PT97311B - Processo para a preparacao de trombina ultra-pura - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de WARNER-LAMBERT COMPANY, norte-americana, industrial e comercial, estabelecida em 201 Tabor Road, Morris Plains, New Jersey 07950, Estados Unidos da América,(inventores Amai Boctor, Galen Radebaugh e Surendra Mehta, residentes nos E.u.A.) para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TROMBINA ULTRA-PURA.

DESCRIÇÃO

ANTECEDENTES essencial para a

A trombina, uma enzima proteolítica, é hemostase. É um principio activo dum reagente que intervém na formação dos coágulos sanguíneos através da produção de fibrina. Devido à sua eficácia como auxiliar da coa. gulação, a trombina e as suas preparações são úteis durante as operações cirúrgicas para controlar as hemorragias. Enquanto a trombina liofilisada se encontra disponível no mercado, as suas preparações liquidas são geralmente preferidas devido a considerações ligadas à facilidade e à rapidez da sua manipulação.

Ate hoje, ainda não se conseguiram produzir preparações de trombina liquida altamente estáveis e lim1

pidas, que simultaneamente sejam estáveis durante a armazenagem e se encontrem prontas para utilização durante as operações cirúrgicas. Isto devese ao facto de a trombina, quando dissolvida em água ou em soro fisiológico, perder rapidamente a sua actividade devido a desnaturação e autólise da proteina trombina.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma nova modificação dum processo para a preparação de uma trombina de qualidade ultrapura em solução. Esta solução é totalmente límpida e livre de turvação, e tem a caracteristica de exercer uma actividade coagulante intensa, conter menos proteínas inac«tivas, e ter uma actividade altamente especifica, superior à de qualquer outro produto à base de trombina até hoje descrito

A novidade do presente processo , que consegue atingir o objectivo de proporcionar uma solução límpida de trombina, é a combinação única de todo um conjunto de passes no seio de uma sequência particular.

Em primeiro lugar, existe no sangue circulante a trombina vulgar sob uma forma inactiva chamada protrombina e é necessário um agente denominado tromboplastina para que a protrombina se converta em trombina. A presente invenção nãoenvolve a habitual utilização de extracto de pulmão bovino comofonte de tromboplastina, mas utiliza uma tromboplastina isolada e altamente purificada, como a seguir se descreve. Este processo elimina uma quantidade significativa de proteinas contaminantes que são provavelmente a fonte de impurezas e de turvação que frequentemente aparecem nos produtos finais.

meio líquido em que ocorre a conversão da protrombina em trombina, após o habitual passo de centrifugação, é passado através de uma coluna de cromatografia de permuta aniónica, proporcionando um material eluído que ainda é

turvo. Este produto é então, na presente invenção, congelado e depoisdescongelado, seguindo-se nova centrifugação para remover a maior parte da turvação. A remoção desta turvação melhora o fluxo da solução através da segunda fase do procedimen to cromatografico em coluna de permuta aniónica.

Após uma segunda passagem da solução atra vés de um permutador catiónteo, o melhoramento neste passo con siste em fazer a eluição do produto através desta coluna por fluxo normal com débito de cima até baixo com gradiente salino em vez de uma solução padrão de cloreto de sódio.

Os resultados destas modificações têm pro porcionado o isolamento de uma trombina ultra- pura e isenta de água, cuja actividade especifica é muito superior à de qual quer produto disponível no mercado, como se verifica pelo quadro 1.

QUADRO 1

Comparação entre Thrombostat, Thrombinard e Trombina Ultra-Pura

Trombostat(a) Thrombinard(b) Tr. Ultra-Pura

Actividade (c)

Coagulante (U/ml)	2164	1372	7820
Proteina (mg/ml)	11.56	0.82	0.82
Actividade
Especifica (U/mg)	187	1663	9500

a Parke-Davis b Armour c Determinada por uma modificação do método NIH cuja descrição é feita adiante

De acordo com a presente invenção, no seu âmbito mais geral, esta proporciona:

1. Uma solução de trombina ultra-pura, límpida e sem côr, tendo uma actividade especifica de 4000 a 11000 unidades/ /mg de proteína.

II Uma solução de trombina ultra-pura, límpida e sem côr pre parada fazendo reagir protrombina com tromboplastina puri ficada e tratando a trombina resultante, depois de a centrifugar, pela eluição do sobrenadante através de uma coluna de agarose de permuta aniónica; congelando e depois descongelando, até atingir aproximadamente 25QC, as fracções desejadas do eluído? centrifugando e eluindo o sobre nadante através de uma coluna de agarose de permuta catió nica com um gradiente salino num soluto tampão.

III Um proeesso para preparar uma solução de trombina ultra-pura, límpida e incolor que consiste em:

Fazer reagir protrombina com tromboplastina purificada? centrifugar a suspensão; eluir o sobrenadante através de uma coluna de agarose de permuta aniónica com um soluto tampão? congelar e depois descongelar até 25^QC as fracções desejadas do eluído; centrifugar e eluir o sobrenadan te através de uma coluna de agarose de permuta catiónica com um gradiente salino no seio duma solução tampão.

VANTAGENS

As composições à base de trombina e os métodos da presente invenção têm várias vantagens sobre as pre parações e sobre os métodos convencionais utilizados para se auxiliar ou acelerar a coagulação sanguínea.

Ao contrário das preparações em pó, as composições da presente invenção não necessitam de ser reconstituídas antes de serem utilizadas. Assim, a necessidade e os

cuidados a ter quanto a medir, misturar, esterilizar, etc., um ou mais componente(s) ou contentor(es) deixam de ser considerações importantes. Estas preparações límpidas podem ser utilizadas sem preparação prévia anterior à sua aplicação fina], por causa da ausência das partículas que causam turvação nas preparações líquidas anteriormente utilizadas.

Por outro lado, a estabilidade dos produtos actuais que contêm trombina é tal que a necessidade de ter inventários de existências e/ou de fazer rotações dos produtos é largamente eliminada. Ao contrário da maioria das soluções de trombina em água ou em soro fisiológico, que apenas permanecem estáveis durante uma semana à temperatura de 4^eC, estas preparaçõesforam concebidas e desenvolvidas para se manterem estáveis a uma temperatura de refrigeração normal (isto é, cer ca de 4sc) e à temperatura ambiente (isto é, cerca de 252c) durante 6 meses ou mais.

Sabe-se que elevadas concentrações de glicerol, sacarose e outros polióis são capazes de estabilizar as proteínas em solução. No caso da trombina, é sabido que o glicerol a uma concentração de 67% consegue estabilizar nitidamente uma solução de trombina na proporção de 1000 ug/ml. no entanto, a utilização de altas concentrações de glicerol não é prática na preparação em grande escala de soluções estéreis de trombina por causa do elevado grau de viscosidade de tais preparações. As composições da presente invenção que podem conter 30% ou menos de glicerol, evitam este tipo de problemas.

Outras vantagens e aspectos relevantes da invenção tornar-se-ão aparentes tendo em consideração a memória descrita que se segue.

DESCRIÇÃO SUMARIA DA FIGTJRA 1

A figura 1 é uma gráfico que ilustra a purificação da trombina graças ao perfil da sua eluição através ,, -^2a!8E®^ei>wwae_aBa^ duma coluna de CM-Sepharose usando um gradiente de salino de cloreto de sódio 0,1 M a 1,0 M, como se descreve no exemplo.

DESCRIÇÃO PREMENORIZADA PE FORMAS

PREFERIDAS DE REALIZAÇÃO

ISOLAMENTO DA TROMBOPLASTINA A PARTIR DE TECIDO PULMONAR tecido pulmonar de vitela/vaca é aparado para se lhe retirar o tecido gordo, cortado em pequenos frag mentos, homogeneizado num homogeneizador de tecido com um tampão fosfatado 25-50 mM a pH 6,2 - 6,7, de preferência a pH 6,5, contendo 0,5 - 1,0 % de polissorbato 80. O agente tensio-activo facilita a extracção da enzima. Podem ser utilizados outros agentes tensio-activos não iónicos, ou seja, os ésteres de ácidos gordos com polióxietileno-sorbitano, por exemplo, o Tween, Cl? ésteres de ácido gordos com polioxialquileno, por exemplo, o MYRJ, ICI; éteres gordos de polioxietileno, por exemplo, o Brij, ICI; éteres de polióxipropileno-polietileno, como, por exemplo, o Pluronic, Basf? os mono-ésteres da sacarose; e o Triton x-100. 0 homogenato é centrifugado a 12 - 14 Krpm e o sobrenadante é recolhido. 0 pH do sobrenadante é ajustado a

5,2 - 5,7, de preferência a pH 5,5, utilizando gotas de ácido acético a 10 %, e centrifugando a 12 - 14 Krpm. 0 sobrenadante obtido durante esta fase é carregado numa coluna de agarose recticulada, de permuta catiónica convencional, por exemplo, CM-Sefarose (podem ser utilizadas outras resinas catiónicas, por exemplo, de CM-Sefadex) e eluído com tampão fosfato 25-50 mM tal como descrito anteriormente. A monitorização do eluído faz-se a 280 nM. A actividade da tromboplastina no eluido é também monitorizada indirectamente, procedendo primeiro à conversão da protrombina em trombina, sendo a actividade desta última então determinada pela medição da actividade coagulante feita com um fibrómetro.

As fracções que no início do processo sao eluídas da coluna fazem parte do primeiro pico que contém trom boplastina. As fracções cuja eluição é posterior e que fazem

parte do segundo pico contêm proteínas estranhas, não aetivas. Esta solução de tromboplastina purificada é opalescente, sem qualquer brilho difuso ou turvação. Esta fracção pode ser melhor clarificada através de um ciclo de congelamento / descongelamento e de centrifugação sem qualquer perda da actividade de conversão da protrombina.

! PREPARAÇÃO,ISOLAMENTO , E PURIFICAÇÃO DE TROMBINA ULTRA PURA. Ensaio para determinação da actividade de trombina

A actividade coagulante da trombina foi determinada utilizando um método NIH modificado. As soluções utilizadasconsistiam de: a) Um tampão de imidazol de reserva (IBS), feito pela dissolução de l,72g de imidazol em 90 ml de ácido clorídrico 0.1 N seguida de diluição com água destilada até perfazero volume de 100 ml (o pH final deve ser aproximadamente de 7,2). b) A solução PEG/IBS feita através da dissolução de 58,8 ml de PEG; 9,0 g de cloreto de sódio; e 5 g de polietileno glicol (PEG, peso molecular 8000); ajustando-se o k

volume para 1000 ml com água. Foi utilizado plasma humano normal como fonte de fibrinogénio e foi diluído com cloreto de sódio 0,154 M (1:1) antes de ser utilizado, Foi utilizada trom· bina NIH como padrão e foi diluida com soro fisiológico tamponado com polietilenoglicol (8000) / imidazol de modo a ter uma concentração final de 5 U/ml. A determinação analítica da actividade coagulante foi feita usando um fibrómetro. Fez-se a incubação de plasma diluída (200 ul) à temperatura de 372c durante 3 minutos, depois acrescentou-se trombina padrão (100 ul) e registou-se o tempo de coagulação (em segundos) (14 a 15 seI gundos). Utilizando-se uma amostra desconhecida contendo trombina procedeu-se à sua diluição com PEG/IBS, de modo a proporcionar valores do tempo de coagulação maiores e menores que os valores do tampão padrão de coagulação em cerca de 5 segundos.

A actividade enzimática foi calculada como se segue:

([(A-B) (C-D)] +B)q = unidades/ml (E-D)

A: factor de alta diluição da amostra desconhecida de trombinéi

B: factor de baixa diluição da amostra desconhecida de trombina

C: tempo médio de coagulação da trombina padrão.

D: tempo médio de coagulação a baixa diluição de uma amostra desconhecida de trombina.

E: tempo médio de coagulação a alta diluição de uma amostra desconhecida de trombina.

G: unidades de trombina padrão na mistura de ensaio dividida pelo volume da trombina padrão na mistura de ensaio.

A actividade enzimática exprime-rse em unidades/ml (até 8000 U/ml) e em unidades/mg de proteina (até 10 000 U/mg proteína).

Fez-se reagir protrombina de plasma bovino purificada ou parcialmente purificada com tromboplastina purificada na presença de uma solução de cloreto de cálcio 10

- 40 mM a uma temperatura de 10⁹ a 25⁹ C durante 15 a 45 minutos, tal como se descreveu no exemplo B, ISOLAMENTO BE TR0MBI_ NA ULTRA PURA. A intensidade da actividade da tromboplastina é duas a três vezes superior à da protrombina a pH 6,5 - 7,0.

A trombina produzida por esta reacção é ainda subsequentemente purificada da maneira que se segue. A suspensão de proteínas resultante é centrifugada (12 Krpm) numa centrifugadora refrigerada (2⁹ - 10⁹ c) para separar as proteínas insolúveis e inactivas. O sobrenadante é carregado numa coluna de permuta aniónica de fraca potência (DEAE - Sefarose, DEAE - Sefadex,

BE - 52). Faz-se a eluição da coluna com um tampão fosfato 25

- 50 mM (pH 6,5) que contém cloreto de sódio 0.1 M (a 22 - 102 C). Controla-se o eluento a 280 nM. As fracções com alta absorção de UV são re-examinadas para se titularem as actividades coagulantes de natureza trombínica (utilizando um fibrómetro).

Estas fracções reunidas, que contêm trombina, são turvas, sendo possivel purificá-las congelando a suspensão durante a noite, seguindo-se o descongelamento

(4 252 c) e uma centrifugação ou filtração. Com o agregado que contém a trombina carrega-se numa coluna de permuta catiónica (CM-Sefaro se, CM - Sefadex) e faz-se a eluição em gradiente salino (clore to de sódio 0,1 Ma 1 M em tampão fosfato 25 - 50 mM, pH 6,5). Controla-se o eluente a 280 nM e reune-se as fracções que possuem aetividade trombínica (tal como e determinou pelo fibrómetro) (figura 1). As fracções que contêm trombina ultra pura são transparentes como a água e podem ter uma aetividade de cer ca de 8000 U/ml. Determina-e a pureza da trombina por CLEP em fase invertida, electroforose em gel de poliacrilamida, e por focagem isoeléctrica.

A determinação da concentração de proteína existente na fracção Trombinica foi efectuada utilizando o método de ensaio de BRADFORD (Bradford, M., Anal Biochem., 72:248, 1976) e o reagente para proteínas feito pela BioRad (Richmond, CA). A aetividade especifica da preparação foi calculada dividindo a quantidade de unidades de enzima por unidade de volume pela quarítidade de proteínas existente nessa mesma unidade de volume.

A aetividade trombónica especifica excepcionalmente intensa conseguida pela presente invenção é atribuí da aos factores seguintes:

1. A utilização de protrombina recentemente colhida proporciona um produto trombónico de elevada aetividade específica Por outro lado, a trombina inactiva pode co-eluir-se com a trombina activa e isto pode resultar numa redução da actividade específica do produto final. Portanto, todos os passos necessários ao isolamento têm de ser executados a uma temperatura entre 2^eC a 7^S C. Além disso, as soluções não ficaram em repouso, mesmo refrigeradas, por periodos de tempo longos antes de serem utilizadas. A congelação a uma tem peratura entre - 102 a - 202c foi adequada para proteger os produtos.

2. A utilização de tromboplastina altamente purificada como foi descrito na presente invenção diminui o número e/ou a quantidade de contaminantes ou a presença de proteínas não específicas na solução final de trombina, consequentemente aumentando a sua actividade específica.

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As preparações feitas de acordo com a pre sente invenção têm que conter, num meio líquido, trombina ultra pura, e um ou mais tampões. Podem conter soluções salinas e outras substâncias convencionalmente utilizadas em preparações proteicas.

Apesar de se utilizar o termo preparações faz-se observar que os requerentes contemplam todos os tipos de formulações nas quais a trombina, numa forma substancialmente solubilizada, está presente e combinada com um ou mais gli cóis e com tampões.

Quando se prepara uma formulação líquida é geralmente preferido que o(s) solvente(s) ou outro(s) diluente(s) utilizado(s) tenham uma adequada miscibilidade com a trombina, de tal modo que as normas de produção, por exemplo, ou a uniformidade de concentração da trombina, de lote para lote, possam ser facilmente satisfeitos.

A trombina utilizada é uma trombina ultra-pura produzida através do processo da presente invenção.

Esta solução de trombina pode, se desejadc ser então misturada com glieerol que contenha um tampão de acetato ou um tampão fosfato e uma soluçaõ salina, para se poder preparar uma solução estável.

É sabido que a trombina é solúvel em soro fisiológico, isto é, uma solção contendo cerca de 0,9% de NaCL em água. No entanto, é possível utilizar outras soluções salinas. Além disso, é também possível a substituição de todo ou de parte do NaCl nessas soluções, por um ou mais sais de tipo

adequado.

A água é o meio preferido para as preparações da presente invenção. Apesar disso, é desejável a utilização de um ou mais diluente diferentes que não afectem adversamente a solubilidade e/ou a estabilidade da trombina nas preparações estudadas.

Um diluente desse tipo é o glicerol. Outros polióis utilizáveis incluem o manitol, o sorbitol, a sacarose, a glicose e semelhantes. As misturas são possíveis e operacionalmente válidas. 0 glicerol é altamente preferido.

glicerol ou outros ingredientes do grupo dos polióis serão utilizados numa concentração total de cerca de 10 a 40 (peso/peso), de preferência 20 a 30 % (peso / peso) tendo por base do cálculo o peso total da composição.

A menos que seja expressamente referido noutro sentido, todas as quantidades aqui apresentadas são percentagens de peso / peso que têm por base o peso total de cada composição.

Os sistemas de tampões adequados sao aqueles cujas soluções aquosas mantêm o pH da solução de trombina entre 5,0 e 8,0 com uma margem preferida de 5,5 até 6,5. É altamente preferencial que, no caso de se utilizar um tampão fosfato, o pH final da preparação esteja entre 6,0 e 6,5 e que no caso de se utilizar um tampão acetato o pH final seja 5,0.

A medição do pH é faita utilizando um medidor de pH vulgar dotado com um eléctrico de combinação.

Os sistemas de tampões apropriados incorporam acetato, fosfato, sucinato, bicarbonato, imidazol, TRIS, e os tampões de ides simétricos descritos por n. E. Good e S. Izawa, em Methods in Bnzymol, 24, Parte B, 53 (1972); e W. F.

Ferguson, K. I. Braunschveiger, W. R. Braunschweiger, J. R. Smith, J. McCormicK, C. C. Wasmann, N. P. Jarvis D.H. Bell, e N. E. Good in Anal, Biochem 104, 300 (1980). Estas aquisições ¹ tecnológicas ali publicadas são aqui incorporadas por referência.

Os reagentes adequadas para serem utilizados nos sistemas tampões instantâneos incluem MES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES, e semelhantes. Os fosfatos só deveriam ser utilizados quando o ião cálcio estivesse ausente ou na presen — ça de EDTA. Podem ser utilizadas misturas dos reagentes referidos. Se se utilizarem misturas de diferentes tampões, o pH final deve ser adequadamente ajustado.

são preferíveis os tampões que contêm ião fosfato e ião acetato. As misturas são operacionalmente válidas .

Os tampões estarão presentes na solução tamponada, com água e/ou outro(s) diluente(s) adequado(s), numa concentração total situada entre 0,01 M e 0,2 M, aproximadamente de preferência entre 0,025 Me 0,10 M.

A utilização de outros aditivos convencionais, por exemplo, antioxidantes, corantes, agentes tensio-activos, eoutras substâncias semelhantes, está também contemplada. Pode serutilizada glutationa como ingrediente opcional. Podem ser utilizados aminoácidos como ingredientes opcionais, mas a sua presença não deve ocorrer em quantidades que interfiram com a acção estabilizadora dos componentes poliol e tampão sobre a trombina purificada. É geralmente preferível que eles sejam utilizados em quantidades diminutas, em concentrações de 0,5 % ou menos, e eventualmente nenhuns.

HEMOSTATOS

Os materiais hemostáticos, tais como o CEL FOAM, o SURGICEL e AVICEL, e colagénio, que presentemente são

utilizados sozinhos ou em combinação com trombina em pó ou com trombina em solução salina, podem ser utilizados de modo eficaz em combinação com as formulações de trombina estabilizada da presente invenção, utilizando uma variedade de técnicas.

De preferência o agente hemostático absorve a solução estabilizada e depois faz-se a liofilização dessas almofadas e embala-se por um processo estéril.

É possível incorporar também agentes antimicrobianos ou antibióticos nessas almofadas esterilizadas, especialmente para aplicar em pacientes com queimaduras, nos quais é critica a prevenção de infecções.

Um tipo de ligadura adeqado para a preparação de coagulantes de acordo com a presente invenção encontra-se descrito na patente norte-americana n^s 4363319 que aqui se indica com referência.

texto que se segue é ilustrataivo da preparação de uma solução de trombina ultra-pura.

EXEMPLO

A: ISOLAMENTO DA TROMBOPLASTINAs

Procedeu-se à homogeneização de 100 g de tecido pulmonar de vitela em 200 ml de um tampão de fosfato de sódio 25 mM, a pH 6,5, contendo 0,5 % de polissorbato 80, e fez-se a centrifugação a 12 Krpm durante 20 minutos à tempera tura de 5^ c. Recolheu-se o obrenadante e ajustou-se o pH para 5,72 utilizando ácido acético a 10% e depois deixou-se em repou so durante 1 hora no frigorifico. Centrifugou-se a mistura durante 20 minutos como referido anteriormente e recolheu-se o sobrenadante. Utilizando 160 ml do sobrenadante carregou-se uma coluna de CM - Sefarose (30 x 20,5 cm), que foi saturada com um tampão de fosfato de sódio, 25 mM, a pH 6,5, e fez-se a eluição utilizando o mesmo tampão. Procedeu-se à recolha de fracções de

230 gotas (cerca de 13 ml) e mediu-se a densidade óptica (do) das diferentes fracções a 280 nM.

TUBO N- do a 280nM

1	límpido	0.0
2	límpido	0.0
3	límpido	0.0
4	opalescente	1.369
5	opalescente	3.751
6	opalescente	3.828
7	opalescente	0.451
8	amarelado	3.427
9	amarelado	3.993
10	avermelhado	3.513
11	avermelhado	4.060
12	avermelhado	4.071
13	avermelhado	4.055
14	avermelhado	4.073
15	avermelhado	3.944
16	avermelhado	3.723
mistura de amostras ns 1	fracções 4
mistura de amostras ns 2	fracções 7

Procedeu-se ao ensaio das misturas de amos tras para verificação da actividade de tromboplastina, convertendo protrombina em trombina da maneira seguinte:

Misturar protrombina	1,0 ml
solução salina	0,5 ml
fracção amostra	0,1 ml
CaC12 (0.3 M)	100 ul, incubar a

mistura à temperatura de 25² c durante 25 minutos,, depois cen trifugar a temperatura de 5^S C a 13 Krpm durante 10 minutos e testá-la para verificar a existência da actividade coagulante

WH*H da trombina utilizando um fibrómetro.

-ÊEãSSÍS- _têffiE2-Éê_S29gulasão_ mistura de amostras η⁹ 1 10,9 mistura de amostras n^e 2 9,9

As duas misturas de amostras continham uma quantidade significativa de actividade tromboplastinica (conversora da protrombina). Utilizou-se a primeira mistura de amostras paraconverter a protrombina em trombina, por ser amenos colorida. A segunda mistura de amostras, apesar disso, também pôde ser utilizada.

B. ISOLAMENTO DA TROMBINA ULTRA-PURA

A mistura	onde ocorreu a conversão era feita de:
	Protrombina	97	ml
	Solução salina	40	ml
	CaCl2 (0,3 M)	10	ml
	Tromboplastina	15	ml
	( mistura de amostras n9	1 )
e foi incubada	à temperatura de 259 C durante 30	minutos e
trifugada a 13	krpm durante 20 minutos	à temperatura de 59

recolhendo-se o sobrenadante.

C. COLUNA CROMATOGRÁFICA DEAE - SEFAROSE

Equilibrou-se a coluna (30 x 2,5 cm) com um tampão de fosfato de sódio, 25 mM, a pH, 6,5, contendo 0,02% de azida de sódio. Utilizou-se azida de sódio como agente bacterostático; contudo este agente não pode ser utilizado durante o isolamento da tromboplastina uma vez que provoca a viragem para o castanho do hemoglobina vermelha. Podem ser utilizados

e são preferíveis outros agentes bacteriostáticos comuns. Estes incluem os fenóis e os fenóis substituídos, o álcool clorobutobenzílico, o cloreto de benzalcónio, o cloreto de benzetónio, o timerosal e o nitrato fenilmercúrico.

Utilizando 115 ml da preparação convertida e carrega-se a coluna e faz-se a eluição utilizando o mesmo tampão contendo cloreto de sódio 0,1 M. As fracções de 230 gotas são então recolhidas e testadas para determinar a existência da actividade coagulante da tromina.

As fracções n^s 7 - 48 exibiram uma significativa actividade coagulante da trombina; essas fracções foram recolhidas e misturadas (510 ml) e o produto resultante apre sentou umaspecto turvo. 0 produto assim recolhido foi guardado num saco de plástico e congelado durante a noite. O produto foi depois descongelado, centrifugado a 13 krpm durante 20 minutos à temperatura de 5^e C e depois recolheu-se o sobrenadante assim obtido.

D. CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE CM - SEFAROSE

Equilibrou-se a coluna (30 x 2,5 cm) com um tampão de fosfato de sódio 25mM, a pH 6,5, contendo azida de sódio a 0.02 % e cloreto de sódio 0,1 M.

Carregou-se a coluna com os 493 ml do sobrenadante anteriormente obtido no passo da coluna DEAE - Sefarose.

Fez-se a eluição da coluna com um gradien te salino preparado com 225 ml de tampão que continha azida de sódio a 0,02 % e cloreto de sódio 0,1 M. As fracções foram reco lhidas como descrito antes e foram testadas para verificação de actividade coagulante da trombina utilizando um fibrómetro.

As fracções n²s 15 - 21 desmonstraram uma actividade significativa e foram todas reunidas (volume de 90ml)

material assim reunido foi então testado para verificação da actividade da trombina, verificando-se a existência de actividade coagulante correspondente a 8213 U/ml.

Esta fracção recolhida foi também testada para se quantificar o conteúdo em proteínas, utilizando o método de Bradford e o conjunto Bio-Rad para ensaio de proteínas.

material recolhido continha proteínas na proporção de 0,82 mg/ml. A actividade especifica final foi de 8213/0,82 = 10015 U/mg de proteína.

REIVINDICAÇÕES

Claims (1)

1. - lâ Processo para a preparação de uma solução de trombina límpida, ultra-pura, caracterizado por

   a) se fazer reagir protrombina com tromboplastina purificada e centrifugar-se a suspensão proteica resultante;

   b) eluir-se o sobrenadante através de uma coluna de agarose permutadora de aniões e congelar-se e depois descongelar até cerca de 252 c as fracções éluentes desejadas

   c) centrifugar-se e eluir o sobrenadante através de uma coluna de agarose permutadora de catiões com um gradien de cloreto de sódio de 0,1 M a 1M num tampão fosfato e recolher-se as fracções eluentes desejadas.

   - 22 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a tromboplastina purificada ser preparada por com 25 mM de tampão fosfato, pH 6,5, contendo 0,5 a 1,0 % de agente tensio-activonão iónico e se centrifugar a mistura;

   b) ajustar-se o pH do sobrenadante a 5,5 com solução de ácido acético a 10 % e se centrifugar;

   c) eluir o sobrenadante através de uma coluna de agarose permutadora de catiões com 25mM de tampão fosfato e recolher-se as fracções desejadas.

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo a) ser efectuado em solução de 10 a 40 mM de cloreto de cálcio a uma temperatura compreendida entre ao e 25^s C durante 15 a 45 minutos.

   - 4ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a eluição no passo b) ser efectuado com 25 a 50 mM de tampão fosfato contendo 0,1 M de cloreto de sódio.

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a eluição no passo c) ser efectuada utilizando um gradiente de sal de 0,1 M a 1,0 M de cloreto de sódio em 25 mM de tampão fosfato.

   - 6^ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as fracções desejadas serem posteriormente purificadas por congelamento até cerca de 25^s, se centrifugar e recolher o sobrenadante.

   - 7^â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma solução de trombina, incolor, limpida e ultra-pura.

   - 8- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se obter uma solução de trobina possuindo uma actividade especifica compreendida entre 4000 e 11000 unidades por mg de proteína.

   _ ga _

   Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a actividade especifica de 4000 a 11000 unidades por mg de proteína ser determinada por um método de NIH modificado.

   Lisboa, 10 de Abril de 1991

   RESUMO

   PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TROMBINA ULTRA-PURA

   A invenção refer-se a um processo para a preparação de uma solução de trombina límpida, ultra-pura, que compreende

   a) fazer-se reagir protrombina com tromboplastina purificada e centrifugar-se a suspensão proteica resultante:

   b) eluir-se o sobrenadante através de uma coluna de agarose permutadora de anioes e congelar-se e depois descongelar até cerca de 252 c as fraeções eluentes desejadas

   c) centrifugar-se e eluir o sobrenadante através de uma cc luna de agarose permutadora de catiões com um gradiente de cloreto de sódio de 0,1 M a 1M num tampão fosfate e recolher-se as fraeções eluentes desejadas.

   0.9

   0.8

   0.7

   0.6

   Q5

   0,4