴-吲哚-3-醇(0.26克)在丙酮(5毫升)中的悬浮液用氮气饱和。加入1M氢氧化钠溶液(1毫升)。在氮气下使反应混合物搅拌1小时。蒸发后，干燥残留物，并经硅胶色谱层析。用二氯甲烷/甲醇(25∶1)洗脱以除去未反应的色原体(0.128克)。用相同的溶剂系统持续洗脱得到主要含偶合产物7(0.114克)的组份。偶合产物7(0.114克)在室温下用1M在甲醇(0.1毫升)中的甲醇钠处理30分钟。用Dowex 50(H+)树脂中和后，除去树脂并用甲醇洗涤。蒸发合并的滤液。干燥残留物，在硅胶上经色谱层析。汇合并蒸发主要含偶合产物8的组份得到约60毫克8。
在室温下用在50％甲醇水溶液(5毫升)中的1M氢氧化钠(0.5毫升)处理偶合产物8达30分钟。混合物用Dowex 50(H+)树脂中和。过滤除去树脂，用甲醇洗涤。蒸发合并的滤液，残留物经HPLC纯化。第一组份含未偶合的产物。偶合物质为宽峰，它由偶合的4-甲氧基-Neu5Ac和偶合的4，7-二甲氧基-Neu5Ac产物9构成。由于微量的偶合4-甲氧基衍生物会使诊断分析不具特异性，只汇合含高纯度9的组份。蒸发时收集高纯度9(4毫克)；收集物质含低于约5重量％相应的4-烷氧基衍生物。
实施例3
该实施例显示了实施例2的5-溴-3-吲哚基-4，7-二甲氧基-Neu5Ac(9)在流行性感冒A和B的培养病毒的诊断试验中的特异性。用合适的细胞系、培养基和适合具体病毒生长和培养的培养条件，从病人的分离物或冷冻储存培养物使病毒生长。使用了下列细胞：(1)对于流行性感冒和副流行性感冒病毒使用RMK(恒河猴肾)细胞；(2)对于呼吸道合胞病毒和腺病毒使用HEp-2(人体喉头癌)细胞；和(3)对于腮腺炎用VERO(非洲绿猴肾)细胞。在37℃下所有细胞在具有5-10％血清的最小必须培养基的试管或烧瓶中几乎汇合成单层。在合适的细胞系中在37℃下用没有血清的最小必须培养基中进行病毒感染。
监测被病毒感染的培养物并通过特征性的合胞作用和用病毒类型特异单克隆抗体进行免疫荧光试验来观察。对于每个病毒观察到下列特征性的合胞作用：(1)流行性感冒A和B：大面积，不规则的颗粒状或有空泡的细胞，细胞单层具有进行性退化；(2)副流行性感冒1：细胞单层贯穿了小圆细胞；(3)副流行性感冒2：从细胞单层上缩的黑色、颗粒状和不规则的合胞；(4)副流行性感冒3：伸长融合的细胞，它从细胞单层中均匀退缩和离开；(5)呼吸道合胞病毒：大、不规则形状的合胞，其外观好象是大的多核细胞，整个细胞单层具有不可区分的边界；(6)腺病毒：大、圆的致密细胞，它均匀地聚合成圆细胞片并附着在培养瓶上；和(7)腮腺炎：具有空泡的合胞，整个细胞单层细胞退化。市售的病毒类型特异单克隆抗体被用于荧光分析以确认培养物中每个病毒的生长。来自感染培养物的细胞被甲醇固定在玻璃片上或盖玻片上，然后在37℃下用荧光素标记的单克隆抗体培养。使用直接或间接的荧光分析。对于直接分析，固定的病毒感染的细胞用病毒类型特异的荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的单克隆抗体培养30分钟。对于间接分析，固定的、病毒感染的细胞用病毒类型特异的、未标记的单克隆抗体培养30分钟，然后再用辅助的FITC-标记的单克隆抗体培养30分钟。玻璃片或盖玻片用载片培养基覆盖，用荧光显微镜检查。有特征的、病毒特异的、苹果绿菌株的存在表示阳性病毒结果。进行性和特征性细胞病原作用的存在(和伴随的特定病毒用荧光分析确认)是特定培养的病毒繁殖最快的征兆。
在得到最大的病毒生长和确认有合适病毒存在后，从收获培养的液体，用4-甲氧基-N-乙酰基神经氨酸和4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸显色底物评估。含病毒的培养液(0.1毫升)与在含赋形剂和缓冲剂以使pH和神经氨酸酶活性最佳的1毫升或2毫升溶液中的显色底物混合。缓冲剂/赋形剂溶液含具有10mM氯化钙、0.85％氯化钠、0.1％甘露醇、0.5％甲醇和0.1％羟苯甲酯的35mM马来酸/马来酸盐缓冲液。底物与pH约5.4的缓冲剂混合以提供对产生神经氨酸酶病毒进行监测，对于不产生神经氨酸酶病毒和阴性病毒培养物具有清楚的阴性结果。
使试验溶液在37℃下培养约1小时，通过加入0.2毫升缓冲剂浓缩物将pH改变为约为9来中止反应，并帮助增加所释放的显色物质的沉淀。完成的反应混合物然后转移到含选择性多孔滤膜和吸收垫的收集设备中以吸去溶液，从而使沉淀物浓缩。收集装置在我们共同待批专利申请08/479,789(1995年6月7日提交)中揭示。出现合适颜色的沉淀物表示是阳性反应，而没有这类合适颜色的沉淀物表示阴性反应。使用5…溴-3-吲哚基显色物，阳性试验的沉淀物的特征颜色为蓝色。
