NO310822B1 - 4,7-Dialkoksy-N-acetylneuraminsyrederivater og anvendelse av de samme - Google Patents

4,7-Dialkoksy-N-acetylneuraminsyrederivater og anvendelse av de samme Download PDF

Info

Publication number
NO310822B1
NO310822B1 NO19982343A NO982343A NO310822B1 NO 310822 B1 NO310822 B1 NO 310822B1 NO 19982343 A NO19982343 A NO 19982343A NO 982343 A NO982343 A NO 982343A NO 310822 B1 NO310822 B1 NO 310822B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
chromogenic
acetylneuraminic acid
bromo
indolyl
group
Prior art date
Application number
NO19982343A
Other languages
English (en)
Other versions
NO982343D0 (no
NO982343L (no
Inventor
Avraham Liav
Joyce Anne Hansjergen
Craig David Shimasaki
Original Assignee
Oklahoma Med Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oklahoma Med Res Found filed Critical Oklahoma Med Res Found
Publication of NO982343D0 publication Critical patent/NO982343D0/no
Publication of NO982343L publication Critical patent/NO982343L/no
Publication of NO310822B1 publication Critical patent/NO310822B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/027—Keto-aldonic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/50—Indoles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)

Description

Oppfinnelsen skaffer tilveie 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyre og kromogene og fluorogene 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrater og deres anvendelse til å påvise influensatyper A og B i kliniske uttak eller prøver. Mer spesifikt skaffer foreliggende oppfinnelse tilveie 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrater som kan bli anvendt til å adskille mellom forskjellige virus som har neuraminidasereaktivitet. Influensatype A og B viruser kan således bli adskilt fra parainfluensatype 1, 2, 3 og 4 og kusmavirus ved å anvende 4,7-dialoksy-N-acetylneuraminsyrederivatene ifølge oppfinnelsen.
Infeksjonssykdommer er den mest vanlige årsak til besøk hos lege. Virus er ansvarlig for mer av disse infeksjonene enn alle andre typer av mikroorganismer i kombinasjon. Av alle de forskjellige infeksjonene som er forårsaket av virus, er respiratoriske viruser (influensa A og B; parainfluensa 1, 2, 3 og 4; respiratorisk syncytialvirus og adenovirus) mest dominerende som en gruppe. Dødeligheten av influensavirus ble oppdaget så tidlig som år 430 før kristi fødsel ved pesten i Athen (Langmuir et al., New Engl. J. Medicine, 313
(1985) 1027). Influensa er årsak nummer en som forårsaker akutt respiratorisk sykdom og en bidragsyter til den sjette ledende dødsårsaken i USA hvert år (Monthly Vital Statistics Report, Vol. 43, nr. 6 (1995)). Som et resultat har utvikling av diagnostiske metoder for virus og virale infeksjoner har stadig blitt viktigere.
Rask diagnose av virale infeksjoner har også blitt en integrert del av god medisinsk praksis. Noen virus har definerbare antigener mot hvilke antistoffer kan bli produsert. Immunanalyser har derfor fått vid anvendelse for måling av tilstedeværelse av et virion. Der det er ønskelig å måle en bredere gruppe av virioner, er det mulig å påvise en spesiell komponent av viruset. Influensavirus som uttrykker overflateglykoproteiner har neuraminidase (sialidase) aktivitet. Neuraminidaseenzym hydrolyserer substratene som inneholder 2-ketosidisk bundet N-acetylneuraminsyre (Neu5 Ac, også kjent som sialinsyre). Neu5Ac består av en ryggrad av ni karbonatomer, en karbongruppe og en N-acetylgruppe. Den generelle strukturen så vel som nummereringssystemet som ble anvendt for å betegne karbonatomer, er vist under.
Når et virion med neuraminidaseaktivtet er inkubert med et kromagent eller fluorogent glykosid av Neu5 Ac, vil enzymet avspalte det kromogene eller fluorogene aglykon fra substratet, og reaksjonsproduktet vil indikere tilstedeværelse av et virion. Gjennom beskrivelsen vil N-acetylgruppen som er tilknyttet 5-posisjonskarbonet i ovenfornevnte formel betegnes som AcHN.
En måte å påvirke tilstedeværelsen av et virus gjennom reaksjon av et enzym med et kromogent substrat for enzymet er beskrevet i US-patent nr. 5.252.458 som her er innbefattet med referanse. (J. Infectious Diseases, 142 (1980) 516-523. Yoken et al. anvendte 4-metylumbelliferyl-2-ketosid av Neu5Ac som et fluoresserende substrat for å måle neuraminidaseaktivitet i preparater inneholdende små mengder av dyrket virus så vel som i noen nasale vaskeprøver fra menneskelige frivillige infisert med influensavirus. Yolken et al. hevder at "successful development of fluorometric enzyme assays for the detection of influenza neuraminidase might thus provide for å practical means of influenza diagnosis that is sufficiently rapid to allow for the institution of appropriate preventive and therapeutic interventions". I henhold til Yolken et al., var kolorimetriske analyser utilstrekkelig sensitive for klinisk anvendelse. I motsetning til dette bemerker Yolken et al. at fluoremetriske analyser kan være egnet for påvisning av influensaneuraminidase i kliniske prøver.
Pachucki et al. (J. Clinical Microbiology, 26 (1988; 2664-2666) testet 4-metylumbelliferyl-2-ketosid av Neu5Ac i forbindelse med kliniske prøver samlet fra influensapasienter. På grunn av lav sensitivitet var analysen ikke nyttig i påvisning av neuraminidase direkte og raskt i kliniske prøver. Analysen identifiserte imidlertid 91% av virus-positive isolater 25 timer etter en okkulering av vevskulturer.
Anvendelse av modifisert Neu5 Ac substrater kan øke spesifisitet av neuraminidaseanalysen. I forbindelse med sialinsyrer har 4-posisjonkarbon (C-4) blitt rapportert å spille en viktig rolle i enzym-substratinteraksjoner. Ettersom det er kjent at bakterieenzymer i spyttet utviser neuraminidaseaktivitet (Varki et al., J. Biol. Chem., 258
(1983) 12465-12471) er det nødvendig å eliminere disse uønskede interaksjonene. Det har allerede blitt vist at ketosider av 4-metoksy-Neu5 Ac er resistente mot visse bakterielle sialidaser, men blir spaltet raskt av visse virale sialidaser (Beau et al., Eur. J. Biochem., 106 (1980) 531-540).
Selv om modifikasjon av 4-posisjon av N-acetylneuraminsyrer skaffer tilveie spesifisitet mellom en viss viral og viss bakteriell neuraminidasereaktivitet, vil det være ønskelig å
oppnå substrater som tillater videre spesifisitet eller differensiering mellom de forskjellige virale neuraminidasereaktivitetene, mens man opprettholder spesifisitet mellom virale og bakterielle neuraminidasereaktiviteter. Slike substrater vil f. eks. tillate høy spesifisitet for spesielle typer neuraminidaseinneholdende virus og tillate bedre og mer direkte behandlingssystemer. Slike substrater vil også tillate mer nøyaktig overvåking av virale infeksjoner og mere fokuserte medisinske intervensjoner etter behov. De kromogene og fluorogene 4,7-modifisert N-acetylneuraminsyresubstratene ifølge foreliggende oppfinnelse tillater videre spesifisitet ved differensiering mellom de forskjellige virale neuraminidasereaktivitetene mens de opprettholder spesifisitet mellom virale og bakterielle neuraminidasereaktiviteter.
