JP7454861B2 - インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法 - Google Patents
インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7454861B2 JP7454861B2 JP2021503642A JP2021503642A JP7454861B2 JP 7454861 B2 JP7454861 B2 JP 7454861B2 JP 2021503642 A JP2021503642 A JP 2021503642A JP 2021503642 A JP2021503642 A JP 2021503642A JP 7454861 B2 JP7454861 B2 JP 7454861B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- influenza virus
- group
- carbon atoms
- alkyl group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims description 145
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 81
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 243
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims description 94
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 94
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 65
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 63
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 45
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 34
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 34
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 31
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 29
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 27
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 22
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 18
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 17
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 14
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 11
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims description 8
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 64
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 56
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 56
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 53
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 20
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- -1 organic acid salts Chemical class 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 4
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 4
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001524178 Paenarthrobacter ureafaciens Species 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 3
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound NC(=O)CNCCS(O)(=O)=O DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 2
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 150000001555 benzenes Chemical group 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N dodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCO LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N hexadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N tetrafluoroethene Chemical compound FC(F)=C(F)F BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- PIGTXFOGKFOFTO-FVFWYJKVSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[[(3S,4S,4aR,6aR,6bS,8R,8aR,12aS,14aR,14bR)-8a-carboxy-4-formyl-8-hydroxy-4,6a,6b,11,11,14b-hexamethyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O([C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)C[C@@H](O)[C@]1(CCC(C[C@H]14)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PIGTXFOGKFOFTO-FVFWYJKVSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- IQQRAVYLUAZUGX-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-3-methylimidazolium Chemical compound CCCCN1C=C[N+](C)=C1 IQQRAVYLUAZUGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- IEORSVTYLWZQJQ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-nonylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=CC=C1OCCO IEORSVTYLWZQJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPALGXXLALUMLE-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC(N(C)C)C(O)=O XPALGXXLALUMLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- WFDAFOOIFPJRJU-UHFFFAOYSA-N 3-[methyl(pentadecyl)amino]propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCN(C)CCCS(O)(=O)=O WFDAFOOIFPJRJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 4,4-difluoro-N-[3-[3-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound CC(C)C1=NN=C(C)N1C1CC2CCC(C1)N2CCC(NC(=O)C1CCC(F)(F)CC1)C1=CC=CS1 BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- RUPBZQFQVRMKDG-UHFFFAOYSA-M Didecyldimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC RUPBZQFQVRMKDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 229910010082 LiAlH Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- AOMUHOFOVNGZAN-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)dodecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(CCO)CCO AOMUHOFOVNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N N-[3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]acetamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CCC(C=1SC=CC=1)NC(C)=O)C LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- PHSPJQZRQAJPPF-UHFFFAOYSA-N N-alpha-Methylhistamine Chemical compound CNCCC1=CN=CN1 PHSPJQZRQAJPPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000191992 Peptostreptococcus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 241000605894 Porphyromonas Species 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- VBIIFPGSPJYLRR-UHFFFAOYSA-M Stearyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C VBIIFPGSPJYLRR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241001148134 Veillonella Species 0.000 description 1
- LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N [(2r)-2-[(2r,3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- JBIROUFYLSSYDX-UHFFFAOYSA-M benzododecinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 JBIROUFYLSSYDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 1
- KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L calcium folinate Chemical compound [Ca+2].C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C([O-])=O)C=C1 KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001924 cycloalkanes Chemical class 0.000 description 1
- DIOQZVSQGTUSAI-NJFSPNSNSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCC[14CH3] DIOQZVSQGTUSAI-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960004670 didecyldimethylammonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- REZZEXDLIUJMMS-UHFFFAOYSA-M dimethyldioctadecylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC REZZEXDLIUJMMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004664 distearyldimethylammonium chloride (DHTDMAC) Substances 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N dodecyl benzenesulfonate;sodium Chemical compound [Na].CCCCCCCCCCCCOS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000119 electrospray ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000004811 fluoropolymer Substances 0.000 description 1
- 229920002313 fluoropolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003026 hypopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N keto-neuraminic acid Chemical group OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N n-butylhexane Natural products CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 229920000847 nonoxynol Polymers 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- RVZRBWKZFJCCIB-UHFFFAOYSA-N perfluorotributylamine Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)N(C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F RVZRBWKZFJCCIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- BTURAGWYSMTVOW-UHFFFAOYSA-M sodium dodecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC([O-])=O BTURAGWYSMTVOW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940080264 sodium dodecylbenzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- 229940082004 sodium laurate Drugs 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 235000011067 sorbitan monolaureate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003021 water soluble solvent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Description
本発明は、インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法に関する。より詳しくは、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼとバクテリア由来のノイラミニダーゼとに対して異なる反応性を示す基質を用いた、インフルエンザウイルスの検出方法等に関する。
近年、イムノクロマトグラフィを用いた簡易なインフルエンザウイルス検査キットが開発されている（特許文献１参照）。イムノクロマトグラフィを用いる方法は、数分から数十分の間にインフルエンザウイルスを検出できるので、感染の診断や治療等に活用されている。
また、従来、インフルエンザウイルスが有する酵素であるノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）と発色基質との反応に基づいて光学的にインフルエンザウイルスを検出する技術が知られている（特許文献２、３参照）。ノイラミニダーゼは、糖鎖の非還元末端からシアル酸を遊離するエキソ型糖分解酵素である。ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスの表面に存在し、ウイルスの増殖に関与している。発色基質としては、例えば、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ノイラミン酸（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－α－Ｄ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ：４ＭＵ－ＮＡＮＡ、特許文献２参照）や、４－アルコキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸又は４，７－ジアルコキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸の化学発光誘導体（特許文献３参照）などが用いられている。例えば、発色基質として４ＭＵ－ＮＡＮＡを用いた方法では、ノイラミニダーゼによる４ＭＵ－ＮＡＮＡの分解によって蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンが生成する。生成した４－メチルウンベリフェロンの蛍光強度に基づいてノイラミニダーゼの酵素活性値を算出することができ、さらに酵素活性値に基づいてインフルエンザウイルスの粒子数を定量することができる。
特許文献４には、ヒトにおいてインフルエンザがヒトインフルエンザであるかヒト病原性トリインフルエンザであるかを検出するためのキットが開示されている（実施例７参照）。このキットは、ガラクトースに結合したN-グリコリルノイラミン（NeuGcα2-3Gal）酸を含む基質と、ガラクトースに結合したN-アセチルノイラミン酸（NeuAcα2-3Gal）を含む基質とを含んでなる。これら２種類の基質と臨床検体とを接触させ、NeuAcα 2-3Galに基づいた基質のみが切断されればヒトインフルエンザウイルス陽性と判定され、NeuAcα 2-3Galに基づいた基質及びNeuGcα 2-3Galに基づいた基質の双方が切断されればヒト病原性トリインフルエンザウイルス陽性と判断される。
特許文献５には、デジタル法によるインフルエンザウイルスの検出方法が記載されている。デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。特許文献６，７には、物質を極小空間中に封入（Enclose）するための方法であって、デジタル法に適用可能な技術が記載されている。
上部気道粘膜に常在するバクテリアには、ノイラミニダーゼを有するものがある。このため、鼻腔ぬぐい液等を試料に用いた、イラミニダーゼと基質との反応に基づくインフルエンザウイルスの検出方法では、バクテリア由来のノイラミニダーゼに起因する信号が擬陽性として検出される可能性がある。
そこで、本発明は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼとバクテリア由来のノイラミニダーゼに対して異なる反応性を示す基質を用い、インフルエンザウイルスを改善された確度で検出するための技術を提供することを主な目的とする。
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の［１］～［１８］を提供する。
［１］ 生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出する方法であって、
（１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、
検出方法。
［２］ 前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、［１］の検出方法。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［２］の検出方法。
［４］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１］－［３］のいずれかの検出方法。
［５］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、［１］－［４］のいずれかの検出方法。
［６］ デジタル法に基づく、［１］－［５］のいずれかの検出方法。
［１］ 生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出する方法であって、
（１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、
検出方法。
［２］ 前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、［１］の検出方法。
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［２］の検出方法。
［４］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１］－［３］のいずれかの検出方法。
［５］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、［１］－［４］のいずれかの検出方法。
［６］ デジタル法に基づく、［１］－［５］のいずれかの検出方法。
［７］ インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出するためのキットであって、
インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［８］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［７］のキット。
［９］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［７］又は［８］のキット。
インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［８］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［７］のキット。
［９］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［７］又は［８］のキット。
［１０］ 以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩の、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための使用。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１１］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１０］の使用。
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１１］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１０］の使用。
［１２］ インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬であって、以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩を含む試薬。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１２］の試薬。
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１２］の試薬。
［１４］ 対象のインフルエンザウイルスへの感染の有無を診断する方法であって、
（１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定すし、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、
診断方法。
［１５］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１４］の診断方法。
［１６］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１４］又は［１５］の診断方法。
［１７］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、［１４］－［１６］のいずれかの診断方法。
［１８］ デジタル法に基づく、［１４］－［１７］のいずれかの診断方法。
（１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定すし、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、
診断方法。
［１５］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１４］の診断方法。
［１６］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１４］又は［１５］の診断方法。
［１７］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、［１４］－［１６］のいずれかの診断方法。
［１８］ デジタル法に基づく、［１４］－［１７］のいずれかの診断方法。
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
本発明により、インフルエンザウイルスを改善された確度で検出するための技術が提供される。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
１．インフルエンザウイルスの検出方法及びインフルエンザ感染の診断方法
本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼによるプローブの加水分解の有無に基づいてインフルエンザウイルスを検出するものである。したがって、本発明において、「インフルエンザウイルスの検出」と「インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ」の検出とは同義に用いられる。
本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼによるプローブの加水分解の有無に基づいてインフルエンザウイルスを検出するものである。したがって、本発明において、「インフルエンザウイルスの検出」と「インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ」の検出とは同義に用いられる。
本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、以下の手順（ステップ）１，２を含む。
手順１：生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順。
手順２：第一のプローブ及び第二のプローブから生成する信号を検出する手順。
手順１：生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順。
手順２：第一のプローブ及び第二のプローブから生成する信号を検出する手順。
１－１．手順１（生物試料とプローブとの混合手順）
［生物試料］
本発明において、生物試料は、インフルエンザウイルスが含まれ得る、生体由来の材料であれば特に限定されない。
生物試料としては、例えば、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、気管ぬぐい液、唾液、喀痰、血液（全血、血清及び血漿を含む）、尿、細胞や組織、臓器の抽出液等が挙げられる。
本発明に係るインフルエンザ感染の診断方法においては、生物試料は、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離される。
対象は、ヒトに限定されず、サル及びブタを含む哺乳類や、アヒル及びニワトリを含む鳥類であってよい。
［生物試料］
本発明において、生物試料は、インフルエンザウイルスが含まれ得る、生体由来の材料であれば特に限定されない。
生物試料としては、例えば、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、気管ぬぐい液、唾液、喀痰、血液（全血、血清及び血漿を含む）、尿、細胞や組織、臓器の抽出液等が挙げられる。
本発明に係るインフルエンザ感染の診断方法においては、生物試料は、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離される。
対象は、ヒトに限定されず、サル及びブタを含む哺乳類や、アヒル及びニワトリを含む鳥類であってよい。
［プローブ１］
第一のプローブ（以下「プローブ１」と称する）は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
第一のプローブ（以下「プローブ１」と称する）は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
本発明において、「バクテリア」（細菌）との用語は、古細菌を含む原核生物全般を指す最も広義な意味で使用されるが、特には生物試料中に常在しえる真性細菌を意味する。
鼻腔、咽喉頭、口腔及び泌尿器等には、Actinomyces, Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacteriaceae, Eubacterium, Fusobacterium, Haemophilus, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Peptostreptococcus,
Porphyromonas, Prevotella, Propinibacterium, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Spirohaetaceae及びVeillonella等の各属に属する多種のバクテリアが常在しており、これらのバクテリアはノイラミニダーゼを有する場合がある。
鼻腔、咽喉頭、口腔及び泌尿器等には、Actinomyces, Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacteriaceae, Eubacterium, Fusobacterium, Haemophilus, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Peptostreptococcus,
Porphyromonas, Prevotella, Propinibacterium, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Spirohaetaceae及びVeillonella等の各属に属する多種のバクテリアが常在しており、これらのバクテリアはノイラミニダーゼを有する場合がある。
プローブ１は、シアル酸を含む化合物であって、インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ及びバクテリア由来ノイラミニダーゼの双方によりシアル酸のグリコシド結合が加水分解されて分解前の化合物とは異なる光学特性を示す反応生成物を生成するものであればよい。加水分解前のプローブ１の光学特性から、加水分解後に生成する反応生成物の光学特性への変化が、「光学的に検出可能な信号」として検出される。
ここで、光学特性への変化とは、吸光度、旋光度及び屈折率の変化や、蛍光の有無あるいは強度の変化などを意味する。
ここで、光学特性への変化とは、吸光度、旋光度及び屈折率の変化や、蛍光の有無あるいは強度の変化などを意味する。
プローブ１として、ノイラミン酸又はその誘導体に発色団を結合した化合物が好適に用いられる。
発色団は、蛍光物質又は化学発光物質であってよいが、蛍光物質とされること好ましい。蛍光物質には、例えば４－メチルウンベリフェロン（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）及びローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などの公知の物質を用いることができる。
このようなプローブ１としては、例えば、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（４ＭＵ－ＮＡＮＡ）が汎用されている。４ＭＵ－ＮＡＮＡは、インフルエンザウイルス及びバクテリアに由来するノイラミニダーゼと接触して反応すると、蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンを遊離させる。
発色団は、蛍光物質又は化学発光物質であってよいが、蛍光物質とされること好ましい。蛍光物質には、例えば４－メチルウンベリフェロン（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）及びローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などの公知の物質を用いることができる。
このようなプローブ１としては、例えば、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（４ＭＵ－ＮＡＮＡ）が汎用されている。４ＭＵ－ＮＡＮＡは、インフルエンザウイルス及びバクテリアに由来するノイラミニダーゼと接触して反応すると、蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンを遊離させる。
［プローブ２］
第二のプローブ（以下「プローブ２」と称する）は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来のノイラミニダーゼによってのみ分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
第二のプローブ（以下「プローブ２」と称する）は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来のノイラミニダーゼによってのみ分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
プローブ２は、シアル酸を含む化合物であって、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってシアル酸のグリコシド結合が加水分解されて分解前の化合物とは異なる光学特性を示す反応生成物を生成するものであればよい。加水分解前のプローブ２の光学特性から、加水分解後に生成する反応生成物の光学特性への変化が、「光学的に検出可能な信号」として検出される。
プローブ２が生成する「光学的に検出可能な信号」は、プローブ１が生成する「光学的に検出可能な信号」とは異なるものとされる。すなわち、プローブ２が生成する信号と、プローブ１が生成する信号とは、光学的に区別して検出可能なものとされる。
具体的には、例えばプローブ１が生成する信号が、吸光度、旋光度及び屈折率の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での吸光度旋光度及び屈折率の変化であってよい。
また、例えばプローブ１が生成する信号が、蛍光の有無あるいは強度の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、吸光度、旋光度及び屈折率の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。
具体的には、例えばプローブ１が生成する信号が、吸光度、旋光度及び屈折率の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での吸光度旋光度及び屈折率の変化であってよい。
また、例えばプローブ１が生成する信号が、蛍光の有無あるいは強度の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、吸光度、旋光度及び屈折率の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。
プローブ２としては、以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩（以下、単に「化合物（１）」とも称する）が好適に用いられる。
式（１）において、Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
ｍは、０～４の整数である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｍが０であり、Ｒ1存在せずに無置換のベンゼン環である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｍが０であり、Ｒ1存在せずに無置換のベンゼン環である。
式（１）において、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ2及びＲ3がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ2又はＲ3が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ2及びＲ3がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ2及びＲ3がともにフッ素原子であるか、塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ2及びＲ3がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ2又はＲ3が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ2及びＲ3がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ2及びＲ3がともにフッ素原子であるか、塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し、Ｒ2及びＲ3について説明したものと同様である。Ｒ4及びＲ5が共に水素原子であることが好ましい。
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示す。Ｒ6のアルキル基としては、メチル基、エチル基が好ましい。Ｒ6のフッ化アルキル基としては、－ＣＨ2－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＦ3が好ましい。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ6は、－ＣＨ2－ＣＦ3である。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ6は、－ＣＨ2－ＣＦ3である。
式（１）において、Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ7及びＲ8がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ7及びＲ8が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ7又はＲ8が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ7又はＲ8がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
Ｒ7又はＲ8がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
また、後述するＸが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在しない。
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され、好ましくは、水素原子である。
ｓは、１の整数である。
Ｒ10は、存在する場合、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。
一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
ｔは、０～４の整数である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｔが０であり、Ｒ10は存在せずに無置換のベンゼン環である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｔが０であり、Ｒ10は存在せずに無置換のベンゼン環である。
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示す。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは酸素原子である。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは酸素原子である。
ｎは、１～３の整数であり、好ましくは、ｎは１である。
式（１）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができる。
塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。
式（１）で表される化合物は、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。
化合物（１）は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができる。
塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。
式（１）で表される化合物は、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。
化合物（１）は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。
化合物（１）は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
化合物（１）の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、化合物（１）を製造することができる。
化合物（１）は、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ分解されて蛍光増強を示すことが明らかとなっている（試験例１、試験例２参照）。化合物（１）の一例である「ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ」（合成例１参照）のノイラミニダーゼによる酵素加水分解のスキームを図１に示す。
したがって、化合物（１）は、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼを、バクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための蛍光プローブとして利用できる。
本発明は、化合物（１）を含む、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬をも提供するものである。この試薬は、乾燥された化合物（１）あるいは適当な緩衝液に溶解された化合物（１）であってよい。なお、緩衝液には後述のものを適宜用いることができる。
したがって、化合物（１）は、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼを、バクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための蛍光プローブとして利用できる。
本発明は、化合物（１）を含む、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬をも提供するものである。この試薬は、乾燥された化合物（１）あるいは適当な緩衝液に溶解された化合物（１）であってよい。なお、緩衝液には後述のものを適宜用いることができる。
生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合は、同一又は異なる水溶性溶媒に溶解され生物試料、プローブ１及びプローブ２のそれぞれの溶液を混合することによって行うことができる。あるいは、同一の水溶性溶媒に生物試料、プローブ１及びプローブ２を溶解することにより混合してもよい。
［親水性溶媒］
親水性溶媒には、酵素の反応溶液として従来用いられているものであれば特に限定されず、例えば、水、あるいは、水に酵素反応の最適化のために必要な濃度で緩衝物質を添加したバッファー溶液が用いられる。
［親水性溶媒］
親水性溶媒には、酵素の反応溶液として従来用いられているものであれば特に限定されず、例えば、水、あるいは、水に酵素反応の最適化のために必要な濃度で緩衝物質を添加したバッファー溶液が用いられる。
緩衝物質としては、特に限定されないが、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等のいわゆるグッドバッファー（Good's Buffer）や、Ｔｒｉｓ（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）、ＤＥＡ（Diethanolamine）等が用いられ得る。
生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液は、酵素反応のために必要に応じてインキュベートされる。インキュベーションは、例えば、室温－３７℃で、数分－数十分程度である。
１－２．手順２（信号の検出手順）
プローブ１及びプローブ２から生成する信号は、イメージセンサ、分光光度計、旋光計、分光蛍光光度計及び蛍光顕微鏡等の従来公知の機器を用いて検出し、数値化することができる。生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液（以下、「サンプル液」とも称する）を機器にロードし、機器の操作手順書に従って測定を行えばよい。
プローブ１及びプローブ２から生成する信号は、イメージセンサ、分光光度計、旋光計、分光蛍光光度計及び蛍光顕微鏡等の従来公知の機器を用いて検出し、数値化することができる。生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液（以下、「サンプル液」とも称する）を機器にロードし、機器の操作手順書に従って測定を行えばよい。
プローブ１は、インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ及びバクテリア由来ノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ１からの信号強度をＳ１とする。
一方、プローブ２は、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ２からの信号強度をＳ２とする。
一方、プローブ２は、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ２からの信号強度をＳ２とする。
サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがバクテリア由来である場合（対象が非感染の場合）、プローブ１及びプローブ２の双方から信号が生成する。
一方、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）、プローブ１からは信号が生成するが、プローブ２から生成する信号は理論的には０であり、プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）により生成する信号を考慮しても十分に小さい。
したがって、Ｓ２に対するＳ１の比（Ｓ１／Ｓ２）は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が非感染の場合）に比べて、サンプル液中にインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が感染の場合）では、より大きくなる。
すなわち、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）が所定値（閾値）以上であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在する（対象がインフルエンザウイルスに感染している）と検出できる。
一方、比（Ｓ１／Ｓ２）が閾値未満であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在しない（対象がインフルエンザウイルスに感染していない）と検出できる。
これにより、生物試料中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来のものであるかバクテリア由来のものであるかを明確に区別して、バクテリア由来ノイラミニダーゼに起因する信号を擬陽性として検出することなく、インフルエンザウイルスを高確度に検出することができる。
一方、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）、プローブ１からは信号が生成するが、プローブ２から生成する信号は理論的には０であり、プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）により生成する信号を考慮しても十分に小さい。
したがって、Ｓ２に対するＳ１の比（Ｓ１／Ｓ２）は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が非感染の場合）に比べて、サンプル液中にインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が感染の場合）では、より大きくなる。
すなわち、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）が所定値（閾値）以上であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在する（対象がインフルエンザウイルスに感染している）と検出できる。
一方、比（Ｓ１／Ｓ２）が閾値未満であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在しない（対象がインフルエンザウイルスに感染していない）と検出できる。
これにより、生物試料中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来のものであるかバクテリア由来のものであるかを明確に区別して、バクテリア由来ノイラミニダーゼに起因する信号を擬陽性として検出することなく、インフルエンザウイルスを高確度に検出することができる。
閾値は、プローブ１及びプローブ２として用いられる化合物、それらの光学特性、及び生物試料中に存在しえるバクテリアの種類などに応じて適宜設定されえる。例えば、閾値は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合の比（Ｓ１／Ｓ２）の1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍以上に設定できる。
プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）が生じないあるいは無視可能な程度である場合、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）に、プローブ２から生成する信号は０である。この場合には、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）によらずに、インフルエンザウイルスの検出を行うこともできる。
すなわち、プローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、サンプル液中のインフルエンザウイルスの存在（対象のインフルエンザ感染）を検出し、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、サンプル液中のインフルエンザウイルスの不存在（対象のインフルエンザウイルス非感染）を検出することができる。
すなわち、プローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、サンプル液中のインフルエンザウイルスの存在（対象のインフルエンザ感染）を検出し、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、サンプル液中のインフルエンザウイルスの不存在（対象のインフルエンザウイルス非感染）を検出することができる。
１－２－１．デジタル法に基づく検出１
手順２にデジタル法を適用した実施形態を説明する。
デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。
手順２にデジタル法を適用した実施形態を説明する。
デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。
本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ａ１～２Ａ３を含む。
手順２Ａ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ａ２：前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順と、
手順２Ａ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する手順。
手順２Ａ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ａ２：前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順と、
手順２Ａ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する手順。
１－２－１－１．導入手順２Ａ１
図２Ａを参照して導入手順２Ａ１を説明する。
アレイ１０１は、下層部１１１と上層部１２１が空間１３１を隔てて対向して配置されており、空間１３１を流体流路とするフローセル構造を有している。
下層部１１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部１１４が複数形成されている。収容部１１４は、疎水性の上面を有する隔壁１１３によって互いに隔てられている。
また、上層部１２１は、空間１３１を隔てて、下層部１１１における収容部１１４が形成されている面に対向している。
図２Ａを参照して導入手順２Ａ１を説明する。
アレイ１０１は、下層部１１１と上層部１２１が空間１３１を隔てて対向して配置されており、空間１３１を流体流路とするフローセル構造を有している。
下層部１１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部１１４が複数形成されている。収容部１１４は、疎水性の上面を有する隔壁１１３によって互いに隔てられている。
また、上層部１２１は、空間１３１を隔てて、下層部１１１における収容部１１４が形成されている面に対向している。
本手順では、空間１３１にサンプル液４を導入する。サンプル液４には、プローブ１とプローブ２が含まれる。また、サンプル液４には、インフルエンザウイルス又はバクテリア３が含まれえる。サンプル液４は、例えば上層部１２１及び下層部１１１の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から空間１３１内に導入することができる。空間１３１内に導入されたサンプル液４は、毛細管現象に従って空間１３１を通流し、空間１３１内に充填される。
［界面活性剤］
サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、サンプル液４が、空間１３１内及び収容部１１４内へ導入され易くなる傾向がある。
サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、サンプル液４が、空間１３１内及び収容部１１４内へ導入され易くなる傾向がある。
界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばＴＷＥＥＮ２０（ＣＡＳ番号：9005-64-5、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＣＡＳ番号：9002-93-1、一般名ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（n≒10））などが挙げられる。サンプル液４への界面活性剤の添加濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１～１％である。
さらに、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、天然由来の界面活性剤などを広く用いることができる。
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸型、硫酸エステル型、スルホン酸型、リン酸エステル型に分類される。このうち、具体的には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、α-スルホ脂肪酸メチルエステルナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルエトキシレート硫酸ナトリウムなどが挙げられ、中でも、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いることが好ましい。
陽イオン性界面活性剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩型、アルキルアミン型、複素環アミン型に分類される。具体的には、例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、セチルトリピリジニウムクロライド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシド、N-メチルアルキルグルカミドなどが挙げられる。中でも、ドデシルアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、ラウロイルジエタノールアマイドの他、Triton X（Triton X-100など）、Pluronic（登録商標）（Pluronic F-123、F-68など）、Tween (Tween 20、40、60、65、80、85など)、Brij（登録商標）（Brij 35、58、98など）、Span (Span 20、40、60、80、83、85)の名前で市販されているものが好ましい。
両性界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ドデシルアミノメチルジメチルスルホプロピルベタイン、3-(テトラデシルジメチルアミニオ)プロパン-1-スルホナートなどがあるが、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）などを用いることが好ましい。
天然由来の界面活性剤としては、例えば、レシチン、サポニンが好ましく、レシチンとして称される化合物のうち、具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールなどが好ましい。また、サポニンとしてはキラヤサポニンが好ましい。
本手順により、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３が収容部１１４に導入される。サンプル液４においてインフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部１１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となり得る。サンプル液４においてインフルエンザウイルス又はバクテリアの濃度がより高い場合には、１つの収容部１１４には２以上のウイルス２が導入されえる。
１－２－１－２．封入手順２Ａ２
図２Ｂを参照して封入手順２Ａ２を説明する。本手順では、下層部１１１と上層部１２１との間の空間１３１に疎水性溶媒５を導入する。
図２Ｂを参照して封入手順２Ａ２を説明する。本手順では、下層部１１１と上層部１２１との間の空間１３１に疎水性溶媒５を導入する。
疎水性溶媒５は、サンプル液４と混ざり合いにくい溶媒（非混和性の溶媒）であればよく、親水性溶媒であるサンプル液４に対して疎水性溶媒が好適に用いられる。
疎水性溶媒５として、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。パーフルオロカーボンとしては、例えばフロリナート（登録商標）ＦＣ４０（SIGMA社製）等が挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、例えばクロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン等が挙げられる。疎水性イオン液体とは少なくとも水中では解離しないイオン液体をさし、例えば１―Ｂｕｔｙｌ―３―ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ
Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ等が挙げられる。イオン液体とは、室温において液体で存在する塩をさす。
疎水性溶媒５として、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。パーフルオロカーボンとしては、例えばフロリナート（登録商標）ＦＣ４０（SIGMA社製）等が挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、例えばクロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン等が挙げられる。疎水性イオン液体とは少なくとも水中では解離しないイオン液体をさし、例えば１―Ｂｕｔｙｌ―３―ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ
Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ等が挙げられる。イオン液体とは、室温において液体で存在する塩をさす。
疎水性溶媒５も、サンプル液４と同様に、上層部１２１及び下層部１１１の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から空間１３１内に導入すればよい。空間１３１内に導入された疎水性溶媒５は、毛細管現象に従って空間１３１を通流し、空間１３１内のサンプル液４と置換する。置換されたサンプル液４は、空間１３１外に排出される。これにより、収容部１１４内に、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴が形成される。
この液滴の容積（収容部１１４の容積にほぼ等しい）は、極小であってよく、例えば１０ａＬ～１００ｎＬ、好ましくは１ｆＬ～１ｐＬとされる。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
［脱気］
導入手順２Ａ１と封入手順２Ａ２との間に、空間１３１内の脱気を行ってもよい。脱気方法としては、例えば、アレイ１０１を減圧環境下において放置する方法、あるいはアレイ１０１を冷却する方法等を好適に用いることができる。具体的には、約０．１気圧の減圧デシケータ内にアレイ１０１を約３０秒放置する方法などである。
導入手順２Ａ１と封入手順２Ａ２との間に、空間１３１内の脱気を行ってもよい。脱気方法としては、例えば、アレイ１０１を減圧環境下において放置する方法、あるいはアレイ１０１を冷却する方法等を好適に用いることができる。具体的には、約０．１気圧の減圧デシケータ内にアレイ１０１を約３０秒放置する方法などである。
本発明において、脱気手順は必須ではないが、脱気を行なうことにより、収容部１１４内の空気が除去され、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を収容部１１４内に効率よく導入できる。
１－２－１－３．検出手順２Ａ３
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
上述の通り、サンプル液４において、インフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部１１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となるので、収容部１１４にはインフルエンザウイルス及びバクテリアのどちらか一方が封入された液滴が形成される。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合（図２Ｃ左図参照）に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合（図２Ｃ右図参照）には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
プローブ１に４ＭＵ－ＮＡＮＡを、プローブ２に化合物（１）としてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを用いたデジタル法において、インフルエンザウイルスが封入された液滴から生じた４－メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光をCCDカメラにより検出したイメージの一例を図２Ｄ左図に示す。検出領域に信号陽性の液滴が２つ確認できる。インフルエンザウイルスが存在する液滴から４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）が検出されている。液滴にバクリテリアが存在する場合には、４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）とＨＭＲｅｆが発する緑色蛍光（波長：518ｎｍ）が検出される。図２Ｄ右図は、信号陽性の液滴が存在しない領域を撮像したイメージの一例である。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合（図２Ｃ左図参照）に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合（図２Ｃ右図参照）には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
プローブ１に４ＭＵ－ＮＡＮＡを、プローブ２に化合物（１）としてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを用いたデジタル法において、インフルエンザウイルスが封入された液滴から生じた４－メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光をCCDカメラにより検出したイメージの一例を図２Ｄ左図に示す。検出領域に信号陽性の液滴が２つ確認できる。インフルエンザウイルスが存在する液滴から４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）が検出されている。液滴にバクリテリアが存在する場合には、４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）とＨＭＲｅｆが発する緑色蛍光（波長：518ｎｍ）が検出される。図２Ｄ右図は、信号陽性の液滴が存在しない領域を撮像したイメージの一例である。
インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４の数と、インフルエンザウイルスが検出されない収容部１１４の数との比率を用いて、予め作成した当該比率とウイルス粒子数との関係を規定した標準曲線に基づいて、インフルエンザウイルス量を定量的に決定することもできる（デジタル定量）。
なお、インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４が１つでも存在すれば、被検試料についてインフルエンザ陽性と判定してよい。このような判定方法は、検体中のインフルエンザウイルスの数が極めて少ない感染初期の場合にインフルエンザの罹患の有無を判定するため有用である。
なお、インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４が１つでも存在すれば、被検試料についてインフルエンザ陽性と判定してよい。このような判定方法は、検体中のインフルエンザウイルスの数が極めて少ない感染初期の場合にインフルエンザの罹患の有無を判定するため有用である。
１－２－２．デジタル法に基づく検出２
手順２にデジタル法を適用した他の実施形態を説明する。
本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ｂ１～２Ｂ３を含む。
手順２Ｂ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている基板上に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ｂ２：サンプル液よりも比重が大きい疎水性溶媒をサンプル液層の上に積層するようにして導入し、サンプル液層と疎水性溶媒層との層置換を生じさせることにより、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順。
手順２Ｂ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する検出手順。
手順２にデジタル法を適用した他の実施形態を説明する。
本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ｂ１～２Ｂ３を含む。
手順２Ｂ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている基板上に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ｂ２：サンプル液よりも比重が大きい疎水性溶媒をサンプル液層の上に積層するようにして導入し、サンプル液層と疎水性溶媒層との層置換を生じさせることにより、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順。
手順２Ｂ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する検出手順。
１－２－２－１．導入手順２Ｂ１
図３－１～図３－３を参照して導入手順２Ｂ１を説明する。図は、アレイ２０１の側方断面図である。
アレイ２０１は、下層部２１１を含んでなる。アレイ２０１は、下層部２１１と側壁２２１，２２１によって下方及び両側方を区画されておりかつ上方が開放されている領域２１を有する。すなわち、下層部２１１と側壁２２１，２２１は、上方に開口を有する開口ウェルを形成している。当該開口ウェル内の空間を、図中、領域２１として示す。
下層部２１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部２１４が複数形成されている。収容部２１４は、疎水性の上面を有する隔壁２１３によって互いに隔てられている。下層部２１１は、それに対向する面を有さない。
図３－１～図３－３を参照して導入手順２Ｂ１を説明する。図は、アレイ２０１の側方断面図である。
アレイ２０１は、下層部２１１を含んでなる。アレイ２０１は、下層部２１１と側壁２２１，２２１によって下方及び両側方を区画されておりかつ上方が開放されている領域２１を有する。すなわち、下層部２１１と側壁２２１，２２１は、上方に開口を有する開口ウェルを形成している。当該開口ウェル内の空間を、図中、領域２１として示す。
下層部２１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部２１４が複数形成されている。収容部２１４は、疎水性の上面を有する隔壁２１３によって互いに隔てられている。下層部２１１は、それに対向する面を有さない。
本手順では、下層部２１１上にサンプル液４を導入する。サンプル液４には、プローブ１とプローブ２が含まれる。また、サンプル液４には、インフルエンザウイルス又はバクテリア３が含まれえる。サンプル液は、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。
サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、次に説明する封入手順における、サンプル液４と疎水性溶媒との置換を促進できる。界面活性剤には、上述のものを用いることができる。
１－２－２－２．封入手順２Ｂ２
図３－１～図３－３Ｂ－Ｈを参照して封入手順２Ｂ２を説明する。本手順では、疎水性溶媒５をサンプル液４の層の上に積層するようにして導入する。
疎水性溶媒５の導入方法としては、特に限定されないが、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。この際、疎水性溶媒５は、図３－１Ｂに示すように、サンプル液４の層上に疎水性溶媒５の層が積層されるようにして導入することが好ましい。
図３－１～図３－３Ｂ－Ｈを参照して封入手順２Ｂ２を説明する。本手順では、疎水性溶媒５をサンプル液４の層の上に積層するようにして導入する。
疎水性溶媒５の導入方法としては、特に限定されないが、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。この際、疎水性溶媒５は、図３－１Ｂに示すように、サンプル液４の層上に疎水性溶媒５の層が積層されるようにして導入することが好ましい。
疎水性溶媒５には、サンプル液４よりも比重が大きい溶媒が用いられる。また、疎水性溶媒５には、サンプル液４と層置換をしえる程度に相互に親媒性を有するものであることが好ましいが、互いに相溶しないことが必要である。サンプル液４と疎水性溶媒５との間の親媒性が低すぎると、サンプル液４と疎水性溶媒５との層置換が生じない。また、サンプル液４と疎水性溶媒５とが互いに相溶する場合には、サンプル液４と疎水性溶媒５とが層分離せず、積層状態が生じない。このような疎水性溶媒として、上述のものを用いることができる。「表１」に例示的な疎水性溶媒５の比重を挙げる。
疎水性溶媒５は、サンプル液４と同様に、層置換を促進するために界面活性剤を含んでいてもよい。
疎水性溶媒５は、サンプル液４と同様に、層置換を促進するために界面活性剤を含んでいてもよい。
サンプル液４上に導入され積層された疎水性溶媒５は、サンプル液４よりも比重が大きいため、サンプル液４の下方に移動する。すなわち、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが置換されて、上層が疎水性溶媒５で下層がサンプル液４となった状態（図３－１Ｂ参照）から上層がサンプル液４で下層が疎水性溶媒５となった状態（図３－３Ｈ参照）となる。層置換を生じる様子を図３－１Ｃ～図３－３Ｇに模式的に示す。この層置換において、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３が、サンプル液４の下方へ移動していく疎水性溶媒５によって押し込まれるようにして収容部２１４の各々に収容されていく（図３－２Ｄ～Ｆ参照）。その結果、収容部２１４内に、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴が形成される。
この液滴の容積（収容部２１４の容積にほぼ等しい）は、極小であってよく、例えば１０ａＬ～１００ｎＬ、好ましくは１ｆＬ～１ｐＬとされる。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
１－２－２－３．検出手順２Ｂ３
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
上述の通り、サンプル液４において、インフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部２１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となるので、収容部２１４にはインフルエンザウイルス及びバクテリアのどちらか一方が封入された液滴が形成される。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
インフルエンザウイルスが検出された収容部２１４の数と、インフルエンザウイルスが検出されない収容部２１４の数との比率を用いて、予め作成した当該比率とウイルス粒子数との関係を規定した標準曲線に基づいて、インフルエンザウイルス量を定量的に決定することもできる（デジタル定量）。
２．インフルエンザウイルスの検出キット及びインフルエンザ感染の診断キット
本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットである。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、対象におけるインフルエンザ感染の有無の診断に用いられる。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、上述のプローブ１及びプローブ２を含んでなるものであり、これらに加えて任意に上述した疎水性溶媒、及び、アレイ１０１又はアレイ２０１を含んでいてよい。これらのキット構成要素（コンポーネント）は、ひとまとまりで販売されるものであってよく、それぞれ単独で販売されるものであってもよい。
本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットである。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、対象におけるインフルエンザ感染の有無の診断に用いられる。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、上述のプローブ１及びプローブ２を含んでなるものであり、これらに加えて任意に上述した疎水性溶媒、及び、アレイ１０１又はアレイ２０１を含んでいてよい。これらのキット構成要素（コンポーネント）は、ひとまとまりで販売されるものであってよく、それぞれ単独で販売されるものであってもよい。
プローブ１、プローブ２及び疎水性溶媒については上述のとおりである。アレイ１０１及びアレイ２０１について、以下により詳しい構造を説明する。
アレイ１０１及びアレイ２０１の作製のためのフォトリソグラフィー、エッチング、基板積層などの技術は、汎用のマイクロチップやアレイを作成するための技術を適用できる。
アレイ１０１及びアレイ２０１の作製のためのフォトリソグラフィー、エッチング、基板積層などの技術は、汎用のマイクロチップやアレイを作成するための技術を適用できる。
［アレイ１０１］
上層部１２１の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
上層部１２１の厚みは、特に限定されない。
上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）は、疎水性であることが好ましい。「疎水性」とは、ここでは「親油性」と同じ意味で用いられ、疎水性溶媒との親和性が親水性溶媒との親和性よりも高いことをいう。
上層部１２１の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
上層部１２１の厚みは、特に限定されない。
上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）は、疎水性であることが好ましい。「疎水性」とは、ここでは「親油性」と同じ意味で用いられ、疎水性溶媒との親和性が親水性溶媒との親和性よりも高いことをいう。
下層部１１１において、収容部１１４は、板状部材１１２上に形成された隔壁１１３によって互いに隔てられている。収容部１１４の底面は、板状部材１１２の表面であってよい。
板状部材１１２の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
板状部材１１２の厚みは、特に限定されない。
板状部材１１２の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
板状部材１１２の厚みは、特に限定されない。
隔壁１１３は、板状部材１１２の表面に形成した樹脂層により形成でき、例えば撥水性の樹脂又はフッ素系高分子樹脂等のエッチングにより形成できる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂は、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が低いという理由で、好ましく用いられる。
上記アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択した少なくとも１つを好適に用いることができる。中でも、微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が最も好ましい。
上記アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択した少なくとも１つを好適に用いることができる。中でも、微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が最も好ましい。
収容部１１４の形状は、特に限定されず、例えば円柱形状及び角柱形状等であってよい。
収容部１１４の大きさは、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能であれば特に限定されないが、水平方向の幅及び垂直方向の高さ（隔壁１１３の高さ）は、それぞれ、例えば１００ｎｍ－１００μｍ、２００ｎｍ－９０μｍ、３００ｎｍ－８０μｍ、４００ｎｍ－７０μｍ、５００ｎｍ－６０μｍ、６００ｎｍ－５０μｍ、７００ｎｍ－４０μｍ、８００ｎｍ－３０μｍ、９００ｎｍ－２０μｍ、１０００ｎｍ－１０μｍ、２μｍ－９μｍ、３μｍ－８μｍの範囲である。
収容部１１４は、例えば１００万個以上が高密度に配置されていてよい。このような超高密度アレイであっても、先に説明した封入手順によれば、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴を各収容部１１４に効率よく形成できる。
収容部１１４の大きさは、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能であれば特に限定されないが、水平方向の幅及び垂直方向の高さ（隔壁１１３の高さ）は、それぞれ、例えば１００ｎｍ－１００μｍ、２００ｎｍ－９０μｍ、３００ｎｍ－８０μｍ、４００ｎｍ－７０μｍ、５００ｎｍ－６０μｍ、６００ｎｍ－５０μｍ、７００ｎｍ－４０μｍ、８００ｎｍ－３０μｍ、９００ｎｍ－２０μｍ、１０００ｎｍ－１０μｍ、２μｍ－９μｍ、３μｍ－８μｍの範囲である。
収容部１１４は、例えば１００万個以上が高密度に配置されていてよい。このような超高密度アレイであっても、先に説明した封入手順によれば、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴を各収容部１１４に効率よく形成できる。
隔壁１１３の上面（上層部１２１と対向する面）は、疎水性とされることが好ましい。また、収容部１１４の底面を形成する板状部材１１２の表面は親水性であることが好ましい。「親水性」とは、親水性溶媒との親和性が疎水性溶媒との親和性よりも高い表面を指す。
収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面及び上層部１２１の下面が疎水性であることにより、導入手順２Ａ１において、サンプル液４を円滑に収容部１１４内に導入することができる。また、収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ａ２において疎水性溶媒５が収容部１１４内に入り込むことを防止できる。
なお、隔壁１１３は、その上面が疎水性であればよく、その側面（収容部１１４に臨む面）は、疎水性であっても親水性であってもよい。
収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面及び上層部１２１の下面が疎水性であることにより、導入手順２Ａ１において、サンプル液４を円滑に収容部１１４内に導入することができる。また、収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ａ２において疎水性溶媒５が収容部１１４内に入り込むことを防止できる。
なお、隔壁１１３は、その上面が疎水性であればよく、その側面（収容部１１４に臨む面）は、疎水性であっても親水性であってもよい。
上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）と隔壁１１３の上面（上層部１２１と対向する面）との間の距離（空間１３１の高さ）は、毛細管現象に従って液体を空間１３１内に通流させえる程度に小さくされる。空間１３１の高さは、例えば０．１μｍ－５ｍｍ、０．５μｍ－４ｍｍ、１μｍ－３ｍｍ、２μｍ－２ｍｍ、５μｍ－１ｍｍ、１０μｍ－５００μｍ、２０μｍ－４００μｍ、３０μｍ－３００μｍ、４０μｍ－２００μｍ、５０μｍ－１００μｍの範囲である。高さが０．１μｍ未満では、空間１３１内に液体を通流させるのに要する送液圧が高くなりすぎる可能性がある。
［アレイ２０１］
アレイ２０１の下層部２１１は、アレイ１０１の下層部１１１と同様の構成であってよく、下層部２１１を構成する板状部材２１２及び隔壁２１３も、アレイ１０１の板状部材１１２及び隔壁１１３と同様の構成であってよい。
また、収容部２１４も、アレイ１０１の収容部１１４と同様の構成であってよい。
アレイ２０１の下層部２１１は、アレイ１０１の下層部１１１と同様の構成であってよく、下層部２１１を構成する板状部材２１２及び隔壁２１３も、アレイ１０１の板状部材１１２及び隔壁１１３と同様の構成であってよい。
また、収容部２１４も、アレイ１０１の収容部１１４と同様の構成であってよい。
側壁２２１は、板状部材２１２と同様の材質であって、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等からなる部材の表面であってよい。
側壁２２１の高さは、任意であるが、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが積層された状態での合計の厚みを上回る必要がある。
側壁２２１の高さは、任意であるが、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが積層された状態での合計の厚みを上回る必要がある。
収容部２１４の底面が親水性であり、かつ隔壁２１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ｂ２において疎水性溶媒５が収容部２１４内に入り込むことを防止できる。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［合成例１：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成］
以下の反応スキームの手順に従って化合物３を合成した。次に、化合物３を用いてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
以下の反応スキームの手順に従って化合物３を合成した。次に、化合物３を用いてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
［原料］
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入し、追加的な精製を行うことなく使用した。
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入し、追加的な精製を行うことなく使用した。
［測定機器］
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ（４００ＭＨｚ）、１３Ｃ（１０１ＭＨｚ）］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、ｍｉｃｒｏＯＴＯＦ ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ）で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８７ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＵＶＩＤＥＣ－１００－Ｖ検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、６３～２１０μｍ；関東化学株式会社製）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ（４００ＭＨｚ）、１３Ｃ（１０１ＭＨｚ）］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、ｍｉｃｒｏＯＴＯＦ ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ）で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８７ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＵＶＩＤＥＣ－１００－Ｖ検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、６３～２１０μｍ；関東化学株式会社製）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
（１）化合物１の合成
４－ヒドロキシベンズアルデヒド（Ｓ、４７９ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）の溶液に、Ｎ－アセチル－２－クロロ－２－デオイズノイラミン酸メチルエステル４，７，８，９－テトラアセテート３（０．５ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液に加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。この後、すべての溶媒を除去し、トルエン（×３）で希釈した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ、１：１～ＥｔＯＡｃ）を用いて精製して、化合物１を白色泡状物として得た（１４５ｍｇ、６２％）。
４－ヒドロキシベンズアルデヒド（Ｓ、４７９ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）の溶液に、Ｎ－アセチル－２－クロロ－２－デオイズノイラミン酸メチルエステル４，７，８，９－テトラアセテート３（０．５ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液に加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。この後、すべての溶媒を除去し、トルエン（×３）で希釈した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ、１：１～ＥｔＯＡｃ）を用いて精製して、化合物１を白色泡状物として得た（１４５ｍｇ、６２％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.93 (s, 3H, NHOAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.30 (t, 1H, 3JHH = 12.5 Hz, H3ax), 2.74 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.65 (s, 3H, COOMe), 4.11 (m, 1H, H9), 4.13 (m, 1H, H5), 4.25 (dd, 1H, 3JHH = 12.4, 2.4 Hz, H9'), 4.60 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.98 (td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 HZ, H4), 5.23 (d, 1H, 3JHH = 10 Hz, H7), 5.35 (m, 1H, NH), 5.37 (m, 1H, H8), 7.18 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.83 (d, 2H, 3JHH = 8.8 Hz, Ar), 9.93 (s, 1H, CHO). 13C NMR (101 MHz, CDCl3):δ 20.7, 20.7, 20.8, 21.0, 23.2, 38.7, 49.5, 53.2, 62.0, 67.1, 68.4, 68.7, 73.6,
99.5, 118.9, 131.7, 132.0, 158.9, 168.2, 169.9, 170.1, 170.2, 170.6, 170.9, 190.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 618.17933, found 618.18094 (-1.6 mDa) for C27H34NaNO14.
99.5, 118.9, 131.7, 132.0, 158.9, 168.2, 169.9, 170.1, 170.2, 170.6, 170.9, 190.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 618.17933, found 618.18094 (-1.6 mDa) for C27H34NaNO14.
（２）化合物２の合成
化合物１（２４７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃でＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）3（０．８３ｍＬの１．０Ｍ ＴＨＦ溶液）を加えた。０℃で１時間撹拌した後、飽和ＮＨ4Ｃｌ（ａｑ）（５ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を混合物に加え、室温でさらに１時間撹拌した。これにロッシェル塩（水性）（１０ｍＬ）の飽和溶液を加え、粗生成物をＣＨＣｌ3（×３）で抽出したのち、有機層を減圧残去した。次いで残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ １：９９から５：９５）を用いて精製して、化合物２を白色泡状物として得た（１５６ｍｇ、６３％）。
化合物１（２４７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃でＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）3（０．８３ｍＬの１．０Ｍ ＴＨＦ溶液）を加えた。０℃で１時間撹拌した後、飽和ＮＨ4Ｃｌ（ａｑ）（５ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を混合物に加え、室温でさらに１時間撹拌した。これにロッシェル塩（水性）（１０ｍＬ）の飽和溶液を加え、粗生成物をＣＨＣｌ3（×３）で抽出したのち、有機層を減圧残去した。次いで残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ １：９９から５：９５）を用いて精製して、化合物２を白色泡状物として得た（１５６ｍｇ、６３％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.90 (s, 3H, NHOAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 2.13 (s, 3H, OAc), 2.21 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax), 2.72 (dd, 1H, 3JHH = 12.9, 4.6 Hz, H3eq), 3.68 (s, 3H, COOMe), 4.10 (m, 1H, H5),
4.14 (d, 1H, 3JHH = 5 Hz, H9), 4.28 (dd, 1H, 3JHH = 12.6, 2.6 Hz, H9'), 4.38 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.63 (s, 2H, CH2OH), 4.95 (td, 1H, 3JHH = 10.4,
4.6, 1.8 HZ, H4), 5.27 (m, 1H, NH), 5.35 (m, 2H, H7, H8), 7.03 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar), 7.27 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 20.7, 20.8, 20.8, 21.0, 23.2, 38.2, 49.5, 52.9, 62.1, 64.9, 67.4, 68.8, 69.4, 73.4, 99.9, 120.3, 128.3, 136.7, 153.1, 168.1, 170.0, 170.1, 170.3, 170.7, 170.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 620.19498, found 620.19672 (-1.7 mDa) C27H36NaNO14.
4.14 (d, 1H, 3JHH = 5 Hz, H9), 4.28 (dd, 1H, 3JHH = 12.6, 2.6 Hz, H9'), 4.38 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.63 (s, 2H, CH2OH), 4.95 (td, 1H, 3JHH = 10.4,
4.6, 1.8 HZ, H4), 5.27 (m, 1H, NH), 5.35 (m, 2H, H7, H8), 7.03 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar), 7.27 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 20.7, 20.8, 20.8, 21.0, 23.2, 38.2, 49.5, 52.9, 62.1, 64.9, 67.4, 68.8, 69.4, 73.4, 99.9, 120.3, 128.3, 136.7, 153.1, 168.1, 170.0, 170.1, 170.3, 170.7, 170.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 620.19498, found 620.19672 (-1.7 mDa) C27H36NaNO14.
（３）化合物３の合成
化合物２（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、三臭化リン（１２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に添加した。０℃で２時間撹拌後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（×３）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧残去して化合物３を白色泡状物（１３６ｍｇ、８２％）として得た。
化合物２（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、三臭化リン（１２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に添加した。０℃で２時間撹拌後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（×３）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧残去して化合物３を白色泡状物（１３６ｍｇ、８２％）として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.84 (s, 3H, NHOAc), 1.97 (s, 3H, OAc), 1.98 (s, 3H,
OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.15 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax),
2.63 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.58 (s, 3H, COOMe), 4.03 (m, 1H, H9), 4.10 (m, 1H, H5), 4.23 (m, 1H, H9'), 4.37 (m, 1H, H6), 4.40 (s, 2H, CH2Br), 4.89
(td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 Hz, H4), 5.29 (m, 3H, H7, H8, NH), 6.95 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.23 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 19.7, 19.8, 19.8, 20, 22.2, 32.3, 37.2, 48.4, 52.0, 70.0, 66.3, 67.7, 68.1, 72.4, 98.8, 118.7, 129.2, 132.1, 152.8, 167.1, 169.0, 169.1, 169.2, 169.6, 169.9.
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 682.11057, found 682.10666 (3.9 mDa) C27H34BrNNaO13.
OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.15 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax),
2.63 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.58 (s, 3H, COOMe), 4.03 (m, 1H, H9), 4.10 (m, 1H, H5), 4.23 (m, 1H, H9'), 4.37 (m, 1H, H6), 4.40 (s, 2H, CH2Br), 4.89
(td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 Hz, H4), 5.29 (m, 3H, H7, H8, NH), 6.95 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.23 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 19.7, 19.8, 19.8, 20, 22.2, 32.3, 37.2, 48.4, 52.0, 70.0, 66.3, 67.7, 68.1, 72.4, 98.8, 118.7, 129.2, 132.1, 152.8, 167.1, 169.0, 169.1, 169.2, 169.6, 169.9.
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 682.11057, found 682.10666 (3.9 mDa) C27H34BrNNaO13.
（４）ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成
以下の反応スキームの手順に従って、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
以下の反応スキームの手順に従って、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
ＨＭＲｅｆ（７９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）に乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）および乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）を添加し、この混合物をアルゴン気下で０℃で撹拌した。化合物３（１３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。この後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加え、この混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液（×２）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧留去した。残渣をＭｅＯＨ（６ｍＬ）に溶解し、１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）を加えた（３ｍＬ）。混合物を室温で５時間撹拌し、その後、有機溶媒を蒸発させた。残留水溶液を２ＭのＨＣｌで中和し、次いで凍結乾燥させた。次いで、残留物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ、１：４溶液に溶解し、濾過して不溶性塩を除去した。この溶液を減圧留去させ、残渣をＨＰＬＣ（Ａ液：１００ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液、Ｂ液：ＣＨ3ＣＮ ９９％、Ｈ2Ｏ １％。Ａ／Ｂ＝９０／１０で５分間、その後１５分で１０／９０に勾配をかけ、次いで１０／９０で１５分間）で精製し、凍結乾燥後に橙色の粉末（２ステップで３６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.04 (t, 26H, TEAA), 1.84 (1H, t, 3JHH = 11.9 Hz, H3ax), 1.90 (s, 3H, TEAA), 2.02 (s, 3H, NHCOCH3), 2.55 (q, 17 H, TEAA), 2.94 (dd, 1H, 3JHH = 12.2, 4.0 Hz, H3eq), 3.54 (dd, 1H, 3JHH = 9.0, 1.6 Hz, H7), 3.66 (dd, 1H, 3JHH = 11.3, 5.4 Hz, H9), 3.74 (m, 1H, H5), 3.77 (m, 1H, H4), 3.81 (m, 1H, H9'), 3.85 (m, 2H, NHCH2CF3), 3.86 (m, 1H, H8), 3.91 (m, 1H, H6), 5.01 (s, 2H, ArCH2O), 5.23 (s, 2H, ArCH2O), 6.45 (dd, 1H, 3JHH = 8.6, 4JHH = 2.4 Hz, Ar), 6.50 (d, 1H, 4JHH = 2.3 Hz, Ar), 6.65 (dd, 1H, 3JHH = 8.7, 4JHH = 2.6 Hz, Ar), 6.67 (d, 1H, 3JHH = 8.6, Ar), 6.78 (m, 1H, Ar), 6.79 (m, 1H, Ar), 6.82 (m, 1H, Ar), 7.24 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.30 (m, 1H, Ar), 7.31 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar),
7.39 (m, 1H, Ar), 7.43 (m, 1H, Ar). 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 11.2 (TEAA) 22.9, 24.4 (TEAA), 43.1, 45.8, 46.9 (TEAA), 54.3, 64.0, 69.3, 70.2, 72.6, 72.7, 73.1, 75.3, 85.5, 99.3, 104.0, 104.1, 109.7, 110.8, 114.7, 117.8, 118.1, 120.8, 121.9, 124.7, 124.8, 126.9 (q, CF3), 129.3, 129.4, 130.2, 130.2, 130.9, 140.3, 146.0, 150.3, 152.1, 153.0, 157.0, 173.6, 175.6, 180.7 (TEAA). HRMS (ESI+) L calcd for [M+Na]+ 797.75163; found 797.75043 (-1.2 mDa).
直線勾配（０ｍｉｎ、２０％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡａｑ． Ｔｏ １５ｍｉｎ，１００％ＣＨ3ＣＮ ０．１％ＴＦＡ ａｑ；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。５２０ｎｍでの蛍光を調べた。
7.39 (m, 1H, Ar), 7.43 (m, 1H, Ar). 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 11.2 (TEAA) 22.9, 24.4 (TEAA), 43.1, 45.8, 46.9 (TEAA), 54.3, 64.0, 69.3, 70.2, 72.6, 72.7, 73.1, 75.3, 85.5, 99.3, 104.0, 104.1, 109.7, 110.8, 114.7, 117.8, 118.1, 120.8, 121.9, 124.7, 124.8, 126.9 (q, CF3), 129.3, 129.4, 130.2, 130.2, 130.9, 140.3, 146.0, 150.3, 152.1, 153.0, 157.0, 173.6, 175.6, 180.7 (TEAA). HRMS (ESI+) L calcd for [M+Na]+ 797.75163; found 797.75043 (-1.2 mDa).
直線勾配（０ｍｉｎ、２０％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡａｑ． Ｔｏ １５ｍｉｎ，１００％ＣＨ3ＣＮ ０．１％ＴＦＡ ａｑ；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。５２０ｎｍでの蛍光を調べた。
［試験例１：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃのバクテリア由来ノイラミニダーゼとの反応性］
合成例１で得られたＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
合成例１で得られたＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
プローブ（ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、蛍光測定グレード、同仁化学研究所）に溶解してストック溶液を得た。さらに、ストック溶液を、プローブの最終濃度が１μＭになるように緩衝液（１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、２ｍＭ
ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して測定溶液を得た。
測定溶液の蛍光スペクトルを、日立Ｆ－７０００を用いて１秒ごとに測定した（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）。測定開始後６０秒後にアルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼ０．０１Ｕを、単独であるいは酵素阻害剤との組み合わせで添加した。測定時の温度は３７℃、酵素阻害剤（ＤＡＮＡ）の濃度は１００μＭとした。
ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して測定溶液を得た。
測定溶液の蛍光スペクトルを、日立Ｆ－７０００を用いて１秒ごとに測定した（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）。測定開始後６０秒後にアルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼ０．０１Ｕを、単独であるいは酵素阻害剤との組み合わせで添加した。測定時の温度は３７℃、酵素阻害剤（ＤＡＮＡ）の濃度は１００μＭとした。
結果を図４に示す。ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃは、バクテリア由来のノイラミニダーゼとの反応で１３０倍の蛍光増強を示した。
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のノイラミニダーゼを用いた場合にも同様の結果を得た。ウェルシュ菌は、ヒトに常在する菌であり、口腔を含む上部気道粘膜にも常在している。
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のノイラミニダーゼを用いた場合にも同様の結果を得た。ウェルシュ菌は、ヒトに常在する菌であり、口腔を含む上部気道粘膜にも常在している。
［試験例２：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃのインフルエンザ由来ノイラミニダーゼとの反応性］
ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、試験例１と同様にしてインフルエンザイウルス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、試験例１と同様にしてインフルエンザイウルス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
本試験例ではプローブにＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃに加えて４ＭＵ－ＮＡＮＡ（陽性コントロール）に用いた。プローブの測定溶液中の終濃度はＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ １００μＭ、４ＭＵ－ＮＡＮＡ １ｍＭとした。
測定溶液にインフルエンザウイルス（A/PR8 医科研II株）を５×１０7ＰＦＵ／ｍＬを添加し、蛍光スペクトルの測定を開始した（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４４８ｎｍ）。測定時の温度は２５℃とした。
測定溶液にインフルエンザウイルス（A/PR8 医科研II株）を５×１０7ＰＦＵ／ｍＬを添加し、蛍光スペクトルの測定を開始した（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４４８ｎｍ）。測定時の温度は２５℃とした。
結果を図５に示す。陽性コントロールの４ＭＵ－ＮＡＮＡは経時的な蛍光増強を示したが、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃでは蛍光強度の変化は全くみられなかった。本試験例及び試験例１の結果から、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃは、バクテリア由来のノイラミニダーゼに対しては反応性を有するが、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼに対しては反応性を有さないことが明らかとなった。
１：プローブ１、２：プローブ２、３：インフルエンザウイルス又はバクテリア、４：サンプル液、５：疎水性溶媒、１０１，２０１：アレイ、１１１，２１１：下層部、１１２，２１２：板状部材、１１３，２１３：隔壁、１１４，２１４：収容部、１２１：上層部、１３１：空間、２１：領域、２２１：側壁
Claims (9)
- 生物試料中のインフルエンザウイルスを検出する方法であって、
（１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、検出方法。 - 前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、請求項１記載の検出方法。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。） - 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチ
ルノイラミン酸（4MU-NANA）である、請求項１又は２記載の検出方法。 - 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、請求項１－３のいずれか一項に記載の検出方法。 - デジタル法に基づく、請求項１－４のいずれか一項に記載の検出方法。
- インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生
物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、
インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。） - 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチ
ルノイラミン酸（4MU-NANA）である、請求項６記載のキット。 - 以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩の、インフルエンザウイルスをバクテリ
アと識別検出するための使用。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。） - 対象のインフルエンザウイルスへの感染の有無の診断を補助するための方法であって、
（１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染が示され、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染が示される、方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019039299 | 2019-03-05 | ||
| JP2019039299 | 2019-03-05 | ||
| PCT/JP2020/009355 WO2020179858A1 (ja) | 2019-03-05 | 2020-03-05 | インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザウイルス感染の診断方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020179858A1 JPWO2020179858A1 (ja) | 2020-09-10 |
| JP7454861B2 true JP7454861B2 (ja) | 2024-03-25 |
Family
ID=72337162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021503642A Active JP7454861B2 (ja) | 2019-03-05 | 2020-03-05 | インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220145407A1 (ja) |
| EP (1) | EP3936618A4 (ja) |
| JP (1) | JP7454861B2 (ja) |
| CN (1) | CN113518828A (ja) |
| WO (1) | WO2020179858A1 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000501748A (ja) | 1996-09-25 | 2000-02-15 | オクラホマ メディカル リサーチ ファンデーション | ４，７―ジアルコキシ―ｎ―アセチルノイラミン酸誘導体、および臨床的サンプル中のインフルエンザａ型およびｂ型ウィルスの検出法 |
| JP2002541858A (ja) | 1999-04-16 | 2002-12-10 | ザイメテックス インコーポレイテッド | ウイルス由来の酵素および化学発光基質を用いるウイルス検出法 |
| JP2003511385A (ja) | 1999-10-05 | 2003-03-25 | アイベックス インク． | 細菌、ウイルス、原生動物および脊椎動物由来のシアリダーゼの発色基質、ならびにその製造法および使用法 |
| WO2018043733A1 (ja) | 2016-09-05 | 2018-03-08 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | 病原性微生物検出のための方法及びキット |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5663055A (en) * | 1989-12-29 | 1997-09-02 | Oklahoma Medical Research Foundation | Methods for diagnosing human influenza and 4-position modified chromogenic N-acetylneuraminic acid substrated for use therein |
| CA2314431A1 (en) * | 1997-12-18 | 1999-06-24 | Sepracor Inc. | Screening assays for the detection and diagnosis of influenza virus |
| JP2008275511A (ja) | 2007-05-01 | 2008-11-13 | Bl:Kk | インフルエンザウイルス抗原の免疫測定法及びそれに用いられる物 |
| US7893272B2 (en) * | 2007-05-15 | 2011-02-22 | Cellex, Inc. | Reagents and kits for detection of influenza virus and the like |
| JP5706088B2 (ja) | 2010-01-06 | 2015-04-22 | 大阪瓦斯株式会社 | インフルエンザウイルスの検知方法およびインフルエンザウイルスの検知装置 |
| JP7016136B2 (ja) * | 2016-09-05 | 2022-02-04 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | 病原性微生物検出のための方法及びキット |
-
2020
- 2020-03-05 JP JP2021503642A patent/JP7454861B2/ja active Active
- 2020-03-05 US US17/435,629 patent/US20220145407A1/en active Pending
- 2020-03-05 EP EP20767253.6A patent/EP3936618A4/en active Pending
- 2020-03-05 CN CN202080018816.0A patent/CN113518828A/zh active Pending
- 2020-03-05 WO PCT/JP2020/009355 patent/WO2020179858A1/ja unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000501748A (ja) | 1996-09-25 | 2000-02-15 | オクラホマ メディカル リサーチ ファンデーション | ４，７―ジアルコキシ―ｎ―アセチルノイラミン酸誘導体、および臨床的サンプル中のインフルエンザａ型およびｂ型ウィルスの検出法 |
| JP2002541858A (ja) | 1999-04-16 | 2002-12-10 | ザイメテックス インコーポレイテッド | ウイルス由来の酵素および化学発光基質を用いるウイルス検出法 |
| JP2003511385A (ja) | 1999-10-05 | 2003-03-25 | アイベックス インク． | 細菌、ウイルス、原生動物および脊椎動物由来のシアリダーゼの発色基質、ならびにその製造法および使用法 |
| WO2018043733A1 (ja) | 2016-09-05 | 2018-03-08 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | 病原性微生物検出のための方法及びキット |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LIU, D. et al.，Fluorescent sialic derivatives for the specific detection of influenza viruses，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，vol.29,no.126773，2019年08月11日，pp.1-5 |
| MIURA, K. et al.，Discovery of human Golgi b-galactosidase with no identified glycosidase using a QMC substrate design platform for exo-glycosidase，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2016年，vol.24，pp.1369-1375 |
| OBAYASHI,Y. et al.，A single-molecule digital enzyme assay using alkaline phosphatase with a cumarin-based fluorogenic substrate，Analyst，2015年，vol.140，pp.5065-5073 |
| RIVAS, C. et al.，A novel sialidase-activatable fluorescence probe with improved stability for the sensitive detection of sialidase，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2020年，vol.30, no.126860，pp.1-4 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2020179858A1 (ja) | 2020-09-10 |
| CN113518828A (zh) | 2021-10-19 |
| WO2020179858A1 (ja) | 2020-09-10 |
| EP3936618A1 (en) | 2022-01-12 |
| EP3936618A4 (en) | 2023-01-25 |
| US20220145407A1 (en) | 2022-05-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7016136B2 (ja) | 病原性微生物検出のための方法及びキット | |
| JP7274780B2 (ja) | 病原性微生物検出のための方法及びキット | |
| Culling et al. | A new histochemical method for the identification and visualization of both side chain acylated and nonacylated sialic acids. | |
| Kim et al. | Rhodamine hydrazone derivatives as Hg 2+ selective fluorescent and colorimetric chemosensors and their applications to bioimaging and microfluidic system | |
| JP5228190B2 (ja) | パーオキシナイトライト蛍光プローブ | |
| US20160047830A1 (en) | Lysophosphatidic acid detection | |
| FI63064C (fi) | Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet | |
| CN106459125B (zh) | 酶特异性的细胞内滞留性荧光化合物 | |
| Jan et al. | Metabolic labelling of cholesteryl glucosides in Helicobacter pylori reveals how the uptake of human lipids enhances bacterial virulence | |
| Vishwakarma et al. | New fluorescent probes reveal that flippase-mediated flip-flop of phosphatidylinositol across the endoplasmic reticulum membrane does not depend on the stereochemistry of the lipid | |
| JP7454861B2 (ja) | インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法 | |
| JP7329851B2 (ja) | 酵素反応生成物の検出方法 | |
| DK170467B1 (da) | 2-Alkyl-4-(3',5'-di(pseudo)halogen-phen-4'-on)-indonaphth-1-oler samt fremgangsmåde til deres fremstilling | |
| JP2011184374A (ja) | 新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法 | |
| US10732108B2 (en) | Fluorogenic water soluble hydrazine sensors | |
| US8513451B2 (en) | Fluorescent phospholipase A2 indicators | |
| WO2018159810A1 (ja) | アルカリフォスファターゼ検出用蛍光プローブ及びその使用 | |
| JP2007055956A (ja) | 蛍光標識試薬及び疎水場検出試薬としての新規キノリン化合物 | |
| Graßl et al. | Tuning the Polarity of Antibiotic‐Cy5 Conjugates Enables Highly Selective Labeling of Binding Sites | |
| WO2023167305A1 (ja) | 酵素活性の検出方法、及び当該方法に用いる蛍光プローブ | |
| JP5276981B2 (ja) | フルオロフォアの部分を含んでいる酸化リン脂質、および抗動脈硬化作用を有している酵素の存在を決定するための使用 | |
| US20150276751A1 (en) | Reagent for imaging intracellular acetylation | |
| WO2016148125A1 (ja) | 新規蛍光標識スフィンゴミエリン及びその利用 | |
| JP2005257307A (ja) | 高比重リポ蛋白中コレステロールの濃度測定用乾式分析素子 | |
| Kang et al. | Fluorescent phospholipase A 2 indicators |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230106 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231107 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231211 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240206 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240305 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7454861 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |