DE69712747T2 - 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminsaurederivate und methoden zur erkennung von influenza typ a und b in klinischen proben - Google Patents
4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminsaurederivate und methoden zur erkennung von influenza typ a und b in klinischen probenInfo
- Publication number
- DE69712747T2 DE69712747T2 DE69712747T DE69712747T DE69712747T2 DE 69712747 T2 DE69712747 T2 DE 69712747T2 DE 69712747 T DE69712747 T DE 69712747T DE 69712747 T DE69712747 T DE 69712747T DE 69712747 T2 DE69712747 T2 DE 69712747T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- bromo
- indolyl
- dialkoxy
- group
- chromogenic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims description 11
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 title abstract description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 62
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 56
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 18
- -1 3-cyanoumbelliferyl Chemical group 0.000 claims description 90
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 30
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 9
- 125000004207 3-methoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C(OC([H])([H])[H])=C1[H] 0.000 claims description 7
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 7
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 claims description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 11
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 8
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 48
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 6
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 5
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 5
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- YOMWLCGPHJBDTL-YZMNKZFSSA-N CO[C@@]1(O)[C@](NC(C)=O)(Br)[C@H]([C@](O)([C@H](O)CO)OC)OC(O)(C(O)=O)C1C1=CC2=CC=CC=C2N1 Chemical compound CO[C@@]1(O)[C@](NC(C)=O)(Br)[C@H]([C@](O)([C@H](O)CO)OC)OC(O)(C(O)=O)C1C1=CC2=CC=CC=C2N1 YOMWLCGPHJBDTL-YZMNKZFSSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 4
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 4
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003377 acid catalyst Substances 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006200 ethylation reaction Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 2
- XINRYKXXTWADCP-NCCGYJHYSA-N OC(=O)C1(O)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@](NC(C)=O)(Br)[C@@](OC)(O)C1C1=CC2=CC=CC=C2N1 Chemical class OC(=O)C1(O)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@](NC(C)=O)(Br)[C@@](OC)(O)C1C1=CC2=CC=CC=C2N1 XINRYKXXTWADCP-NCCGYJHYSA-N 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000006203 ethylation Effects 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UPMFZISCCZSDND-JJKGCWMISA-M sodium gluconate Chemical compound [Na+].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O UPMFZISCCZSDND-JJKGCWMISA-M 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- SXFBQAMLJMDXOD-UHFFFAOYSA-N (+)-hydrogentartrate bitartrate salt Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O SXFBQAMLJMDXOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- YKYIFUROKBDHCY-ONEGZZNKSA-N (e)-4-ethoxy-1,1,1-trifluorobut-3-en-2-one Chemical group CCO\C=C\C(=O)C(F)(F)F YKYIFUROKBDHCY-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 1
- WOLVOYIZHIXSSE-UHFFFAOYSA-N 1-(5-bromo-3-hydroxyindol-1-yl)ethanone Chemical compound BrC1=CC=C2N(C(=O)C)C=C(O)C2=C1 WOLVOYIZHIXSSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMHJTELEAIHBJT-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-1h-indole Chemical compound ClC1=C(Br)C=CC2=C1C=CN2 JMHJTELEAIHBJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXCKOXONHIRKQP-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(O)=CNC2=C1 AXCKOXONHIRKQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSUYQOYAPVYVHS-UHFFFAOYSA-N 6-bromonaphthalen-1-ol Chemical compound BrC1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 FSUYQOYAPVYVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDARAEPREYFQTE-AADXMLHVSA-N C1=C(Br)C=C2C(O)=CNC2=C1.OC[C@@H](O)[C@](O)(OC)[C@@H]1OC(O)(C(=O)OCOC(C)=O)C[C@@](O)(OC)[C@H]1NC(C)=O Chemical compound C1=C(Br)C=C2C(O)=CNC2=C1.OC[C@@H](O)[C@](O)(OC)[C@@H]1OC(O)(C(=O)OCOC(C)=O)C[C@@](O)(OC)[C@H]1NC(C)=O XDARAEPREYFQTE-AADXMLHVSA-N 0.000 description 1
- NRUJWVPSOHHQIL-ASOHTZRWSA-N CC(=O)N[C@H]1[C@@H](OC(C([C@@]1(O)OC)C2=CC3=CC=CC=C3N2)(C(=O)O)O)[C@@]([C@@H](CO)O)(O)OC Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](OC(C([C@@]1(O)OC)C2=CC3=CC=CC=C3N2)(C(=O)O)O)[C@@]([C@@H](CO)O)(O)OC NRUJWVPSOHHQIL-ASOHTZRWSA-N 0.000 description 1
- XJAKKVPLKLNDAC-CLLZQFASSA-N CO[C@]1(O)CC(O)(C(O)=O)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H]1NC(C)=O Chemical compound CO[C@]1(O)CC(O)(C(O)=O)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H]1NC(C)=O XJAKKVPLKLNDAC-CLLZQFASSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100020870 La-related protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050008265 La-related protein 6 Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-ZTVVOAFPSA-N N-acetyl-D-mannosamine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-ZTVVOAFPSA-N 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QADZSQKMCOHYAY-ZYYQGTOUSA-N OC[C@@H](O)[C@](O)(OC)[C@@H]1OC(O)(C(O)=O)C[C@@](O)(OC)[C@H]1NC(C)=O Chemical compound OC[C@@H](O)[C@](O)(OC)[C@@H]1OC(O)(C(O)=O)C[C@@](O)(OC)[C@H]1NC(C)=O QADZSQKMCOHYAY-ZYYQGTOUSA-N 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100272976 Panax ginseng CYP716A53v2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M Potassium gluconate Chemical compound [K+].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- PTDQUWYFMZSJJM-UHFFFAOYSA-K [Na+].[Na+].[Na+].[Cl-].OP([O-])([O-])=O Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Cl-].OP([O-])([O-])=O PTDQUWYFMZSJJM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006208 butylation Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- LMEDOLJKVASKTP-UHFFFAOYSA-N dibutyl sulfate Chemical class CCCCOS(=O)(=O)OCCCC LMEDOLJKVASKTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N diethyl sulfate Chemical compound CCOS(=O)(=O)OCC DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940008406 diethyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- KNKDZWFHOIKECV-UHFFFAOYSA-L dipotassium 2,3,4-trihydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound [K+].[K+].OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O KNKDZWFHOIKECV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OQOQSRMIBLJVHE-UHFFFAOYSA-L dipotassium 2-hydroxy-2-oxoacetate Chemical compound [K+].[K+].OC(=O)C(O)=O.[O-]C(=O)C([O-])=O OQOQSRMIBLJVHE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JYCKNDWZDXGNBW-UHFFFAOYSA-N dipropyl sulfate Chemical class CCCOS(=O)(=O)OCCC JYCKNDWZDXGNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGFMTHGYKYEDHF-UHFFFAOYSA-L disodium 2-hydroxy-2-oxoacetate Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)C(O)=O.[O-]C(=O)C([O-])=O WGFMTHGYKYEDHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SILCDLWESNHZKB-UHFFFAOYSA-L disodium 4-hydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CCC([O-])=O.OC(=O)CCC([O-])=O SILCDLWESNHZKB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L disodium fumarate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L 0.000 description 1
- MYSDBRXBYJKGLB-WOGKQDBSSA-L disodium;(e)-but-2-enedioate;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)\C=C\C(O)=O.[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O MYSDBRXBYJKGLB-WOGKQDBSSA-L 0.000 description 1
- LVXHNCUCBXIIPE-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O LVXHNCUCBXIIPE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007421 fluorometric assay Methods 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- KDCIHNCMPUBDKT-UHFFFAOYSA-N hexane;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCCCCC KDCIHNCMPUBDKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000147 hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000000654 isopropylidene group Chemical group C(C)(C)=* 0.000 description 1
- BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N keto-neuraminic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N 0.000 description 1
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 1
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- QABLOFMHHSOFRJ-UHFFFAOYSA-N methyl 2-chloroacetate Chemical class COC(=O)CCl QABLOFMHHSOFRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940039748 oxalate Drugs 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000004224 potassium gluconate Substances 0.000 description 1
- 235000013926 potassium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003189 potassium gluconate Drugs 0.000 description 1
- LCPMNMXCIHBTEX-UHFFFAOYSA-M potassium;2-hydroxypropanoate;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound [K+].CC(O)C(O)=O.CC(O)C([O-])=O LCPMNMXCIHBTEX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000006207 propylation Effects 0.000 description 1
- ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N pyridinium p-toluenesulfonate Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1.CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinyl group Chemical group C1(O)=CC(O)=CC=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- KYOYLUVYCHVYGC-BUOKYLHBSA-M sodium (E)-but-2-enedioic acid (E)-4-hydroxy-4-oxobut-2-enoate Chemical compound [Na+].OC(=O)\C=C\C(O)=O.OC(=O)\C=C\C([O-])=O KYOYLUVYCHVYGC-BUOKYLHBSA-M 0.000 description 1
- 235000019265 sodium DL-malate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000019294 sodium fumarate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000176 sodium gluconate Substances 0.000 description 1
- 235000012207 sodium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005574 sodium gluconate Drugs 0.000 description 1
- WPUMTJGUQUYPIV-UHFFFAOYSA-L sodium malate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O WPUMTJGUQUYPIV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LLVQEXSQFBTIRD-UHFFFAOYSA-M sodium;2,3,4-trihydroxy-4-oxobutanoate;hydrate Chemical compound O.[Na+].OC(=O)C(O)C(O)C([O-])=O LLVQEXSQFBTIRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KMPHTYSTEHXSTL-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropanoate;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound [Na+].CC(O)C(O)=O.CC(O)C([O-])=O KMPHTYSTEHXSTL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VDZDAHYKYRVHJR-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropanoate;hydrate Chemical compound [OH-].[Na+].CC(O)C(O)=O VDZDAHYKYRVHJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OESFSXYRSCBAQJ-UHFFFAOYSA-M sodium;3-carboxy-3,5-dihydroxy-5-oxopentanoate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC([O-])=O OESFSXYRSCBAQJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DGPIGKCOQYBCJH-UHFFFAOYSA-M sodium;acetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].CC([O-])=O DGPIGKCOQYBCJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VBGUQBPWJMPQBI-UHFFFAOYSA-M sodium;butanedioic acid;4-hydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound [Na+].OC(=O)CCC(O)=O.OC(=O)CCC([O-])=O VBGUQBPWJMPQBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JISIBLCXFLGVJX-UHFFFAOYSA-M sodium;butanedioic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OC(=O)CCC(O)=O JISIBLCXFLGVJX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KIJIBEBWNNLSKE-UHFFFAOYSA-M sodium;oxalic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OC(=O)C(O)=O KIJIBEBWNNLSKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K trisodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
- C07H7/02—Acyclic radicals
- C07H7/027—Keto-aldonic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/50—Indoles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung stellt chromogene und fluorgene 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrate bereit, die zum Nachweisen von Influenza-Typen A und B in klinischen Proben oder Mustern verwendet werden können. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure- Substrate bereit, die verwendet werden können, um zwischen verschiedenen Viren mit Neuraminidase-Reaktivität zu unterscheiden. Damit können Influenza-Viren vom Typ A und B von Parainfluenza-Viren vom Typ 1, 2, 3 und 4 und Mumps-Viren unter Verwendung der 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure- Derivate dieser Erfindung unterschieden werden.
- Infektiöse Krankheiten sind alleine die häufigste Ursache für Arztbesuche. Viren sind für mehr dieser Infektionen verantwortlich als alle anderen Gruppen von Mikroorganismen zusammen. Unter den verschiedenen Infektionen, die durch Viren hervorgerufen werden, sind Viren, die die Atemwege betreffen (Influenza A und B; Parainfluenza 1, 2, 3 und 4; respiratorischer syncytialer Virus; und Adenovirus), als eine Gruppe am weitesten verbreitet. Die Letalität des Influenza- Virus wurde bereits 430 vor Christus während der Pest in Athen entdeckt (Langmuir et al., New Engl. J. Medicine, 313 (1985) 1027). Influenza ist die Nummer eins, die akute Atemwegserkrankung verursacht, und zu den sechs führenden Todesursachen in den Vereinigten Staaten beiträgt (Monthly Vital Statistics Report, Bd. 43, Nr. 6 (1995)). Als ein Ergebnis wurde die Entwicklung von Diagnoseverfahren für Viren und viralen Infektionen immer wichtiger.
- Die schnelle Diagnose von viralen Infektionen wurde auch ein wesentlicher Bestandteil guter praktischer Medizin. Einige Viren haben definierbare Antigene, gegen die Antikörper hergestellt werden können. Daher sind Immunoassay für die Messung der Anwesenheit eines Virions viel benutzt worden. Wo es wünschenswert ist, eine breite Gruppe an Virionen zu messen, kann es möglich sein, eine spezielle Komponente des Virus nachzuweisen. Z. B. exprimieren Influenza-Viren Oberflächenglycoproteine mit Neuraminidase (Sialidase) - Aktivität. Das Neuraminidase-Enzym hydrolysiert Substrate, die 2-ketosidisch gebundene N-Acetylneuraminsäure enthalten (Neu5Ac, auch bekannt als Sialsäure). Neu5Ac besteht aus einer Hauptkette von 9 Kohlenstoffatomen, einer Carboxyl- Gruppe und einer N-Acetyl-Gruppe. Die allgemeine Struktur sowie das System zum Numerieren, das verwendet wird, um die Kohlenstoffatome zu bezeichnen, ist unten gezeigt.
- Wenn ein Virion mit Neuraminidase-Aktivität mit einem chromogenen oder fluorogenen Glycosid von Neu5Ac inkubiert wird, wird das Enzym das chromogene oder fluorogene Aglycon von dem Substrat abspalten und das Reaktionsprodukt wird auf die Anwesenheit eines Virions hinweisen. In dieser ganzen Patentschrift wird die N-Acetyl-Gruppe, die in der obigen Formel mit dem Kohlenstoff in 5-Position verbunden ist, als AcHN bezeichnet.
- Ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Virus durch die Reaktion eines Enzyms mit einem chromogenen Substrat für das Enzym wird in dem US-Patent 5 252 458 beschrieben. Ein Assay für die direkte Messung von Influenzaneuraminidase wurde von Yolken et al. (J. Infectious Diseases, 142 (1980) 516-523) entwickelt. Yolken et al. verwendeten das 4-Methylumbelliferyl-2-ketosid von Neu5Ac als ein fluoreszierendes Substrat, um die Neuraminidase-Aktivität in Präparaten zu messen, die kleine Mengen an kultiviertem Virus enthielten, sowie in einigen Proben einer Nasenauswaschung von menschlichen Freiwilligen, die mit dem Influenza-Virus infiziert waren. Yolken et al. schlugen vor, daß "erfolgreiche Entwicklung von fluorometrischen Enzym- Assays für den Nachweis von Influenzaneuraminidase damit ein praktisches Mittel für Influenza-Diagnose bereitstellen mag, das schnell genug ist, angemessen vorbeugende und therapeutische Eingriffe zu gestatten. Gemäß Yolken et al. waren colorimetrische Assays unzureichend empfindlich für klinische Anwendungen. Im Gegensatz dazu bemerkten Yolken et al., daß fluorometrische Assays zum Nachweis von Influenzaneuraminidase in klinischen Proben geeignet sein könnten.
- Pachucki et al. (J. Clinical Microbiology, 26 (1988, 2664- 2666) untersuchten das 4-Methylumbelliferyl-2-ketosid von Neu5Ac an klinischen Proben, die von Influenza-Patienten gesammelt wurden. Aufgrund seiner geringen Empfindlichkeit war das Assay für den direkten und schnellen Nachweis von Neuraminidase in klinischen Proben nicht nützlich. Das Assay identifizierte aber 91% der Viruspositiven Isolierungen 25 Stunden nach Beimpfung von Gewebekulturen.
- Die Verwendung von modifizierten Neu5Ac-Substraten kann die Spezifität des Neuraminidase-Assays erhöhen. Es ist berichtet worden, daß in Sialsäuren der Kohlenstoff in 4-Position (C-4) eine wichtige Rolle bei Enzym-Substrat-Wechselwirkungen spielt. Da es bekannt ist, daß Speichelbakterien-Enzyme Neuraminidase-Aktivität zeigen (Varki et al., J. Bio. Chem., 258 (1983) 12465-12471) ist es ferner wesentlich, diese unerwünschten Wechselwirkungen zu beseitigen. Es ist bereits gezeigt worden, daß Ketoside von 4-Methoxy-Neu5Ac gegenüber gewissen bakteriellen Sialidasen resistent. sind, aber schnell durch gewisse virale Sialidasen abgespaltea werden (Beau et al., Eur. J. Biochem., 106 (1980) 531-540).
- Gemäß WO-A-91 09972 werden chromogene Derivate von N- Acetylneuraminsäure, modifiziert in der 4-Position, als Substrate verwendet, um Influenza-Infektion nachzuweisen.
- Obwohl Modifikation der 4-Position von N-Acetylneuraminsäuren Spezifität zwischen gewisser viraler und gewisser bakterieller Neuraminidase-Reaktivität bereitstellt, würde es noch wünschenswerter sein, Substrate zu erhalten, die weitere Spezifität oder Differenzierung zwischen den verschiedenen viralen Neuraminidase-Reaktivitäten erlauben, während die Spezifität zwischen viralen und bakteriellen Neuraminidase- Reaktivitäten erhalten bleibt. Solche Substrate würden z. B. hohe Spezifität für spezielle Typen von Neuraminidase enthaltenden Viren und bessere und direktere Behandlungstherapien erlauben. Solche Substrate würden auch exaktere Überwachung von viralen Infektionen und gezielteres, jeweils anwendbares medizinisches Eingreifen, erlauben. Die chromogenen und fluorogenen 4,7-modifizierten N-Acetylneuraminsäure-Substrate der vorliegenden Erfindung schaffen die Voraussetzung für weitere Spezifität und Differenzierung zwischen den verschiedenen viralen Neuraminidase-Reaktivitäten, während die Spezifität zwischen viralen und bakteriellen Neuraminidase-Reaktivitäten erhalten bleibt.
- Diese Erfindung betrifft chromogene und fluorogene 4,7-modifizierte N-Acetylneuraminsäure-Substrate, die für den Nachweis und die Identifizierung von Influenza-Viren in klinischen Proben verwendet werden können. Insbesondere betrifft diese Erfindung chromogene und fluorogene 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrate, die für den Nachweis und die Identifizierung von Influenza-Viren in klinischen Proben verwendet werden können. Diese 4,7-modifizierten N-Acetylneuraminsäure-Substrate können in diagnostischen Tests verwendet werden, um zwischen Influenza- Viren vom Typ A und B und anderen Neuraminidase-Enzyme aufweisenden Viren in klinischen Proben zu unterscheiden. Diese Erfindung betrifft auch diagnostische Verfahren, die solche Substrate anwenden.
- Es ist beabsichtigt, daß die hier verwendeten Ausdrücke "chromogene oder fluorogene Gruppe" und "Marker- oder Reportergruppe" ohne Limitierung Moleküle beinhalten, die Extinktion oder Fluoreszenz zeigen. Dementsprechend ist beabsichtigt, daß der Ausdruck "Farbe" ohne Limitierung Extinktion und Fluoreszenz beinhaltet.
- Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, chromogene und fluorogene 4,7-modifizierte N-Acetylneurazninsäure-Substrate bereitzustellen, die für diagnostische Verfahren zum Nachweis von Viren verwendbar sind. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein praktisches, bequemes und kosteneffektives Verfahren zum Nachweis von Influenza-Viren vom Typ A und. B in klinischen Proben bereitzustellen. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein praktisches, bequemes und kosteneffektives diagnostisches Verfahren bereitzustellen, das zwischen Influenza-Viren vom Typ A und B und anderen Viren mit allgemeiner Neuraminidase- Reaktivität in klinischen Proben unterscheiden kann.
- Noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure der allgemeinen Formel
- bereitzustellen, worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Gruppen sind, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugt sind sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Methyl-Gruppen.
- Noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat der allgemeinen Formel
- bereitzustellen, worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Gruppen sind, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, und R&sub3; eine chromogene oder fluorogene Gruppe ist. Bevorzugt sind sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Methyl-Gruppen und R&sub3; ist eine chromogene Gruppe.
- Noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis von Influenza-Viren vom Typ A und B in einer klinischen Probe von einer Einzelperson, die im Verdacht steht, eine virale Infektion der Atemwege zu haben, bereitzustellen, wobei das Verfahren umfaßt:
- (1) Inkubieren der klinischen Probe mit einem chromogenen oder fluorogenen 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat der allgemeinen Formel
- worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Reste sind, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, und R&sub3; eine chromogene oder fluorogene Gruppe ist, die eine deutliche und charakteristische Farbe zeigt, wenn sie von dem Substrat oder einem Salz des Substrats abgespalten wird;
- (2) Beobachten der inkubierten klinischen Probe, um zu bestimmen, ob die deutliche und charakteristische Farbe gebildet wird, wobei die Bildung der deutlichen und charakteristischen Farbe auf die Anwesenheit von Influenza- Viren vom Typ A oder B in der klinische Probe hinweist.
- Noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis von Influenza-Viren vom Typ A und B in einer klinischen Probe von einer Einzelperson, die im Verdacht steht, eine virale Infektion der Atemwege zu haben, bereitzustellen, wobei das Verfahren umfaßt:
- (1) Teilen der klinischen Probe in einen ersten Teil und einen zweiten Teil;
- (2) Inkubieren des ersten Teils mit einem chromogenen oder fluarogenen ersten 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure- Substrat der allgemeinen Formel
- worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Reste sind, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, und R&sub3; eine erste chromogene oder fluorogene Gruppe ist, die eine deutliche und charakteristische erste Farbe zeigt, wenn sie von dem ersten Substrat oder einem Salz des ersten Substrats abgespalten wird;
- (3) Beobachten des inkubierten ersten Teils, um zu bestimmen; ob die deutliche und charakteristische erste Farbe gebildet wird, wobei die Bildung der deutlichen und charakteristischen ersten Farbe auf die Anwesenheit von Influenza-Viren vom Typ A oder B in der klinischen Probe hinweist;
- (4) Inkubieren des zweiten Teils mit einem chromogenen oder fluorogenen zweiten 4-Alkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat der allgemeinen Formel
- worin R&sub4; ein Alkyl-Rest ist, der 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, und R&sub5; eine zweite chromogene oder fluorogene Gruppe ist, die eine deutliche und charakteristische zweite Farbe zeigt, wenn sie von dem zweiten Substrat oder einem Salz des zweiten Substrats abgespalten wird; und
- (5) Beobachten des inkubierten zweiten Teils, um zu bestimmen, ob die deutliche und charakteristische zweite Farbe gebildet wird, wobei die Bildung der deutlichen und charakteristischen zweite Farbe auf die Anwesenheit von Neuraminidase reaktiven Viren in der klinischen Probe hinweist;
- wobei die Anwesenheit der ersten und zweiten Farbe auf die Anwesenheit von Influenza-Viren vom Typ A oder Ballein oder in Kombination mit Neuraminidase reaktiven Viren, andere als Influenza-Viren vom Typ A und B, in der klinischen Probe hinweist;
- wobei die Anwesenheit der zweiten Farbe und das Fehlen der ersten Farbe auf Neuraminidase reaktive Viren, andere als Influenza-Viren vom Typ A und B, in der klinischen Probe hinweist; und
- wobei das Fehlen der ersten und zweiten Farbe auf die Abwesenheit von Neuraminidase reaktiven Viren in der klinischen Probe hinweist.
- Andere Aufgaben, Vorteile, Merkmale und Charakteristiken der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden Beschreibung und der angefügten Ansprüche deutlicher.
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine 4,7-Dialkoxy-Nacetylneuraminsäure der allgemeinen Formel
- worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Gruppen sind, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten. R&sub1; und R&sub2; können gleiche oder verschiedene Alkyl-Gruppen sein. Die höheren Alkyl-Gruppen (d. h. wenn R 3 bis 4 Kohlenstoffatome enthält) beinhalten lineare oder verzweigte Isomere. Bevorzugt sind R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Gruppen, die 1 oder 2 Kohlenstoffatome enthalten; insbesondere bevorzugt sind sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Methyl- Gruppen.
- Die 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung des folgenden allgemeinen Reaktionsschemas hergestellt werden:
- Das Ausgangsmaterial 1 (8,9-O-Isopropylidin-methylestermethylketosid-Derivat von NeuSAc) wird aus Neu5Ac hergestellt, wie allgemein in unserem US-Patent 5 556 963, erteilt 17. September 1996 (Anmeldungsserien-Nr. 08/286 573, eingereicht am 5. August 1994) beschrieben, das hiermit durch das Zitat eingeschlossen wird. Neu5Ac ist kommerziell erhältlich (MediHerb Inc., 4540 S. Navajo #1, Englewood, Co. 80110). Es kann auch enzymatisch aus N-Acetyl-D-mannosamin und Brenztraubensäure synthetisiert werden, wobei das Verfahren, das von Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 6481 beschrieben und durch die folgende Gleichung verdeutlich wird, verwendet wird: Schema 1
- Die enzymatische Reaktion kann mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) kontrolliert werden und das Produkt kann durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt werden.
- Neu5Ac wird zuerst in ein Alkylesteralkylketosid der allgemeinen Formel
- umgewandelt, wie in dem US-Patent 5 556 963 beschrieben. Die vicinalen Hydroxyl-Gruppen am C-8 und C-9 dieses Methylestermethylketosids werden durch die Bildung eines Ketals (1) durch die Behandlung mit wirksamen Mengen an Aceton und einem sauren Katalysator, wodurch das Ketal gebildet wird, geschützt. Geeignete saure Katalysatoren beinhalten p-Toluolsulfonsäure, Salze von p-Toluolsulfonsäure wie das Pyridinsalz (PPTS) und andere Salze ZnCl&sub2;, FeCl&sub3; und dgl. Der bevorzugte saure Katalysator ist das nichthygroskopische Pyridinsalze von p-Toluolsulfonsäure.
- Das geschützte Methylestermethylketosid (1) wird dann alkyliert, um eine Mischung von Verbindung 2, enthaltend eine Alkoxy-Gruppe an der 4-Position, und Verbindung 3 mit Alkoxy- Gruppen sowohl in 4- als auch 7-Position. Alkylierung der Hydroxyl-Gruppe am C-4 und C-7 kann Methylierung, Ethylierung, Propylierung oder Butylierung sein, wodurch die Hydroxy-Gruppe am C-4 in 2 in eine -OR-Gruppe umgewandelt wird und die Hydroxy-Gruppen am C-4 und C-7 in 3 in -OR- Gruppen umgewandelt werden, worin R ein Alkyl-Rest ist, der 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Bevorzugt ist die Alkylierung am C-4 und/oder C-7 Methylierung oder Ethylierung; wodurch 4-Methoxy- oder 4-Ethoxy-Derivate oder 4,7-Dimethoxy- oder 4,7-Diethoxy-Derivate erhalten werden. Bevorzugter ist die Alkylierung am C-4 und/oder C-7 Methylierung, wodurch 4-Methoxy- oder 4,7-Dimethoxy-Derivate erhalten werden. Einbringung von höheren Alkyl-Gruppen an den C-4- und C-7- Positionen ist gewöhnlich langsamer als Methylierung und die Ausbeuten sind ein wenig niedriger. Ferner neigen chromogene Substrate mit höheren Alkyl-Gruppen dazu, weniger empfindlich hinsichtlich enzymatischer Abspaltung zu sein als 4,7-Dimethoxy-Neu5Ac, wodurch weniger empfindliche Assays resultieren. Nichts desto Trotz können für einige spezielle Anwendungen und Assays solche höheren Alkyl-Gruppen am C-4 und. C-7 nützlich und sogar bevorzugt sein.
- Alkylierung an der sterisch mehr gehinderten freien Hydroxyl- Gruppe am C-7 kann durch Einstellen der Reaktionsbedingungen, wie hier im folgenden sofort beschrieben, gefördert werden. Gemäß dem Verfahren wird das Zwischenprodukt 1 mit einem Überschuß (gewöhnlich größer als etwa 1,5 molare Äquivalente) eines Alkylierungsmittels in einer etwa 80%igen Natriumhydroxid-Dispersion behandelt. Das Alkylierungsmittel wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dimethylsulfat, Diethylsulfat, Dipropylsulfate und Dibutylsulfate. Die Reaktion wird gewöhnlich bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 30ºC für etwa 10 Minuten bis etwa 48 Stunden durchgeführt. Die Reaktionstemperatur ist bevorzugt im Bereich von etwa 0ºC bis etwa 22ºC. Längere Reaktionszeiten sind gewöhnlich bevorzugt, wenn die höheren Alkoxy-Gruppen an der 4- und 7-Positionen gebildet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Methylierungsreaktion zum Bilden von Methoxy-Gruppen am C-4 und C-7 bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 30ºC, bevorzugter von etwa 0ºC bis etwa 22ºC, für etwa 10 Minuten bis etwa 30 Minuten durchgeführt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der. Erfindung wird eine Ethylierungsreaktion zum Bilden von Ethoxy-Gruppen am C-4 und C-7 bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 30ºC, bevorzugter von etwa 0ºC bis etwa 22ºC, für etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden durchgeführt.
- Die Behandlung des geschützten Methylestermethylketosids 1 mit einem Überschuß Alkylierungsmittel (z. B. Dimethylsulfat) erzeugt eine Mischung von Komponente 2, die eine Alkoxy- Gruppe in der 4-Position enthält, und Verbindung 3 mit Alkoxy-Gruppen in sowohl der 4- als auch 7-Position. Gewöhnlich wird ein Überschuß von etwa 1,5 molaren Äquivalenten an Alkylierungsmittel verwendet. Bevorzugt werden etwa 1,5 bis etwa 2,0 molare Äquivalente des Alkylierungsmittels verwendet. Gewöhnlich erhöht sich die Menge der gewünschten Verbindung 3 relativ zur Verbindung 2, wenn die Menge an Alkylierungsmittel erhöht wird. Die Reaktionsmischung, die aus solch einer Behandlung resultiert, enthält gewöhnlich die 4-Alkoxy-Verbindung 2 als Hauptprodukt und etwa 10 bis 20 Gew.-% der 4,7-Dialkoxy-Verbindung 3. Teilweise Trennung der Verbindungen 2 und 3 kann z. B. durch Säulenchromatographie und anschließende Kristallisation aus einer Aceton-Hexan-Mischung, die vorzugsweise die 4-Alkoxy- Verbindung 2 entfernt, erhalten werden. Der resultierende Rest enthält eine Mischung aus den zwei Verbindungen, die mit dem 4,7-Dialkoxy-Material angereichert ist; gewöhnlich ist das molare Verhältnis der zwei Verbindungen auf wenigstens etwa 1 : 1 erhöht.
- Entfernung der Ketal-Gruppe aus Verbindung 3 wird durch Behandeln mit etwa 80%iger Essigsäure erreicha. Die Essigsäure-Hydrolyse kann auch in teilweise Acetylierung an der C-9 Hydroxy-Gruppe resultieren. Daher kann das Hydrolyse- Produkt mit Natriummethoxid behandelt werden, um jegliche Acetat-Gruppen am C-9 zu entfernen. Abschließende Entschützung von 4 wird durch alkalische Behandlung und nachfolgende saure Hydrolyse durchgeführt, um das Endprodukt 4,7-Dialkoxy-Neu5Ac (5) zu ergeben. Natürlich wird die in der Mischung vorliegende 4-Alkoxy-Verbindung 2 auch auf eineähnliche Weise behandelt, um die entsprechende 4-Alkoxy- NeuSAc-Verbindung zu ergeben.
- Das resultierende 4,7-Dialkoxy-Neu5AC kann ferner verwendet werden durch Koppeln an eine geeignete Marker- oder Reporter- Gruppe, einschließlich z. B. eine chromogene oder fluorogene Marker-Gruppe. Die bevorzugte Marker- oder Reporter-Gruppe ist eine chromogene Gruppe einschließlich z. B. 4-Chloro-1- naphthol, 6-Bromo-1-naphthol und 5-Bromo-4-chlor-indol. Chromogenes modifiziertes 4,7-Dialkoxy-Neu5Ac kann in ein Neruaminidase-Assay, das zum Detektieren von viraler Neuraminidase-Aktivität von Influenza Typ A und B in klinischen Proben oder Präparaten verwendbar ist, eingebaut werden. Verfahren zum Synthetisieren und Verwenden solcher in 4,7-Position modifizierten chromogenen N-Acetylneuraminsäure- Substrate in viralen Assays sind ähnlich zu solchen, die für die verwandten in 4-Position modifizierten Substrate in der PCT-Veröffentlichungsschrift WO 91/09972; Yolken et al., J. Infectious Diseases, 142 (1980) 516-523; und Pachucki et al., J. Clinical Microbiology, 26 (1988) 2664-266 beschrieben sind. Natürlich können die vorliegenden 4,7-Dialkoxy-Nacetylneuraminsäuren auch in anderen viralen Assays verwendet werden.
- Gewöhnlich kann die chromogene oder fluorogene Marker-Gruppe in das 4,7-Dialkoxy-Neu5Ac (5) unter Verwendung des folgenden Reaktionsschemas eingebaut werden (unter Verwendung von 5-Brom-3-indolyl als eine beispielhafte Markergruppe): Schema 2
- Verbindung 5 wird zuerst in das entsprechende Methylester- Derivat durch Behandeln mit konzentrierter Trifluoressigsäure und Methanol umgewandelt, und der Ester wird dann mit einem Überschuß an Acetylchlorid umgesetzt, um das Ghloracetatmethylester-Derivat von 4,7-Dialkoxy-Neu5Ac (6) zu bilden. Koppeln von 6 mit dem Natriumsalz von 5-Brom-3- indolyl ergibt den 5-Bromindol-3-ol-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäureacetoxymethylester (7). Deacetylierung von 7 wird durch Behandeln mit Natriummethoxid in Methanol bewirkt, um Verbindung 8 zu ergeben, und nachfolgende Behandlung mit Natriumhydroxid ergibt das Natriumsalz von 5-Brom-3-indolyl-4,7-dimethoxy-N-acetylneuraminsäure (9).
- Natürlich wird das 4-Alkoxy-Neu5Ac in der Mischung ähnlichen Kopplungsreaktionen unterzogen, um das 5-Brom-3-indolyl-4- methoxy-N-acetylneuraminsäuresalz zu bilden.
- Das gekoppelte 4,7-Dialkoxy-Derivat 9 wird dann von der Mischung aus den zwei gekoppelten Verbindungen (d. h. die 4-Alkoxy- und 4,7-Dialkoxy-Derivate) durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung von z. B. einer C18-Umkehr-Platten-Silicakolonne abgetrennt. Die Mischung der gekoppelten Produkte kann in Wasser gelöst und auf die Säule aufgegeben werden. Die Produkte werden durch einen sich erhöhenden Gradienten von Methanol mit den geeigneten Fraktionen, die gesammelt und vereinigt werden, getrennt. Die resultierende gereinigte 5-Brom-3-indolyl-4,7- dimethoxy-N-acetylneuraminsäure (9) kann getrocknet und bis zur Verwendung gelagert werden. Gewöhnlich enthält das resultierende Produkt im wesentlichen kein 4-Methoxy-Derivat. Es ist wichtig, daß diese Mischung im wesentlichen kein 4-Methoxy-Derivat enthält, da es hochreaktiv mit Mumps-Virus und anderen Neuraminidase-enthaltenden Viren ist.
- Wie oben bemerkt, haben die chromogenen oder fluorogenen 4,7-Dialkoxy-Derivate dieser Erfindung die allgemeine Formel
- worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Gruppen sind, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, und R&sub3; eine chromogene oder fluorogene Gruppe ist. R&sub1; und R&sub2; können gleiche oder unterschiedliche Alkyl-Gruppen sein. Bevorzugt sind sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Methyl-Gruppen und R&sub3; ist eine chromogene Gruppe.
- Bevorzugter ist. R&sub3; 4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3- indolyl, 5-Brom-3-indolyl, 3-Indolyl, Nitrophenylazophenyl, Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl oder 6-Brom-2- naphthyl. Sogar noch mehr bevorzugt ist R&sub3; 4-Methylumbelliferyl, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl oder 5-Brom-3- indolyl. Am meisten bevorzugt ist R&sub3; 5-Brom-3-indolyl. Einfache Salze dieser Substrate, wie die Na&spplus;-, K&spplus;- und NH&sub4;&spplus;--Salze können ebenfalls verwendet werden.
- Beispiele für chromogene 4,7-Dialkoxy-NeuSAc-Derivate, die unter die obige Formel fallen, beinhalten 4-Methylumbelliferyl-4,7-dimethoxy-N-acetylneuraminsäurealplha-ketosid, 2-Nitrophenyl-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 4-Nitrophenyl-4,7-methoxy- N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Cyanoumbelliferyl-4,7- dimethoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Resorufin- 4,7-dimethoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-4,7-dimethoxy-N-acetylneuraminsäure-alphaketosid, 5-Brom-3-indolyl-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Indolyl-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 2-[4-(4-Nitrophenylazo)phenyl]-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 2-[4-(4-Nitrophenylazo)resorcinyl]-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Methoxyphenyl-4,7- dimethoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Dimethylaminophenyl-4,7-dimethoxy-N-acetylneuraminsäurealpha-ketosid, 6-Brom-2-naphthyl-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 4-Chlor-1-naphthyl-4,7- dimethoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, sowie die entsprechenden 4,7-Diethoxy-, 4,7-Dipropyl- und 4,7-Dibutyl- Derivate. Gewöhnlich sind die 4,7-Dimethoxy-Derivate bevorzugt. Wenn gewünscht, können "gemischte" 4,7-Dialkoxy- Derivate (z. B. 4-Methoxy-7-ethoxy) verwendet werden.
- Die chromogenen oder fluorogenen 4,7-Dialkoxy-Derivate können in diagnostischen Tests für Influenza-Viren von Typ A und B in klinischen Proben verwendet werden. Die klinischen Proben, die in dieser Erfindung getestet werden, werden typischerweise pharyngeale, nasopharyngeale oder respiratorische Sekrete sein, die von Patienten gesammelt wurden, die an Influenza erkrankt sind oder die in Verdacht stehen erkrankt zu sein, als Spülungsabstrich oder Auswurfproben. Die Spülung, Auswurf oder Abstrich wird bevorzugt mit einer einen Stabilisator enthaltenden wäßrigen Pufferlösung vor dem Mischen mit dem Substrat kombiniert. Die Pufferlösung enthält gewöhnlich einen Puffer, der den pH bei etwa 4 bis 7, bevorzugt 5,5 bis 6,5 hält, optional etwa 0,1 bis 10 Gew.-% eines nichtionischen Detergenzes, eine kleine Menge (1 bis 20 mM) eines Erdalkalimetall-Kations (Ca, Mg, bevorzugt Ca) und eine ausreichende Menge eines Stabilisators, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alditolen, Monosacchariden und Disacchariden, um die thermische Stabilität der Neuraminsäure in der Probe zu erhöhen.
- Das Volumen der Pufferlösung, die mit der Probe kombiniert wird, wird normalerweise 0,1 bis 2 ml sein. Der Puffer kann organisch oder anorganisch sein. Geeignete Puffer beinhalten z. B. herkömmliche Puffer von organischen Säuren und Salzen davon, wie Citrat-Puffer (z. B. Mischung aus Mononatriumcitrat-Dinatriumcitrat, Mischung aus Zitronensäure-Trinatriumcitrat, Mischung aus Zitronensäure- Mononatriumcitrat usw.) Acetatpuffer (z. B. Mischung aus Essigsäure-Natriumacetat), Succinat-Puffer (z. B. Mischung aus Succinsäure-Mononatriumsuccinat, Mischung aus Succinsäure- Natriumhydroxid, Mischung aus Succinsäure-Dinatriumsuccinat, usw.), Tartratpuffer (z. B. Mischung aus Weinsäure-Tartrat, Mischung aus Weinsäure-Kaliumtartrat, Mischung aus Weinsäure- Natriumhydroxid, usw.), Fumarat-Puffer (z. B. Mischung aus Fumarsäure-Mononatriumfumarat, Mischung aus Fumarsäure- Dinatriumfumarat, Mischung aus Mononatriumfumaratsäure- Dinatriumfumarat), Gluconat-Puffer (z. B. Mischung aus Gluconsäure-Natriumgluconat, Mischung aus Gluconsäure- Natriumhydroxid, Mischung aus Gluconsäure-Kaliumgluconat usw.), Oxalat-Puffer (z. B. Mischung aus Oxalsäure- Natriumoxalat, Mischung aus Oxalsäure-Natriumhydroxid, Mischung aus Oxalsäure-Kaliumoxalat usw.), Lactat-Puffer (z. B. Mischung aus Milchsäure-Natriumlactat, Mischung aus Milchsäure-Natriumhydroxid, Mischung aus Milchsäure- Kaliumlactat usw.), Acetat-Puffer (z. B. Mischung aus Essigsäure-Natriumacetat, Mischung aus Essigsäure- Natriumhydroxid usw.), Malat-Puffer (z. B. Mischung aus D,L-Äpfelsäure-Dinatriummalat), Phosphat-Puffer (z. B. Mischung aus Mononatriumphosphat-Dinatriumphosphat, Mischung aus Mononatriumphosphat-Natriumhydroxid, Mischung aus Trinatriumphosphat-Salzsäure usw.), 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure, [Bis-(2- hydroxyethyl)imino]tris(hydroxymethyl)methan, N-2-ACetamidoiminodiessigsäure, 1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan, Piperazin- N,N'-2-ethansulfonsäure), N-2-Acetamido-2- aminoethansulfonsäure, 3-(N-Morpholin)-2- hydroxypropansulfonsäure, 3-(N-Morpholin)propansulfonsäure, 2-[Tris(hydroxymethyl)methylamino]ethansulfonsäure, N-2-Hydroxyethylpiperazin-NN'-2-ethansulfonsäure, 3-[Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2- hydroxypropansulfonsäure.