下列病毒用来试验5-溴-3-吲哚基-4-甲氧基-N-乙酰基神经氨酸底物(BI-4-MeONeu5Ac)和5-溴-3-吲哚基-4，7-二甲氧基-N-乙酰基神经氨酸底物(BI-4，7-(MeO)2Neu5Ac)。
    病毒   滴度     来源
    流行性感冒A     #1 ATCC # VR97菌株A1/FM/1/47
    #2 ATCC # VR97菌株A1/FM/1/47
    流行性感冒B     #1 新墨西哥大学临床分离菌#92-7471
    #2 新墨西哥大学临床分离菌#92-7471
  副流行性感冒1型     #1 Cardinal Glenon Children’s Clinical分离菌#92-48
    #2 Cardinal Glenon Children’s Clinical分离菌#92-7902
  副流行性感冒2型     #1 新墨西哥大学临床分离菌#92-6173
    #2 新墨西哥大学临床分离菌#92-6173
  副流行性感冒3型     #1 Cardinal Glenon Children’s Clinical分离菌#94-5576
    #2 新墨西哥大学临床分离菌#93-4546
    腮腺炎病毒     #1 ACTT #VR-106菌株Enders
    #2 ACTT #VR-106菌株Enders
    #3 ACTT #VR-106菌株Enders
  呼吸道合胞病毒     #1 ACTT #VR-106菌株Long
    腺病毒     #1 新墨西哥大学临床分离菌#93-0539
用这些各种病毒培养物得到下列结果。病毒培养物生长到其最大的滴度(通过多方面观察…约90到100％…在细胞片中有病毒特征的细胞病原作用，和对大多数细胞进行荧光分析有苹果绿、病毒特异的着色进行确证)以保证任何反应差异不是由于不可监测的病毒浓度产生的。
    病毒   滴度   BI-4-MeONeu5Ac  BI-4，7-(MeO)2Neu5Ac
  流行性感冒A     #1     1+     1+
    #2     1+/2+     2+
  流行性感冒B     #1     1+     1+
    #2     3+     3+
副流行性感冒1型     #1     阴性     阴性
    #2     2+     阴性
副流行性感冒2型     #1     阴性     阴性
    #2     1+/2+     阴性
副流行性感冒3型     #1     不确定     阴性
    #2     阴性     阴性
  腮腺炎病毒     #1     阴性     阴性
    #2     1+     阴性
    #3     3+     阴性
呼吸道合胞病毒     #1     阴性     阴性
    腺病毒     #1     阴性     阴性
根据反应颜色的强度作出的1+到3+的分级用来表示可监测到的神经氨酸活性的相对水平。分级颜色与来自标准参照源(The PantoneColor Specific Book747XR)的颜色样本相配。1+(淡颜色)表示低阳性，2+(中等颜色)表示中等阳性，3+(深颜色)表示高阳性。没有特征颜色表示为阴性。若肉眼观察到极为暗淡的特征颜色或提示有特征颜色，则表示不确定的结果。
从这些结果可见，含流行性感冒A型和B型神经氨酸酶的病毒为与未稀释的4-甲氧基-Neu5Ac和4，7-二甲氧基-Neu5Ac底物和所有稀释试验中给出阳性反应的仅有的试验微生物。对于副流行性感冒1、2和3型病毒和腮腺炎病毒，4-甲氧基-Neu5Ac底物根据稀释情况给出阴性和阳性反应。副流行性感冒1型、2型和3型及其腮腺炎病毒与4，7-二甲氧基-Neu5Ac底物不论是未稀释或稀释时都是阴性的。含非神经氨酸酶病毒(即呼吸道合胞病毒和腺病毒)与两个底物都产生阴性结果。当然，没有病毒的阴性对照也是阴性的。这些结果清楚地显示出4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸显色底物对流行性感冒A型和B型病毒的特异性。
实施例4
用5-溴-4-氯-吲哚-3-醇和4-甲基-7-羟基香豆素作为4-甲氧基-Neu5Ac和4，7-二甲氧基-Neu5Ac的报告性分子时得到与实施例3相似的结果。
预期本技术领域的人员在考虑到前述本发明的详述后，对实施本发明可有许多种修饰和改变。结果这类修饰和改变也在下列权利要求书的范围里。

Claims (15)

1.一种下式的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸：其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基。