Oppfinnelsen angår kromogene og fluorogene 4,7-modifiserte N-acetylneuraminsyresubstrater og deres anvendelse for deteksjon og identifikasjon av influensavirus i kliniske prøver. Mer spesfikt angår oppfinnelsen kromogene og fluorogene 4,7-dialkoksy N-acetylneuraminsyresubstrater som kan bli anvendt for påvisning og identifikasjon av influensavirus i kliniske prøver. Disse 4,7-dialkoksy N-acetylneuraminsyresubstrater kan bli anvendt i diagnostiske tester for å adskille mellom influensatype A og B virus og andre virus som innehar neuraminidaseenzymer i kliniske prøver.
Slik det ble anvendt her har "kromogen eller fluorogen gruppe" og "markør eller reportergruppe" til hensikt å innbefatte uten begrensning molekyler som utviser absorbans eller fluorescens. Begrepet "farge" har på samme måte til hensikt å innbefatte, uten begrensning, absorbans og fluorescens.
Ifølge oppfinnelsen er det således tilveiebrakt en 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyre, kjennetegnet ved at den har den generelle formel
der Ri og R2 er alkylgrupper som inneholder 1 til 4 karbonatomer.
Foretrukne trekk med 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyrene ifølge oppfinnelsen fremgår av medfølgende krav 2 og 3.
Dessuten er det ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt et 4,7-dialkoksy N-acetylneuraminsyresubstrat kjennetegnet ved at det har den generelle formel
der Ri og R2 er alkylgrupper som inneholder 1 til 4 karbonatomer og R3 er en kromogen eller fluorgen gruppe.
Foretrukne trekk ved 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstratene ifølge oppfinnelsen fremgår fra medfølgende krav 5-9.
Et ytterligere trekk ved foreliggende oppfinnelse er anvendelse av et kromogent eller fluorgent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat med den generelle formel hvori Ri og R2 er alkylradikaler som inneholder 1 til 4 karbonatomer og R3 er en kromogen eller fluorogen gruppe som utviser en distinkt og karakteristisk farge når den spaltes fra substratet eller et salt av substratet;
for å detektere viruser av influensa type A og B i en klinisk prøve fra et individ som er mistenkt for å ha en respiratorisk virusinfeksjon ved:
(1) å inkubere den kliniske prøven med det ovenfor nevnte substratet; og
(2) å observere den inkuberte kliniske prøven for å bestemme om den distinkte og karakteristiske fargen dannes, hvori dannelse av den distinkte og karakteristiske fargen indikerer nærværet av viruser av influensa type A eller B i den kliniske prøven.
Foretrukne trekk ved anvendelsen av et kromogent eller fluorgent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat fremgår fra medfølgende krav 11 - 15.
Ifølge oppfinnelsen er det dessuten tilveiebrakt en anvendelse av et kromogent eller fluorgent 4-alkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat med den generelle formel
hvori R4 er et alkylradikal som inneholder 1 til 4 karbonatomer og R5 er en kromogen eller fluorogen gruppe som utviser en distinkt og karakteristisk farge når den spaltes fra substratet eller et salt av substratet; (1) for å detektere viruser av influensatype A og B i en klinisk prøve fra et individ som er mistenkt for å ha en respiratorisk virusinfeksjon; og (2) for å skille mellom viruser av influensa type A og B og neuraminidase-reaktive viruser som ikke er viruser av influensa type A og B i den kliniske prøven.
Spesielt foretrukne trekk ved anvendelsen av det kromogene eller fluorgene 4-alkoksy-N-acetylneuraminsyresubstratet fra krav 16 ifølge oppfinnelsen, fremgår av de medfølgende kravene 17 og 18.
Foreliggende oppfinnelse angår altså en 4,7-dialkoksy N-acetylneuraminsyre med generell formel
der Ri og R2 er alkylgrupper inneholdende 1 til 4 karbonatomer. Ri og R2 kan være like eller forskjellige alkylgrupper. Høyere alkylgrupper (dvs. når R inneholder 3 til 4 karbonatomer) kan innbefatte lineære og forgrenede isomerer. Rj og R2 er fortrinnsvis alkylgrupper inneholdende 1 eller 2 karbonatomer; mer foretrukket er både Ri og R2 begge metylgrupper. 4,7-dialkoksy N-acetylneuraminsyre fra foreliggende oppfinnesle kan bli fremstilt ved å anvende generelle reaksjonsskjema: Utgangsmaterialet 1 (8,9-O-isopropylidin-metylester-metylketosidderivat av Neu5Ac) ble fremstilt fra Neu5Ac som generelt beskrevet i US-patent nr. 5.556.963. Neu5Ac er kommersielt tilgjengelig (MediHerb Inc., 4540 S. Navajo #1, Englewood, Co. 80110). Den kan også bli syntetisert enzymatisk fra N-acetyl-D-mannosamin og druesyre ved å anvende
Fremgangsmåte som beskrevet av Kim et al., J. Am. Chem. Soc, 110 (1988) 6481, og illustrert ved følgende ligning:
Den enzymatiske reaksjonen kan bli overvåket ved tynnsjiktkromatografi og produktet kan bli renset ved ionebyttekromatografi.
Neu5Ac blir først omdannet til et alkylesteralkylketosid med generell formel
som beskrevet i US-patent nr. 5.556.963. De vicinale hydroksylgruppene i C-8 og C-9 av dette metylestermetylketosid blir beskyttet ved dannelse av et ketal (1) ved behandling med effektive mengder av aceton og en syrekatalysator for å danne ketalet. Egnede syrekatalysatorer innbefatter p-toluensulfonsyre , salter av p-toluensulfonsyre slik som pyridiniumsalt (PPTS) og andre salter, ZnCb, FeCl3 og lignende. Den foretrukkede syrekatalysatoren er ikke-hygroskopisk pyridiniumsalt av p-toluensulfonsyre.
Beskyttet metylestermetylketosid 1 blir deretter alkylert for å danne en blanding av forbindelse 2 som inneholder en alkoksygruppe i 4-posisjon og forbindelse 3 med alkoksygrupper i både 4- og 7-posisjoner. Alkylering av hydroksylgruppen i C-4 og C-7 kan være metylering, etylering, propylering eller butylering, hvorved hydroksygruppen i C-4 i 2 er omdannet til en OR-gruppe og hydroksygruppen i C-4 og C-7 i 3 blir omdannet til -OR-grupper der R er et alkylradikal inneholdende ltil 4 karbonatomer. Alkylering i C-4 og/eller C-7 er metylering eller etylering, hvorved 4-metoksy eller 4-etoksyderivater eller 4,7-dimetoksy eller 4,7-dietoksyderivater fortrinnsvis blir oppnådd. Alkylering i C-4 og/eller C-7 er metylering, hvorved 4-metoksy eller 4,7-dimetoksyderivater blir oppnådd. Introduksjon av høyere alkylgrupper i C-4 og C-7 posisjoner er generelt langsommere enn metylering og utbytte er noe lavere. Kromogene substrater med høyere alkylgrupper har tendens til å være mindre utsatt for enzymatisk spalting enn 4,7-dimetoksy-Neu5Ac, og resulterer derved i mindre sensitive analyser. Ikke desto mindre kan i noen spesielle anvendelser og analyser, slike høyere alkylgrupper ved C-4 og C-7 være nyttige og til og med foretrukkede.
Alkylering ved den mer sterisk hindrede frie hydroksylgruppen i C-7 kan bli fremmet ved å regulere reaksjonsbetingelsene som beskrevet umiddelbart i det etterfølgende. I overenstemmelse med fremgangsmåten, blir mellomprodukt 1 behandlet med et overskudd (generelt høyere enn ca. 1,5 molare ekvivalenter) av et alkyleringsmiddel i ca. en 80% dispersjon av natriumhydrid. Alkyleringsmidlet blir valgt fra gruppen bestående av dimetylsulfat, dietylsulfat, dipropylsulfater, og dibutylsulfater. Reaksjonen blir generelt gjennomført ved en temperatur fra ca. 0°C til ca. 30°C i ca. 10 minutter til 48 timer. Reaksjonstemperaturen er fortrinnsvis i området fra ca. 9°C til ca. 22°C. Lengre reaksjonstider er generelt foretrukket når man danner høyere alkoksygrupper i 4- og 7-posisjoner. I en foretrukket utførelsesform blir en metyleringsreaksjon for å danne metoksygrupper i C-4 og C-7 gjennomført ved en temperatur fra ca. 0°C til ca. 30°C, mer å foretrekke fra ca. 0°C til ca. 22°C, i fra ca. 10 minutter til ca. 30 minutter. I en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, blir en etyleringsreaksjon for å danne etoksygrupper i C-4 og C-7 gjennomført ved en temperatur fra ca. 0°C til ca. 30°C, mer å foretrekke fra ca. 0°C til ca. 22°C, i ca. 1 time til ca. 24 timer.
Behandling av beskyttet metylestermetylketosid 1 med overskudd alkyleringsmiddel (f. eks. dimetylsulfat) produserer en blanding av forbindelse 2 som inneholder en alkoksygruppe i 4-posisjon og forbindelse 3 med alkoksygrupper i både 4- og 7-posisjoner. Et overskudd av ca. 1,5 molare ekvivalenter av alkyleringsmiddel blir anvendt. Ca. 1,5 til ca. 2,0 molare ekvimolare ekvivalenter av alkyleringsmiddel blir fortrinnsvis anvendt. Mengden av den ønskede forbindelsen 3 blir generelt øket relativt til forbindelse 2 når mengden av alkyleringsmiddel øker. Reaksjonsblandingen som er resultat av slik behandling inneholder generelt 4-alkoksyforbindelse 2 som hovedprodukt og ca. 10 til 20 vektprosent av 4,7-dialkoksyforbindelsen 3. Delvis separasjon av forbindelsene 2 og 3 kan bli oppnådd, f. eks. ved kolonnekromatografi og etterfølgende krystallisering fra en aceton-heksanblanding som fortrinnsvis fjerner 4-alkoksyforbindelse 2. Resulterende rest inneholder en blanding av de to forbindelsene anriket med 4,7-dialkoksymateriale; generelt blir det molare forhold av de to forbindelsene øket til minst ca. 1:1.
Fjerning av ketalgruppen fra forbindelse 3 ble oppnådd ved behandling med ca. 80% eddiksyre. Eddiksyrehydrolyse kan også resultere i delvis acetylering i C-9 hydroksylgruppen. Hydrolyseproduktet kan således bli behandlet med natriummetoksid for å fjerne eventuelle acetalgrupper på C-9. Endelig avbeskyttelse av 4 blir gjennomført ved alkalisk behandling og etterfølgende syrehydrolyse for å gi det endelige 4,7-dialkoksy-Neu5Ac produkt 5. 4-alkoksyforbindelse 2 som er tilstede i blandingen vil naturligvis også bli behandlet på en tilsvarende måte for å gi tilsvarende 4-alkoksy-Neu5Ac forbindelse.
Resulterende 4,7-dialkoksy-Neu5Ac kan bli videre utnyttet gjennom kopling til en hvilken som helst egnet markør eller reportergruppe, inkludert f.eks. en kromogen eller fluorogen markørgruppe. Foretrukket markør eller reportergruppe er en kromogen gruppe, inkludert f. eks. 4-klor-l-naftol, 6-brom-l-naftol og 5-brom-4-klor-indol. Kromogent modifisert 4,7-dialkoksy-Neu5 Ac kan bli inkorporert inn i en neuraminidaseanalyse som er nyttig for påvisning av viral neuraminidaseaktivitet fra influensatype A og B i kliniske prøver eller uttak. Metoder for å syntetisere og anvende slike 4,7-posisjonsmodifiserte kromogen N-acetylneuraminsyresubstrater i virale analyser er lik de som er beskrevet for beslektet 4-posisjon modifiserte substrater i PCT publikasjon nr. WO 91/09972; Yolken et al., J. Infectious Diseases, 142 (1980) 516-523; og Pachucki et al., J. Clinical Microbiology, 26 (1988) 2664-2666, hver av disse er innbefattet her med referanse. Foreliggende 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyrer kan naturligvis bli anvendt for å danne andre kromogen- og fluorogen-inneholdende derivater og kan bli anvendt i andre virale analyser.
Generelt kan den kromogene eller fluorogene markørgruppen bli inkorporert i 4,7-dialkoksy-Neu5Ac (5) ved å anvende følgende reaksjonsskjema (ved å anvende 5-brom-3-indolyl som en eksempelmarkørgruppe):
Forbindelse 5 blir først omdannet til tilsvarende metylesterderivat ved behandling med konsentrert trifluoreddiksyre og metanol, og esteren blir deretter reagert med overskudd av acetylklorid for å danne kloracetat-metylesterderivatet av 4,7-dialkoksy-Neu5Ac 6. Kopling av 6 med natriumsaltet av 5-brom-3-indolyl gir opphav til 5-brom-indol-3-ol-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-acetoksy-metylester 7. De-acetylering av 7 blir - gjennomført ved behandling med natriummetoksid i metanol for å gi forbindelse 8 og etterfølgende behandling med natriumhydroksid gir natriumsaltet av 5-brom-3-indolyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre (9). 4-alkoksy-Neu5Ac i blandingen gjennomgår tilsvarende koplingsreaksjoner for å danne 5-brom-3-indolyl-4-metoksy-N-acetylneuraminsyresalt.
Det koplete 4,7-dialkoksyderivatet 9 blir deretter separert fra blandingen av de to koplede forbindelsene (dvs. 4-alkoksy og 4,7-dialkoksyderivater) ved høyeffektsvæskekromatografi (HPLC) ved å anvende en Cl8 revers-plate silikakolonne. Blandingen av de koplede produktene kan bli oppløst i vann og anbrakt på kolonnen. Produktene blir separert ved hjelp av en økende gradient av metanol med passende fraksjoner oppsamlet og blandet. Resulterende rensede 5-brom-3-indolyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre 9 kan bli tørket og lagret inntil bruk. Resulterende produkt er generelt hovedsakelig fri for 4-metoksyderivat. Det er viktig at denne blandingen hovedsakelig er fri for 4-metoksyderivat siden den er meget reaktiv med kusmavirus og andre neuraminidaseinneholdende virus.
Som angitt over har de kromogene eller fluorgene 4,7-dialkoksyderivatene ifølge oppfinnelsen generell formel der Ri og R2 er alkylgrupper inneholdende 1 til 4 karbonatomer og R3 er en kromogen
eller fluorogen gruppe. Ri og R2 kan være like eller forskjellige alkylgrupper. Ri og R2 er fortrinnsvis begge metylgrupper og R3 er en kromogen gruppe. R3 er mer å foretrekke 4-metylumbelliferyl, 3-cyanoumbelliferyl, 2-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 3-resorufin, 5-brom-4-klor-3-indolyl, 5-brom-3-indolyl, 3-indolyl, nitrofenylazofenyl nitrofenylazoresorcinyl, 3-metoksyfenyl, 3-dimetylaminofenyl, 4-klor-l-naftyl, eller 6-brom-2-naftyl. Mer å foretrekke er at R3 er 4-metylumbelliferyl, 5-brom-4-klor-3-indolyl eller 5-brom-3-indolyl. Det er mest å foretrekke at R3 er 5-brom-3-indolyl. Enkle salter av disse substratene, slik som Na<+>, K<+> og NH/ salter kan også bli anvendt.