- Nichtionische Detergentien, die in der Pufferlösung verwendbar sind, beinhalten z. B. die Pluronics wie Polysorbat 20 oder Polysorbat 80, Triton X-100, NP-40 und Alkylglucoside wie C&sub8;- und C&sub9;-Alkylglucoside. Das Detergens ist eine optionale Komponente und erleichtert das Freisetzen der Neuraminidase aus der viralen Umhüllung. Stabilisatoren, die in der Pufferlösung verwendet werden, beinhalten z. B. dreiwertige oder höhere Alditole wie Glycerin, Erythrol, Arabitol, Xylitol, Sorbitol, Mannitol, die Hexosen Glucose und Fructose und das Disaccharid Sucrose. Diese Stabilisatoren können alleine oder in Kombination verwendet werden. Um die Aktivität der Neuraminidase-enthaltenden Viren zu stabilisieren, werden die Stabilisatoren zu dem Flüssigformulierung/Trägersubstanz-System in einer Menge von 0,2 M bis 2,1 M und bevorzugt 0,6 M bis 2,0 M zugegeben. Sobald mit der Pufferlösung gemischt, kann die Probe für längere Zeitdauern gelagert werden, bevorzugt bei 2ºC bis 8ºC, ohne bedeutenden Verlust von Neuraminidase-Aktivität.
- Das Substrat wird normalerweise zu der gepufferten stabilisierten Probe in einer Menge im Bereich zwischen 0,05 mM und 0,5 mM zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur bis physiologischer Temperatur (d. h. etwa 18ºC bis 40ºC) für eine Zeit, die ausreichend ist, um jegliche Neuraminidase in der Probe mit dem Substrat umzusetzen, inkubiert. Diese Zeit wird normalerweise in dem Bereich von 1 Minute bis 4 Stunden, normalerweise 5 bis 120 Minuten, und noch mehr 30 bis 60 Minuten liegen. Wenn es Neuraminidase- Aktivität in der Probe gibt, wird die Marker- oder Reporter- Gruppe von dem Substrat freigesetzt und der freigesetzte Marker oder Reporter-Niederschlag wird der Mischung eine charakteristische Farbe verleihen. Insbesondere für kolorimetrische Derivate, wird die resultierende Reaktionsmischung bevorzugt in eine Sammelvorrichtung, die einen porösen Membranfilter und ein absorbierendes Kissen enthält, um die Lösung aufzusaugen ("wick away") übertragen. Einmal ist solch eine Sammelvorrichtung in unserer gleichzeitig anhängigen Anmeldung, Serien-Nr. 08/479 789 (eingereicht 7. Juni 1995) gezeigt, die hiermit durch das Zitat eingeschlossen wird. Bei Anwesenheit von Influenza Typ A und B Neuraminidase wird die Reportergruppe an dem 4,7-modifiziertem Neu5Ac durch die Wirkung der Neuraminidase freigesetzt und das resultierende Reportermolekül wird als ein gefärbter Niederschlag auf der porösen Filtermembran gesammelt. Die Anwesenheit eines solches farbigen Produktes zeigt eine positive Diagnose für Influenza-Typen A und B an; die Abwesenheit eines solchen gefärbten Produktes zeigt eine negative Diagnose für Influenza-Typen A und B an. Konzentration oder Ansammlung des gefärbten Niederschlags erhöht die Empfindlichkeit es diagnostischen Tests. Solche Sammelvorrichtungen sind jedoch nicht für die Ausführung der Erfindung notwendig.
- Die folgende Tabelle zeigt die charakteristische Farbe, die gebildet wird, wenn Neuraminidase mit verschiedenen chromogenen oder fluorogenen 4,7-modifizierten. NeuSAc- Derivaten reagiert und das Reportermolekül freisetzt.
- Die vorliegenden chromogenen und fluorogenen 4,7-Dialkoxy- Neu5Ac-Derivate zeigen die charakteristische Farbe nur bei Anwesenheit von Influenza-Virus vom Typ A und B. Sie zeigen die charakteristische Farbe nicht (d. h. kein Freisetzen des Reportermoleküls findet statt) in der Gegenwart von Parainfluenza-Typen. 1, 2, 3 und 4, Mumps, respiratorischer syncytialer Viren und/oder Adenoviren. Darüber hinaus weisen die chromogenen und fluorogenen 4,7-Dialkoxy-Neu5Ac-Derivate nicht auf bakterielle Neuraminidase-Reaktivität hin. Um den gewünschten Grad an Empfindlichkeit zu erhalten, sollten die 4,7-Dialkoxy-NeuSAc-Derivate im wesentlichen frei von den entsprechenden 4-Alkoxy-Neu5Ac-Derivaten sein. Die maximalen Niveaus der 4-Alkoxy-Neu5Ac-Derivate, die akzeptable Empfindlichkeit erlauben, kann experimentell bestimmt werden unter Verwendung von bekannten Stämmen der verschiedenen Viren-Typen. Gewöhnlich sollten die Gehalte an 4-Alkoxy- Neu5Ac-Derivaten geringer als etwa 5 Gew.-% sein und bevorzugt weniger als etwa 0,5 Gew.-%.
- Ein möglicherweise aufschlußreicherer diagnostischer Test kann durch Kombinieren der Neuraminidase-Reaktivität und Empfindlichkeit der vorliegenden chromogenen und fluorogenen 4,7-Dialkoxy-Neu5Ac-Derivate und der chromogenen und fluorogenen 4-Alkoxy-Neu5Ac-Derivate in einem einzigen Test erhalten werden. In solch einem System wird die klinische Probe in zwei Teile unterteilt, die dann getrennt voneinander mit den 4,7-Dialkoxy- bzw. den 4-Alkoxy-Neu5Ac-Derivaten inkubiert werden. Die Anwesenheit und/oder Abwesenheit der charakteristischen Farbe in den zwei inkubierten Proben kann verwendet werden, um den Typ des Virus, der, wenn überhaupt, in der klinischen Probe vorliegt, näher zu bestimmen. Wenn nur Influenza-Viren vom Typ A oder B in der klinischen Probe vorliegen, dann zeigen sowohl die 4-Alkoxy als auch die 4,7-Dialkoxy-Derivate ihre charakteristischen Farben ihrer Reportermoleküle. Wenn sowohl Influenza-Viren vom Typ A oder B als auch Neuraminidase reaktive Viren, andere als Influenza-Viren vom Typ A und B, in der klinischen Probe vorliegen, dann wird jeder Teil die charakteristische Farbe seines Reportermoleküls zeigen. Wenn nur Neuraminidasereaktive Viren, andere als Influenza-Viren vom Typ A und B, in der klinischen Probe vorliegen, dann wird nur das 4-Alkoxy-Derivat die charakteristische Farbe seines Reportermoleküls zeigen. Wenn keine Neuraminidase aktive Viren in der klinischen Probe vorliegen, dann wird weder der eine Teil noch der andere Teil die charakteristische Farbe seines Reportermoleküls zeigen.
- Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einfache und schnelle Techniken zum selektiven Diagnostizieren von Influenza, insbesondere der Typen A und B, bereit, die in der Klinik oder in der Arztpraxis durchgeführt werden können und dem Arzt ermöglichen, die angemessene Behandlung zu verschreiben, um die Infektion und/oder die angemessene prophylaktische Behandlung an Personen, die in nahem Kontakt mit dem infizierten Patienten stehen, zu behandeln.
- Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen.
- Die Synthese von 4,7-Dimethoxy-Neu5Ac wurde unter Verwendung der Reaktionen, die in Schema 1 gezeigt sind, ausgeführt. Eine kalte (Eisbadtemperatur) Lösung des Isopropyliden-Derivats 1 (1,2 g), in etwa 10 ml trockenem Acetonitril wurde mit Stickstoff gesättigt. Natriumhydroxid (270 mg; 80 Gew.-% Dispersion in Öl) wurde zugegeben und die Mischung wurde für 20 Minuten gerührt. Dimethylsulfat (1 ml) wurde zugegeben und das Rühren wurde für zusätzliche 30 Minuten unter Verwendung eines Eisbads zum Kühlen der Mischung fortgesetzt. Die resultierende Mischung wurde durch Celite filtriert und der Niederschlag wurde mit trockenem Acetonitril gewaschen. Das Filtrat wurde evaporiert und der Rest wurde getrocknet und mit Aceton extrahiert. Nach Filtration wurde das Filtrat wieder evaporiert. Der resultierende Rest wurde getrocknet und auf Silicagel chromatographiert. Elution mit Methylenchlorid/Methanol (25 : 1) entfernte einige Nebenprodukte. Fortgesetzte Elution mit demselben Lösungsmittelsystem stellte einen Sirup, der 2 und 3 enthielt, bereit, der aus Aceton/Hexan auskristallisiert wurde. Kristallines 2 (177 mg) wurde gesammelt. Das Filtrat enthielt eine Mischung aus 2 und 3 (etwa 1 : 1), aber mit einem höheren Anteil von 3 als die ursprüngliche Mischung.
- Das 3 (1,22 g) enthaltende Filtrat wurde mit 80%iger wäßriger Essigsäure (15 ml) bei 85ºC für eine Stunde behandelt. Die Mischung wurde evaporiert und mit Wasser co-evaporiert. Der Rest wurde chromatographiert. Elution mit Methylenchlorid/Methanol (5 : 1) entfernte ein geringes Nebenprodukt. Fortgesetzte Elution mit demselben Lösungsmittelsystem ergab das teilweise entschützte Produkt 4 (0,87 g; 80% Ausbeute).
- Das 4,7-Dimethoxymethylestermethylketosid (4) (0,87 g) wurde mit 1 M Natrimhydroxid (3 ml) in Methanol (5 ml) und Wasser (5 ml) bei Raumtemperatur für eine Stunde behandelt. Die Mischung wurde neutralisiert mit Dowex 50 (H&spplus;)-Harz; das Harz wurde durch Filtration entfernt und mit Methanol gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde evaporiert. Der Rest wurde mit Dowex 50 (H&spplus;)-Harz (1,5 g) in 0,025 M Salzsäure bei 100ºC für zwei Stunden behandelt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat gesammelt und evaporiert. Der Rest wurde unter Vakuum getrocknet, um im wesentlichen reines 4,7-Dimethoxy-Neu5Ac (5) zu ergeben (0,71 g; 88% Ausbeute).
- Die Synthese von 5-Brom-3-indolyl-4,7-dimethoxy- Neu5Ac wurde unter Verwendung der Reaktionen, die in Schema 2 gezeigt sind, ausgeführt. Verbindung 5 (1,0 g) wurde mit Trifluoressigsäure (0,2 ml) in Methanol (25 ml) über Nacht bei Raumtemperatur behandelt. Die Mischung wurde evaporiert. Der Rest wurde getrocknet und mit Acetylchlorid (5 ml) in Methylenchlorid (5 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann evaporiert. Der Rest wurde getrocknet, um das rohe Chlorid 6 (1,36 g) bereitzustellen. Das rohe Produkt 6 wurde aufgrund seiner Instabilität nicht weiter gereinigt.
- Eine Suspension des rohen Produktes 6 (0,7 g) und 1-Acetyl-5- bromindol-3-ol (0,26 g) in Aceton (5 ml) wurde mit Stickstoff gesättigt. Eine 1 M Natriumhydroxid-Lösung (1 ml) wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff für eine Stunde gerührt. Nach Evaporation wurde der Rest getrocknet und auf Silicagel chromatographiert. Elution mit Methylenchlorid/Methanol (25 : 1) entfernte das unreagierte Chromogen (0,128 g). Fortgesetzte Elution mit demselben Lösungsmittelsystem ergab Fraktionen, die hauptsächlich das gekoppelte Produkt 7 (0,114 g) enthielten. Das gekoppelte Produkt 7 (0,114 g) wurde mit 1 M Natriummethoxid in Methanol (0,1 ml) für 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Nach Neutralisierung mit Dowex 50 (H&spplus;)-Harz wurde das Harz entfernt und mit Methanol gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde evaporiert. Der Rest wurde getrocknet und auf Silicagel chromatographiert. Fraktionen die hauptsächlich das gekoppelte Produkt 8 enthielten, wurden vereinigt und evaporiert, um etwa 60 mg von 8 zu ergeben.
- Das gekoppelte Produkt 8 (60 mg) würde mit 1 M Natriumhydroxid (0,5 ml) in 50% wäßrigem Methanol (5 ml) für 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Die Mischung wurde mit Dowex 50 (H&spplus;)-Harz neutralisiert. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und mit Methanol gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde evaporiert und der Rest wurde durch HPLC gereinigt. Die ersten Fraktionen enthielten ein ungekoppeltes Produkt. Das gekoppelte Material erschien als ein breiter Peak, der sowohl aus gekoppeltem 4-Methoxy-Neu5Ac und gekoppeltem 4,7-Dimethoxy-Neu5Ac Produkt 9 bestand. Da die geringere Menge des gekoppelten 4-Methoxy-Derivats die diagnostische Analyse unspezifisch machen könnte, wurden nur hochreine Fraktionen, die 9 enthielten, vereinigt. Während Evaporation wurde hochgereinigte 9 (4 mg) gesammelt; das gesammelte Material enthielt weniger als etwa 5 Gew.-% des entsprechenden 4-Alkoxy-Derivats.
- Dieses Beispiel veranschaulicht die Spezifität des 5-Brom-3-indolyl-4,7-dimethoxy-Neu5Ac (9) von Beispiel 2 in diagnostischen Tests für Influenza A und B in kultivierten Viren. Viren wurden von frischen Patientenisolaten oder gefrorenen Stock-Kulturen unter Verwendung der angemessenen Zellinie Medium- und Inkubationsbedingungen, die für das Wachstum und Züchten des speziellen Virus geeignet sind, gewachsen. Die folgenden Zellen wurden verwendet: (1) RMK (Rhesus-Affen-Niere) Zellen für Influenza- und Parainfluenza- Viren; (2) HEp-2 (menschliches Larynx Karzinom) Zellen für respiratorischen syncytialen Virus und Adenovirus; und (3) VERC (Niere von afrikanischen Grünaffen) Zellen für Mumps. Alle Zellen wurden zu nah-konfluenten Monoschichten in Röhren oder Kolben mit minimalem unbedingt notwendigem Medium mit 5 bis 10% Serum bei 37ºC gewachsen. Vireninfektionen wurden in den angemessenen Zellinien mit minimalen unbedingt erforderlichem Medium ohne Serum bei 37ºC durchgeführt.
- Viren-infizierte Kulturen wurden beobachtet und bestätigt durch Beobachten des Erscheinens der charakteristischen cytopathischen Effekte und durch Testen mit Immunofluoreszenz-Assays unter Verwendung vom Virus-typischen spezifischen monoklonalen Antikörpern. Die folgenden charakteristischen cytopathischen Effekte wurden für jedes verwendete Virus wie folgt beobachtet: (1) Influenza A und B: Bereiche von großen unregelmäßig geformten granularen oder vaculierten Zellen mit fortschreitender Degeneration der Zellmonoschicht; (2) Parainfluenza 1: kleine gerundete Zellen in der ganze Zellmonoschicht; (3) Parainfluenza 2: dunkle granulare und unregelmäßige Syncytia, die sich von der Zellmonoschicht zurückziehen; (4) Parainfluenza 3: elongierte Fysiform-Zellen, die schließlich zurückziehen und sich von der Zellmonoschicht zurückziehen; (5) respiratorischer Syncytia-Virus: große unregelmäßig geformte Syncytia, die als große multinukleierte Zellen mit unbestimmten Grenzen über die ganze Zellmonoschicht erscheinen; (6) Adenovirus: große gerundete hypnotische Zellen, die schließlich in gerundete Zellschichten aggrelieren und sich von dem Kulturgefäß ablösen; und (7) Mumps: Syncytia mit Vacuolation und Zelldegeneration in der ganzen Zellmonoschicht. Kommerzielle, spezielle monoklonale Antikörper von Virus-Typ wurden in Fluoreszenz-Assays verwendet, um das Wachstum jeden Viruses in den beimpften Kulturen zu bestätigen. Die Zellen von den infizierten Kulturen wurden mit Methanol auf Glasplättchen oder Deckgläschen fixiert und dann bei 37ºC mit Fluorescein gekennzeichneten monoklonalen Antikörpern inkubiert. Sowohl der direkte als auch indirekte Fluoreszenz-Assay wurden die fixierten Virus-infizierten Zellen für 30 Minuten mit speziellen Fluoresceinisothiocyanat (FITC) gekennzeichneten monoklonalen Antikörpern vom Virus-Typ inkubiert. Für die indirekten Assays wurden die fixierten Virus-infizierten Zellen für 30 Minuten mit speziellen ungekennzeichneten monoklonalen Antikörpern vom Virus-Typ inkubiert, gefolgt von Inkubation für weitere 30 Minuten mit zweiten FITCgekennzeichneten monoklonalen Antikörpern. Die Glasplättchen oder Deckgläschen wurden mit Auftragmedium überzogen und unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops untersucht. Ein positives Virusergebnis wurde durch die Anwesenheit einer charakteristischen Virus-spezifischen apfelgrünen Färbung verifiziert. Die Anwesenheit von fortschreitenden und charakteristischen cytopathischen Effekten (zusammen mit begleitender spezieller Virus-Beständigkeit mit Fluoreszenz- Assay) war ein Hinweis darauf, daß der spezielle beimpfte Virus maximal gewuchert hatte.
- Nach Erzielen von maximalem Viruswachstum und Beständigkeit der Anwesenheit der entsprechenden Viren wurden die Kulturflüssigkeiten zur Bewertung mit den chromogenen 4- Methoxy-N-acetylneuraminsäure- und 4,7-Dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-Substraten geerntet. Virusenthaltende Kulturflüssigkeiten (0,1 ml) wurden mit den chromogenen Substraten in einer 1 oder 2 ml-Lösung, die Trägersubstanzen und Puffer, der so beschaffen war, den optimalen pH und Neuraminidase-Aktivität zu erzielen, gemischt. Die Puffer/Trägersubstanz-Lösung enthielt 35 mM Äpfelsäure/Malat- Puffer mit 10 mM Calciumchlorid, 0,85% Natriumchlorid, 0,1% Mannitol, 0,5% Methanol und 0,1% Methylparaben. Das Substrat und Pufferkombination bei einem pH von etwa 5,4 wurde bestimmt, um spezifischen Nachweis von Neuraminidaseerzeugende Viren mit klar negativen Ergebnissen für nicht Neuraminidaseerzeugende Viren und Virus-negative Kulturen bereitzustellen.
- Die Testlösungen wurden bei 37ºC für etwa eine Stunde bei 37'ºC inkubiert, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 0,2 ml eines Pufferkonzentrats der den pH auf etwa 9 änderte und die Erhöhung des Niederschlags des freigesetzten Chromogens unterstützte, gestoppt. Die fertige Reaktionsmischung wurde dann auf eine Sammelvorrichtung übertragen, die einen selektiv porösen Membranfilter und ein absorbierendes Kissen, das die Lösung aufsaugt, wodurch der Niederschlag konzentriert wurde. Das Erscheinen eines entsprechend gefärbten Niederschlags wies auf eine positive Reaktion hin, wohingegen die Abwesenheit eines solchen entsprechenden gefärbten Niederschlags eine negative Reaktion anzeigte. Unter Verwendung des 5-Brom-3-indolyl-Chromogens war die charakteristische Farbe des Niederschlags für einen positiven Test blau.
- Die folgenden Viren wurden verwendet, um das 5-Brom-3- indolyl-4-methoxy-N-acetylneuarminsäure-Substrat (BI-4-MeONeu5Ac) und das 5-Brom-3-indolyl-4,7-dimethoxy-Nacetylneuraminsäure-Substrat (BI-4,7-(MeO)&sub2;Neu5Ac) zu testen.
- Die folgenden Ergebnisse wurden unter Verwendung dieser verschiedenen Viruskulturen erhalten. Die Viruskulturen wurden bis zu ihren maximalen Titern gewachsen (bestimmt durch Beobachtung von umfassenden - etwa 90 bis 100% - Virus-charakteristischen cytopathischen Effekten in der Zelischicht und Bestätigung mit Fluoreszenz-Assays der leuchtend apfelgrünen Virus-spezifischen Färbung in der Mehrheit der Zellen), um sicherzugehen, daß Reaktionsunterschiede nicht von undetektierbaren viralen Konzentrationen herrührten.
- Eine Beurteiiungsskala von 1+ bis 3+ basierend auf der Intensität der Reaktionsfarbe wurde verwendet, um relative Niveaus von detektierbarer Neuraminidase-Aktivität anzuzeigen. Die zu beurteilenden Farben wurden mit Farbproben von einer Standard-Referenzquelle (The Pantone® Color Specific Book 747XR) verglichen. Eine Beurteilung von 1+ (helle Farbe) bezeichnet ein niedrig Positiv, 2+ (mäßige Farbe) bezeichnet ein moderat Positiv und 3+ (dunkle Farbe) weist auf ein hoch Positiv hin. Ein negatives Ergebnis wird durch die Abwesenheit der charakteristischen Farbe gekennzeichnet. Ein unbestimmtes Ergebnis ist gekennzeichnet, wenn eine sehr helle Spur oder Andeutung der charakteristischen Farbe durch optische Beobachtung anwesend sein kann.
- Wie aus diesen Ergebnissen ersehen werden kann, waren Virusenthaltende Influenza-Neuraminidase vom Typ A und B die einzigen getesteten Organismen, die eine gositive Reaktion mit sowohl dem 4-Methoxy-NeuSAc und dem 4,7-Dimethoxy-NeuSAc- Substrat unverdünnt und bei allen getesteten Verdünnungen zeigte. Für Parainfluenza-Typen 1, 2 und 3 und dem Mumps- Virus ergab das 4-Methoxy-Neu5Ac-Substrat abhängig von der Verdünnung sowohl negative als auch positive Reaktionen. Das 4,7-Dimethoxy-Neu5Ac-Substrat ergab eine negative Reaktion mit Parainfluenza-Typen 1, 2 und 3 und dem Mumps-Virus unverdünnt und bei allen Verdünnungen. Nicht-Neuraminidaseenthaltende Viren (d. h. respiratorischer syncytialer Virus und Adenovirus) erzeugten negative Ergebnisse mit beiden Substraten. Auch Virus-negative Kontrollen ohne Virus waren entsprechend negativ. Diese Ergebnisse demonstrieren deutlich die Spezifität der chromogenen 4,7-Dialkoxy-Nacetylneuraminsäure-Substrate für Influenza-Viren vom Typ A und B.
- Ähnliche Ergebnisse, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden unter Verwendung von 5-Brom-4-chlorindol- 3-ol und 4-Methylumbelliferon als Reportermoleküle an 4-Methoxy-Neu5Ac und 4,7-Dimethoxy-Neu5Ac erhalten.
Claims (21)
1. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure der allgemeinen
Formel:
worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Gruppen sind, die 1 bis 4
Kohlenstoffatome enthalten.
2. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure gemäß Anspruch 1,
worin sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Methyl-Gruppen sind.
3. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure gemäß Anspruch 1,
worin sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Ethyl-Gruppen sind.
4. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat der
allgemeinen Formel:
worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Gruppen sind, die 1 bis 4
Kohlenstoffatome enthalten, und R&sub3; eine chromogene oder
fluorogene Gruppe ist.
5. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat gemäß
Anspruch 4, worin sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Methyl-Gruppen
sind und R&sub3; eine chromogene Gruppe ist.
6. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat gemäß
Anspruch 5, worin R&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus 4-Methylumbelliferyl,
3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl,
3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-
indolyl, 3-Indolyl, Nitrophenylazophenyl,
Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl,
3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-
naphthyl.
7. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat gemäß
Anspruch 6, worin R&sub3; 5-Brom-3-indolyl ist.
8. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat gemäß
Anspruch 4, worin sowohl R&sub1; als auch R&sub2; Ethyl-Gruppen
sind und R&sub3; eine chromogene Gruppe ist.
9. 4,7-Dialkoxy-N-acetylneuraminsäure-Substrat gemäß
Anspruch 8, worin R&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus 4-Methylumbelliferyl,
3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl,
3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-
indolyl, 3-Indolyl, Nitrophenylazophenyl,
Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl,
3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-
naphthyl.
10. Verfahren zum Nachweis von Influenza-Viren vom Typ A
und B in einer klinischen Probe von einer Einzelperson,
die im Verdacht steht, eine virale Infektion der
Atemwege zu haben, wobei das Verfahren umfaßt:
(1) Inkubieren der klinischen Probe mit einem
chromogenen oder fluorogenen
4,7-Dialkoxy-Nacetylneuraminsäure-Substrat der allgemeinen Formel:
worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Reste sind, die 1 bis 4
Kohlenstoffatome enthalten, und R&sub3; eine chromogene oder
fluorogene Gruppe ist, die eine deutliche und
charakteristische Farbe zeigt, wenn sie von dem
Substrat oder einem Salz des Substrats abgespalten
wird;
(2) Beobachten der inkubierten klinischen Probe, um zu
bestimmen, ob die deutliche und charakteristische Farbe
gebildet wird, wobei die Bildung der deutlichen und
charakteristischen Farbe auf die Anwesenheit von
Influenza-Viren vom Typ A oder B in der klinischen
Probe hinweist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin sowohl R&sub1; als auch
R&sub2; Methyl-Gruppen sind und eine R&sub3; eine chromogene
Gruppe ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, worin R&sub3; ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus 4-Methylumbelliferyl,
3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl,
3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-
indolyl, 3-Indolyl, Nitrophenylazophenyl,
Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl,
3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-
naphthyl.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin R&sub3; 5-Brom-3-indolyl
ist.
14. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin sowohl R&sub1; als auch
R&sub2; Ethyl-Gruppen sind und R&sub3; eine chromogene Gruppe
ist.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, worin R&sub3; ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus 4-Methylumbelliferyl,
3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl,
3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-
indolyl, 3-Indolyl, Nitrophenylazophenyl,
Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl,
3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-
naphthyl.
16. Verfahren zum Nachweis von Influenza-Viren vom Typ A
und B in einer klinischen Probe von einer Einzelperson,
die im Verdacht steht, eine virale Infektion der
Atemwege zu haben, wobei das Verfahren umfaßt:
(1) Teilen der klinischen Probe in einen ersten Teil
und einen zweiten Teil;
(2) Inkubieren des ersten Teils mit einem chromogenen
oder fluorogenen ersten
4,7-Dialkoxy-Nacetylneuraminsäure-Substrat der allgemeinen Formel:
worin R&sub1; und R&sub2; Alkyl-Reste sind, die 1 bis 4
Kohlenstoffatome enthalten, und R&sub3; eine erste
chromogerte oder fluorogene Gruppe ist, die eine
deutliche und charakteristische erste Farbe zeigt, wenn
sie von dem ersten Substrat oder einem Salz des ersten
Substrats abgespalten wird;
(3) Beobachten des inkubierten ersten Teils, um zu
bestimmen, ob die deutliche und charakteristische erste
Farbe gebildet wird, wobei die Bildung der deutlichen
und charakteristischen ersten Farbe auf die Anwesenheit
von Influenza-Viren vom Typ A oder B in der klinischen
Probe hinweist;
(4) Inkubieren des zweiten Teils mit einem chromogenen
oder fluorogenen zweiten
4-Alkoxy-Nacetylneuraminsäure-Substrat der allgemeinen Formel:
worin R&sub4; ein Alkyl-Rest ist, der 1 bis 4
Kohlenstoffatome enthält, und R&sub5; eine zweite chromogene
oder fluorogene Gruppe ist, die eine deutliche und
charakteristische zweite Farbe zeigt, wenn sie von dem
zweiten Substrat oder einem Salz des zweiten Substrats
abgespalten wird; und
(5) Beobachten des inkubierten zweiten Teils, um zu
bestimmen, ob die deutliche und charakteristische
zweite Farbe gebildet wird, wobei die Bildung der
deutlichen und charakteristischen zweiten Farbe auf die
Anwesenheit von Neuraminidase reaktiven Viren in der
klinischen Probe hinweist;
wobei die Anwesenheit der ersten und zweiten Farbe auf
die Anwesenheit von Influenza-Viren vom Typ A oder B
allein oder in Kombination mit Neuraminidase reaktiven
Viren, andere als Influenza-Viren vom Typ A und B, in
der klinischen Probe hinweist;
wobei die Anwesenheit der zweiten Farbe und das Fehlen
der ersten Farbe auf Neuraminidase reaktive Viren,
andere als Influenza-Viren vom Typ A und B in der
klinischen Probe hinweist; und
wobei die Abwesenheit der ersten und zweiten Farbe auf
die Abwesenheit von Neuraminidase reaktiven Viren in
der klinischen Probe hinweist.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, worin sowohl R&sub1; als auch
R&sub2; Methyl-Gruppen sind und R&sub3; eine erste chromogene
Gruppe ist.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin R&sub4; eine Methyl-
Gruppe ist und R&sub5; eine zweite chromogene Gruppe ist.
19. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin R&sub3; und R&sub4; unabhängig
ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl,
2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-
chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-indolyl, 3-Indolyl,
Nitrophenylazopheriyl, Nitrophenylazoresorcinyl,
3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-
naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin R&sub3; 5-Brom-3-indolyl
ist.
21. Verfahren gemäß Anspruch 18, worin R&sub3; und R&sub4; unabhängig
ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
4-Methylubelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl,
2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-
chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-indolyl, 3-Indolyl,
Nitrophenylazophenyl, Nitrophenylazoresorcinyl,
3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-
naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/718,666 US5719020A (en) | 1996-09-25 | 1996-09-25 | 4,7-dialkoxy N-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type A and B viruses in clinical specimens |
| PCT/US1997/015602 WO1998013372A1 (en) | 1996-09-25 | 1997-09-05 | 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type a and b viruses in clinical specimens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69712747D1 DE69712747D1 (de) | 2002-06-27 |
| DE69712747T2 true DE69712747T2 (de) | 2002-11-21 |
Family
ID=24886990
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69712747T Expired - Fee Related DE69712747T2 (de) | 1996-09-25 | 1997-09-05 | 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminsaurederivate und methoden zur erkennung von influenza typ a und b in klinischen proben |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5719020A (de) |
| EP (1) | EP0888371B1 (de) |
| JP (1) | JP4070817B2 (de) |
| CN (2) | CN1091447C (de) |
| AT (1) | ATE217879T1 (de) |
| AU (1) | AU716275B2 (de) |
| BR (1) | BR9706776A (de) |
| CA (1) | CA2237790A1 (de) |
| DE (1) | DE69712747T2 (de) |
| ES (1) | ES2173481T3 (de) |
| HK (1) | HK1016988A1 (de) |
| IL (1) | IL124511A (de) |
| NO (1) | NO310822B1 (de) |
| NZ (1) | NZ330443A (de) |
| PL (1) | PL327109A1 (de) |
| WO (1) | WO1998013372A1 (de) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6667161B1 (en) * | 1997-10-27 | 2003-12-23 | Ibbex, Inc. | Chromogenic substrates of sialidase of bacterial, viral, protozoa, and vertebrate origin and methods of making and using the same |
| EP1038037A4 (de) * | 1997-12-18 | 2003-02-12 | Sepracor Inc | Bestimmungsverfahren zum nachweis und zur diagnose des influenzavirus |
| US6303764B1 (en) | 1998-09-24 | 2001-10-16 | Zymetx, Inc. | Synthesis of 4,7-dialkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids |
| US6555698B1 (en) * | 1998-11-17 | 2003-04-29 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent substrates for neuraminidase, assays for detection of neuraminidase and kits therefor |
| WO2000063423A2 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Zymetx, Inc. | Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates |
| US6420552B1 (en) | 1999-09-10 | 2002-07-16 | Zymetx, Inc. | Syntheses of 4-alkyl chromogenic glycosides and 7-alkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids |
| US6627396B1 (en) * | 1999-10-28 | 2003-09-30 | The Regents Of The University Of California | Influenza sensor |
| SE9904289D0 (sv) * | 1999-11-26 | 1999-11-26 | Niklas Arnberg | Method and camposition for the treatment of adenovairal ocular infections |
| AU2003267949A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-12-31 | U.S. Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Methods and compositions using cellular asialodeterminants and glycoconjugates for targeting cells to tissues and organs |
| EA200500625A1 (ru) * | 2002-10-10 | 2006-06-30 | Дипартмент Оф Ветеранс Афэрс | Обнаружение, локализация и определение стадий опухолей с помощью меченых активированных лимфоцитов, направленных на специфический опухолевый эпитоп |
| EA014533B1 (ru) * | 2006-05-18 | 2010-12-30 | Ветеринермедицинише Универзитет Вин | Способы обнаружения вирусов гриппа |
| US8652782B2 (en) | 2006-09-12 | 2014-02-18 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids |
| US20090098527A1 (en) * | 2006-09-12 | 2009-04-16 | Fischer Gerald W | Biological organism identification product and methods |
| US8097419B2 (en) | 2006-09-12 | 2012-01-17 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009 |
| US8080645B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-12-20 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Biological specimen collection/transport compositions and methods |
| US9598462B2 (en) | 2012-01-26 | 2017-03-21 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
| US9481912B2 (en) | 2006-09-12 | 2016-11-01 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples |
| US9683256B2 (en) | 2007-10-01 | 2017-06-20 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Biological specimen collection and transport system |
| US11041215B2 (en) | 2007-08-24 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences |
| CA2697373C (en) | 2007-08-27 | 2019-05-21 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Immunogenic compositions and methods |
| US10004799B2 (en) | 2007-08-27 | 2018-06-26 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
| US11041216B2 (en) | 2007-10-01 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples |
| EP3020832A1 (de) | 2007-10-01 | 2016-05-18 | Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC | System zum sammeln und transportieren biologischer proben sowie verfahren zur verwendung |
| US9119866B2 (en) * | 2008-04-08 | 2015-09-01 | Huiru Wang | Glycan-based drugs, therapies and biomarkers |
| RU2713112C2 (ru) | 2013-04-01 | 2020-02-03 | Бектон, Дикинсон Энд Компани | Способы и средства для диагностики гриппа |
| WO2016183292A1 (en) | 2015-05-14 | 2016-11-17 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples |
| PL3516067T3 (pl) * | 2016-09-19 | 2022-08-08 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Związek i guma do żucia zawierająca ten związek do wykrywania wirusów za pomocą smaku |
| TWI631340B (zh) * | 2017-06-16 | 2018-08-01 | 國立臺北科技大學 | 檢測神經胺酸酶活性的方法 |
| CN107446004B (zh) * | 2017-08-10 | 2020-05-01 | 济南山目生物医药科技有限公司 | 一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成方法 |
| US20220145407A1 (en) * | 2019-03-05 | 2022-05-12 | Japan Science And Technology Agency | Method and kit for detecting influenza virus, and method for diagnosing influenza virus infection |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3950322A (en) * | 1973-08-27 | 1976-04-13 | Research Corporation | Fluorogenic substrate glycosides |
| JPS5925699A (ja) * | 1982-08-03 | 1984-02-09 | Torii Yakuhin Kk | 酵素活性測定方法 |
| JPS60164499A (ja) * | 1984-02-07 | 1985-08-27 | Kyowa Medetsukusu Kk | 酵素活性測定法 |
| US4632901A (en) * | 1984-05-11 | 1986-12-30 | Hybritech Incorporated | Method and apparatus for immunoassays |
| US5081017A (en) * | 1986-02-18 | 1992-01-14 | Texas Bioresource Corporation | Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria |
| US4810636A (en) * | 1986-12-09 | 1989-03-07 | Miles Inc. | Chromogenic acridinone enzyme substrates |
| ES2097804T3 (es) * | 1989-12-29 | 1997-04-16 | Oklahoma Med Res Found | Metodos para diagnosticar la gripe humana y sustratos cromogenos de acido n-acetilneuraminico para usar en estos metodos. |
| WO1991009971A1 (en) * | 1990-01-05 | 1991-07-11 | Symex Corp. | Chromogenic 5-position modified neuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith |
| WO1991010744A1 (en) * | 1990-01-10 | 1991-07-25 | Symex Corp. | Chromogenic 9-position modified n-acetylneuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith |
| AP249A (en) * | 1990-04-24 | 1993-03-17 | Biota Scient Management Pty Ltd | Anti-viral compounds. |
| US5252485A (en) * | 1990-08-10 | 1993-10-12 | Savant Instruments, Inc. | Unit for hydrolyzing amino-acid containing specimens |
| WO1992006691A1 (en) * | 1990-10-19 | 1992-04-30 | Biota Scientific Management Pty. Ltd. | Anti-viral compounds that bind the active site of influenza neuramidase and display in vivo activity against orthomyxovirus and paramyxovirus |
| US5252458A (en) * | 1990-12-31 | 1993-10-12 | Symex Corp. | Method for visually detecting the presence of a virus in a clinical specimen |
| US5489675A (en) * | 1992-06-25 | 1996-02-06 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Disaccharide sialidase substrates and inhibitors |
| US5556963A (en) * | 1994-08-05 | 1996-09-17 | Oklahoma Medical Research Foundation | Synthesis of 4-alkoxy-N-acetylneuraminic acid |
-
1996
- 1996-09-25 US US08/718,666 patent/US5719020A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-09-05 CA CA002237790A patent/CA2237790A1/en not_active Abandoned
- 1997-09-05 ES ES97940823T patent/ES2173481T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 IL IL12451197A patent/IL124511A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-09-05 EP EP97940823A patent/EP0888371B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 JP JP51565598A patent/JP4070817B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-05 BR BR9706776A patent/BR9706776A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-09-05 NZ NZ330443A patent/NZ330443A/xx unknown
- 1997-09-05 AU AU42512/97A patent/AU716275B2/en not_active Ceased
- 1997-09-05 PL PL97327109A patent/PL327109A1/xx unknown
- 1997-09-05 AT AT97940823T patent/ATE217879T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-09-05 WO PCT/US1997/015602 patent/WO1998013372A1/en active IP Right Grant
- 1997-09-05 DE DE69712747T patent/DE69712747T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-05 CN CN97191313A patent/CN1091447C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-05-22 NO NO19982343A patent/NO310822B1/no unknown
-
1999
- 1999-04-27 HK HK99101848A patent/HK1016988A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-18 CN CNB011166940A patent/CN1147589C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2173481T3 (es) | 2002-10-16 |
| CA2237790A1 (en) | 1998-04-02 |
| EP0888371B1 (de) | 2002-05-22 |
| NZ330443A (en) | 1998-12-23 |
| BR9706776A (pt) | 1999-05-18 |
| DE69712747D1 (de) | 2002-06-27 |
| NO982343D0 (no) | 1998-05-22 |
| NO982343L (no) | 1998-07-01 |
| IL124511A (en) | 2002-08-14 |
| IL124511A0 (en) | 1998-12-06 |
| EP0888371A1 (de) | 1999-01-07 |
| CN1147589C (zh) | 2004-04-28 |
| AU4251297A (en) | 1998-04-17 |
| WO1998013372A1 (en) | 1998-04-02 |
| CN1324954A (zh) | 2001-12-05 |
| JP4070817B2 (ja) | 2008-04-02 |
| ATE217879T1 (de) | 2002-06-15 |
| CN1205011A (zh) | 1999-01-13 |
| NO310822B1 (no) | 2001-09-03 |
| JP2000501748A (ja) | 2000-02-15 |
| PL327109A1 (en) | 1998-11-23 |
| CN1091447C (zh) | 2002-09-25 |
| HK1016988A1 (en) | 1999-11-12 |
| US5719020A (en) | 1998-02-17 |
| AU716275B2 (en) | 2000-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69712747T2 (de) | 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminsaurederivate und methoden zur erkennung von influenza typ a und b in klinischen proben | |
| US5663055A (en) | Methods for diagnosing human influenza and 4-position modified chromogenic N-acetylneuraminic acid substrated for use therein | |
| DE69509903T2 (de) | Synthese von 4-alkoxy-n-acetylneuraminsäure | |
| EP0157384B1 (de) | Substrate für Hydrolasen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| DE60208063T2 (de) | Chromogenischen enzymsubstraten und verfahren zum nachweis von beta-d-ribofuranosidase-wirksamkeit | |
| EP0146866B1 (de) | Phenolsulfonphtaleinyl-Beta-D-galactoside, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Beta-D-Galactosidase | |
| DE69029276T2 (de) | Verfahren zur diagnostizierung von menschlicher grippe und in position 4 modifizierte chromogene n-acetylneuraminsäure substrate zur verwendung in diesen verfahren | |
| AU781391B2 (en) | Chromogenic substrates of sialidase of bacterial, viral, protozoa, and vertebrate origin and methods of making and using the same | |
| WO1991009975A1 (en) | Chromogenic 7- or 8-position modified n-acetylneuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith | |
| US6812332B2 (en) | Chromogenic substrates of sialidase and methods of making and using the same | |
| JP2003522113A (ja) | シアリダーゼの発色基質とその製造法および使用法 | |
| US5272260A (en) | Reagents and methods for the determination of glycohydrolytic enzymes | |
| JP2003516157A (ja) | アリザリンをベースにした新規色原体基質 | |
| DE69131504T2 (de) | Verfahren zum visuellen nachweis der anwesenheit eines virus in einer klinischen probe | |
| WO1991010744A1 (en) | Chromogenic 9-position modified n-acetylneuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith | |
| MXPA98004081A (en) | 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type a and b viruses in clinical specimens | |
| WO1991009971A1 (en) | Chromogenic 5-position modified neuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith | |
| DE69017090T2 (de) | Chromogene Dibenzoxazepinon- und Dibenzothiazepinon-Enzymsubstrate. | |
| DE3852147T2 (de) | Substrate für beta-Galactosidase. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |