CN107446004B - 一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成方法 - Google Patents

一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种流感病毒神经酰胺酶荧光底物2‑(4’‑甲基伞形酮)‑alpha‑N‑乙酰基神经氨酸钠的合成方法：以N‑乙酰基神经氨酸为起始原料，得到苄酯，然后2位上引入离去基团‑Cl，其余位点用乙酰基保护，2位与4‑甲基伞形酮偶联，最后脱乙酰基和苄酯保护得到目标钠盐产品。本发明采用苄酯中间体比甲酯更容易生成单一构型，更利于析晶提纯；采用冰醋酸/乙酰氯代替吡啶/乙酸酐先得到全乙酰化中间体，反应过程中2位上的乙酰基被‑Cl取代成为为更好的离去基团。本发明可以大量低成本快速制备2‑(4’‑甲基伞形酮)‑alpha‑N‑乙酰基神经氨酸钠，作为开发流感病毒检测试剂盒的关键原料。

Description

一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成 方法
技术领域
本发明涉及一种神经酰胺酶荧光底物的合成方法，具体涉及一种流感病毒神经酰胺酶荧光底物2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成方法。
背景技术
流感是发病率高、传播快、致病地域最广的传染性疾病之一，快速检测流感病毒技术对制定预防措施及指导早期使用抗病毒药物起着关键性的作用。现有常规的流感病毒的分离培养、血清检测等流感病毒的检测方法存在耗时长、灵敏度滴等缺陷。神经氨酸酶(NA)对A型和B型的流感病毒复制有重要作用，检测该酶的活性为快速检测流感病毒提供了新的方法。专利US 2014272942 A1 Methods of deteting influenza virus中公开了2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠可以通过荧光检测方法，在数小时内检测出流感病毒的存在和种类结果，具有特异性强、敏感度高、实时监测等优点，在爆发疫情的应急检测中具有很高的应用价值。2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠作为流感病毒神经酰胺酶的底物可以快速灵敏的检测流感病毒，也可以快速确定抗流感药物的病毒抑制效果，有效的筛选出有效的抗病毒药物。其原理在于，神经氨酸酶分解该底物，使其裂解释放出一个荧光化合物——4-甲基伞形酮，根据荧光强度可以测得神经氨酸酶的活性，确定流感病毒是否存在或者所设计的药物抗病毒抑制的效果。
荧光反应机理：
Figure BDA0001375348260000011
然而，关于此化合物的合成方法报道较少。Thomas G.等，报道了以N-乙酰基神经氨酸为起始原料，最终通过2-deoxy-2-chloro-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-N-acetylneuraminic acid methyl ester与7-羟基-4-甲基香豆素钠合成2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸(Synthesis of 2'-(4-methylumbelliferyl)-alpha-D-N-acetylneuraminic acid and detection of skin fibroblast neuraminidase innormal humans and in sialidosis.Biochemistry,1979,18(13),pp 2783-2787)，该反应过程收率低、成本高，不适于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种合成步骤简单、成本低廉的神经酰胺酶荧光底物2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠盐的合成方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠盐的合成方法，包括以下步骤：
(1)N-乙酰基神经氨酸溶于适量水中，加入碳酸铯溶液至溶液呈弱碱性，减压蒸馏除水得到固体N-乙酰基神经氨酸铯。N-乙酰基神经氨酸铯溶于适当溶剂，滴加溴化苄反应一段时间，过滤，滤液减压蒸馏得油状物，在适当溶剂中结晶，得化合物1；
(2)将化合物1溶于冰醋酸中，滴加乙酰氯，TLC跟踪反应完全后，加入共沸溶剂减压蒸馏得油状物，即化合物2；
(3)将化合物2溶于溶剂中，加入4-甲基伞形酮，减压蒸馏脱溶后，剩余物过硅胶柱，洗脱液脱溶得固体化合物3；
(4)将化合物3溶于溶剂中加氢氧化钠溶液，反应结束后先中和再抽滤，滤液减压蒸馏得油状粗品，在适当溶剂中结晶，抽滤得固体化合物4，即2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠。
步骤(1)中，N-乙酰基神经氨酸与碳酸铯的摩尔比为1:0.55-0.60；N-乙酰基神经氨酸的浓度为0.50-0.65mol/L；碳酸铯的浓度为8-12％w.t.；碱性pH为7.3-8.5；N-乙酰基神经氨酸铯与溴化苄的摩尔比为1:1.5-2.0；N-乙酰基神经氨酸铯的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；结晶溶剂选用异丙醇，与油状物的体积比为3.5-4.0:1；溴化苄的滴加速度为5.0-10mL/min；反应温度为室温。
步骤(2)中，化合物1与乙酰氯的摩尔比为1:1.0-1.5；化合物1的浓度为0.5-0.65mol/L；所述共沸溶剂为甲苯；滴加乙酰氯温度为0-4℃；减压蒸馏温度为30-40℃。
步骤(3)中，化合物2与4-甲基伞形酮的摩尔比为1:0.9-1.1；化合物2的浓度为0.5-0.65mol/L；所述溶剂为乙腈:二异丙基乙胺为20:3(v/v)的混合溶剂；洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚4:1(v/v)。
步骤(4)中，所述化合物3与氢氧化钠的摩尔比为1:1.1-1.5；溶解化合物3与氢氧化钠的溶剂均为甲醇；化合物3的浓度为0.50-0.65mol/L；中和试剂为酸性树脂；结晶溶剂为丙酮，与油状粗品的体积比为1:3.0-4.0。
反应路线如下：
Figure BDA0001375348260000031
本发明具有以下有益优点：
本发明以N-乙酰基神经氨酸为起始原料，得到苄酯，然后2位上引入离去基团-Cl，其余位点用乙酰基保护，2位与4-甲基伞形酮偶联，最后脱乙酰基和苄酯保护得到目标钠盐产品。本发明采用苄酯而不是传统的甲酯，其目的在于苄酯中间体比甲酯更容易生成单一构型，更利于析晶提纯；采用冰醋酸/乙酰氯代替吡啶/乙酸酐先得到全乙酰化中间体，反应过程中2位上的乙酰基被-Cl取代成为为更好的离去基团。本发明可以大量低成本快速制备2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠，作为开发流感病毒检测试剂盒的关键原料。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠合成
(1)将200g N-乙酰基神经氨酸溶于1L水中，在室温下加入10％的碳酸铯水溶液至溶液pH＝8，然后减压蒸馏除水得到N-乙酰基神经氨酸铯盐固体，将该固体溶于2L DMF中，室温下滴加120mL溴苄，加料完毕后，室温下反应2h，反应完全后，过滤，滤液减压蒸馏，得到的油状物用异丙醇结晶，得到217.5g白色固体产品化合物1，产率87％，，反应式如下：
Figure BDA0001375348260000032
(2)将100g化合物1溶于600mL冰醋酸中，冰浴下滴加300mL乙酰氯，得到浅黄色透明体系，体系自然回温至室温，反应6小时后TLC检测反应完全，向体系加入500mL甲苯，30℃下减压蒸馏，然后再用甲苯带2次，最终得到浅黄色的油状物化合物2，产物直接用于下一步，反应式如下：
Figure BDA0001375348260000041
(3)将步骤(2)中所得到的油状物化合物2溶于2L乙腈与300mL二异丙基乙胺的混合溶剂中，加入380g 4-甲基伞形酮，室温下反应3h，TLC检测反应完全后，体系减压蒸馏，剩余物用乙酸乙酯比/石油醚4:1的洗脱剂过硅胶柱，得到白色固体产品155g化合物3，步骤2与步骤3两步收率为72％，，反应式如下：
Figure BDA0001375348260000042
(4)将40g化合物3溶于240mL无水甲醇中，室温下滴加0.1M氢氧化钠/甲醇溶液145mL，滴加完毕后室温搅拌2h，用酸性树酯中和后抽滤，滤液减压蒸馏得到油状粗产品，油状物用240mL丙酮析晶，抽滤得到白色的固体产品23g化合物4，产率80％，高效液相色谱法检测纯度为98.5％，反应式如下：
Figure BDA0001375348260000043

Claims (5)

1.一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠盐的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)N-乙酰基神经氨酸溶于适量水中，加入碳酸铯溶液至溶液呈弱碱性，减压蒸馏除水得到固体N-乙酰基神经氨酸铯；N-乙酰基神经氨酸铯溶于适当溶剂，滴加溴化苄反应一段时间，过滤，滤液减压蒸馏得油状物，在适当溶剂中结晶，得化合物1，反应式如下：
Figure FDA0002385110430000011
(2)将化合物1溶于冰醋酸中，滴加乙酰氯，TLC跟踪反应完全后，加入共沸溶剂减压蒸馏得油状物，即化合物2，反应式如下：
Figure FDA0002385110430000012
(3)将化合物2溶于溶剂中，加入4-甲基伞形酮，减压蒸馏脱溶后，剩余物过硅胶柱，洗脱液脱溶得固体化合物3，反应式如下：
Figure FDA0002385110430000013
(4)将化合物3溶于溶剂中加氢氧化钠溶液，反应结束后先中和再抽滤，滤液减压蒸馏得油状粗品，在适当溶剂中结晶，抽滤得固体化合物4，即2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠，反应式如下：
Figure FDA0002385110430000014
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，N-乙酰基神经氨酸与碳酸铯的摩尔比为1:0.55-0.60；N-乙酰基神经氨酸的浓度为0.50-0.65mol/L；碳酸铯的浓度为8-12％w.t.；碱性pH为7.3-8.5；N-乙酰基神经氨酸铯与溴化苄的摩尔比为1:1.5-2.0；N-乙酰基神经氨酸铯的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；结晶溶剂选用异丙醇，与油状物的体积比为3.5-4.0:1；溴化苄的滴加速度为5.0-10mL/min；反应温度为室温。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)中，化合物1与乙酰氯的摩尔比为1:1.0-1.5；化合物1的浓度为0.5-0.65mol/L；所述共沸溶剂为甲苯；滴加乙酰氯温度为0-4℃；减压蒸馏温度为30-40℃。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(3)中，化合物2与4-甲基伞形酮的摩尔比为1:0.9-1.1；化合物2的浓度为0.5-0.65mol/L；所述溶剂为乙腈:二异丙基乙胺为20:3v/v的混合溶剂；洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚为4:1v/v的混合。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，所述化合物3与氢氧化钠的摩尔比为1:1.1-1.5；溶解化合物3与氢氧化钠的溶剂均为甲醇；化合物3的浓度为0.50-0.65mol/L；中和试剂为酸性树脂；结晶溶剂为丙酮，与油状粗品的体积比为1:3.0-4.0。
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