ES2614088T3 - Cumarinas sulfonadas, su síntesis, sustratos fluorogénicos que resultan de un injerto de estas cumarinas sobre azúcares, procedimiento de obtención de estos sustratos, así como sus aplicaciones - Google Patents

Cumarinas sulfonadas, su síntesis, sustratos fluorogénicos que resultan de un injerto de estas cumarinas sobre azúcares, procedimiento de obtención de estos sustratos, así como sus aplicaciones Download PDF

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Abstract

Sustrato fluorogénico que tiene por fórmula general (II)**Fórmula** en la que: - R1 representa H, u OH, o un radical alquilo de C1 a C6 sustituido o no, lineal o ramificado, o -COR4, o -COOR4, o -CONHR4, - R2 representa H, o un halógeno, en particular el flúor, o un radical alquilo de C1 a C6 sustituido o no, lineal o ramificado, o -COR4, o -COOR4, o -CONHR4, - R1 y R2 pueden formar juntos un anillo, tal como un arilo o un furano, sustituido o no, - R3 representa H, o un halógeno, en particular el flúor, o un radical alquilo de C1 a C6 sustituido o no, lineal o ramificado, o -COR4, o -COOR4, o -CONHR4, - siendo R4 H, o un radical alquilo de C1 a C6 sustituido o no, lineal o ramificado o un arilo, sustituido o no, - M representa Na o K, - Z representa un azúcar seleccionado de entre los azúcares siguientes: celobiosa, xilobiosa, maltosa, sacarosa, glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa, xilano, glucano, xilotriosa, maltotriosa, celotriosa, xilotetraosa, o una mezcla de algunos de ellos, - y en la que no pudiendo Z ser la galactosa cuando R1 es H, R2 y R3 son F y M es Na.

Description

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y en las que los compuestos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 son unos ejemplos de sustratos que entran en la fórmula general (II).
Diferentes ejemplos de síntesis de estas cumarinas y sustratos se darán ahora, a título indicativo y de ninguna 5 manera limitativo.
Ejemplo 1. Síntesis de 4-clorometil-6,8-difluoro-7-hidroxicumarina (1)
Una solución de 2,4-difluororesorcinol (0,8 g) en 8 ml de ácido metilsulfónico se introduce en un matraz, y después
10 se añaden gota a gota 1,3 equivalentes (963 µl) de 4-cloroacetoacetato de etilo. Después de 3h de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se enfría hasta 0°C , después se añaden 100 ml de agua. Se filtra entonces el residuo, se seca y después se lava con éter dietílico para dar 0,34 g (25%) del compuesto 1.
RMN 1H (MeOD) δ (ppm) 7,42 (d, 1H); 6,05 (s, 1H); 4,81 (s, 2H) 15
Ejemplo 2. Síntesis de 6,8-difluoro-7-hidroxicumarin-4-metanosulfonato de sodio (2)
Una solución de 320 mg del compuesto 1 disuelto en 25 ml de etanol se introduce en un matraz, y después se añade una solución de sulfito de sodio (1,1 equivalente, 185 mg) en 6 ml de agua. La mezcla se lleva a reflujo y se
20 sigue la evolución de la reacción por CCM (Cromatografía sobre capa delgada). Después de 40h de calentamiento, la mezcla se enfría hasta 0°C. Se filtra la solució n y después se evapora el filtrado bajo presión reducida para dar un sólido amarillo.
El sólido obtenido se purifica una primera vez por cromatografía sobre columna de sílice inversa previamente 25 envasada (eluyente: agua pura, cartucho Puriflash Interchrom C18) y después con un aparato de purificación Biotage-IsoleraOne (eluyente: agua pura, cartucho SNAP C18 120 g, caudal de elución: 25 ml/min).
Después de la evaporación del agua bajo presión reducida, el producto 2 se obtiene puro con un rendimiento del 40%. 30 RMN 1H (D2O) δ (ppm) 7,28 (d, 1H); 6,18 (s, 1H); 4,32 (s 2H).
RMN 13C (D2O) δ (ppm) 163,7; 153,1 (dd); 150,5 (t); 149,0; 142,2 (dd); 140,7 (m); 109,2; 105,3 (d); 103,6 (d); 52,7.
35 Máximo de excitación/emisión = 370/470 nm (10 µM en tampón fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,5).
Ejemplo 3. Síntesis de 5,6-benzo-4-clorometil-7-hidroxicumarina (3)
Una solución de 1,3-dihidroxinaftaleno (1 g) en 10 ml de ácido metanosulfónico se introduce en un matraz, y
40 después se añaden gota a gota 1,3 equivalentes (1,10 ml) de 4-cloroacetoacetato de etilo. Después de 4 días de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se enfría hasta 0°C, y después se añaden 50 ml de agua. Se filtra entonces el residuo, se lava con agua y se seca para dar 1,30 g (80%) del compuesto 3.
RMN 1H (DMSO) δ (ppm) 8,47 (d, 1H); 8,32 (d, 1H); 7,75 (t, 1H); 7,60 (t, 1H); 6,88 (s, 1H); 6,58 (s, 1H); 5,33 (s, 2H). 45
Ejemplo 4. Síntesis de 5,6-benzo-7-hidroxicumarin-4-metanosulfonato de sodio (4)
Una solución de 0,7 g del compuesto 3 disuelto en 50 ml de etanol se introduce en un matraz, y después, se añade una solución de sulfito de sodio (1,1 equivalentes, 370 mg) en 13 ml de agua. La mezcla se lleva a reflujo y se sigue
50 la evolución de la reacción por CCM. Después de 20h de calentamiento, la mezcla se enfría hasta 0°C. S e filtra la solución sobre un embudo Büchner y después se evapora el filtrado bajo presión reducida para dar el compuesto 4 bruto en forma de un sólido amarillo con un rendimiento del 77%.
El sólido obtenido se purifica una primera vez por cromatografía sobre columna de sílice inversa previamente 55 envasada (eluyente: agua pura, cartucho Puriflash Interchrom C18) y después con un aparato de purificación Biotage-IsoleraOne (eluyente: 10% acetonitrilo/90% agua, cartucho SNAP C18 120 g, caudal de elución: 25 ml/min).
Después de la evaporación de los disolventes bajo presión reducida, el producto 4 se obtiene puro con un rendimiento del 31%. 60 RMN 1'H (D20) δ (ppm) 8,26 (d, 1H); 8,02 (d, 1H); 7,56 (t, 1H); 7,44 (t, 1H); 6,32 (s, 1H); 6,11 (s, 1H); 4,45 (s, 2H).
Máximo de excitación/emisión = 420/510 nm (100 µM en tampón fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,5).
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Ejemplo 5. Síntesis de 4-clorometil-7-hidroxi-8-metilcumarina (5)
Una solución de 2-metilresorcinol (1 g) en 10 ml de ácido metilsulfónico se introduce en un matraz, y después se añaden gota a gota 1,3 equivalentes (1,42 ml) de 4-cloroacetoacetato de etilo. Después de 1 noche de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se enfría hasta 0°C , y después se añaden 50 ml de agua. Se filtra entonces el residuo, se seca y después se lava con éter dietílico para dar 1,63 g (90%) del compuesto 5.
RMN 1H (DMSO) δ (pm) 7,52 (d, 1H); 6,90 (d, 1H); 6,41 (s, 1H); 4,93 (s, 2H); 2,16 (s, 3H). RMN 13C (DMSO) δ (ppm) 160,8; 159,7; 153,6; 151,7; 123,5; 112,3; 111,6; 111,1; 109,8; 41,9; 8,4.
Ejemplo 6. Síntesis de 4-clorometil-7-hidroxi-8-metilcumarin-4-metanosulfonato de sodio (6)
Una solución de 1 g del compuesto 5 disuelto en 90 ml de etanol se introduce en un matraz, y después se añade una solución de sulfito de sodio (1,1 equivalente, 617 mg) en 22 ml de agua. La mezcla se lleva a reflujo. Después de 20h de calentamiento, la mezcla se enfría hasta 0°C. Se filtra la solución sobre un embudo Büchner, el residuo beige obtenido se lava con etanol, en cuanto al filtrado, éste se evapora bajo presión reducida para dar un sólido amarillo. Este sólido se lava con etanol y con éter dietílico. Los dos sólidos obtenidos se reúnen para dar 1 g (80%) de compuesto 6 bruto.
El compuesto 6 bruto se purifica después por varias cromatografías sobre columna de sílice inversa previamente envasada (eluyente: agua pura, cartucho Puriflash Interchrom C18) sucesivas para dar el producto 6 puro con un rendimiento del 23%.
RMN 1H (D2O) δ (ppm) 7,32 (d, 1H); 6,69 (d, 1H); 6,15 (s, 1H); 4,19 (s, 2H); 1,97 (s, 3H). RMN 13C (D2O) δ (ppm) 164,2; 158,5; 148,9; 123,9; 112,6; 112,2; 111,8; 111,3; 52,4; 7,3.
Máximo de excitación/emisión = 340/485 nm (10 µM en tampón fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,5).
Ejemplo 7. Síntesis del sustrato β-D-celobiosido 6,8-difluoro-7-hidroxicumarin-4-metanosulfonato de sodio
(8)
Bromación del azúcar protegido:
Bajo atmósfera de nitrógeno, se introduce 1 g de aceto-α-D-celobiosa y 12,5 ml de DCM (diclorometano) anhidro en un matraz. La mezcla se enfría hasta 0°C, y después se añaden gota a gota 15 ml de una solución de ácido bromhídrico en solución al 33% en ácido acético. Después de 5h de reacción a 0°C, se añaden 25 ml de D CM, y después se agita la mezcla otra vez durante 10 min. Se añade después una solución de carbonato de potasio cuidadosamente hasta la desaparición de la liberación de CO2, y el medio se deja bajo agitación durante 20 min. Después de la decantación, se recupera la fase orgánica, se extrae la fase acuosa 3 veces con DCM, y después se combinan las fases orgánicas, se secan sobre MgSO4 y se evaporan bajo presión reducida. La acetobromo-α-Dcelobiosa se obtiene en forma de un sólido blanco con un rendimiento del 62%. El producto así obtenido es inestable, y conviene entonces utilizarlo directamente, o bien conservarlo a -20°C.
RMN 1'H (CDCl3) δ (ppm) 6,67 (m, 1H); 5,55 (t, 1H); 5,13 (m, 2H); 4,95 (t, 1H); 4,78 (m, 1H); 4,55 (m, 2H); 4,38 (m, 1H); 4,20 (m, 2H); 4,07 (m, 1H); 3,84 (m, 1H); 3,68 (m, 1H); 2,09 (m, 21H).
Injerto del azúcar sobre la cumarina:
Bajo atmósfera de nitrógeno y protección de la luz, se introducen en un matraz 40 mg de cumarina 2 diluidos en 5 ml de DMF (dimetilformamida) anhidra y 150 mg de carbonato de plata. Se disuelven 4 equivalentes de acetobromo-αD-celobiosa (350 mg) en 10 ml de DMF anhidro. Esta solución se añade después muy lentamente a la mezcla anterior. Después de una noche de agitación a temperatura ambiente, se filtra la solución sobre celita y se evapora el filtrado bajo presión reducida. El sólido obtenido se purifica finalmente por cromatografía sobre columna de sílice (eluyente: 20% MeOH/80% DCM). El compuesto 7 se obtiene con un rendimiento del 4,8%.
Desprotección de las funciones de tipo acetal:
Bajo atmósfera de nitrógeno, se introducen en un matraz 40 mg del compuesto 7 y 7,5 ml de metanol anhidro. La mezcla se enfría hasta 0°C, y después, se añaden 16 mg de metilato de sodio en 5 ml de metanol gota a gota. Se sigue la evolución de la reacción por LC/MS. Después de 1h de agitación, se neutraliza el medio por adición de una solución diluida de ácido cítrico. Después de una agitación suplementaria de 20 min, se evapora el disolvente bajo presión reducida para dar un aceite amarillo translúcido.
El residuo obtenido se purifica una primera vez por cromatografía sobre columna de sílice inversa previamente envasada (eluyente: agua pura, cartucho Puriflash Interchrom C18) y después con una HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography).
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RMN 1H (D2O) δ (ppm) 8,24 (d, 1H); 8,18 (d, 1H); 7,53 (m, 2H); 6,80 (s, 1H); 6,24 (s,1H); 5,25 (d, 1H); 4,49 (m,2H); 4,0-3,5 (m, 6H).
Ejemplo 13. Síntesis del sustrato β-D-xilosido 5,6-benzo-7-hidroxicumarin-4-metanosulfonato de sodio (20)
5 Injerto del azúcar sobre la cumarina:
Bajo atmósfera de nitrógeno y protección de la luz, se introducen en un matraz 55 mg de cumarina 4 diluidos en 4 ml de DMF anhidro y 5 equivalentes de carbonato de plata (0,3 g). Se disuelven 5 equivalentes de acetobromo-α-D
10 xilosa (obtenido como se describe en el ejemplo 9) en 4 ml de DMF anhidro. Se añade después esta solución lentamente a la mezcla anterior. Después de 20h de agitación a temperatura ambiente, se filtra la solución sobre celita y se evapora el filtrado bajo presión reducida.
El sólido obtenido se purifica por cromatografía sobre columna de sílice (eluyente: 10% MeOH/90% DCM). El 15 compuesto 19 se obtiene puro con un rendimiento del 42%.
RMN 1H (MeOD/D2O) δ (ppm) 8,57 (d, 1H); 8,00 (d, 1H); 7,68 (t, 1H); 7,55 (t, 1H); 6,89 (s, 1H); 6,52 (s, 1H); 5,53 (m, 1H); 5,31 (m, 2H); 5,08 (m, 1H); 4,61 (m, 2H); 4,23 (m, 1H); 3,78 (m, 1H); 2,17 (m, 9H).
20 Desprotecciones de las funciones de tipo acetal:
Bajo atmósfera de nitrógeno, se introducen en un matraz 40 mg del compuesto 19 y 11 ml de metanol anhidro. La mezcla se enfría hasta 0°C, y después se añaden got a a gota 500 µl de una solución de metilato de sodio al 1% (g/g) en el metanol. Después de 2h15 de reacción, se añaden de nuevo 400 µl de la solución de metilato de sodio.
25 Después de 3h30 de agitación, se añade Amberlite IR120 hasta la neutralización del medio. Después de la filtración del Amberlite, se evapora el filtrado bajo presión reducida.
El residuo obtenido se purifica por cromatografía sobre columna de sílice inversa previamente envasada (eluyente: 10% acetonitrilo en agua pura, cartucho Puriflash Interchrom C18) para dar el compuesto 20 con un rendimiento del
30 35%.
RMN 1H (D2O) δ (ppm) 8,09 (d, 1H); 7,99 (d, 1H); 7,46 (m, 1H); 7,38 (m, 1H); 6,51 (s, 1H); 6,16 (s, 1H); 4,98 (m, 1H); 4,37 (m, 2H); 4,01 (m, 1H); 3,8-3,4 (m, 4H).
35 Ejemplo 14. Síntesis del sustrato β-D-glucosido 7-hidroxi-8-metilcumarin-4-metanosulfonato de sodio (22)
Injerto del azúcar sobre la cumarina:
Bajo atmósfera de nitrógeno y protección de la luz, se introducen en un matraz 80 mg de cumarina 6 diluidos en 7 ml
40 de DMF anhidro y 5 equivalentes de carbonato de plata (377 mg). Se disuelven 5 equivalentes (563 mg) de acetobromo-α-D-glucosa en 7 ml de DMF anhidro. Se añade después esta solución lentamente a la mezcla anterior. Después de 20h de agitación a temperatura ambiente, se filtra la solución sobre celita y se evapora el filtrado bajo presión reducida.
45 El sólido obtenido se purifica una primera vez por cromatografía sobre columna de sílice (eluyente: 10% MeOH/90% DCM) y después por cromatografía sobre columna de sílice inversa previamente envasada (eluyente: gradiente del 0% al 50% de acetonitrilo en agua pura, cartucho Puriflash Interchrom C18). El compuesto 21 se obtiene así puro con un rendimiento del 17%.
50 RMN 1H (MeOD) δ (ppm) 7,85 (d, 1H); 7,67 (d, 1H); 6,47 (s, 1H); 5,47 (m, 2H); 5,30 (t, 1H); 5,16 (t, 1H); 4,4-4,1 (m, 5R); 2,25 (s, 3H); 2,08 (m, 12H).
Desprotecciones de las funciones de tipo acetal:
55 Bajo atmósfera de nitrógeno, se introducen en un matraz 18 mg del compuesto 21 y 5 ml de metanol anhidro. La mezcla se enfría hasta 0°C, y después se añaden 100 µl de una solución de metilato de sodio a 1% (g/g) en el metanol gota a gota. Se sigue la evolución de la reacción por CCM. Después de 1h30 de agitación, se añade Amberlite IR120 hasta la neutralización del medio. Después de la filtración del Amberlite, se evapora el filtrado bajo presión reducida.
60 El compuesto 22 se obtiene con un rendimiento del 34%.
RMN 1H (D2O) δ (ppm) 7,53 (d, 1H); 7,06 (d, 1H); 6,26 (s, 1H); 5,15 (d, 1H); 4,24 (m, 2H); 3,90 (m, 1H); 3,73 (m, 1H); 3,6-3,4 (m, 4H); 2,13 (s, 3H).
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Ejemplo 15. Síntesis del sustrato β-D-galactosido 7-hidroxi-8-metilcumarin-4-metanosulfonato de sodio (24)
Injerto del azúcar sobre la cumarina:
Bajo atmósfera de nitrógeno y protección de la luz, se introducen en un matraz 80 mg de cumarina 6 diluidos en 5 ml de DMF anhidro y 5 equivalentes de carbonato de plata (377 mg). Se disuelven 5 equivalentes (563 mg) de acetobromo-α-D-galactosa en 5 ml de DMF anhidro. Se añade después esta solución lentamente a la mezcla anterior. Se sigue la evolución de la reacción por CCM. Después de 40h de agitación a temperatura ambiente, se filtra la solución sobre celita y se evapora el filtrado bajo presión reducida.
El sólido obtenido se purifica una primera vez por cromatografía sobre columna de sílice inversa previamente envasada (eluyente: gradiente del 0% al 50% de acetonitrilo en agua pura, cartucho Puriflash Interchrom C18) y después por cromatografía sobre columna de sílice (eluyente: 10% MeOH/90% DCM). El compuesto 23 se obtiene así puro con un rendimiento del 42%.
RMN 1H (MeOD) δ (ppm) 7,81 (d, 1H); 7,65 (d, 1H); 6,45 (s, 1H); 5,49 (m, 3H); 5,37 (m, 1H); 4,37 (m, 3H); 4,20 (m, 2H); 2,23 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,12 (s, 3H); 2,08 (s, 3H); 2,03 (s, 3H). RMN 13C (MeOD) δ (ppm) 170,80; 170,65; 170,08; 169,97; 161 ,57; 157,33; 152,52; 148,64; 124,58; 114,82; 114,41; 114,15; 110,77; 98,48; 70,93; 70,67; 68,60; 67,39; 61,29; 52,61; 19,41; 19,37; 19,19; 19,18; 7,03.
Desprotecciones de las funciones de tipo acetal:
Bajo atmósfera de nitrógeno, se introducen en un matraz 45 mg del compuesto 23 y 20 ml de metanol anhidro. La mezcla se enfría hasta 0°C, y después se añaden 300 µl de una solución de metilato de sodio al 1% (g/g) en el metanol gota a gota. Se sigue la evolución de la reacción por CCM. Después de 1h30 de agitación, la reacción no es total, se añaden de nuevo 300 µl de la solución de metilato. Después de 3h de reacción, se añade Amberlite IR120 hasta la neutralización del medio. Después de la filtración del Amberlite, se evapora el filtrado bajo presión reducida.
El compuesto 24 se obtiene con un rendimiento del 36%.
RMN 1H (D2O) δ (ppm) 7,51 (d, 1H); 7,07 (d, 1H); 6,24 (s, 1H); 5,09 (d, 1H); 4,0-3,6 (m, 8H); 2,13 (s, 3H).
Los sustratos así obtenidos encuentran en particular su aplicación para la detección de actividades glicosidasas (EC3.2.1) sobre unos extractos enzimáticos purificados o no o sobre unos microorganismos o sobre células.
Será por ejemplo posible efectuar la determinación fluorescente de actividades xilanasa y/o celulosa y/o celobiasa y/o glucosidasa y/o xilosidasa y/o galactosidasa de extractos enzimáticos, o bien efectuar el cribado por fluorescencia según sus actividades glicosidasas (EC3.2.1) de enzimas o de microorganismos o de células.
De manera más particular, los nuevos sustratos según la invención permitirán la detección de actividades glicosidasas (EC3.2.1) sobre unos extractos enzimáticos purificados o no o sobre unos microorganismos o sobre unas células compartimentadas en unas gotitas acuosas en suspensión en una fase oleosa (emulsión) producidas por agitación mecánica. Será así posible realizar el cribado por FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) según sus actividades xilanasa y/o celulosa y/o celobiasa y/o glucosidasa y/o xilosidasa y/o galactosidasa de enzimas o de microorganismos o de células compartimentadas en gotitas acuosas en suspensión en una fase oleosa.
De manera aún más particular, los sustratos según la invención permitirán la detección de actividades glicosidasas (EC3.2.1) sobre unos extractos enzimáticos purificados o no o sobre unos microorganismos o sobre unas células compartimentadas en unas gotitas acuosas en suspensión en una fase oleosa (emulsión) producidas por un dispositivo microfluídico. En esta hipótesis, será posible realizar por ejemplo el cribado según sus actividades xilanasa y/o celulosa y/o celobiasa y/o glucosidasa y/o xilosidasa y/o galactosidasa de enzimas o de microorganismos o de células compartimentadas en gotitas acuosas en suspensión en una fase oleosa creada por un dispositivo microfluídico.
Diferentes ejemplos de detecciones de actividades enzimáticas con la ayuda de los sustratos fluorogénicos descritos se darán ahora, a título indicativo y de ninguna manera limitativo.
Ejemplo 16. Detección de actividades enzimáticas sobre extractos enzimáticos solubles con los sustratos 10, 12, 14y18
Las cinéticas enzimáticas se realizan en microplacas sobre unos extractos enzimáticos solubles (A, B, C y D) ricos en actividades de tipo celulasa y xilanasa. Estos extractos se diluyen 10 veces (sustrato 18, figura 1) o 100 veces (sustrato 10, 12 y 14, figura 2) en un tampón fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,5. Un volumen de 20 µl de extracto enzimático diluido se añade a 20 µl de sustrato fluorogénico (10, 12, 14 o 18) a 0,25 mM en un tampón fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,5. Las cinéticas se realizan a 30ºC. La hidrólisis enzimática de los diferentes sustratos fluorogénicos se continúa durante 120 minutos por medición de la fluorescencia con unas longitudes de
excitación y de emisión de: 339 nm y 452 nm para los sustratos 10, 12 y 14; 375 nm y 510 nm para el sustrato 18.
Los resultados obtenidos (figuras 1 y 2) muestran que los sustratos fluorogénicos ensayados permiten detectar unas actividades enzimáticas de tipo β-glucosidasa (sustrato 10 y 18), β-xilosidasa (sustrato 12) y xilanasa (sustrato 14) en los extractos enzimáticos utilizados.
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Diferentes cepas control se cultivan en medio LB a 30ºC bajo agitación (240 rpm) durante 18 h. Para cada cepa, se centrifuga el cultivo (2500 g, 5 minutos) y se lava dos veces el residuo de células en 5 ml de medio LB (centrifugación a 2500 g, 5 minutos). Este residuo se utiliza para inocular a DO = 0,005 un cultivo en medio inductor
15 (medio Dubos a 2,5 g/l de carboximetil-celulosa) que contiene el sustrato fluorogénico (8 o 10) a 0,25 mM. El cultivo se incuba a 30ºC bajo agitación durante 24h. Se recogen unas muestras de sobrenadante de cultivo a diferentes tiempos de incubación para poder seguir la aparición de las actividades celulosa o β-glucosidasa en el medio de cultivo. La aparición de estas actividades se sigue por medición de la fluorescencia sobre los sobrenadantes de cultivo en microplacas con unas longitudes de onda de excitación y de emisión de 388 nm y 455 nm.
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