2.根据权利要求1所述的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸，其中R1和R2是甲基。
3.根据权利要求1所述的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸，其中R1和R2是乙基。
4.一种下式的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物：
Figure C9719131300022
其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是显色或荧光基团。
5.根据权利要求4所述的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，其中R1和R2是甲基，R3是显色基团。
6.根据权利要求5所述的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，其中R3选自4-甲基-7-羟基-香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-试卤灵、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮间苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基和6-溴-2-萘基。
7.根据权利要求6所述的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，其中R3是5-溴-3-吲哚基。
8.根据权利要求4所述的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，其中R1和R2都是乙基，R3是显色基团。
9.根据权利要求8所述的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，其中R3选自4-甲基-7-羟基-香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-试卤灵、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮间苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基和6-溴-2-萘基。
10.一种对来自怀疑有呼吸道病毒感染的个体的临床样本检测流行性感冒A和B型病毒的方法，所述的方法包括：
(1)将临床样本与下列通式的显色或荧光4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸底物一起培养：
Figure C9719131300031
其中R1和R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是当从底物或底物的盐上裂解下来后出现明显的和特征性颜色的显色或荧光基团；
(2)观察培养的临床样本以决定是否形成了明显的和特征性的颜色，其中明显的和特征性颜色的形成表示在临床样本中有流行性感冒A或B型病毒的存在。
11.根据权利要求10所述的方法，其中R1和R2是甲基，R3是显色基团。
12.根据权利要求11所述的方法，其中R3选自4-甲基-7-羟基-香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-试卤灵、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮间苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基和6-溴-2-萘基。
13.根据权利要求12所述的方法，其中R3是5-溴-3-吲哚基。
14.根据权利要求10所述的方法，其中R1和R2都是乙基，R3是显色基团。
15.根据权利要求14所述的方法，其中R3选自4-甲基-7-羟基-香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-试卤灵、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮间苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基和6-溴-2-萘基。
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