Eksempler på 4,7-dialkoksykromogene Neu5Ac derivater som faller innenfor ovenfornevnte formel innbefatter 4-metylumbelliferyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 2-nitrofenyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 4-nitrofenyl-4,7-metoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 3 - cyanoumbelliferyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 3 -resorufin-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 5-bromo-4-klor-3-indolyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 5-brom-3 -indolyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 3 -indolyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 2-[4-(4-nitrofenylazo)fenyl] -4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 2-[4-(4-nitrofenylazo)resorcinyl] -4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 3 - metoksyfenyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 3 -dimetylaminofenyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 6-brom-2-naftyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, 4-klor-1 -naftyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyre-alfa-ketosid, så vel som tilsvarende 4,7-dietoksy, 4,7-dipropyl og 4,7-dibutylderivater. 4,7-dimetoksyderivatene er generelt foretrukke. Om ønskelig kan "blandede" 4,7-dialkoksyderivater (feks. 4-metoksy-7-etoksy) bli anvendt.
Kromogene eller fluorogene 4,7-dialkoksyderivater kan bli anvendt i diagnostiske tester for influensa type A og B virus i kliniske prøver. De kliniske prøvene som blir testet i oppfinnelsen vil typisk være faryngeale, nasofaryngeale eller respiratoriske sekreter samlet fra pasienter som lider av, eller mistenkes å lide av, influensa, som vaske-, utstryknings- eller opphostingsprøver. Vaske-, oppspytt- eller utstrykningsprøvene vil fortrinnsvis bli kombinert med en vandig bufferoppløsning inneholdende stabilisator forut for blanding med substrater. Bufferoppløsningen inneholder generelt en buffer som opprettholder pH ved ca. 4,7, fortrinnsvis 5,5 til 6,5, eventuelt ca. 0,1% til 10 vekt-% ikke-ionisk detergent, en liten mengde (1-20 mM) jordalkalimetallkation (Ca, Mg, fortrinnsvis Ca), og en tilstrekkelig mengde stabilisator valgt fra gruppen som består av alditoler, monosakkarider og disakkarider for å forbedre den termiske stabiliteten i neuraminsyre i prøven.
Volum av bufferoppløsning kombinert med prøven vil normalt være 0,1 til 2 ml. Bufferen kan være organisk eller uorganisk. Egnede buffere innbefatter f.eks. konvensjonelle buffere av organiske syrer og salter derav slik som sitratbuffere (f. eks. mononatriumsitrat-dinatriumsitratblanding, sitronsyre-trinatirumsitratblanding, sitronsyre-mononatriumsitratblanding, etc), acetatbuffere (f.eks. acetatsyre-natriumacetatblanding), suksinatbuffere (f. eks. ravsyre-mononatriumsuksinatblanding, ravsyre-natriumhydroksidblanding, ravsyre-dinatriumsuksinatblanding, etc.), tartratbuffere f. eks. vinsyre-tartratblanding, vinsyre-kaliumtartratblanding, vinsyre-natriumhydroksidblanding etc), fumaratbuffere (feks. fumarsyre-mononatriumfumarat-blading, fumarsyre-dinatriurnfumeratblanding, mononatriumfumaratsyre-dinatriumfumaratblanding), glukonatbuffere (feks. glukonsyre-natriumglukonatblanding, glukonsyre-natriumhydroksidblanding, glukonsyre-kaliumglukonatblanding, etc.), oksalatbuffere (feks. oksalsyre-natriumoksalatblanding, oksalsyre-natriumhydroksidblanding, oksalsyre-kaliumoksalatblanding), laktatbuffere (feks. melkesyre-natriumlaktatblanding, melkesyre-natriumhydroksidblanding, melkesyre-kaliumlaktat-bladning, etc), acetatbuffere (feks. eddiksyre-natriumacetatblanding, eddiksyre-natriumhydroksidblanding, etc), malatbuffere (feks. D,L-malinsyre-dinatriummalatblanding), fosfatbuffere (feks. mononatriumfosfat-dinatriumfosfatblanding, mononatriumfosfat-natirumhydroksidblanding, trinatriumfosfat-saltsyreblanding, etc), 2-(N-morfolino)etansulfonsyre, [bis-(2-hydroksyetyl)imino]tris(hydroksymetyl)metan, N-2-acetamidoiminodieddiksyre, 1,3-bis[tris(hydroksymetyl)metylamino]propan, piperazin-N,N' -2-etansulfonsyre), N-2-acetarnido-2-aminoetansulfonsyre, 3 -(N-morfolin)-2-hydroksypropansulfonsyre, 3 -(N-morfolin)propansulfonsyre, 2-[tris(hydroksymetyl)metylamino]etansulfonsyre, N-2-hydroksyetylpiperazin-N,N'-2-etansulfonsyre, 3-[tris-(hydroksymetyl)metylamino]-2-hydroksypropansulfonsyre.
Ikke-ioniske detergenter som er nyttig i bufferoppløsning innbefatter feks. pluroniks, slik som polysorbat 20 eller polysorbat 80, triton X-100, NP-40 og alkylglukosider som Cg til C9 alkylglukosider. Detergenten er eventuelt en komponent og forenkler frigjøring av neuraminidase fra den virale mantelen. Stabilisatorer som ble anvendt i bufferoppløsning innbefatter feks. treverdige eller høyere alditoler, slik som glyserin, erytritol, arabitol, xylitol, sorbitol, mannitol, heksosen glukose og fruktose og disakkaridet sukrose. Disse stabilisatorene kan bli anvendt alene eller i kombinasjon. For å stabilisere aktiviteten av neuraminidase-inneholdende virus, blir stabilisatorene tilsatt væskeformulering/eksipientsystemet i en mengde fra 0,2 M til 2,1 M og fortrinnsvis 0,6 M til 2,0 M. Med en gang den er blandet med bufferoppløsning, kan prøven bli laget over lengre periode, fortrinnsvis ved 2°C til 8°C, uten betydelig tap av neuraminidaseaktivitet.
Substratet vil normalt bli tilsatt den buffrede stabiliserte prøven i mengder i området mellom 0,05 mM og 0,5 mM. Blandingen blir inkubert ved omgivelsestemperatur til fysiologisk temperatur (dvs. ca. 18°C til 40°C) i en tidsperiode som er tilstrekkelig til å tillate at enhver neuraminidase i prøven reagerer med substratet. Denne tiden vil normalt være i området fra 1 minutt til 4 timer, vanligvis fra 5 til 120 minutter, og ennå mer vanlig 30 til 60 minutter. Dersom det er neuraminidaseaktivitet i prøven, vil markør eller reportergruppe bli frigjort fra substrat og frigjort markør eller reporterutfelling vil gi en karakteristisk farge på blandingen. Særlig for kolorimetriske derivater blir resulterende reaksjonsblandingen overført til en oppsamlingsinnretning som inneholder et porøst membranfilter og en absorbentpute for å oppsamle oppløsningen. En slik oppsamlingsinnretning er vist i søknad serienummer 08/479.789 (inngitt 7. juni, 1995), som med dette er innbefattet med referanse. I nærvær av influensa type A og B neuraminidase, blir reportergruppen på 4,7-modifisert Neu5 Ac frigjort ved virkning av neuraminidase og resulterende reportermolekyl blir samlet som en farget utfelling på den porøse filtermembranen. Tilstedeværelse av et slikt farge produkt viser en positiv diagnose for influensatype A og B; fravær av et slikt farget produkt indikerer en negativ diagnose for influensatype A og B.
Konsentrasjon eller oppsammling av den fargede utfellingen øker sensitivitet i den diagnostiske testen. Slike oppsamlingsinnretninger er imidlertid ikke nødvendig for gjennomføring av opprinnelsen.
Følgende tabell viser den karakteristiske fargen generert når neuraminidase reagerer med forskjellige kromogene eller fluorogene 4,7-modifiserte Neu5Ac derivater og frigjør reportermolekylet. Foreliggende kromogene og fluorogene 4,7-dialkoksy-Neu5Ac-derivater utviser bare karakteristisk farge i nærvær av influensa type A og B virus. De viser ingen karakteristisk farge (dvs. ingen frigjøring av reportermolekyl forekommer) i nævær av parainfluensatyper 1, 2, 3 og 4, kusma, respiratorisk syncytialvirus og/eller adenovirus. De komogene og fluorogene 4,7-dialkoksy-Neu5Ac-derivatene utviser ingen bakteriell neuraminidaseaktivitet. For å opprettholde ønsket grad av selektivitet, bør 4,7-dialkoksy-Neu5Ac-derivatene hovedsakelig være fri for tilsvarende 4,7-dialkoksy-Neu5Ac-derivatene. Maksimumnivå av 4,7-dialkoksy-Neu5Ac-derivater som tillater akseptabel selektivitet kan bestemmes eksperimentelt ved å anvende kjente stammer av de forskjellige virustypene. Nivåer av 4,7-dialkoksy-Neu5 Ac-derivater bør generelt være mindre enn ca. 5 vekt-%, og fortrinnsvis mindre enn ca. 0,5 vekt-%.
En potensiell mer informativ diagnostisk test kan bli oppnådd ved å kombinere neuraminidasereaktivitet og selektivitet av foreliggende kromogene og fluorogene 4,7-dialkoksy-Neu5 Ac-derivater og kromogene og fluorogene 4,7-dialkoksy-Neu5Ac-derivater i en enkel test. I et slikt system blir den kliniske prøven delt i to deler som deretter blir inkorporert separat med hhv. 4,7-dialkoksy og 4-alkoksy-Neu5Ac-derivater. Tilstedeværelse og/eller fravær av karakteristisk farge i de to inkuberte prøvene kan bli anvendt for mer nøyaktig å bestemme virustype, om noen, er tilstede i den kliniske prøven. Dersom bare influensa type A eller B virus er tilstede i den kliniske prøven, da vil både 4,7-alkoksy og 4,7-dialkoksyderivatene utvise karakteristiske farger til deres reportermolekyl. Dersom både influensa type A og B virus og neuraminidasereaktivt virus forskjellig fra influensa type A og B virus er tilstede i den kliniske prøven, vil hver del utvise karakteristisk farge til sitt reportermolekyl. Hvis bare neuraminidase reaktive virus forskjellige fra influensa type A og B virus er tilstede i den kliniske prøven, vil bare 4-alkoksyderivat utvise den karakteristiske fargen til sitt reportermolekyl. Dersom ikke noe neuraminidasereaktivt virus er tilstede i den kliniske prøven, vil ingen del utvise karakteristisk farge av sitt reportermolekyl.
Således er det mulig å skaffe tilveie enkle og raske teknikker for selektiv diagnosering av influensa — særlig typer A og B — som kan bli gjennomført i sykehus eller på et legekontor og muliggjør at den behandlende medlem kan foreskrive passende terapi til å behandle infeksjon og/eller passende profylaktisk behandling til personer i nærkontakt med den infiserte pasienten.
Følgende eksempler har til hensikt å illustrere oppfinnelsen.
Eksempel 1:
Syntese av 4,7-dialkoksy-Neu5Ac ble gjennomført ved å anvende reaksjonene som er vist i skjema 1. En kald oppløsning (isbadtemperatur) av isopropylidenderivat 1 (1,2 g) i ca. 10 ml tørr acetonitril ble mettet med nitrogen. Natriumhydroksid (270 mg; 80% dispersjon i olje) ble tilsatt og blandingen omrørt i 20 minutter. Dimetylsulfat (1 ml) ble tilsatt og omrøringen foretatt i ytterligere 30 minutter ved å anvende et isbad for å avkjøle blandingen. Resulterende blanding ble filtrert gjennom celitt og utfellingen ble vasket med tørt acetonitril. Filtratet ble inndampet og resten ble tørket og ekstrahert med aceton. Etter filtrering ble filtratet igjen inndampet. Resulterende rest ble tørket og kromatografert på silikagel. Eluering med metylenkloird/metanol (25:1) fjernet flere biprodukter. Fortsatt eluering med samme oppløsningsmiddelsystem ga en sirup som inneholdt 2 og 3 som ble krystallisert fra aceton-heksan. Krystallinsk 2 (177 mg) ble samlet. Filtratet inneholdt en blanding av 2 og 3 (ca. 1:1) men med en høyere andel av 3 enn den opprinnelige blandingen.
Filtratet inneholdende 3 (1,22 g) ble behandlet med 80% vandig eddiksyre (15 ml) ved 85°C i en time. Blandingen ble inndampet og ko-inndampet med vann. Resten ble kromatografert. Eluering med metylenklorid/metanol (5:1) fjernet et mindre biprodukt. Fortsatt eluering med samme oppløsningsmiddelsystem ga delvis avbeskyttelsesprodukt 4 (0,87 g; 80% utbytte).
4,7-dimetoksy-metylestermetylketosid 4 (0,87 g) ble behandlet med 1 M natriumhydroksid (3 ml) i metanol (5 ml) og vann (5 ml) ved romtemperatur i 1 time. Blandingen ble nøytralisert med Dowex 50 (Ff) harpiks; harpiksen ble fjernet ved filtrering og vasket med metanol. Kombinert filtrat ble inndampet. Resten ble behandlet med Dowex 50 (Ff) harpiks (1,5 g) i 0,025 M saltsyre ved 100°C i 2 timer. Harpiks ble fjernet ved filtrering og filtratet samlet og inndampet. Resten ble tørket under vakuum for hovedsakelig å gi ren 4,7-dimetoksy-Neu5Ac 5 (0,71 g; 88% utbytte).
Eksempel 2
Syntese av 5-brom-3-indolyl-4,7-dimetoksy-Neu5Ac ble gjennomført ved å anvende reaksjonene som er vist i skjema 2. Forbindelse 5 (1,0 g) ble behandlet med trifluoreddiksyre (0,2 ml) i metanol (25 ml) over natten ved romtemperatur. Blandingen ble inndampet. Resten ble tørket og behandlet med acetylklorid (5 mj) i metylenklorid (5 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur og deretter inndampet. Resten ble tørket for å skaffe tilveie råkloridet 6 (1,36 g). Råprodukt 6 ble ikke ytterligere renset på grunn av ustabilitet.
En suspensjon av råprodukt 6 (0,7 g) og l-acetyl-5-brom-indol-3-ol (0,26 g) i aceton (5 ml) ble mettet med nitrogen. En 1 M natriumhydroksidoppløsning (1 ml) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt under nitrogen i 1 time. Etter inndamping ble resten tørket og kromatografert på silikagel. Eluering med metylenklorid/metanol (25:1) fjernet ureagert kromogen (0,128 g). Fortsatt eluering med samme oppløsningssystem ga fraksjoner inneholdende hovedsakelig koplet produkt 7 (0,114 g). Koplet produkt 7 (0,114 g) ble behandlet med 1 M natriummetoksid i metanol (0,1 ml) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter nøytralisering med Dowex 50 (FT) harpiks, ble harpiksen fjernet og vasket med metanol. Kombinert filtrat ble inndampet. Resten ble tørket og kromatografert på silikagel. Fraksjoner inneholdende hovedsakelig koplet produkt 8 ble oppsamlet og dampet inn for å gi ca. 60 mg av 8.
Koplet produkt 8 (60 mg) ble behandlet med 1 M natriumhydroksid (0,5 ml) i 50% vandig metanol (5 ml) i 30 minutter ved romtemperatur. Blandingen ble nøytralisert med Dowex 50 (FT) harpiks. Harpiksen ble fjernet ved filtrering og vasket med metanol. Kombinert filtrat ble inndampet og resten renset ved HPLC. De første fraksjonene inneholdt et ukoplet produkt. Det koplede materialet fremkom som en bred topp som besto av både koplet 4-metosky-Neu5Ac og koplet 4,7-dimetoksy-Neu5Ac produkt 9. Siden mindre mengder av koplet 4-metoksyderivat kunne kjøre den diagnostiske analysen uspesifikt, ble bare meget rene fraksjoner inneholdende 9 oppsamlet. Ved inndamping ble meget renset 9 (4 mg) oppsamlet; det oppsamlede materialet inneholdt mindre enn ca . 5 vekt-% av tilsvarende 4-alkoksyderivat.
Eksempel 3
Dette eksemplet viser spesifisiteten til 5-brom-3-indolyl-4,7-dimetoksy-Neu5Ac 9 fra eksempel 2 i diagnostiske tester for influensa A og B i dyrkede viruser. Virus ble dyrket fra ferske pasientisolater eller frosne forrådskulturer ved å anvende den passende cellelinje, medium og inkubasjonsbetingelser som er egnet for vekst og dyrking av det spesielle virus. Følgende celler ble anvendt: (1) RMK (Rhesus-apenyre) celler for influensa og parainfluensavirus; (2) HEp-2 (human strupehodekarsinom) celler for respiratorisk syncytialvirus og adenovirus; og (3) VERO (African Green apenyre) celler for kusma. Alle celler ble dyrket til nær-sammenflytende monolag i rør eller flasker med minium essensielt medium med 5-10 prosent serum ved 37°C. Virusinfeksjoner ble gjennomført i passende cellelinjer med minimum essensielt medium uten serum ved 37°C.
Virus-infiserte kulturer ble overvåket og bekreftet ved observering av tilsynekomst av karakteristiske cytopatiske effekter og ved testing med immunfluorescensanalyser ved å anvende virus-type spesifikk monoklonale antistoffer. Følgende karakteristiske cytopatiske effekter ble observert for hvert av virusene som ble anvendt som følger: (1) Influensa A og B: områder av store, uregelmessig formede, granulære eller vakulerte celler med gradvis degenerering av celleenkeltlaget; (2) Parainfluensa 1: små avrundede celler gjennom hele celleenkeltlaget; (3) Parainfluensa 2; mørke, granulære og uregelmessig syncytika som var tilbaketrukket fra celleenkeltlaget; (4) Parainfluensa 3: forlengede, fusiformceller som eventuelt var trukket tilbake eller vekk fra celleenkeltlaget; (5) Respiratorisk syncytial virus: store, uregelmessige formede syncytia som fremkom som store mangekjernede celler med ikke-distinkte grenser gjennom hele celleenkeltlaget; (6) Adenovirus: store, avrundede pycnotiske celler som eventuelt aggregerer til avrundet cellelag og løsnes fra dyrkningsbeholderen; og (7) Kusma: syncytia med vakuolering og celledegenerering gjennom hele celleenkeltlaget. Kommersielle virustype-spesifikke monoklonale antistoffer ble anvendt i fluorescensanalyser for å bekrefte vekst av hvert virus i inokulerte kulterer. Celler fra infiserte kulturer ble metanolfiksert på objektglass eller dekkglass og deretter inkubert ved 37°C med fluorescein-merkede monoklonale antistoffer. Både direkte og indirekte fluorescensanalyser ble anvendt. For direkte analyser ble fikserte virusinfiserte celler inkubert i 30 minutter med virus type-spesifikke, fluoresceinisotiocyanat (FITC) merkede monoklonale antistoffer. For indirekte analyser ble fikserte virusinfiserte celler inkubert i 30 minutter med virus type-spesifikke, umerkede monoklonale antistoffer, etterfulgt av inkubasjon i ytterligere 30 minutter med sekundære FITC-merkede monoklonale antistoffer. Objektglassene eller dekkglassene ble lagt over med et monteringsmedium og undersøkt ved å anvende et fluorescensmikroskop. Et positivt virusresultat ble verifisert ved tilstedeværelse av en karakteristisk, virusspesifikk, eple-grønn farging. Tilstedeværelse av progressive og karakteristiske cytopatiske effekter (sammen med ledsagende spesifikk virusbekreftelse med fluorescensanalyse) var en indikasjon at det spesielle inokulerte virus hadde proliferert maksimalt.
Etter å ha oppnådd maksimal virusvekst og bekreftelse av tilstedeværelse av passende virus, ble dyrkingsfluidene høstet og evaluert med 4-metoksy-N-acetylneuraminsyre og 4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyrekromogene substrater. Virus-inneholdende dyrkingsfluider (0,1 ml) ble blandet med kromogene substrater i en 1 eller 2 ml oppløsning inneholdende eksipienter og buffer utformet for å oppnå optimal pH og neuramindaseaktivitet. Buffer/eksipientoppløsning som inneholder 35 mm malin/malatbuffer med 10 mm kalsiumklorid, 0,85 prosent natriumklorid, 0,1 prosent mannitol, 0,5 prosent metanol og 0,1 prosent metylparaben. Substrat og buffer i kombinasjon ved en pH på ca. 5,4 ble bestemt for å skaffe tilveie spesifikk påvisning av neuraminidase-produserende virus med klart negative resultater for ikke-neuraminidase-produserende virus og virus-negative kulturer.
Testoppløsning ble inkubert ved 37°C i ca. 1 time og etter dette ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 0,2 ml av et bufferkonsentrat som endret pH til ca. 9 og hjalp de å øke utfelling av frigjort kromogen. Reaksjonsblandingen ble deretter overført til en oppsamlingsinnretning inneholdende et selektivt porøst membranfilter og en absorbentpute for å oppsamle oppløsningen hvorved utfellingen ble konsentrert. Oppsamlingsinnretningen er beskrevet i søknad serienr. 08/479.789. Tilsynekomst av en riktig farget utfelling viste en positiv reaksjon mens fråvær av en slik farget utfelling viste en negativ reaksjon. Ved å anvende 5-brom-3-indolylkromogen, var karakteristisk farge på utfellingen i en positiv test blå.
Følgende virus ble anvendt til å teste 5-brom-3-indolyl-4-metoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat (BI-4-MeONeu5Ac) og 5-brom-3 -indolyl-4,7-dimetoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat (BI-4,7-(MeO)2Neu5Ac). Følgende resultater ble oppnådd ved å anvende disse forskjellige viruskulturene. Viruskulturene ble dyrket til deres maksimale titere (slik det ble bestemt ved observering av omfattende - - ca. 90 til 100 prosent — viruskarakteristiske cytopatiske effekter i celleplaten og bekreftelse med fluorescensanalyser av klar eplegrønn, virusspesifikk farging i hoveddelen av cellene) for å sikre at eventuelle reaksjonsforskjeller ikke skyldes upåviselige virale konsentrasjoner.
En vurderingsskala fra 1+ til 3+ basert på intensiteten av reaksjonsfargen ble anvendt for å indikere relative nivåer av påviselig neuraminidaseaktivitet. Vurderingsfargene ble samholdt med fargeprøver fra en standard referansekilde (The Pantone Color Specific Book 747XR). En vurdering på 1+ (lys farge) indikerer en lav positiv, 2+ (moderat farge) viser en moderat positiv, og 3+ (dyp farge) indikerer en høy positiv. Et negativt resultat er indikert ved fravær av karakteristisk farge. Et ubestemmelig resultat er angitt dersom et meget svakt spor eller antydelse av den karakteristiske fargen kan være tilstede ved visuell observasjon.
Slik man kan se fra disse resultatene, ble virusinneholdende influensa type A og B neuraminidase bare testet av organismen som ga en positiv reaksjon med både 4-metoksy-Neu5 Ac og 4,7-dimetoksy-Neu5Ac substrater ufortynnet og alle fortynninger testet. For parainfluensa typer 1, 2 og 3 og kusmavirus, ga 4-metoksy-Neu5Ac substrat både negative og positive reaksjoner avhengig av fortynning. 4,7-dimetoksy-Neu5Ac substrat ga en negativ reaksjon med parainfluensa typer 1, 2 og 3 og kusmavirus ufortynnet og ved alle fortynninger. Ikke-neuraminidase inneholdende virus (feks. respiratorisk syncytial virus og adenovirus) produserte negative resultater med begge substrater. Virusnegative kontroller uten virus var på tilsvarende måte også negative. Disse resultatene viser klart spesifisiteten til 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyre kromogen substrat for influensa type A og B virus.
Eksempel 4
Tilsvarende resultater som er rapportert i eksempel 3 ble oppnådd ved å anvende 5-brom-4-klor-indol-3-ol og 4-metylumbelliferon som reportermolekyler på 4-metoksy-Neu5Ac og 4,7-dimetoksy-Neu5Ac.

Claims (18)

1. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyre, karakterisert v e d at den har generell formel der RiOg R2 er alkylgrupper som inneholder 1 til 4 karbonatomer.
2. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyre ifølge krav 1, karakterisert ved at både Ri og R2 er metylgrupper.
3. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyre ifølge krav 1, karakterisert ved at både Ri ogR2 er etylgrupper.
4. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat karakterisert v e d at den har generell formel der Ri og R2 er alkylgrupper som inneholder 1 til 4 karbonatomer og R3 er en kromogen eller fluorgen gruppe.
5. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 4, karakterisert ved at både Ri ogR2 er metylgrupper og R3 er en kromogen gruppe.
6. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 5, karakterisert ved at R3 blir valgt fra gruppen bestående av 4-metylumbelliferyl, 3-cyanoumbelliferyl, 2-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 3-resorufin, 5-brom-4-klor-3-indolyl, 5-brom-3-indolyl, 3-indolyl, nitrofenylazofenyl, nitrofenylazoresocinyl, 3-metoksyfenyl, 3-dimetylaminofenyl, 4-klor-l-naftyl, og 6-brom-2-naftyl.
7. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 6, karakterisert ved atR3er 5-brom-3-indolyl.
8. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 4, karakterisert ved at både Ri og R2 er etylgrupper og R3 er en kromogen gruppe.
9. 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 8, karakterisert ved at R3 blir valgt fra gruppen bestående av 4-metylumbelliferyl, 3-cyanoumbelliferyl, 2-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 3-resorufin, 5-brom-4-klor-3-indolyl, 5-brom-3-indolyl, 3-indolyl, nitrofenylazofenyl, nitrofenylazoresocinyl, 3-metoksyfenyl, 3-dimetylaminofenyl, 4-klor-l-naftyl, og 6-brom-2-naftyl.
10. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat med den generelle formel hvori Ri og R2 er alkylradikaler som inneholder 1 til 4 karbonatomer og R3 er en kromogen eller fluorogen gruppe som utviser en distinkt og karakteristisk farge når den spaltes fra substratet eller et salt av substratet; for å detektere viruser av influensa type A og B i en klinisk prøve fra et individ som er mistenkt for å ha en respiratorisk virusinfeksjon ved:
(1) å inkubere den kliniske prøven med det ovenfor nevnte substratet; og
(2) å observere den inkuberte kliniske prøven for å bestemme om den distinkte og karakteristiske fargen dannes, hvori dannelse av den distinkte og karakteristiske fargen indikerer nærværet av viruser av influensa type A eller B i den kliniske prøven.
11. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 10, hvori både Ri og R2 er metylgrupper og R3 er en kromogen gruppe.
12. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 11, hvori R3 er valgt fra gruppen som består av 4-metylumbelliferyl, 3-cyanoumbelliferyl, 2-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 3-resorufin, 5-brom-4-klor-3-indolyl, 5-brom-3-indolyl, 3-indolyl, nitrofenylazofenyl, nitrofenylazoresocinyl, 3-metoksyfenyl, 3-dimetylaminofenyl, 4-klor-l-naftyl og 6-brom-2-naftyl.
13. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 12, hvori R3 er 5-brom-3-indolyl.
14. Anvendelse av en kromogent eller fluorogent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 10, hvori både Ri og R2 er etylgrupper og R3 er en kromogen gruppe.
15. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4,7-dialkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 14, hvori R3 er valgt fra gruppen som består av 4-metylumbelliferyl, 3-cyanoumbelliferyl, 2-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 3-resorufin, 5-brom-4-klor-3-indolyl, 5-brom-3-indolyl, 3-indolyl, nitrofenylazofenyl, nitrofenylazoresocinyl, 3-metoksyfenyl, 3-dimetylaminofenyl, 4-klor-l-naftyl og 6-brom-2-naftyl.
16. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4-alkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat med den generelle formelen hvori R4 er et alkylradikal som inneholder 1 til 4 karbonatomer og R5 er en kromogen eller fluorogen gruppe som utviser en distinkt og karakteristisk farge når den spaltes fra substratet eller et salt av substratet;
(1) for å detektere viruser av influensatype A og B i en klinisk prøve fra et individ som er mistenkt for å ha en respiratorisk virusinfeksjon; og
(2) for å skille mellom viruser av influensa type A og B og neuraminidase-reaktive viruser som ikke er viruser av influensa type A og B i den kliniske prøven.
17. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4-alkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 16, hvori R4 er en metylgruppe og R5 er en kromogen gruppe.
18. Anvendelse av et kromogent eller fluorogent 4-alkoksy-N-acetylneuraminsyresubstrat ifølge krav 17, hvori R5 er uavhengig valgt fra gruppen som består av 4-metylumbelliferyl, 3-cyanoumbelliferyl, 2-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 3-resorufin, 5-brom-4-klor-3-indolyl, 5-brom-3-indolyl, 3-indolyl, nitrofenylazofenyl, nitrofenylazoresocinyl, 3-metoksyfenyl, 3-dimetylaminofenyl, 4-klor-l-naftyl og 6-brom-2-naftyl.
NO19982343A 1996-09-25 1998-05-22 4,7-Dialkoksy-N-acetylneuraminsyrederivater og anvendelse av de samme NO310822B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/718,666 US5719020A (en) 1996-09-25 1996-09-25 4,7-dialkoxy N-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type A and B viruses in clinical specimens
PCT/US1997/015602 WO1998013372A1 (en) 1996-09-25 1997-09-05 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type a and b viruses in clinical specimens

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO982343D0 NO982343D0 (no) 1998-05-22
NO982343L NO982343L (no) 1998-07-01
NO310822B1 true NO310822B1 (no) 2001-09-03

Family

ID=24886990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19982343A NO310822B1 (no) 1996-09-25 1998-05-22 4,7-Dialkoksy-N-acetylneuraminsyrederivater og anvendelse av de samme

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5719020A (no)
EP (1) EP0888371B1 (no)
JP (1) JP4070817B2 (no)
CN (2) CN1091447C (no)
AT (1) ATE217879T1 (no)
AU (1) AU716275B2 (no)
BR (1) BR9706776A (no)
CA (1) CA2237790A1 (no)
DE (1) DE69712747T2 (no)
ES (1) ES2173481T3 (no)
HK (1) HK1016988A1 (no)
IL (1) IL124511A (no)
NO (1) NO310822B1 (no)
NZ (1) NZ330443A (no)
PL (1) PL327109A1 (no)
WO (1) WO1998013372A1 (no)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6667161B1 (en) * 1997-10-27 2003-12-23 Ibbex, Inc. Chromogenic substrates of sialidase of bacterial, viral, protozoa, and vertebrate origin and methods of making and using the same
EP1038037A4 (en) * 1997-12-18 2003-02-12 Sepracor Inc DETERMINATION PROCEDURE FOR DETECTING AND DIAGNOSING THE INFLUENCE VIRUS
US6303764B1 (en) 1998-09-24 2001-10-16 Zymetx, Inc. Synthesis of 4,7-dialkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids
US6555698B1 (en) * 1998-11-17 2003-04-29 Tropix, Inc. Chemiluminescent substrates for neuraminidase, assays for detection of neuraminidase and kits therefor
WO2000063423A2 (en) * 1999-04-16 2000-10-26 Zymetx, Inc. Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates
US6420552B1 (en) 1999-09-10 2002-07-16 Zymetx, Inc. Syntheses of 4-alkyl chromogenic glycosides and 7-alkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids
US6627396B1 (en) * 1999-10-28 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Influenza sensor
SE9904289D0 (sv) * 1999-11-26 1999-11-26 Niklas Arnberg Method and camposition for the treatment of adenovairal ocular infections
AU2003267949A1 (en) * 2002-03-15 2003-12-31 U.S. Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Methods and compositions using cellular asialodeterminants and glycoconjugates for targeting cells to tissues and organs
EA200500625A1 (ru) * 2002-10-10 2006-06-30 Дипартмент Оф Ветеранс Афэрс Обнаружение, локализация и определение стадий опухолей с помощью меченых активированных лимфоцитов, направленных на специфический опухолевый эпитоп
EA014533B1 (ru) * 2006-05-18 2010-12-30 Ветеринермедицинише Универзитет Вин Способы обнаружения вирусов гриппа
US8652782B2 (en) 2006-09-12 2014-02-18 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids
US20090098527A1 (en) * 2006-09-12 2009-04-16 Fischer Gerald W Biological organism identification product and methods
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
US8080645B2 (en) 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
US9598462B2 (en) 2012-01-26 2017-03-21 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
CA2697373C (en) 2007-08-27 2019-05-21 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Immunogenic compositions and methods
US10004799B2 (en) 2007-08-27 2018-06-26 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
EP3020832A1 (en) 2007-10-01 2016-05-18 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Biological specimen collection and transport system and methods of use
US9119866B2 (en) * 2008-04-08 2015-09-01 Huiru Wang Glycan-based drugs, therapies and biomarkers
RU2713112C2 (ru) 2013-04-01 2020-02-03 Бектон, Дикинсон Энд Компани Способы и средства для диагностики гриппа
WO2016183292A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
PL3516067T3 (pl) * 2016-09-19 2022-08-08 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Związek i guma do żucia zawierająca ten związek do wykrywania wirusów za pomocą smaku
TWI631340B (zh) * 2017-06-16 2018-08-01 國立臺北科技大學 檢測神經胺酸酶活性的方法
CN107446004B (zh) * 2017-08-10 2020-05-01 济南山目生物医药科技有限公司 一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成方法
US20220145407A1 (en) * 2019-03-05 2022-05-12 Japan Science And Technology Agency Method and kit for detecting influenza virus, and method for diagnosing influenza virus infection

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3950322A (en) * 1973-08-27 1976-04-13 Research Corporation Fluorogenic substrate glycosides
JPS5925699A (ja) * 1982-08-03 1984-02-09 Torii Yakuhin Kk 酵素活性測定方法
JPS60164499A (ja) * 1984-02-07 1985-08-27 Kyowa Medetsukusu Kk 酵素活性測定法
US4632901A (en) * 1984-05-11 1986-12-30 Hybritech Incorporated Method and apparatus for immunoassays
US5081017A (en) * 1986-02-18 1992-01-14 Texas Bioresource Corporation Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria
US4810636A (en) * 1986-12-09 1989-03-07 Miles Inc. Chromogenic acridinone enzyme substrates
ES2097804T3 (es) * 1989-12-29 1997-04-16 Oklahoma Med Res Found Metodos para diagnosticar la gripe humana y sustratos cromogenos de acido n-acetilneuraminico para usar en estos metodos.
WO1991009971A1 (en) * 1990-01-05 1991-07-11 Symex Corp. Chromogenic 5-position modified neuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith
WO1991010744A1 (en) * 1990-01-10 1991-07-25 Symex Corp. Chromogenic 9-position modified n-acetylneuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith
AP249A (en) * 1990-04-24 1993-03-17 Biota Scient Management Pty Ltd Anti-viral compounds.
US5252485A (en) * 1990-08-10 1993-10-12 Savant Instruments, Inc. Unit for hydrolyzing amino-acid containing specimens
WO1992006691A1 (en) * 1990-10-19 1992-04-30 Biota Scientific Management Pty. Ltd. Anti-viral compounds that bind the active site of influenza neuramidase and display in vivo activity against orthomyxovirus and paramyxovirus
US5252458A (en) * 1990-12-31 1993-10-12 Symex Corp. Method for visually detecting the presence of a virus in a clinical specimen
US5489675A (en) * 1992-06-25 1996-02-06 E. I. Du Pont De Nemours And Company Disaccharide sialidase substrates and inhibitors
US5556963A (en) * 1994-08-05 1996-09-17 Oklahoma Medical Research Foundation Synthesis of 4-alkoxy-N-acetylneuraminic acid

Also Published As

Publication number Publication date
ES2173481T3 (es) 2002-10-16
CA2237790A1 (en) 1998-04-02
EP0888371B1 (en) 2002-05-22
NZ330443A (en) 1998-12-23
BR9706776A (pt) 1999-05-18
DE69712747D1 (de) 2002-06-27
NO982343D0 (no) 1998-05-22
NO982343L (no) 1998-07-01
IL124511A (en) 2002-08-14
IL124511A0 (en) 1998-12-06
EP0888371A1 (en) 1999-01-07
CN1147589C (zh) 2004-04-28
AU4251297A (en) 1998-04-17
WO1998013372A1 (en) 1998-04-02
CN1324954A (zh) 2001-12-05
JP4070817B2 (ja) 2008-04-02
ATE217879T1 (de) 2002-06-15
CN1205011A (zh) 1999-01-13
JP2000501748A (ja) 2000-02-15
PL327109A1 (en) 1998-11-23
CN1091447C (zh) 2002-09-25
HK1016988A1 (en) 1999-11-12
US5719020A (en) 1998-02-17
AU716275B2 (en) 2000-02-24
DE69712747T2 (de) 2002-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0888371B1 (en) 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type a and b viruses in clinical specimens
US5663055A (en) Methods for diagnosing human influenza and 4-position modified chromogenic N-acetylneuraminic acid substrated for use therein
US7081352B2 (en) Chemiluminescent influenza diagnostic kit
JP3947218B2 (ja) ４−アルコキシ−ｎ−アセチルノイラミン酸の合成
AU656721B2 (en) Methods for diagnosting human influenza and 4-position modified chromogenic N-acetylneuraminic acid substrates for use therein
AU781391B2 (en) Chromogenic substrates of sialidase of bacterial, viral, protozoa, and vertebrate origin and methods of making and using the same
Liav et al. Synthesis of bromoindolyl 4, 7-di-O-methyl-Neu5Ac: specificity toward influenza A and B viruses
WO1991009975A1 (en) Chromogenic 7- or 8-position modified n-acetylneuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith
JP2003522113A (ja) シアリダーゼの発色基質とその製造法および使用法
MXPA98004081A (en) 4,7-dialkoxy-n-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type a and b viruses in clinical specimens
US6420552B1 (en) Syntheses of 4-alkyl chromogenic glycosides and 7-alkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids
WO1991010744A1 (en) Chromogenic 9-position modified n-acetylneuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith
US6303764B1 (en) Synthesis of 4,7-dialkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids
JPH01131192A (ja) 色原体アクリジノン酵素基質及びその製造方法
WO1991009971A1 (en) Chromogenic 5-position modified neuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith