CN113518828A - 用于流感病毒检测的方法及试剂盒、以及流感病毒感染的诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明作为用于以经过改善的准确度检测流感病毒的技术，提供一种生物试样中的流感病毒检测方法，该方法使用了第一探针和第二探针，所述第一探针由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号，所述第二探针由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号，并且不由流感来源的神经氨酸酶分解。

Description

用于流感病毒检测的方法及试剂盒、以及流感病毒感染的诊 断方法
技术领域
本发明涉及用于流感病毒检测的方法及试剂盒、以及流感病毒感染的诊断方法。更具体而言，涉及使用了对流感来源的神经氨酸酶和细菌来源的神经氨酸酶显示出不同的反应性的底物的流感病毒的检测方法等。
背景技术
近年来，开发出使用了免疫层析法的简易的流感病毒检测试剂盒(专利文献1参照)。使用免疫层析法的方法能够在数分钟到数十分钟之间检测出流感病毒，因此在感染的诊断、治疗等中得到有效利用。
另外，以往已知有基于作为流感病毒所具有的酶的神经氨酸酶(sialidase)与显色底物的反应而以光学方式检测流感病毒的技术(参照专利文献2、3)。神经氨酸酶是从糖链的非还原末端游离出唾液酸的外切型糖分解酶。神经氨酸酶存在于流感病毒的表面，参与病毒的增殖。作为显色底物，例如使用4-甲基伞形基-α-D-神经氨酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid：4MU-NANA、参照专利文献2)、4-烷氧基-N-乙酰神经氨酸或4，7-二烷氧基-N-乙酰神经氨酸的化学发光衍生物(参照专利文献3)等。例如，在使用4MU-NANA作为显色底物的方法中，通过由神经氨酸酶所致的4MU-NANA的分解而生成作为荧光物质的4-甲基伞形酮。基于所生成的4-甲基伞形酮的荧光强度可以算出神经氨酸酶的酶活性值，进而基于酶活性值可以对流感病毒的粒子数进行定量。
专利文献4中，公开过用于检测人的流感为人流感还是人病原性禽流感的试剂盒(参照实施例7)。该试剂盒含有包含与半乳糖键合的N-羟乙酰神经氨酸(NeuGcα2-3Gal)的底物、和包含与半乳糖键合的N-乙酰神经氨酸(NeuAcα2-3Gal)的底物而成。使这2种底物与临床样品接触，若仅基于NeuAc α 2-3Gal的底物被切断，则判定为人流感病毒阳性。若基于NeuAcα2-3Gal的底物及基于NeuGcα2-3Gal的底物双方被切断，则判断为人病原性禽流感病毒阳性。
专利文献5中，记载有基于数字法(日文：デジタル法)的流感病毒的检测方法。数字法中，向许多的极小空间(例如微小液滴)中最多各存在1个分子地导入检测对象物。此后，检测各极小空间内的检测对象物，将其存在情况用0或1进行数值化。由此，利用数字法，能够高灵敏度并且定量地对检测对象物进行检测。专利文献6、7中，记载有作为用于将物质封入(Enclose)极小空间中的方法的、能够应用于数字法的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-275511号
专利文献2：日本特开2011-139656号
专利文献3：日本特表2002-541858号
专利文献4：日本特表2009-516502号
专利文献5：日本特开2018-038384号
专利文献6：日本再表2012-121310号
专利文献7：日本再表2016-006208号
发明内容
发明所要解决的问题
在常居于上呼吸道粘膜中的细菌中，有具有神经氨酸酶的细菌。因此，在使用鼻腔擦拭液等作为试样的、基于神经酰胺酶(日文：イラミニダーゼ)与底物的反应的流感病毒的检测方法中，有可能将起因于细菌来源的神经氨酸酶的信号作为假阳性检测出。
因而，本发明的主要目的在于，提供一种技术，其用于使用对于流感来源的神经氨酸酶和细菌来源的神经氨酸酶显示出不同的反应性的底物，以经过改善的准确度来检测流感病毒。
用于解决问题的手段
为了解决上述的问题，本发明提供以下的[1]～[18]。
[1]一种检测方法，是检测生物试样中的流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶的方法，该方法包括：
(1)将所述生物试样与第一探针和第二探针混合的步骤1；
此处，所述第一探针是由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号的探针，
所述第二探针是由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号并且不由流感来源的神经氨酸酶分解的探针，
由所述第一探针生成的信号和由所述第二探针生成的信号能够以光学方式进行区别地检测；和
(2)检测由所述第一探针及所述第二探针生成的信号的步骤2，
(A)在由所述第一探针生成的信号的强度相对于由所述第二探针生成的信号的强度的比为规定值以上的情况下，检测出所述生物试样中存在流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶，
在所述比小于所述规定值的情况下，检测出所述生物试样中不存在流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶；或者
(B)在检测出由所述第一探针生成的信号、未检测出由所述第二探针生成的信号的情况下，检测出所述生物试样中存在流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶，
在检测出由所述第一探针生成的信号及由所述第二探针生成的信号的情况下，检测出所述生物试样中不存在流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶。
[2]根据[1]中记载的检测方法，其中，所述第二探针为以下的式(1)所示的化合物或其盐。
[化1]
Figure BDA0003245842640000041
(式中，
R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基；
R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，
此处，在X为氧原子的情况下，R7及R8不存在；
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基(日文：オキソ基)中；
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；X表示氧原子、硅原子或碳原子；
m为0～4的整数；
n为1～3的整数；
s为1的整数；
t为0～4的整数。)
[3]根据[2]中记载的检测方法，其中，式(1)中，R6为-CH2-CF3。
[4]根据[1]-[3]中任一项记载的检测方法，其中，所述第一探针为2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(日文：2′－(4－メチルウンベリフェリル)－α－D－N－アセチルノイラミン酸)(4MU-NANA)。
[5]根据[1]-[4]中任一项记载的检测方法，其中，在检测出由所述第一探针生成的信号、未检测出由所述第二探针生成的信号的情况下，检测出所述生物试样中存在流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶，
在检测出由所述第一探针生成的信号及由所述第二探针生成的信号的情况下，检测出所述生物试样中不存在流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶。
[6]根据[1]-[5]中任一项记载的检测方法，其基于数字法。
[7]一种试剂盒，是用于检测从感染了流感病毒的对象或有感染的嫌疑的对象中分离出的生物试样中的流感病毒或流感病毒来源神经氨酸酶的试剂盒，
所述试剂盒包含：
第一探针，其由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号；和
第二探针，其由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号并且不由流感来源的神经氨酸酶分解，
所述第二探针为以下的式(1)所示的化合物或其盐。
[化2]
Figure BDA0003245842640000051
(式中，
R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基；
R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，
此处，在X为氧原子的情况下，R7及R8不存在；
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基中；
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；X表示氧原子、硅原子或碳原子；
m为0～4的整数；
n为1～3的整数；
s为1的整数；
t为0～4的整数。)
[8]根据[7]中记载的试剂盒，其中，式(1)中，R6为-CH2-CF3。
[9]根据[7]或[8]中记载的试剂盒，其中，所述第一探针为2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(4MU-NANA)。
[10]一种以下的式(1)所示的化合物或其盐的用于将流感病毒或流感来源神经氨酸酶与细菌或细菌来源神经氨酸酶识别检测的应用。
[化3]
Figure BDA0003245842640000071
(式中，
R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基；
R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，
此处，在X为氧原子的情况下，R7及R8不存在；
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基中；
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；X表示氧原子、硅原子或碳原子；
m为0～4的整数；
n为1～3的整数；
s为1的整数；
t为0～4的整数。)
[11]根据[10]中记载的应用，其中，式(1)中，R6为-CH2-CF3。
[12]一种试剂，是用于将流感病毒或流感来源神经氨酸酶与细菌或细菌来源神经氨酸酶识别检测的试剂，其包含以下的式(1)所示的化合物或其盐。
[化4]
Figure BDA0003245842640000081
(式中，
R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基；
R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，
此处，在X为氧原子的情况下，R7及R8不存在；
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基中；
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；X表示氧原子、硅原子或碳原子；
m为0～4的整数；
n为1～3的整数；
s为1的整数；
t为0～4的整数。)
[13]根据[12]中记载的试剂，其中，式(1)中，R6为-CH2-CF3。
[14]一种诊断方法，是诊断对象有无感染流感病毒的方法，
所述方法包括：
(1)步骤1，将从感染了流感病毒的对象或有感染的嫌疑的对象中分离出的生物试样与第一探针和第二探针混合，
此处，所述第一探针是由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号的探针，
所述第二探针是由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号并且不由流感来源的神经氨酸酶分解的探针，
由所述第一探针生成的信号和由所述第二探针生成的信号能够以光学方式进行区别地检测；和
(2)步骤2，检测由所述第一探针及所述第二探针生成的信号，
(A)在由所述第一探针生成的信号的强度相对于由所述第二探针生成的信号的强度的比为规定值以上的情况下，确定所述对象感染流感病毒，
在所述比小于所述规定值的情况下，确定所述对象未感染流感病毒，或者
(B)在检测出由所述第一探针生成的信号、未检测出由所述第二探针生成的信号的情况下，确定所述对象感染流感病毒，
在检测出由所述第一探针生成的信号及由所述第二探针生成的信号的情况下，确定所述对象未感染流感病毒。
[15]根据[14]中记载的诊断方法，其中，式(1)中，R6为-CH2-CF3。
[16]根据[14]或[15]的诊断方法，其中，所述第一探针为2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(4MU-NANA)。
[17]根据[14]-[16]中任一项记载的诊断方法，其中，在检测出由所述第一探针生成的信号、未检测出由所述第二探针生成的信号的情况下，确定所述对象感染流感病毒，在检测出由所述第一探针生成的信号及由所述第二探针生成的信号的情况下，确定所述对象未感染流感病毒。
[18]根据[14]-[17]中任一项记载的诊断方法，其基于数字法。
本说明书中，“烷基”或包含烷基部分的取代基(例如烷氧基等)的烷基部分在没有特别提及的情况下，例如是指由碳原子数1～6个、优选为碳原子数1～4个、更优选为碳原子数1～3个左右的直链、支链、环状、或它们的组合形成的烷基。更具体而言，作为烷基，例如可以举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丙基甲基、正戊基、正己基等。
本说明书中在提到“卤素原子”的情况下，可以是氟原子、氯原子、溴原子、或碘原子的任意者，优选为氟原子、氯原子、或溴原子。
发明效果
根据本发明，可以提供用于以经过改善的准确度检测流感病毒的技术。
附图说明
图1表示作为式(1)所示的化合物的一例的“HMRef-S-Neu5Ac”、和4MU-NANA的由流感病毒或细菌的神经氨酸酶所致的酶水解的路线图。
图2是用于说明本发明的流感病毒检测方法的步骤2的一个实施方式的图。
图3-1是用于说明本发明的流感病毒检测方法的步骤2的另一实施方式的图。
图3-2是用于说明本发明的流感病毒检测方法的步骤2的另一实施方式的图。
图3-3是用于说明本发明的流感病毒检测方法的步骤2的另一实施方式的图。
图4是表示伴随着与产脲节杆菌(日文：アルスロバクター·ウレアファシエンス)来源的神经氨酸酶的酶反应的HMRef-S-Neu5Ac的荧光强度的经时变化的曲线图(试验例1)。
图5是表示伴随着与流感病毒来源的神经氨酸酶的酶反应的HMRef-S-Neu5Ac及4MU-NANA的荧光强度的经时变化的曲线图(试验例2)。
具体实施方式
以下，在参照附图的同时，对用于实施本发明的合适的方式进行说明。需要说明的是，以下说明的实施方式表示本发明的代表性的实施方式的一例，并非由此来狭义地解释本发明的范围。
1.流感病毒的检测方法及流感感染的诊断方法
本发明的流感病毒检测方法基于有无由流感病毒来源的神经氨酸酶所致的探针的水解来检测流感病毒。因而，本发明中，“检测出流感病毒”与“检测出流感病毒来源神经氨酸酶”以相同含义使用。
本发明的流感病毒检测方法包括以下的步骤(step)1、2。
步骤1：将生物试样与第一探针和第二探针混合的步骤。
步骤2：检测由第一探针及第二探针生成的信号的步骤。
1-1.步骤1(生物试样与探针的混合步骤)
[生物试样]
本发明中，生物试样只要是能够包含流感病毒的、来源于生物体的材料，就没有特别限定。
作为生物试样，例如可以举出鼻腔吸引液、鼻腔擦拭液、咽擦拭液、气管擦拭液、唾液、痰、血液(包括全血、血清及血浆)、尿、细胞、组织、身体器官的提取液等。
在本发明的流感感染的诊断方法中，生物试样从感染了流感病毒的对象或有感染的嫌疑的对象中分离。
对象并不限定为人，可以是包括猴及猪在内的哺乳类、包括鸭及鸡在内的鸟类。
[探针1]
第一探针(以下称作“探针1”)由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方水解而生成能够以光学方式检测的信号。
本发明中，“细菌”(bacteria)这样的术语以指包括古细菌在内的全部原核生物的最广义的含义使用，特别指可能常居于生物试样中的真细菌。
在鼻腔、咽喉、口腔及泌尿器官等中，常居有属于放线菌属(Actinomyces)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacteriaceae)、真杆菌属(Eubacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propinibacterium)、沙门菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、Spirohaetaceae及韦荣球菌属(Veillonella)等各属的多种细菌，这些细菌有时具有神经氨酸酶。
探针1只要是包含唾液酸的化合物、并且是由流感病毒来源神经氨酸酶及细菌来源神经氨酸酶双方将唾液酸的糖苷键水解而生成显示出与分解前的化合物不同的光学特性的反应生成物的化合物即可。可以将从水解前的探针1的光学特性到水解后生成的反应生成物的光学特性的变化作为“能够以光学方式检测的信号”检测出。
此处，所谓光学特性的变化，是指吸光度、旋光度及折射率的变化、荧光的有无或强度的变化等。
作为探针1，可以合适地使用在神经氨酸或其衍生物键合有显色团的化合物。
显色团可以是荧光物质或化学发光物质，然而优选被制成荧光物质。荧光物质例如可以使用4-甲基伞形酮(4-Methylumbelliferone)、荧光素(Fluorescein)、试卤灵(Resorufin)及罗丹明(Rhodamine)等公知的物质。
作为此种探针1，例如广泛使用2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(4MU-NANA)。4MU-NANA若与来自于流感病毒及细菌的神经氨酸酶接触并反应，则使作为荧光物质的4-甲基伞形酮游离。
[探针2]
第二探针(以下称作“探针2”)不由流感来源的神经氨酸酶分解、而是仅由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号。
探针2只要是包含唾液酸的化合物、并且是不由流感来源神经氨酸酶分解、而是由细菌来源神经氨酸酶将唾液酸的糖苷键水解而生成显示出与分解前的化合物不同的光学特性的反应生成物的化合物即可。从水解前的探针2的光学特性到水解后生成的反应生成物的光学特性的变化被作为“能够以光学方式检测的信号”检测出。
探针2所生成的“能够以光学方式检测的信号”被设为与探针1所生成的“能够以光学方式检测的信号”不同。即，探针2所生成的信号与探针1所生成的信号被设为能够以光学方式进行区别地检测。
具体而言，例如在探针1所生成的信号为吸光度、旋光度及折射率的变化的情况下，探针2所生成的信号可以是荧光的有无或强度的变化。或者，该情况下，探针2所生成的信号可以是在与探针1所生成的信号不同的波长区域中的吸光度、旋光度及折射率的变化。
另外，例如在探针1所生成的信号为荧光的有无或强度的变化的情况下，探针2所生成的信号可以是吸光度、旋光度及折射率的变化。或者，该情况下，探针2所生成的信号可以是在与探针1所生成的信号不同的波长区域中的荧光的有无或强度的变化。
作为探针2，合适地使用以下的式(1)所示的化合物或其盐(以下有时也简称为“化合物(1)”)。
[化5]
Figure BDA0003245842640000131
式(1)中，R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基。作为一价的取代基，可以举出卤素、任选被取代的烷基等。
m为0～4的整数。
在本发明的1个优选的方面中，是m为0、R1不存在而无取代的苯环。
式(1)中，R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子。
在R2及R3表示烷基的情况下，该烷基中可以存在1个或2个以上的卤素原子、羧基、磺酰基、羟基、氨基、烷氧基等，例如R2或R3所表示的烷基可以是卤代烷基、羟基烷基、羧基烷基等。优选R2及R3各自独立地为氢原子或卤素原子，更优选R2及R3均为氟原子、或氯原子的情况。
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基、或卤素原子，与针对R2及R3说明的内容相同。优选R4及R5均为氢原子。
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基。作为R6的烷基，优选甲基、乙基。作为R6的氟代烷基，优选-CH2-CF3、-CH2-CH2-CF3。
在本发明的1个优选的方面中，R6为-CH2-CF3。
式(1)中，R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，优选R7及R8各自独立地为碳原子数1～3个的烷基，更优选R7及R8均为甲基。R7及R8所示的烷基中可以存在1个或2个以上的卤素原子、羧基、磺酰基、羟基、氨基、烷氧基等，例如R7或R8所示的烷基可以是卤代烷基、羟基烷基、羧基烷基等。
在R7或R8表示芳基的情况下，芳基可以是单环的芳香族基团或稠合芳香族基团的任意者，芳基环也可以包含1个或2个以上的成环杂原子(例如氮原子、氧原子、或硫原子等)。作为芳基优选苯基。可以在芳基环上存在1个或2个以上的取代基。作为取代基，例如可以存在1个或2个以上的卤素原子、羧基、磺酰基、羟基、氨基、烷氧基等。
另外，在后述的X为氧原子的情况下，R7及R8不存在。
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基中，优选为氢原子。
s为1的整数。
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基。
作为一价的取代基，可以举出卤素、任选被取代的烷基等。
t为0～4的整数。
在本发明的1个优选的方面中，是t为0、R10不存在而无取代的苯环。
X表示氧原子、硅原子或碳原子。
在本发明的1个优选的方面中，X为氧原子。
n为1～3的整数，优选n为1。
式(1)所示的化合物可以作为酸加成盐或碱加成盐存在。
作为酸加成盐，例如可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等无机酸盐、或甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐等有机酸盐等。
作为碱加成盐，可以举出钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐、铵盐、或三乙基胺盐等有机胺盐等。
式(1)所示的化合物有时也形成与甘氨酸等氨基酸的盐。
化合物(1)有时也以水合物或溶剂合物的形式存在。
化合物(1)根据取代基的种类有时具有1个或2个以上的手性碳原子，本发明的范围中不仅包含基于1个或2个以上的手性碳原子的光学活性体、基于2个以上的手性碳原子的非对映异构体等立体异构体，还包含立体异构体的任意的混合物、外消旋体等。
在本说明书的实施例中具体地给出化合物(1)的代表性化合物的制造方法。因而，本领域技术人员可以基于这些说明，适当地选择反应原料、反应条件、以及反应试剂等，并根据需要对这些方法加以修饰、改变，由此制造化合物(1)。
已经弄清，化合物(1)不由流感来源神经氨酸酶分解，而是仅由细菌来源神经氨酸酶分解而显示出荧光增强(参照试验例1、试验例2)。将作为化合物(1)的一例的“HMRef-S-Neu5Ac”(参照合成例1)的由神经氨酸酶所致的酶水解的路线图表示于图1中。
因而，化合物(1)可以作为用于将流感病毒或流感来源神经氨酸酶与细菌或细菌来源神经氨酸酶识别检测的荧光探针来利用。
本发明还提供包含化合物(1)的、用于将流感病毒或流感来源神经氨酸酶与细菌或细菌来源神经氨酸酶识别检测的试剂。该试剂可以是经过干燥的化合物(1)或溶解于适当的缓冲液中的化合物(1)。需要说明的是，缓冲液可以适当地使用后述的缓冲液。
生物试样、探针1及探针2的混合可以通过溶解于相同或不同的水溶性溶剂中并将生物试样、探针1及探针2的各自的溶液混合来进行。或者，也可以通过将生物试样、探针1及探针2溶解于相同的水溶性溶剂中来混合。
[亲水性溶剂]
亲水性溶剂只要是以往作为酶的反应溶液使用的亲水性溶剂，就没有特别限定，例如可以使用水、或在水中为了酶反应的最佳化而以必需的浓度添加有缓冲物质的缓冲溶液。
作为缓冲物质，没有特别限定，然而可以使用MES(2-吗啉乙磺酸)、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)、PIPES(哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)等的所谓的Good′s缓冲液(Good′sBuffer)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、DEA(二乙醇胺)等。
为了酶反应，根据需要对生物试样、探针1及探针2的混合液进行温育。温育例如在室温-37℃条件下进行数分钟-数十分钟左右。
1-2.步骤2(信号的检测步骤)
由探针1及探针2生成的信号可以使用图像传感器、分光光度计、旋光计、分光荧光光度计及荧光显微镜等以往公知的设备进行检测，并进行数值化。将生物试样、探针1及探针2的混合液(以下也称作“样品液”)装载于设备中、并依照设备的操作步骤书进行测定即可。
探针1由流感病毒来源神经氨酸酶及细菌来源神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号。将来自于探针1的信号强度设为S1。
另一方面，探针2仅由细菌来源神经氨酸酶水解而生成能够以光学方式检测的信号。将来自于探针2的信号强度设为S2。
在存在于样品液中的神经氨酸酶为细菌来源的情况下(对象未感染的情况下)，由探针1及探针2双方生成信号。
另一方面，在存在于样品液中的神经氨酸酶为流感病毒来源的情况下(对象感染的情况下)，由探针1生成信号，而由探针2生成的信号在理论上为0，即使考虑到探针2的因自然分解(不依赖于神经氨酸酶的酶活性的分解)而生成的信号也足够小。
因而，对于S1相对于S2的比(S1/S2)而言，与在样品液中存在细菌来源神经氨酸酶的情况(对象未感染的情况)相比，在样品液中存在流感病毒来源神经氨酸酶的情况(对象感染的情况)更大。
即，若由探针2生成的信号的强度S2与由探针1生成的信号的强度S1的比(S1/S2)为规定值(阈值)以上，则可以检测为在样品液中存在流感病毒(对象感染了流感病毒)。
另一方面，若比(S1/S2)小于阈值，则可以检测为在样品液中不存在流感病毒(对象没有感染流感病毒)。
由此，可以明确地区别存在于生物试样中的神经氨酸酶是流感病毒来源的神经氨酸酶还是细菌来源的神经氨酸酶，不将起因于细菌来源神经氨酸酶的信号作为假阳性检测出地、高准确度地检测流感病毒。
阈值可以根据作为探针1及探针2使用的化合物、它们的光学特性、以及可能存在于生物试样中的细菌的种类等适当地设定。例如，阈值可以设定为在样品液中存在细菌来源神经氨酸酶时的比(S1/S2)的1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍以上。
在探针2的自然分解(不依赖于神经氨酸酶的酶活性的分解)不发生或者是可以忽视的程度时，在存在于样品液中的神经氨酸酶为流感病毒来源的情况下(对象感染的情况下)，由探针2生成的信号为0。该情况下，无论由探针2生成的信号的强度S2相对于由探针1生成的信号的强度S1的比(S1/S2)如何，都可以进行流感病毒的检测。
即，在检测出由探针1生成的信号、未检测出由探针2生成的信号的情况下，检测出样品液中存在流感病毒(对象感染流感)，在检测出由探针1生成的信号及由探针2生成的信号的情况下，可以检测出样品液中不存在流感病毒(对象未感染流感病毒)。
1-2-1.基于数字法的检测1
对在步骤2中应用了数字法的实施方式进行说明。
数字法中，向许多的极小空间(例如微小液滴)中最多各存在1个分子地导入检测对象物。此后，检测各极小空间内的检测对象物，将其存在情况用0或1进行数值化。由此，数字法中，能够高灵敏度并且定量地检测检测对象物。
本实施方式的步骤2包括以下的步骤2A1～2A3。
步骤2A1：向下层部与上层部之间的空间导入样品液的步骤，所述下层部由具有疏水性的上表面的隔壁彼此隔开而形成有能够收容流感病毒及细菌的多个收容部，所述上层部与该下层部的形成有该收容部的面相面对；
步骤2A2：向所述空间导入疏水性溶剂、在所述收容部内形成由疏水性溶剂包覆并且包含流感病毒和/或细菌的样品液的液滴的步骤；
步骤2A3：在所述液滴中检测由探针1及探针2生成的信号的步骤。
1-2-1-1.导入步骤2A1
参照图2A对导入步骤2A1进行说明。
阵列101具有隔着空间131相面对地配置下层部111和上层部121、并以空间131作为流体流路的流动室结构。
在下层部111，形成有多个能够收容流感病毒和/或细菌的收容部114。收容部114由具有疏水性的上表面的隔壁113彼此隔开。
另外，上层部121隔着空间131与下层部111的形成有收容部114的面相面对。
本步骤中，向空间131导入样品液4。在样品液4中，包含探针1和探针2。另外，在样品液4中，可能包含流感病毒或细菌3。样品液4例如可以从形成于上层部121及下层部111的至少一方的贯穿孔(未图示)导入空间131内。导入空间131内的样品液4遵循毛细管现象流过空间131，填充于空间131内。
[表面活性剂]
在样品液4中，可以添加表面活性剂。通过添加表面活性剂，有易于将样品液4向空间131内及收容部114内导入的趋势。
作为表面活性剂，没有特别限定，例如可以举出TWEEN20(CAS号：9005-64-5、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)及Triton X-100(CAS号：9002-93-1、通用名聚乙二醇单-4-辛基苯基醚(n≈10))等。表面活性剂向样品液4中的添加浓度没有特别限定，优选为0.01～1％。
此外，作为表面活性剂，可以广泛地使用阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、两性离子表面活性剂、天然来源的表面活性剂等。
作为阴离子性表面活性剂，例如分类为羧酸型、硫酸酯型、磺酸型、磷酸酯型。其中，具体而言，例如可以举出十二烷基硫酸钠、月桂酸钠、α-磺基脂肪酸甲酯钠、十二烷基苯磺酸钠、乙氧基化十二烷基硫酸钠等，其中，优选使用十二烷基苯磺酸钠。
作为阳离子性表面活性剂，例如分类为季铵盐型、烷基胺型、杂环胺型。具体而言，例如可以举出硬脂基三甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基三氯化吡啶(日文：セチルトリピリジニウムクロライド)、十二烷基二甲基苄基氯化铵等。
作为非离子表面活性剂，例如可以举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯单脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脂肪酸聚甘油酯、烷基聚葡糖苷、N-甲基烷基葡糖酰胺等。其中，除了优选十二烷基醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、月桂酸二乙醇酰胺(日文：ラウロイルジエタノールアマイド)以外，还优选以Triton X(Triton X-100等)、Pluronic(注册商标)(Pluronic F-123、F-68等)、Tween(Tween 20、40、60、65、80、85等)、Brij(注册商标)(Brij 35、58、98等)、Span(Span 20、40、60、80、83、85)的名称在市场上销售的产品。
作为两性表面活性剂，例如有月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱、十二烷基氨基甲基二甲基磺丙基甜菜碱、3-(十四烷基二甲铵)-1-丙磺酸内盐等，优选使用3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐(CHAPSO)等。
作为天然来源的表面活性剂，例如优选卵磷脂、皂甙，在被称作卵磷脂的化合物当中，具体而言，优选磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰丙三醇等。另外，作为皂甙优选皂树皂甙。
利用本步骤，将探针1、探针2、以及流感病毒或细菌3导入收容部114。在样品液4中流感病毒或细菌被稀释为足够低的浓度的情况下，进入1个收容部114的流感病毒或细菌3的数目能够为0或最多为1。在样品液4中流感病毒或细菌的浓度更高的情况下，可能向1个收容部114导入2个以上的病毒2。
1-2-1-2.封入步骤2A2
参照图2B对封入步骤2A2进行说明。本步骤中，向下层部111与上层部121之间的空间131导入疏水性溶剂5。
疏水性溶剂5只要是难以与样品液4混杂在一起的溶剂(非混溶性的溶剂)即可，相对于作为亲水性溶剂的样品液4可以合适地使用疏水性溶剂。
作为疏水性溶剂5，例如可以合适地使用选自饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅油、全氟碳、卤素系溶剂、以及疏水性离子液体中的至少一种或包含它的混合物等。作为饱和烃，例如可以举出烷烃、环烷烃等。作为烷烃，例如可以举出癸烷、十六烷等。作为不饱和烃，例如可以举出角鲨烯等。作为芳香族烃，例如可以举出苯、甲苯等。作为全氟碳，例如可以举出FLUORINERT(注册商标)FC40(SIGMA公司制)等。作为卤素系溶剂，例如可以举出氯仿、二氯甲烷、氯苯等。所谓疏水性离子液体，是指至少在水中不解离的离子液体，例如可以举出1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐等。所谓离子液体，是指在室温下以液体存在的盐。
疏水性溶剂5也与样品液4同样地从形成于上层部121及下层部111的至少一方的贯穿孔(未图示)导入空间131内即可。导入空间131内的疏水性溶剂5遵循毛细管现象流过空间131，置换空间131内的样品液4。受到置换的样品液4被排出到空间131外。由此，在收容部114内，形成由疏水性溶剂5包覆并且包含探针1、探针2、以及流感病毒或细菌3的样品液4的液滴。
该液滴的容积(与收容部114的容积大致相等)可以极小，例如设为10aL～100nL、优选设为1fL～1pL。
在样品液4的液滴的极小容积中，进行流感病毒或细菌的神经氨酸酶与探针1及探针2的反应。
[脱气]
在导入步骤2A1与封入步骤2A2之间，可以进行空间131内的脱气。作为脱气方法，例如可以合适地使用将阵列101放置在减压环境下的方法、或将阵列101冷却的方法等。具体而言，是将阵列101在约0.1个大气压的减压干燥器内放置约30秒的方法等。
本发明中，脱气步骤并非必需，然而通过进行脱气，可以除去收容部114内的空气，将探针1、探针2、以及流感病毒或细菌3高效地导入收容部114内。
1-2-1-3.检测步骤2A3
本步骤中，检测在样品液4的液滴中生成的来自探针1及探针2的信号。
如上所示，在样品液4中，在流感病毒或细菌被稀释为足够低的浓度的情况下，进入1个收容部114的流感病毒或细菌3的数目为0或最多为1，因此在收容部114形成封入有流感病毒及细菌的某一方的液滴。
在各液滴中检测出由探针1生成的信号、未检测出由探针2生成的信号的情况下(参照图2C左图)，在该液滴中可以检测出流感病毒。另一方面，在检测出由探针1生成的信号及由探针2生成的信号的情况下(参照图2C右图)，可以检测出在该液滴中存在细菌(不存在流感病毒)。
在探针1使用了4MU-NANA、在探针2作为化合物(1)使用了HMRef-S-Neu5Ac的数字法中，将利用CCD照相机检测出从封入有流感病毒的液滴中产生的4-甲基伞形酮(4MU)的荧光的图像的一例表示于图2D左图中。可以在检测区域中确认到2个信号阳性的液滴。从存在流感病毒的液滴中检测出4MU发出的蓝色荧光(波长443nm)。在液滴中存在细菌的情况下，检测出4MU发出的蓝色荧光(波长443nm)和HMRef发出的绿色荧光(波长：518nm)。图2D右图是拍摄了不存在信号阳性的液滴的区域的图像的一例。
也可以使用检测出流感病毒的收容部114的数目与未检测出流感病毒的收容部114的数目的比率，基于预先制成的规定了该比率与病毒粒子数的关系的标准曲线，来定量地确定流感病毒量(数字定量)。
需要说明的是，检测出流感病毒的收容部114只要存在1个，就可以对受检试样判定为流感阳性。此种判定方法由于在样品中的流感病毒的数目极少的感染初期时判定有无罹患流感，因此有用。
1-2-2.基于数字法的检测2
对在步骤2中应用了数字法的另一实施方式进行说明。
本实施方式的步骤2包括以下的步骤2B1～2B3。
步骤2B1：向由具有疏水性的上表面的隔壁彼此隔开地形成有能够收容流感病毒及细菌的多个收容部的基板上导入样品液的步骤。
步骤2B2：层叠于样品液层上地导入比重大于样品液的疏水性溶剂，产生样品液层与疏水性溶剂层的层置换，由此在所述收容部内形成由疏水性溶剂包覆并且包含流感病毒和/或细菌的样品液的液滴的步骤。
步骤2B3：在所述液滴中检测由探针1及探针2生成的信号的检测步骤。
1-2-2-1.导入步骤2B1
参照图3-1～图3-3对导入步骤2B1进行说明。图是阵列201的横向剖视图。
阵列201包含下层部211而成。阵列201由下层部211和侧壁221、221划分出下方及两侧方并且具有上方被敞开的区域21。即，下层部211和侧壁221、221形成在上方具有开口的开口孔。在图中将该开口孔内的空间设为区域21表示。
在下层部211，形成有多个能够收容流感病毒和/或细菌的收容部214。收容部214由具有疏水性的上表面的隔壁213彼此隔开。下层部211不具有与之相面对的面。
本步骤中，向下层部211上导入样品液4。在样品液4中，包含探针1和探针2。另外，在样品液4中，可能包含流感病毒或细菌3。样品液例如可以从开口孔的开口导入区域21内。
在样品液4中，可以添加表面活性剂。通过添加表面活性剂，可以促进下面说明的封入步骤中的样品液4与疏水性溶剂的置换。表面活性剂可以使用上述的表面活性剂。
1-2-2-2.封入步骤2B2
参照图3-1～图3-3B-H对封入步骤2B2进行说明。本步骤中，层叠于样品液4的层上地导入疏水性溶剂5。
作为疏水性溶剂5的导入方法，没有特别限定，例如可以从开口孔的开口向区域21内导入。此时，疏水性溶剂5优选如图3-1B所示，在样品液4的层上层叠疏水性溶剂5的层地导入。
作为疏水性溶剂5，使用比重大于样品液4的溶剂。另外，作为疏水性溶剂5，优选为以能够与样品液4进行层置换的程度相互具有两亲性(日文：親媒性)的疏水性溶剂，然而需要彼此不相容。若样品液4与疏水性溶剂5之间的两亲性过低，则不产生样品液4与疏水性溶剂5的层置换。另外，在样品液4与疏水性溶剂5彼此相容的情况下，样品液4与疏水性溶剂5不发生层分离，不产生层叠状态。作为此种疏水性溶剂，可以使用上述的疏水性溶剂。举出“表1”中例示的疏水性溶剂5的比重。
疏水性溶剂5可以与样品液4同样地为了促进层置换而包含表面活性剂。
[表1]
第二溶剂 密度
PF-5052 1.700g/mL于25℃
FLUORINERT FC-72 1.680g/mL于25℃
FLUORINERT FC-770 1.790g/mL于25℃
FLUORINERT FC-3283 1.830g/mL于25℃
FLUORINERT FC-40 1.870g/mL于25℃
FLUORINERT FC-43 1.880g/mL于25℃
氯仿 1.492g/mL于25℃(lit.)
ASAHIKLIN AE-3000 1.470g/mL于25℃
Novec 7000 1.400g/mL
Novec 7100 1.520g/mL
Novec 7200 1.430g/mL
Novec 7300 1.660g/mL
Kry tox GPL-100 1.87g/mL于0℃
Krytox GPL-101 1.89g/mL于0℃
Krytox GPL-102 1.91g/mL于0℃
Krytox GPL-103 1.92g/mL于0℃
Krytox GPL-104 1.93g/mL于0℃
Krytox GPL-105 1.94g/mL于0℃
Krytox GPL-106 1.95g/mL于0℃
Krytox GPL-107 1.95g/mL于0℃
向样品液4上导入并层叠的疏水性溶剂5由于比重大于样品液4，因此向样品液4的下方移动。即，样品液4的层与疏水性溶剂5的层被置换，从上层为疏水性溶剂5、下层为样品液4的状态(参照图3-1B)变为上层为样品液4、下层为疏水性溶剂5的状态(参照图3-3H)。将产生层置换的样子示意性地表示于图3-1C～图3-3G中。在该层置换中，探针1、探针2、以及流感病毒或细菌3由向样品液4的下方移动来的疏水性溶剂5压入地收容于各个收容部214(参照图3-2D～F)。其结果是，在收容部214内，形成由疏水性溶剂5包覆并且包含探针1、探针2及流感病毒或细菌3的样品液4的液滴。
该液滴的容积(与收容部214的容积大致相等)可以极小，例如设为10aL～100nL、优选设为1fL～1pL。
在样品液4的液滴的极小容积中，进行流感病毒或细菌的神经氨酸酶与探针1及探针2的反应。
1-2-2-3.检测步骤2B3
本步骤中，检测在样品液4的液滴中生成的来自于探针1及探针2的信号。
如上所示，在样品液4中，在流感病毒或细菌被稀释为足够低的浓度的情况下，进入1个收容部214的流感病毒或细菌3的数目为0或最多为1，因此在收容部214形成封入了流感病毒及细菌的某一方的液滴。
在各液滴中检测出由探针1生成的信号、未检测出由探针2生成的信号的情况下，可以在该液滴中检测出流感病毒。另一方面，在检测出由探针1生成的信号及由探针2生成的信号的情况下，可以检测出在该液滴中存在细菌(不存在流感病毒)。
也可以使用检测出流感病毒的收容部214的数目与未检测出流感病毒的收容部214的数目的比率，基于预先制成的规定了该比率与病毒粒子数的关系的标准曲线，来定量地确定流感病毒量(数字定量)。
2.流感病毒的检测试剂盒及流感感染的诊断试剂盒
本发明的流感病毒的检测试剂盒是用于检测从感染了流感病毒的对象或有感染的嫌疑的对象中分离出的生物试样中的流感病毒的试剂盒。本发明的流感病毒的检测试剂盒用于对象的流感感染的有无的诊断中。本发明的流感病毒的检测试剂盒包含上述的探针1及探针2而成，可以在它们的基础上还任选包含上述的疏水性溶剂、以及阵列101或阵列201。这些试剂盒构成要素(组件)可以整合到一起销售，也可以各自单独销售。
关于探针1、探针2及疏水性溶剂如上所述。关于阵列101及阵列201，利用以下内容来说明详细的结构。
用于阵列101及阵列201的制作的光刻、蚀刻、基板层叠等技术可以应用通用的用于制成微型芯片、阵列的技术。
[阵列101]
上层部121的材质例如可以设为玻璃、硅、高分子树脂等。
上层部121的厚度没有特别限定。
上层部121的下表面(面对空间131的面)优选为疏水性。所谓“疏水性”，在此处以与“亲油性”相同的含义使用，是指与疏水性溶剂的亲和性高于与亲水性溶剂的亲和性。
在下层部111，收容部114由形成于板状构件112上的隔壁113彼此隔开。收容部114的底面可以是板状构件112的表面。
板状构件112的材质例如可以设为玻璃、硅、高分子树脂等。
板状构件112的厚度没有特别限定。
隔壁113可以利用在板状构件112的表面形成的树脂层来形成，例如可以利用抗水性的树脂或氟系高分子树脂等的蚀刻来形成。作为氟系高分子树脂，例如可以举出无定形氟树脂等。基于具有高疏水性、并且对生物体试样的毒性低的理由，优选使用无定形氟树脂。
作为上述无定形氟树脂，例如可以合适地使用选自CYTOP(注册商标)、TEFLON(注册商标)AF2400、以及TEFLON(注册商标)AF1600中的至少一种。其中，基于易于微细加工的理由，最优选CYTOP(注册商标)。
收容部114的形状没有特别限定，例如可以是圆柱形状及棱柱形状等。
收容部114的大小只要是能够收容流感病毒和/或细菌，就没有特别限定，然而水平方向的宽度及垂直方向的高度(隔壁113的高度)分别例如为100nm-100μm、200nm-90μm、300nm-80μm、400nm-70μm、500nm-60μm、600nm-50μm、700nm-40μm、800nm-30μm、900nm-20μm、1000nm-10μm、2μm-9μm、3μm-8μm的范围。
收容部114例如可以高密度地配置100万个以上。即使是此种超高密度阵列，根据先前说明的封入步骤，也可以在各收容部114高效地形成由疏水性溶剂5包覆并且包含探针1、探针2、以及流感病毒或细菌3的样品液4的液滴。
隔壁113的上表面(与上层部121相面对的面)优选被制成疏水性。另外，形成收容部114的底面的板状构件112的表面优选为亲水性。所谓“亲水性”，是指与亲水性溶剂的亲和性高于与疏水性溶剂的亲和性的表面。
通过使收容部114的底面为亲水性、并且隔壁113的上表面及上层部121的下表面为疏水性，在导入步骤2A1中，可以将样品液4顺畅地导入收容部114内。另外，通过使收容部114的底面为亲水性、并且隔壁113的上表面为疏水性，可以防止在封入步骤2A2中疏水性溶剂5进入收容部114内。
需要说明的是，隔壁113只要其上表面为疏水性即可，其侧面(面对收容部114的面)可以是疏水性，也可以是亲水性。
上层部121的下表面(面对空间131的面)与隔壁113的上表面(与上层部121相面对的面)之间的距离(空间131的高度)被缩小到能够使液体遵循毛细管现象在空间131内流过的程度。空间131的高度例如为0.1μm-5mm、0.5μm-4mm、1μm-3mm、2μm-2mm、5μm-1mm、10μm-500μm、20μm-400μm、30μm-300μm、40μm-200μm、50μm-100μm的范围。若高度小于0.1μm，则为了使液体在空间131内流过所需的送液压有可能变得过高。
[阵列201]
阵列201的下层部211可以是与阵列101的下层部111同样的构成，构成下层部211的板状构件212及隔壁213也可以是与阵列101的板状构件112及隔壁113同样的构成。
另外，收容部214也可以是与阵列101的收容部114同样的构成。
侧壁221可以是与板状构件212同样的材质，例如可以是由玻璃、硅、高分子树脂等制成的构件的表面。
侧壁221的高度任意，然而需要大于样品液4的层与疏水性溶剂5的层被层叠的状态下的合计的厚度。
通过使收容部214的底面为亲水性、并且隔壁213的上表面为疏水性，可以防止在封入步骤2B2中疏水性溶剂5进入收容部214内。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行说明，然而本发明并不受其限定。
[合成例1：HMRef-S-Neu5Ac的合成]
依照以下的反应路线图的步骤合成化合物3。然后，使用化合物3合成HMRef-S-Neu5Ac。
[化6]
Figure BDA0003245842640000281
[原料]
合成中使用的全部化学物质从东京化成工业(株)、和光纯药工业(株)、SigmaAldrich(株)购入，不进行追加的纯化地使用。
[测定设备]
在氘代溶剂中、利用Bruker NMR AVANCE III 400分光计[1H(400MHz)、13C(101MHz)]得到NMR谱图。
利用microOTOF II(Bruker)得到高分辨率ESI质谱图。
利用具备Inertstil-ODS-3色谱柱(Φ10×250mm(半制备柱(日文：セミ分取))及Φ20×250mm(制备柱(日文：分取)))的JASCO PU-2087 Plus泵(GL Science Co.、Ltd.)及UVIDEC-100-V检测器(JASCO)进行HPLC纯化。
HPLC中使用的溶剂从和光(株)获取。使用硅胶60N(球状、中性、63～210μm；关东化学株式会社制)进行硅胶柱层析。
利用硅胶板F254(0.25mm(分析)；Merck、AKG)进行TLC。
利用Shimadzu UV-2450分光光度计得到UV-vis谱图。
(1)化合物1的合成
向4-羟基苯甲醛(S、479mg、3.9mmol)及二异丙基乙基胺(5mL)的溶液中，加入N-乙酰基-2-氯-2-脱氧神经氨酸甲基酯4，7，8，9-四乙酸酯3(0.5mL、3.1mmol)的MeCN溶液，将反应混合物在室温搅拌3小时。之后，除去所有的溶剂，用甲苯(×3)稀释。将所得的残渣使用硅胶色谱(EtOAc：DCM、1：1～EtOAc)进行纯化，以白色泡状物的形式得到化合物1(145mg、62％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.93(s，3H，NHOAc)，2.05(s，3H，OAc)，2.06(s，3H，OAc)，2.12(s，3H，OAc)，2.19(s，3H，OAc)，2.30(t，1H，3JHH＝12.5Hz，H3ax)，2.74(dd，1H，3JHH＝13，4.7Hz，H3eq)，3.65(s，3H，COOMe)，4.11(m，1H，H9)，4.13(m，1H，H5)，4.25(dd，1H，3JHH＝12.4，2.4Hz，H9′)，4.60(dd，1H，3JHH＝10.8，1.6Hz，H6)，4.98(td，1H，3JHH＝10.4，4.6，1.8HZ，H4)，5.23(d，1H，3JHH＝10Hz，H7)，5.35(m，1H，NH)，5.37(m，1H，H8)，7.18(d，2H，3JHH＝8.7Hz，Ar)，7.83(d，2H，3JHH＝8.8Hz，Ar)，9.93(s，1H，CHO).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ20.7，20.7，20.8，21.0，23.2，38.7，49.5，53.2，62.0，67.1，68.4，68.7，73.6，99.5，118.9，131.7，132.0，158.9，168.2，169.9，170.1，170.2，170.6，170.9，190.9.HRMS(ESI+)：[M+Na+]计算值：618.17933，测得：618.18094(-1.6mDa)对于C27H34NaNO14.
(2)化合物2的合成
将化合物1(247mg、0.42mmol)溶解于干燥THF(5mL)中，在0℃加入LiAlH(OtBu)3(0.83mL的1.0M THF溶液)。在0℃搅拌1小时后，将饱和NH4Cl(aq)(5mL)及EtOAc(10mL)加入混合物中，在室温再搅拌1小时。向其中加入罗谢尔盐(水性)(10mL)的饱和溶液，将粗产物用CHCl3(×3)萃取后，减压蒸馏除去有机层。然后，将残留物用硅胶色谱(MeOH：DCM 1：99到5：95)进行纯化，以白色泡状物的形式得到化合物2(156mg、63％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.90(s，3H，NHOAc)，2.04(s，3H，OAc)，2.04(s，3H，OAc)，2.12(s，3H，OAc)，2.13(s，3H，OAc)，2.21(t，1H，3JHH＝12.6Hz，H3ax)，2.72(dd，1H，3JHH＝12.9，4.6Hz，H3eq)，3.68(s，3H，COOMe)，4.10(m，1H，H5)，4.14(d，1H，3JHH＝5Hz，H9)，4.28(dd，1H，3JHH＝12.6，2.6Hz，H9')，4.38(dd，1H，3JHH＝10.8，1.6Hz，H6)，4.63(s，2H，CH2OH)，4.95(td，1H，3JHH＝10.4，4.6，1.8HZ，H4)，5.27(m，1H，NH)，5.35(m，2H，H7，H8)，7.03(d，2H，3JHH＝8.6Hz，Ar)，7.27(d，2H，3JHH＝8.6Hz，Ar).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ20.7，20.8，20.8，21.0，23.2，38.2，49.5，52.9，62.1，64.9，67.4，68.8，69.4，73.4，99.9，120.3，128.3，136.7，153.1，168.1，170.0，170.1，170.3，170.7，170.9.HRMS(ESI+)：[M+Na+]计算值：620.19498，测得：620.19672(-1.7mDa)C27H36NaNO14.
(3)化合物3的合成
将化合物2(150mg、0.25mmol)溶解于DCM(3mL)中，在0℃向溶液中添加三溴化磷(12μL、0.13mmol)。在0℃搅拌2小时后，用饱和NaHCO3水溶液(×3)及饱和食盐水(×1)清洗溶液。利用硫酸钠使有机层干燥，减压蒸馏除去后以白色泡状物(136mg、82％)的形式得到化合物3。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.84(s，3H，NHOAc)，1.97(s，3H，OAc)，1.98(s，3H，OAc)，2.05(s，3H，OAc)，2.09(s，3H，OAc)，2.15(t，1H，3JHH＝12.6Hz，H3ax)，2.63(dd，1H，3JHH＝13，4.7Hz，H3eq)，3.58(s，3H，COOMe)，4.03(m，1H，H9)，4.10(m，1H，H5)，4.23(m，1H，H9')，4.37(m，1H，H6)，4.40(s，2H，CH2Br)，4.89(td，1H，3JHH＝10.4，4.6，1.8Hz，H4)，5.29(m，3H，H7，H8，NH)，6.95(d，2H，3JHH＝8.7Hz，Ar)，7.23(d，2H，3JHH＝8.7Hz，Ar).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ19.7，19.8，19.8，20，22.2，32.3，37.2，48.4，52.0，70.0，66.3，67.7，68.1，72.4，98.8，118.7，129.2，132.1，152.8，167.1，169.0，169.1，169.2，169.6，169.9.HRMS(ESI+)：[M+Na+]计算值：682.11057，测得：682.10666(3.9mDa)C27H34BrNNaO13.
(4)HMRef-S-Neu5Ac的合成
依照以下的反应路线图的步骤，合成HMRef-S-Neu5Ac。
[化7]
Figure BDA0003245842640000311
向HMRef(79mg、0.2mmol)及NaH(6mg、0.26mmol)中添加干燥THF(3mL)及干燥DMF(1mL)，将该混合物在氩气下在0℃搅拌。加入化合物3(130mg、0.2mmol)的干燥THF(3mL)溶液，将反应混合物在室温搅拌16小时。之后，加入EtOAc(20mL)，将该混合物用饱和NH4Cl溶液(×2)及饱和食盐水(×1)清洗。
使有机层在硫酸钠上干燥，并减压蒸馏除去。将残渣溶解于MeOH(6mL)中，加入1MNaOH(水溶液)(3mL)。将混合物在室温搅拌5小时，其后，使有机溶剂蒸发。将残留水溶液用2M的HCl中和，然后冷冻干燥。然后，将残留物溶解于MeOH：DCM、1：4溶液中，过滤后除去不溶性盐。减压蒸馏除去该溶液，将残渣用HPLC(A液：100mM TEAA缓冲液、B液：CH3CN 99％、H2O1％。以A/B＝90/10、5分钟、其后15分钟为10/90设置梯度，然后以10/90进行15分钟)进行纯化，冷冻干燥后得到橙色的粉末(以2个步骤计为36％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.04(t，26H，TEAA)，1.84(1H，t，3JHH＝11.9Hz，H3ax)，1.90(s，3H，TEAA)，2.02(s，3H，NHCOCH3)，2.55(q，17H，TEAA)，2.94(dd，1H，3JHH＝12.2，4.0Hz，H3eq)，3.54(dd，1H，3JHH＝9.0，1.6Hz，H7)，3.66(dd，1H，3JHH＝11.3，5.4Hz，H9)，3.74(m，1H，H5)，3.77(m，1H，H4)，3.81(m，1H，H9')，3.85(m，2H，NHCH2CF3)，3.86(m，1H，H8)，3.91(m，1H，H6)，5.01(s，2H，ArCH2O)，5.23(s，2H，ArCH2O)，6.45(dd，1H，3JHH＝8.6，4JHH＝2.4Hz，Ar)，6.50(d，1H，4JHH＝2.3Hz，Ar)，6.65(dd，1H，3JHH＝8.7，4JHH＝2.6Hz，Ar)，6.67(d，1H，3JHH＝8.6，Ar)，6.78(m，1H，Ar)，6.79(m，1H，Ar)，6.82(m，1H，Ar)，7.24(d，2H，3JHH＝8.7Hz，Ar)，7.30(m，1H，Ar)，7.31(d，2H，3JHH＝8.7Hz，Ar)，7.39(m，1H，Ar)，7.43(m，1H，Ar).13C NMR(101MHz，CD3OD)：δ11.2(TEAA)22.9，24.4(TEAA)，43.1，45.8，46.9(TEAA)，54.3，64.0，69.3，70.2，72.6，72.7，73.1，75.3，85.5，99.3，104.0，104.1，109.7，110.8，114.7，117.8，118.1，120.8，121.9，124.7，124.8，126.9(q，CF3)，129.3，129.4，130.2，130.2，130.9，140.3，146.0，150.3，152.1，153.0，157.0，173.6，175.6，180.7(TEAA).HRMS(ESI+)L[M+Na]+计算值：797.75163；测得：797.75043(-1.2mDa).
使用直线梯度(0min、20％CH3CN/0.1％TFAaq.到15min，100％CH3CN0.1％TFA aq；flow rate(流速)＝1.0mL/min)进行HPLC分析。研究了520nm处的荧光。
[化8]
Figure BDA0003245842640000321
[试验例1：HMRef-S-Neu5Ac的与细菌来源神经氨酸酶的反应性]
对于合成例1中得到的HMRef-S-Neu5Ac，研究了伴随着与产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)来源的神经氨酸酶的酶反应的荧光强度的经时变化。
将探针(HMRef-S-Neu5Ac)溶解于二甲亚砜(DMSO、荧光测定级、同仁化学研究所)中而得到储备溶液。继而，将储备溶液以使探针的最终浓度为1μM的方式用缓冲液(100mMNaOAc、2mM CaCl2、pH7.4)稀释而得到测定溶液。
使用日立F-7000每隔1秒地测定测定溶液的荧光谱图(激发波长490nm、发光波长520nm)。测定开始后60秒后单独或者以与酶抑制剂的组合添加产脲节杆菌来源的神经氨酸酶0.01U。测定时的温度设为37℃，酶抑制剂(DANA)的浓度设为100μM。
将结果表示于图4中。HMRef-S-Neu5Ac因与细菌来源的神经氨酸酶的反应而显示出130倍的荧光增强。
在使用产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)来源的神经氨酸酶的情况下也得到同样的结果。产气荚膜梭菌是常居于人体中的细菌，也常居于包括口腔在内的上呼吸道粘膜。
[试验例2：HMRef-S-Neu5Ac的与流感来源神经氨酸酶的反应性]
对于HMRef-S-Neu5Ac，与试验例1同样地研究了伴随着与流感病毒来源的神经氨酸酶的酶反应的荧光强度的经时变化。
本试验例中作为探针在HMRef-S-Neu5Ac的基础上还使用了4MU-NANA(阳性对照)。探针在测定溶液中的最终浓度设为HMRef-S-Neu5Ac 100μM、4MU-NANA 1mM。
向测定溶液中添加5×107PFU/mL的流感病毒(A/PR8医科研II株)，开始荧光谱图的测定(激发波长360nm、发光波长448nm)。测定时的温度设为25℃。
将结果表示于图5中。虽然作为阳性对照的4MU-NANA显示出经时的荧光增强，然而HMRef-S-Neu5Ac中完全观察不到荧光强度的变化。根据本试验例及试验例1的结果，显而易见，HMRef-S-Neu5Ac对于细菌来源的神经氨酸酶具有反应性，然而对于流感来源神经氨酸酶不具有反应性。
附图标记说明
1探针1，2探针2，3流感病毒或细菌，4样品液，5疏水性溶剂，101、201阵列，111、211下层部，112、212板状构件，113、213隔壁，114、214收容部，121上层部，131空间，21区域，221侧壁。

Claims (9)

1.一种检测方法，是检测生物试样中的流感病毒的方法，所述方法包括：
(1)将所述生物试样与第一探针和第二探针混合的步骤1，
此处，所述第一探针是由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号的探针，
所述第二探针是由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号并且不由流感来源的神经氨酸酶分解的探针，
由所述第一探针生成的信号和由所述第二探针生成的信号能够以光学方式进行区别地检测；和
(2)检测由所述第一探针及所述第二探针生成的信号的步骤2，
在由所述第一探针生成的信号的强度相对于由所述第二探针生成的信号的强度的比为规定值以上的情况下，检测出所述生物试样中存在流感病毒，
在所述比小于所述规定值的情况下，检测出所述生物试样中不存在流感病毒。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
所述第二探针为以下的式(1)所示的化合物或其盐：
Figure FDA0003245842630000011
式中，
R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基；
R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，
此处，在X为氧原子的情况下，R7及R8不存在；
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基中；
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
X表示氧原子、硅原子或碳原子；
m为0～4的整数；
n为1～3的整数；
s为1的整数；
t为0～4的整数。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，
所述第一探针为2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸即4MU-NANA。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，
在检测出由所述第一探针生成的信号、未检测出由所述第二探针生成的信号的情况下，检测出所述生物试样中存在流感病毒，
在检测出由所述第一探针生成的信号及由所述第二探针生成的信号的情况下，检测出所述生物试样中不存在流感病毒。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其基于数字法。
6.一种试剂盒，是用于检测从感染了流感病毒的对象或有感染的嫌疑的对象中分离出的生物试样中的流感病毒的试剂盒，
所述试剂盒包含：
第一探针，其由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号；和
第二探针，其由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号并且不由流感来源的神经氨酸酶分解，
所述第二探针为以下的式(1)所示的化合物或其盐：
Figure FDA0003245842630000031
式中，
R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基；
R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，
此处，在X为氧原子的情况下，R7及R8不存在；
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基中；
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
X表示氧原子、硅原子或碳原子；
m为0～4的整数；
n为1～3的整数；
s为1的整数；
t为0～4的整数。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，
所述第一探针为2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸即4MU-NANA。
8.以下的式(1)所示的化合物或其盐的用于将流感病毒与细菌识别检测的应用；
Figure FDA0003245842630000041
式中，
R1在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
R2及R3各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R4及R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～6个的烷基或卤素原子；
R6表示氢原子、碳原子数1～5个的烷基、或碳原子数1～5个的氟代烷基；
R7及R8在存在的情况下，各自独立地表示碳原子数1～6个的烷基或芳基，
此处，在X为氧原子的情况下，R7及R8不存在；
R9在各出现中独立地选自氢原子、碳原子数1～5个的烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、桥氧基中；
R10在存在的情况下，表示在苯环上存在的相同或不同的一价的取代基；
X表示氧原子、硅原子或碳原子；
m为0～4的整数；
n为1～3的整数；
s为1的整数；
t为0～4的整数。
9.一种诊断方法，是诊断对象有无感染流感病毒的方法，
所述诊断方法包括：
(1)步骤1，将从感染了流感病毒的对象或有感染的嫌疑的对象中分离出的生物试样与第一探针和第二探针混合，
此处，所述第一探针是由流感病毒来源的神经氨酸酶及细菌来源的神经氨酸酶双方分解而生成能够以光学方式检测的信号的探针，
所述第二探针是由细菌来源的神经氨酸酶分解而生成能够以光学方式检测的信号并且不由流感来源的神经氨酸酶分解的探针，
由所述第一探针生成的信号和由所述第二探针生成的信号能够以光学方式进行区别地检测；和
(2)步骤2，检测由所述第一探针及所述第二探针生成的信号，
在由所述第一探针生成的信号的强度相对于由所述第二探针生成的信号的强度的比为规定值以上的情况下，确定所述对象感染流感病毒，
在所述比小于所述规定值的情况下，确定所述对象未感染流感病毒。
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