EP0843594A1 - Carte d'analyse a usage unique comprenant un conduit d'ecoulement de liquides - Google Patents
Carte d'analyse a usage unique comprenant un conduit d'ecoulement de liquidesInfo
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- EP0843594A1 EP0843594A1 EP97928314A EP97928314A EP0843594A1 EP 0843594 A1 EP0843594 A1 EP 0843594A1 EP 97928314 A EP97928314 A EP 97928314A EP 97928314 A EP97928314 A EP 97928314A EP 0843594 A1 EP0843594 A1 EP 0843594A1
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Classifications
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
Definitions
- Disposable analysis card including a liquid flow conduit
- the present invention relates to the analysis of one or more different liquid samples, in which or which one seeks to identify, detect and / or quantify one or more analytes, according to any simple or complex analysis process, involving one or more several different reagents, depending on the chemical, biochemical, biological or physical nature of the analyte (s) sought.
- the present invention will nevertheless be illustrated by reference to the biological analysis, of one or more ligands, requiring for their detection and / or quantification the use of one or more anti-ligands.
- ligand is meant any biological species, for example an antigen, an antibody, a nucleic acid, a nucleic acid fragment, or an oligonucleotide, capable of binding, with an anti-ligand.
- an example of application of the analysis techniques described below relates to immunoassays, whatever their format, for example by direct analysis or by competition. But of course, in the biological field, the analysis techniques described below are applied in the same way to the detection and / or the quantification of a nucleic material or of nucleotides.
- analysis devices or cards which generally comprise a body in the form of a plate, in which are arranged or arranged: an orifice for introducing a starting liquid sample; a plurality or multiplicity of operating chambers, containing respectively different reagents, and each arranged to receive a share or aliquot of the starting liquid sample, treated in each said operating chamber;
- a plurality or multiplicity of liquid transfer conduits arranged in parallel with respect to each other, and each communicating on one side with the introduction orifice and on the other side with an operating enclosure.
- the internal volume of which the above-mentioned elements have been previously placed under vacuum or under vacuum the starting liquid sample is introduced, to be analyzed, by the introduction orifice, whereby the sample liquid is introduced and distributed, without further intervention, in the various operating rooms.
- the analysis card is sealed at its insertion orifice, then subjected to various treatments, in particular incubation, to develop the reactions specific to the analysis process adopted in the different operating enclosures, respectively.
- the detection and / or quantification of the reaction products for example by optical means, in the various operating enclosures, provides a set of qualitative and / or quantitative information, making it possible to express an analysis result.
- the various steps or sequences required by the analysis once the analysis card has been sealed, are generally implemented automatically in an appropriate analysis equipment, controlled or ordered, in particular programmed to run automatically. required operations.
- an analysis card constitutes a sort of passive component, in the sense that it is no longer possible to move the same starting liquid sample, or a treated liquid sample, from an enclosure to another, to perform within the same analysis card any processing process required for the determination of the analyte.
- an analysis card constituting an active component has been described, in the sense that its arrangement makes it possible to move any liquid sample from one place to another on the card.
- the proposed analysis device comprises a flattened body, in which are arranged or arranged:
- a liquid circulation circuit capable of being isolated from the outside, by definitive sealing of the introduction orifice, comprising at least one operating chamber for the treated liquid sample, obtained with all or part of the starting sample, and communicating with said introduction orifice;
- this circulation circuit describes, in two dimensions of the map, a geometric line composed of one end to another of successive branches, some of which are "dead ends", so that, in a plane or vertical frame of reference, any change orientation of the card, circulates the liquid by gravity only, from one section or branch to another section or branch of the same circuit, for example on one side or the other of the operating enclosure.
- Such a card makes it possible to circulate any liquid by simple gravity, in the circulation circuit isolated from the outside, due to the relatively large or open section of said circuit.
- the present invention therefore relates to an analysis device, in particular a single-use analysis card, allowing, once said device sealed or closed relative to the outside, regular circulation of any liquid sample, including in the case of a capillary type circulation circuit.
- gravity is used as the source of displacement or movement of any liquid within the card.
- the circulation circuit is both continuous, and looped on itself, between the introduction orifice and the operating enclosure.
- the device comprises at least one liquid transfer duct, arranged or arranged in the body, communicating on one side with the introduction orifice, and on the other side with the operating chamber, the circuit continuous circulation is looped on the transfer duct.
- continuous is meant the characteristic that any portion of the circulation circuit considered comprises on either side respectively two inlet and / or outlet orifices. This qualification is in particular opposed to the concept of "dead end", which implies that the portion of the circuit considered comprises only one inlet and / or outlet. This qualification is not exclusive of the characteristic according to which one or more circuits or conduits, themselves “dead end” can communicate with or connect to the continuous circuit considered.
- looped in on itself is meant the characteristic that the continuous circulation circuit forms in space, that is to say in the volume of the body of the analysis card, a complete loop, in so that any volume of liquid present in the conduit is substantially in equi-pressure on both sides of the column of liquid thus formed.
- This continuous circulation duct looped in on itself, communicates with one or more orifices for introducing liquid samples, and one or more vent orifices, as described below.
- the circulation of the liquids takes place in the analysis card, by simple gravity, without any particular resistance, resulting from the depression created by the flow or the capillarity, and this only by changing the map orientation.
- the geometric line described by the continuous circulation circuit comprises at at least one planar segment, located in a plane, for example parallel or coincident with one of the faces of the plate; and this planar segment itself describes a regular line, for example along at least one substantially circular portion, so that the plate being arranged vertically, the change in orientation of the card, for example around an axis perpendicular to the plate and passing substantially through the center of said circular portion, circulates the liquid from one section to another of the continuous circulation circuit.
- the considered portion of the planar circulation segment can also be sinusoidal.
- the previously defined analysis card has many other advantages.
- the circulation of the liquid under simple gravity that is to say without using or using significant energies, makes it possible to practically avoid any formation of bubbles, by dissolution or release of the gases, within the circulating liquids.
- the circulation of a liquid sample within the card, itself presenting bubbles or microbubbles at the outset makes it possible practically entirely to eliminate or degas them.
- FIG. 1 shows in perspective, and with partial cutaway, an analysis card according to a first embodiment of the invention
- Figures 2 and 3 show vertical partial sections respectively along lines II-II and III-III of Figure 1
- FIG. 10 shows a front view of an analysis card according to a second embodiment of the invention
- FIG. 11 shows a partial vertical sectional view of the analysis card according to Figure 10
- Figs 12 to 15 show three different embodiments of the means for permanently closing a vent orifice, and / or an introduction orifice, bearing the reference numeral 9 in all the figures.
- FIG. 16 shows schematically an analysis card, front view, according to a third embodiment of the invention
- FIG. 17 shows, still viewed from the front, an analysis card according to the invention, according to a fourth embodiment Figure 18 shows a view in vertical section, along line XVIII-XVIII of Figure 17, of the analysis card shown in Figure 17 - Figures 19 and 20 schematically represent the analysis card shown in Figure 17, in two respectively different positions corresponding to two different handling phases of the analysis card
- FIG. 21 shows an embodiment of a device according to the invention, as used for the test described in Example 1.
- the analysis card 1 represented in FIG. 1 comprises a continuous circuit 5 for circulation of liquid, integrated or disposed at least partially in the body 2 having the form of a plate, of the analysis card 1.
- the continuous circulation circuit 5 gathers in a loop: - an operating chamber 6, which may or may not be materialized, in particular by the internal presence of reagent;
- a transfer duct 7 communicating by a bypass route with an orifice 3 for introducing a starting liquid sample
- an observation tank By “operating enclosure” is meant any enclosure, whatever its material form, making it possible to carry out any operation or treatment of the treated liquid sample, within the period of time during which said sample stays in said enclosure.
- the operation considered can be of a physical, mechanical, chemical, biochemical or biological nature.
- the enclosure considered may contain, beforehand (for example in dry and / or liquid form), or at the time of the operation or treatment, any reagents or material means aiding said operation.
- observation tank means any means arranged or arranged in the body, making it possible to obtain qualitative and / or quantitative information from one or more parameters or characteristics, observed directly or indirectly in any liquid present in said tank 17.
- the observation tank which communicates with and is included in circuit 5, is arranged, in particular with transparent walls, to detect or measure a parameter, in particular optical, for example fluorescence, to obtain a signal representative of the presence and / or the amount of a biological analyte, for example an antibody, a nucleic acid or the like.
- a parameter in particular optical, for example fluorescence
- the body described in two dimensions of the card 1, a determined geometric line, in this case circular, so that any change in orientation of the card, arranged vertically, as shown in Figure 4, with respect to a three-dimensional reference system having a vertical reference dimension, circulates the liquid present in the circuit, only by gravity from one section to another, for example on one side or the other of the operating enclosure 6, and this in a controlled manner as a function of the amplitude of the change in orientation with respect to the above-mentioned standard.
- the body described in
- the geometric line described by the circuit 5 comprises a planar segment 51, coincident with the face 2a of the plate, and this planar segment 51 comprises or is constituted by a substantially circular portion, thus forming a regular line.
- the analysis card 1 being arranged vertically, any change in orientation of the card in the vertical plane around an axis 77 perpendicular to the plate 2, and preferably passing substantially through the center of the circular portion defined by the planar segment 51, circulates the liquid from one section to another of the circuit 5, for example on one side or the other of the operating enclosure 6.
- planar segment 51 can be regular or broken, and that this same segment can include both a substantially circular portion and a substantially sinusoidal portion. But this geometric line remains continuous, within the meaning of the definition set out above.
- vent orifice 8 communicates with the circuit 5 at a junction point different from the junction point of the introduction orifice
- vent orifice 8 and the introduction orifice 3 comprise or are associated with definitive sealing means, for example sealing.
- a decantation tank 15 is arranged or arranged in the body 2, downstream of the introduction orifice 3, in the direction of introduction of the liquid sample, and the circuit 5 can be closed either on the tank 15 decantation, either downstream of the latter.
- the operating enclosure 6 is delimited in the continuous circulation circuit 5, in the direction of introduction of the liquid sample, by at least one means 18 for stopping the liquid introduced, chosen or arranged to free the passage of said liquid under the effect of a minimum hydrostatic head.
- different means shown in Figures 7 to 9 can be used:
- the stop means 18 is a local arrangement of the continuous circulation circuit 5, generating a pressure drop, for example by a throttle 19 shown in Figure 9, or a baffle 20 shown in Figure 8; this baffle 20 is obtained by passing from the upper face 2a to the lower face 2b of the body 2 by a first vertical through conduit, by circulating on the lower face 2b, then going up towards the upper face 2a, by a second through conduit ;
- the stop means 18 can be constituted by a local and punctual coating, hydrophobic, of the circuit 5, therefore with low wetting, hindering, in the absence of a minimum charge, the circulation of the liquid ; more particularly, and as shown in Figure 7, the stop means 18 is constituted by two notches, arranged one opposite the other, on either side of the conduit 5, and forming with it a local liquid retention area.
- the analysis card 2 is obtained essentially, by precision molding of a technical plastic material, compatible with the treated liquids.
- the circuit 5 is formed at least in part by a channel 25, formed at least in part on the surface of one 2a and / or the other face 2b, it being understood that, as shows the combination of Figures 1 and 8, the circuit 5 extends over one 2a and / or the other face 2b of the body, parallel one to the other, possibly crossing right through the body 2, locally, at one or more places in the continuous circulation circuit 5.
- the two faces 2a and 2b of the body 2 are coated in a sealed manner, by two sheets or films, for example of transparent plastic, 22.
- the operating enclosure 6 comprises, freely or fixed relative to the body, one or more reactive. This fixation can consist as well in a covalent chemical bond of the reagent on the wall of circuit 5, as in a weak bond, for example by adsorption or absorption of the reagent on this same wall.
- analysis card 1 The operation of the analysis card 1 can be explained with reference to Figures 4 to 5, the analysis card 1 being arranged vertically.
- the introduction orifice 3 and the vent orifice 8 are open.
- the liquid sample to be analyzed, whether or not associated with a reagent, is introduced through the orifice 3, whereby it forms a liquid column 62 at the bottom of the circuit 5 in equilibrium, and in contact with the reagent contained in the operating chamber 6 Then the openings 8 and 3 are hermetically sealed, so that the card is isolated from the outside.
- the liquid sample is circulated, in one direction then in the other, in contact with the reagent, so that a reaction grows between the liquid sample and the reagent. In the angular position represented in FIG.
- the column of liquid is displaced in the observation tank 17. Also by rotation on either side of the angular position represented in FIG. 5, one can make circulate, in one direction then in the other, the liquid through the tank 17. Thus, it is possible to detect and / or measure the 1 analyte present in the tank 17.
- the analysis card according to the second embodiment differs from the first embodiment by the following points: - an enclosure 21 is arranged and arranged flat, substantially in the center of the body 2, and once sealed, forms a chamber included in the continuous circuit 5 for circulation of the liquid; this enclosure is sealed and closed off by a membrane which, by successive insertion and release, makes it possible to aspirate the liquid sample through the introduction orifice 3; the orifice 3 for introducing the liquid sample opens into a settling tank 15, before communicating with the circuit 5 proper; the decantation tank 15 is provided with at least one vent 81 and / or 82 which is closed when the cavity 21 is used to suck up the liquid and make it flow in the conduit 5;
- the circuit 5 is looped over the settling tank 15, by a through conduit, passing from the face 2a to the face 2b of the body 2.
- the enclosure 21 has another utility: it allows in practice to absorb pressure variations, within the analysis card.
- the means for permanently closing the orifice 3 or 16 (see Figure 17) and vents 81, 82 can be chosen from the following means:
- this means is a cover 10 for final closure;
- this sealing means combines the conduit 11 for introducing the liquid sample, the active end 11a of which can take two positions relative to the body 2, namely a retracted position ( Figure 13 ) communicating in a leaktight manner with an introduction cavity 12 for the liquid, and an advanced position (FIG. 14), penetrating in a leaktight manner into a calibrated blind orifice 13 formed in the body 2; in the latter position, the introduction conduit 11 is sealed; - And an adhesive strip 14 which is attached, in a leaktight manner, and adhesive on the orifice 3, see Figure 15.
- the analysis card according to the third embodiment differs from the first embodiment by the fact that the planar segment 51 of the circuit 5 describes a line formed by at least two substantially circular portions 511 and 512 , concentric, connected together in series, by a conduit passing right through the body 2.
- the following variants can be made:
- Several operating enclosures 6 can be provided and arranged in the body 2, being included in series in the continuous circulation circuit 5, so that the controlled change of orientation of the card 2, makes it possible to circulate in an adapted manner the liquid sample in one and / or the other operating enclosure; - Several continuous circuits 5 for circulating liquid can be arranged or arranged in the body 2, and be connected together, in series and / or in parallel.
- the different circuits 5 can communicate with the same introduction orifice 3 or 16, or respectively with two separate orifices 3 and 16, for two liquid samples respectively.
- the circuits 5 can communicate with the same observation tank 17, or respectively each with a separate observation tank 17 for each sample processed.
- the analysis card according to the fourth embodiment of the invention differs from the first embodiment by the following characteristics.
- the circuit 5 comprises a planar segment 51, constituted by two substantially circular portions 511 and 512, and concentric, connected together in series, and this by passing below the portion 511, as shown in the Figure 18, on its right side.
- An additional circuit 23 is arranged or arranged in the body 2 on the face 2a of the corresponding plate, and comprises:
- the annex circuit 23 communicates on one side with the circuit 5, and has no exit or exit on the other side, other than 1 • vent 8.
- any change in orientation in the other direction of rotation that is to say in the positive direction, makes it possible to introduce any liquid contained in the cavity 24 into the main circuit 5.
- the above characteristic is obviously useful, for temporarily storing a reagent, and introducing it in a controlled manner into circuit 5, at any time during the analysis process.
- the liquid (reagent for example) is injected at the level of the introduction orifice 16, and thanks to the conduit 65 fills the cavity 24, by an outlet orifice emerging at the top of '' a stud, located substantially in the center and at two thirds of the height of the cavity 24.
- TMA Transcription-Mediated Amplification
- the "MTD-2" amplification test was carried out according to the supplier's manual protocol with a few modifications. Briefly, the reaction was assembled by combining 25 ⁇ l of a positive control (10 exp 6 copies of a 16S rRNA molecule synthesized in vitro, corresponding approximately to 100 bacterial cells) or 25 ⁇ l of a negative control (water ultrapure, with resistivity greater than or equal to 18 MegaOhms), to 12.5 ⁇ l of reconstituted amplification reagent, in a 12 x 75 mm 5 ml tube (polypropylene) and the whole is covered with 200 ⁇ l of mineral oil .
- a positive control 10 exp 6 copies of a 16S rRNA molecule synthesized in vitro, corresponding approximately to 100 bacterial cells
- a negative control water ultrapure, with resistivity greater than or equal to 18 MegaOhms
- the tube is heated for 5 minutes to 95 ° C, cooled to 42 ° C for 5 minutes (thermostatically controlled dry baths), then 12.5 ⁇ l of enzymatic reagent are added and mixed by gentle stirring.
- the reaction is incubated for one hour at 42 ° C (water bath), then placed on ice while waiting to be subjected to the detection step by HPA.
- HPA detection was carried out in a separate tube on 10 ⁇ l of reaction mixture (1/5 of reaction) supplemented with 90 ⁇ l of water, to which are added 100 ⁇ l of acridinium ester probe.
- the tube is incubated for 15 minutes at 60 ° C (water bath) to hybridize the probe, and a selection step is carried out with 300 ⁇ l of selection reagent.
- the automation of the amplification steps was carried out with a card or device 1 according to Figure 21, obtained in a body 2, machined in a square plate 10 cm side and 3 mm thick.
- the card is made functional by affixing a transparent adhesive film 22 of the BOPP type to the body, in order to seal the circulation circuit 5 tightly.
- a solid ball of enzymatic reagent is deposited and contained in a mini bowl provided for this purpose, in position "R2" of the circulation circuit.
- This 2 mm diameter ball is obtained by lyophilization of droplets of a trehalose solution (20%) containing the equivalent of a unit dose of enzyme necessary for carrying out a TMA amplification reaction.
- a reagent has the advantage of being stable for months at room temperature and of dissolving instantly on contact with an aqueous solution.
- the card thus formed is considered to be the analysis device in which the amplification steps from a sample are carried out automatically.
- the test within the device begins with a single initial phase of introduction of reagents by the manipulator or a device for dispensing liquids.
- washing buffer PBS IX, Tween-20 0.5%) are introduced into the external circular segment of the card, through the orifice 81 communicating with the circuit 5, below the position according to the internal circular segment "RI".
- the sample to be tested is composed of 25 ⁇ l positive or negative control as previously described, supplemented with 12.5 ⁇ l of enzyme dilution buffer (Enzyme Dilution Buffer, Gen-Probe) and 12.5 ⁇ l of amplification reagent reconstructed.
- the assembly is injected through the orifice 8 in position "RI" of the card.
- the device is inserted vertically in a computer-controlled automaton, a program of which allows the simultaneous control of the stages of rotation of the card around its central axis (speed, amplitude, acceleration, polarity, sequences) and the temperature of the liquids contained in the external and internal circular segments of the card, by means of a heating pad.
- This heating pad is in direct contact with the adhesive film of the device, the thin thickness of the latter ensuring perfect heat exchange for controlling the temperature inside the liquid segment located at its level.
- the shoe covers the circular segments over an angular amplitude of 45 ° on either side of the lower position of the device (vertical to the "RI" position), position in which the liquids are permanently located, whatever the rotation of the device, due to the combined effect of gravity and the liquid piston, specific to the present invention.
- the heating pad is regulated by a thermocouple probe; its heating is active, while its cooling is passive, under the action of an air flow at room temperature (20-25 ° C) conveyed by a pump under a pressure of 0.5 bar.
- the treatment program for the device or card is carried out as follows: the card which has just been filled with the washing buffer and the sample, as previously described, is inserted into the automaton whose temperature setpoint is 65 ° C (preheating carried out).
- the initial position of the card is that where the sample and the washing buffer are centered on the RI position.
- the sample is homogenized by 30 continuous oscillations of amplitude ⁇ 30 °, centered on the "RI" position (ie a maximum total amplitude of 60 ° per oscillation), and incubated simultaneously for 5 minutes at 65 ° C.
- the temperature is then stabilized at 42 ° C for 2 minutes, the card then being stationary, in the initial position.
- the temperature of the pad remaining at 42 ° C, a rotation of 140 ° C (anti-clockwise) is performed, which allows the liquid fraction to be centered on the "R2" position.
- the detection process is not carried out here inside the map, but the incorporation during the TMA amplification process of markers (for example fluorescent) allows , by the presence of washing buffers within the card, to carry out the detection of the amplification products by specific capture on probes immobilized in the observation tank.
- markers for example fluorescent
- the HPA detection was here carried out in a separate tube on 10 ⁇ l of reaction mixture (1/5 of reaction) supplemented with 90 ⁇ l of water, to which are added 100 ⁇ l of acridinium ester probe. The tube is incubated for 15 minutes at 60 ° C (water bath) to hybridize the probe, and a selection step is carried out with 300 ⁇ l of selection reagent.
- the interest of such a device according to the invention is important, in particular in the field of molecular biology, including techniques such as TMA make it possible to carry out sensory detection of pathogenic agents quickly.
- these techniques given their performance, are very sensitive to environmental contamination or brought during handling to carry out the intermediate steps of adding or mixing reagents, thus leading to false positive tests.
- the present invention makes it possible to carry out the amplification steps in a confined and isolated manner, and optionally to chain them with the detection steps, from the introduction of a sample within the disposable device.
- the latter can therefore contain ready-to-use reagents in stabilized form, the conditioning and preparation of which can be carried out in a controlled environment free from contamination.
- the experimenter must simply ensure that there is no contamination during the steps of preparing the sample, before carrying out the test and when it is introduced into the card. More generally, when the detection steps are also integrated within the card, the elimination and destruction of the laboratory card without ever opening the latter, authorize the carrying out of all the steps located upstream of such a test. amplification and detection; pretreatment of clinical samples, lysis of microorganisms, extraction of nucleic acids can be carried out in the same working environment, without risk of producing erroneous results.
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Abstract
Dispositif d'analyse (1) comprenant un corps (2) dans lequel sont disposés ou ménagés: un orifice (3) d'introduction d'un échantillon liquide de départ; un circuit (5) de circulation de liquide, comprenant au moins une enceinte opératoire (6) pour un échantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, communiquant avec ledit orifice d'introduction (3), ledit circuit de circulation décrivant, dans au moins deux dimensions de la carte, une ligne géométrique déterminée, en sorte que tout changement d'orientation de la carte dans un référentiel tridimensionnel, comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide par gravité uniquement, d'une section à une autre dudit circuit, par exemple d'un côté ou de l'autre avec l'enceinte opératoire (6); caractérisé en ce que, le circuit (5) de circulation est continu et bouclé sur lui-même entre ledit orifice d'introduction (3) et ladite enceinte opératoire (6).
Description
Carte d*analyse à usage unique comprenant un conduit d'écoulement de liquides
La présente invention concerne l'analyse d'un ou plusieurs échantillons liquides différents, dans lequel ou lesquels on cherche à identifier, détecter et/ou quantifier un ou plusieurs analytes, selon tous processus simples ou complexes d'analyse, mettant en jeu un ou plusieurs réactifs différents, selon la nature chimique, biochimique, biologique, ou physique du ou des analytes recherchés.
Les principes techniques, définis et décrits ci- après, ne sont pas limités à un analyte particulier, ce terme générique désignant aussi bien une composition, un composé, que toutes espèces chimiques, biochimiques, ou biologiques ou autres entités, la seule condition requise étant que l'analyte soit distribué dans l'échantillon liquide de départ, à analyser, en suspension ou solution. En particulier, le processus d'analyse mis en oeuvre peut être effectué, sous formes homogène ou hétérogène, ou mixte.
A titre d'exemple non limitatif, la présente invention sera néanmoins illustrée par référence à l'analyse biologique, d'un ou plusieurs ligands, nécessitant pour leur détection et/ou quantification l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Par "ligand", on entend toute espèce biologique, par exemple un antigène, un anticorps, un acide nucléique, un fragment d'acide nucléique, ou un oligonucléotide, susceptible de se lier, avec un anti-ligand. Par conséquent, un exemple d'application des techniques d'analyse décrites ci-après concerne les immuno-essais, quel que soit leur format, par exemple par analyse directe ou par compétition. Mais bien entendu, dans le domaine biologique, les techniques d'analyse décrites ci-après sont appliquées de la même manière à la détection et/ou la quantification d'un matériel nucléique ou de nucléotides.
Dans le domaine de l'analyse biologique en particulier, et à titre de produits jetables ou à usage unique, des dispositifs ou cartes d'analyse sont actuellement fabriqués et disponibles, lesquels comprennent de manière générale un corps sous forme de plaque, dans lequel sont disposés ou ménagés : un orifice d'introduction d'un échantillon liquide de départ; une pluralité ou multiplicité d'enceintes opératoires, contenant des réactifs respectivement différents, et agencées chacune pour recevoir une quote- part ou aliquote de l'échantillon liquide de départ, traitée dans chaque dite enceinte opératoire;
- une pluralité ou multiplicité de conduits de transfert de liquide, disposés en parallèle les uns par rapport aux autres, et communiquant chacun d'un côté avec l'orifice d'introduction et de l'autre côté avec une enceinte opératoire.
Avec une telle carte d'analyse, dont le volume interne constitué par les éléments précités a été préalablement mis sous vide ou sous dépression, on introduit l'échantillon liquide de départ, à analyser, par l'orifice d'introduction, moyennant quoi le liquide de l'échantillon se trouve introduit et distribué, sans autre intervention, dans les différentes enceintes opératoires. Puis la carte d'analyse est scellée au niveau de son orifice d'introduction, puis soumise à différents traitements, notamment d'incubation, pour développer les réactions propres au processus d'analyse retenu dans les différentes enceintes opératoires, respectivement. Et finalement, la détection et/ou quantification des produits de réaction, par exemple par voie optique, dans les différentes enceintes opératoires, fournit un ensemble d'informations qualitatives et/ou quantitatives, permettant d'exprimer un résultat d'analyse.
Comme dit précédemment, les différentes étapes ou séquences requises par l'analyse, une fois la carte d'analyse scellée, sont en général mises en oeuvre de manière automatique dans un équipement d'analyse approprié, contrôlé ou commandé, notamment programmé pour dérouler automatiquement les opérations requises.
Il résulte de la description précédente qu'une telle carte d'analyse constitue en quelque sorte un composant passif, au sens où il n'est plus possible de déplacer un même échantillon liquide de départ, ou un échantillon liquide traité, d'une enceinte opératoire à une autre, pour effectuer au sein de la même carte d'analyse tout processus de traitement requis pour la détermination de l'analyte. Conformément au document EP-A-0 339 277, on a décrit une carte d'analyse constituant un composant actif, au sens où son agencement permet de déplacer tout échantillon liquide d'un endroit à un autre de la carte. A cette fin, le dispositif d'analyse proposé comprend un corps de forme aplatie, dans lequel sont disposés ou ménagés:
- outre un orifice d'introduction d'un échantillon liquide de départ,
- un circuit de circulation de liquide, susceptible d'être isolé de l'extérieur, par obturation définitive de l'orifice d'introduction, comprenant au moins une enceinte opératoire pour l'échantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, et communiquant avec ledit orifice d'introduction; ce circuit de circulation décrit, dans deux dimensions de la carte, une ligne géométrique composée d'une extrémité à une autre de branches successives, dont certaines en "cul de sac", en sorte que, dans un plan ou référentiel vertical, tout changement d'orientation de la carte, fait circuler le liquide par gravité uniquement, d'une section ou branche à une autre section ou branche du même circuit,
par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire.
Une telle carte, de dimensions relativement importantes, permet de faire circuler tout liquide par simple gravité, dans le circuit de circulation isolé par rapport à l'extérieur, en raison de la section relativement importante ou ouverte dudit circuit.
Tel n'est pas le cas avec une carte de dimensions relativement faibles, et/ou mettant en oeuvre un circuit de section relativement faible, du type conduit capillaire, pour lequel les forces de tension superficielle s'opposent à la circulation de tout liquide, lorsque ledit circuit est isolé de l'extérieur.
La présente invention a donc pour objet un dispositif d'analyse, notamment carte d'analyse à usage unique, permettant, une fois ledit dispositif scellé ou fermé par rapport à l'extérieur, une circulation régulière de tout échantillon liquide, y compris dans le cas d'un circuit de circulation de type capillaire. Comme précédemment, la gravité est retenue comme source de déplacement ou mouvement de tout liquide au sein de la carte. Et selon l'invention, le circuit de circulation est à la fois continu, et bouclé sur lui-même, entre l'orifice d'introduction et l'enceinte opératoire. En particulier, lorsque le dispositif comprend au moins un conduit de transfert de liquide, disposé ou ménagé dans le corps, communiquant d'un côté avec l'orifice d'introduction, et de l'autre côté avec l'enceinte opératoire, le circuit de circulation continu est bouclé sur le conduit de transfert.
Par "continu", on entend la caractéristique selon laquelle toute portion du circuit de circulation considéré comporte de part et d'autre respectivement deux orifices d'entrée et/ou sortie. Cette qualification s'oppose en particulier à la notion de "cul de sac", qui implique que la portion du circuit considéré ne comporte qu'un seul
orifice d'entrée et/ou sortie. Cette qualification n'est pas exclusive de la caractéristique selon laquelle un ou plusieurs circuits ou conduits, eux-mêmes "sans issue" peuvent communiquer avec ou se brancher sur le circuit continu considéré.
Par "bouclé sur lui-même" , on entend la caractéristique selon laquelle le circuit continu de circulation forme dans l'espace, c'est-à-dire dans le volume du corps de la carte d'analyse, une boucle complète, en sorte que tout volume de liquide présent dans le conduit se trouve sensiblement en équi-pression des deux côtés de la colonne de liquide ainsi formée. Une telle caractéristique permet de déplacer cette même colonne de liquide, sans aucune contrainte ou résistance, puisque le volume gazeux poussé d'un côté se trouve recyclé ou renvoyé de l'autre côté de la même colonne. Bien entendu, comme dit plus haut, ce conduit continu de circulation, bouclé sur lui-même communique par ailleurs avec un ou plusieurs orifices d'introduction des échantillons liquides, et un ou plusieurs orifices d'évent, comme décrit ci-après.
Par conséquent, selon l'invention, la circulation des liquides s'effectue dans la carte d'analyse, par simple gravité, sans résistance particulière, résultant de la dépression créée par l'écoulement ou la capillarité, et ce uniquement en changeant l'orientation de la carte. Bien entendu, pour obtenir un tel déplacement, il faut disposer d'une hauteur de liquide suffisante, pour l'échantillon liquide traité ; mais l'homme de métier est à même de déterminer cette hauteur minimum, en fonction notamment du liquide traité et de ses caractéristiques, et de celles du conduit continu de circulation, et ceci par des essais de routine.
Préférentiellement, lorsque le corps de la carte d'analyse a la forme d'une plaque, la ligne géométrique décrite par le circuit continu de circulation comprend au
moins un segment planaire, situé dans un plan, par exemple parallèle ou confondu avec l'une des faces de la plaque; et ce segment planaire décrit lui-même une ligne régulière, par exemple selon au moins une portion sensiblement circulaire, en sorte que la plaque étant disposée verticalement, le changement d'orientation de la carte, par exemple autour d'un axe perpendiculaire à la plaque et passant sensiblement par le centre de ladite portion circulaire, fait circuler le liquide d'une section à une autre du circuit continu de circulation.
La portion considérée du segment planaire de circulation peut être également de forme sinusoïdale.
La carte d'analyse précédemment définie présente bien d'autres avantages. La circulation du liquide sous simple gravité, c'est-à-dire sans mettre en oeuvre ou en jeu des énergies importantes, permet d'éviter pratiquement toute formation de bulles, par dissolution ou relargage des gaz, au sein des liquides en circulation. Mieux encore, la circulation d'un échantillon liquide au sein de la carte, présentant lui-même au départ des bulles ou microbulles, permet pratiquement en totalité d'éliminer ou dégazer ces dernières. Ceci constitue un avantage fondamental, compte tenu en particulier de la taille, par exemple capillaire, des veines liquides susceptibles de circuler dans de telles cartes, étant entendu que la présence de bulles, aussi petites soient telles, perturbe ou contrarie, non seulement le régime d'écoulement des liquides, mais aussi la précision de leur déplacement et de leur observation, par exemple par voie optique, et par conséquent influence la qualité de l'analyse.
Et le dispositif ou carte d'analyse selon l'invention peut être aisément manipulé ou traité, ce qui veut dire que l'équipement correspondant est agencé avec des mécanismes ou automatismes, notamment une robotique, particulièrement simple.
La présente invention est maintenant décrite par référence au dessin annexé, dans lequel :
- la Figure 1 représente en perspective, et avec arrachement partiel, une carte d'analyse selon un premier mode d'exécution de l'invention les Figures 2 et 3 représentent des coupes partielles verticales respectivement selon les lignes II- II et III-III de la Figure 1
- les Figures 4, 5 et 6 représentent des vues schématiques de la carte d'analyse représentée à la Figure
1, pour trois phases de manipulation de la carte d'analyse respectivement différentes les Figures 7 à 9 représentent de manière schématique trois modes respectivement différents du moyen d'arrêt du liquide, représenté schématiquement à la Figure 1 sous la référence 18
- la Figure 10 représente en vue de face une carte d'analyse selon un deuxième mode d'exécution de l' invention - la Figure 11 représente une vue en coupe verticale partielle de la carte d'analyse selon Figure 10
- les Figues 12 à 15 représentent trois modes d'exécution différents du moyen d'obturation définitive d'un orifice d'évent, et/ou d'un orifice d'introduction, portant la référence numérique 9 sur toutes les figures.
- la Figure 16 représente de manière schématique une carte d'analyse, vue de face, selon un troisième mode d'exécution de l'invention
- la Figure 17 représente, toujours vue de face, une carte d'analyse selon l'invention, selon un quatrième mode d'exécution la Figure 18 représente une vue en coupe verticale, selon la ligne XVIII-XVIII de la Figure 17, de la carte d'analyse montrée à la Figure 17 - les Figures 19 et 20 représentent, de manière schématique, la carte d'analyse représentée à la Figure
17, dans deux positions respectivement différentes correspondant à deux phases de manipulation différentes de la carte d'analyse
- la Figure 21 représente un mode d'exécution d'un dispositif selon l'invention, tel qu'utilisé pour l'essai décrit à l'exemple 1.
Il doit être préalablement entendu que les représentations des dessins ne sont pas à l'échelle réelle, et qu'en particulier la dimension du ou des conduits de circulation a été volontairement exagérée, aux fins de l'explication de la présente invention.
D'un point de vue fluidique, la carte d'analyse 1 représentée à la Figure 1 comprend un circuit 5 continu de circulation de liquide, intégré ou disposé au moins pour partie dans le corps 2 ayant la forme d'une plaque, de la carte d'analyse 1.
Comme le montre la Figure 1, et toujours sous l'angle fluidique, le circuit 5 continu de circulation rassemble selon une boucle : - une enceinte opératoire 6, qui peut être matérialisée ou non, notamment par la présence interne de réactif;
- un conduit de transfert 7 communiquant par une voie en dérivation avec un orifice 3 d'introduction d'un échantillon liquide de départ;
- un conduit 61 de retour vers le conduit de transfert 7, communiquant par une dérivation avec un orifice d'évent 8;
- une cuve d'observation 17. Par "enceinte opératoire", on entend toute enceinte, quelle que soit sa forme matérielle, permettant d'effectuer toute opération ou traitement de l'échantillon liquide traité, dans le laps de temps pendant lequel ledit échantillon séjourne dans ladite enceinte. L'opération considérée peut être de nature physique, mécanique, chimique, biochimique, ou biologique. A cette fin,
l'enceinte considérée peut contenir, préalablement (par exemple sous forme sèche et/ou liquide) , ou au moment de l'opération ou traitement, tous réactifs ou moyens matériels aidant ladite opération. Par "cuve d'observation", on entend tout moyen ménagé ou disposé dans le corps, permettant d'obtenir une information qualitative et/ou quantitative à partir d'un ou plusieurs paramètres ou caractéristiques, observés directement ou indirectement dans tout liquide présent dans ladite cuve 17. A titre d'exemple, et pour une analyse biologique, la cuve d'observation, qui communique avec et est comprise dans le circuit 5, est agencée, notamment avec des parois transparentes, pour détecter ou mesurer un paramètre, notamment optique, par exemple une fluorescence, pour obtenir un signal représentatif de la présence et/ou de la quantité d'un analyte biologique, par exemple un anticorps, un acide nucléique ou analogue.
Il résulte de la description précédente, que mis à part les dérivations ou branchements vers l'orifice d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8, le circuit 5 est bouclé sur lui-même, au sens où un échantillon liquide y circulant à partir d'un point donné peut être recyclé vers ce point.
Selon l'invention, le circuit continu 5 de circulation décrit dans deux dimensions de la carte 1, une ligne géométrique déterminée, en l'occurrence circulaire, en sorte que tout changement d'orientation de la carte, disposée verticalement, comme montré à la Figure 4, par rapport à un référentiel tridimensionnel comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide présent dans le circuit, uniquement par gravité d'une section à une autre, par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire 6, et ceci de manière contrôlée en fonction de l'amplitude du changement d'orientation par rapport au référentiel précité.
En pratique, comme montré à la Figure 1, le corps
2 ayant la forme d'une plaque, la ligne géométrique décrite par le circuit 5 comprend un segment planaire 51, confondu avec la face 2a de la plaque, et ce segment planaire 51 comprend ou est constitué par une portion sensiblement circulaire, formant ainsi une ligne régulière. De cette manière, la carte d'analyse 1 étant disposée verticalement, tout changement d'orientation de la carte dans le plan vertical autour d'un axe 77 perpendiculaire à la plaque 2, et passant de préférence sensiblement par le centre de la portion circulaire définie par le segment planaire 51, fait circuler le liquide d'une section à une autre du circuit 5, par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire 6.
Il doit être entendu que la ligne géométrique décrite par le segment planaire 51 peut être régulière ou brisée, et que ce même segment peut comprendre aussi bien une portion sensiblement circulaire qu'une portion sensiblement sinusoïdale. Mais cette ligne géométrique demeure continue, au sens de la définition énoncée précédemment.
Comme le montre la Figure 1, l'orifice d'évent 8 communique avec le circuit 5 en un point de jonction différent du point de jonction de l'orifice d'introduction
3 avec le circuit 5.
De manière non représentée, mais comme il sera décrit ci-après par référence aux Figures 11 à 15, l'orifice d'évent 8 et l'orifice d'introduction 3 comportent ou sont associés à des moyens d'obturation définitive, par exemple scellement.
Une cuve de décantation 15 est disposée ou ménagée dans le corps 2, en aval de l'orifice d'introduction 3, dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, et le circuit 5 peut être bouclé soit sur la cuve 15 de décantation, soit en aval de cette dernière.
L'enceinte opératoire 6 est délimitée dans le circuit 5 continu de circulation, dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, par au moins un moyen d'arrêt 18 du liquide introduit, choisi ou agencé pour libérer le passage dudit liquide sous l'effet d'une charge hydrostatique minimum. A cette fin, différents moyens représentés aux Figures 7 à 9 peuvent être utilisés:
- le moyen d'arrêt 18 est un agencement local du circuit 5 continu de circulation, générant une perte de charge, par exemple par un étranglement 19 montré à la Figure 9, ou une chicane 20 montrée à la Figure 8 ; cette chicane 20 est obtenue, en passant de la face supérieure 2a à la face inférieure 2b du corps 2 par un premier conduit vertical traversant, en circulant sur la face inférieure 2b, puis en remontant vers la face supérieure 2a, par un deuxième conduit traversant;
- de manière non représentée, le moyen d'arrêt 18 peut être constitué par un revêtement local et ponctuel, hydrophobe, du circuit 5, par conséquent à faible mouillage, contrariant, en l'absence d'une charge minimum, la circulation du liquide; de manière plus particulière, et comme représenté à la Figure 7, le moyen d'arrêt 18 est constitué par deux encoches, disposées l'une en face de l'autre, de part et d'autre du conduit 5, et formant avec lui une zone locale de rétention du liquide.
En termes de réalisation, la carte d'analyse 2 est obtenue pour l'essentiel, par moulage de précision d'une matière plastique technique, compatible avec les liquides traités. De cette manière, directement obtenu par moulage, le circuit 5 est formé au moins pour partie par un canal 25, ménagé au moins pour partie à la surface de l'une 2a et/ou l'autre face 2b, étant entendu que, comme le montre la combinaison des Figures 1 et 8, le circuit 5 s'étend sur l'une 2a et/ou l'autre face 2b du corps, parallèles
l'une à l'autre, en traversant éventuellement de part en part le corps 2, localement, à un ou plusieurs endroits du circuit continu de circulation 5.
De manière à assurer l'étancheite du circuit 5 par rapport à d'autres circuits ou conduits présents sur le corps 2, mais aussi par rapport à l'extérieur, les deux faces 2a et 2b du corps 2 sont revêtues de manière étanche, par deux feuilles ou films, par exemple en matière plastique transparente, 22. Compte tenu du processus d'analyse à effectuer au sein de la carte 1, l'enceinte opératoire 6 comprend, de manière libre ou fixée par rapport au corps, un ou plusieurs réactifs. Cette fixation peut consister aussi bien dans une liaison chimique covalente du réactif sur la paroi du circuit 5, que dans une liaison faible, par exemple par adsorption ou absorption du réactif sur cette même paroi.
Le fonctionnement de la carte d'analyse 1 peut être expliqué par référence aux Figures 4 à 5, la carte d'analyse 1 étant disposée verticalement.
Par référence à la Figure 4, l'orifice d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8 sont ouverts. On introduit l'échantillon liquide à analyser, associé ou non à un réactif, par l'orifice 3, moyennant quoi il forme une colonne liquide 62 au bas du circuit 5 en équilibre, et au contact du réactif contenu dans l'enceinte opératoire 6. Puis les orifices 8 et 3 sont scellés hermétiquement, de telle sorte que la carte se trouve isolée par rapport à l'extérieur. Par rotation angulaire de la carte 5, de plus ou moins 45° (selon le sens trigonométrique) , on fait circuler l'échantillon liquide, dans un sens puis dans l'autre, au contact du réactif, de telle sorte qu'une réaction se développe entre l'échantillon liquide et le réactif.
Dans la position angulaire représentée à la Figure 5, la colonne de liquide s'est déplacée dans la cuve d'observation 17. Egalement par rotation de part et d'autre de la position angulaire représentée à la Figure 5, on peut faire circuler, dans un sens puis dans l'autre, le liquide au travers de la cuve 17. Ainsi, il est possible de détecter et/ou mesurer l1analyte présent dans la cuve 17.
Une fois la mesure effectuée, on revient à la position initiale, représentée à la Figure 6, et la carte d'analyse utilisée peut être jetée.
La carte d'analyse selon le deuxième mode d'exécution (conférer Figure 10), diffère du premier mode d'exécution, par les points suivants: - une enceinte 21 est disposée et ménagée à plat, sensiblement au centre du corps 2, et forme une fois scellée une chambre comprise dans le circuit 5 continu de circulation du liquide ; cette enceinte est scellée et obturée par une membrane qui, par enfoncement et relâchement successifs, permet d'aspirer l'échantillon liquide par l'orifice d'introduction 3; l'orifice d'introduction 3 de l'échantillon liquide débouche dans une cuve 15 de décantation, avant de communiquer avec le circuit 5 proprement dit ; la cuve 15 de décantation est pourvue d'au moins un évent 81 et/ou 82 qui est fermé quand la cavité 21 est utilisée pour aspirer le liquide et le faire cheminer dans le conduit 5;
- à la sortie de l'enceinte 21, le circuit 5 est bouclé sur la cuve 15 de décantation, par un conduit traversant, passant de la face 2a à la face 2b du corps 2.
L'enceinte 21 a une autre utilité : elle permet en pratique d'absorber les variations de pression, au sein de la carte d'analyse.
Comme montré par les Figures 2 à 14 , le moyen d'obturation définitive de l'orifice 3 ou 16 (cf Figure
17) et des évents 81,82, peut être choisi parmi les moyens suivants:
- conformément à la Figure 12 , ce moyen est un opercule 10 d'obturation définitive; - conformément aux Figures 13 et 14, ce moyen d'obturation associe le conduit d'introduction 11 de l'échantillon liquide, dont l'extrémité active lia peut prendre deux positions par rapport au corps 2 , à savoir une position rétractée (Figure 13) communiquant de manière étanche avec une cavité d'introduction 12 du liquide, et une position avancée (Figure 14) , pénétrant de manière étanche dans un orifice borgne 13 calibré, ménagé dans le corps 2; dans cette dernière position, le conduit d'introduction 11 est scellé; - et une bande adhésive 14 qui est rapportée, de manière étanche, et adhésive sur l'orifice 3, cf Figure 15.
La carte d'analyse selon le troisième mode d'exécution (cf Figure 16) , diffère du premier mode d'exécution par le fait que le segment planaire 51 du circuit 5 décrit une ligne constituée par au moins deux portions 511 et 512 sensiblement circulaires, concentriques, reliées entre elles en série, par un conduit traversant de part en part le corps 2. Bien entendu, comme non décrit spécifiquement par référence à des figures, mais de manière parfaitement compréhensible pour l'homme de métier, les variantes suivantes peuvent être apportées :
- plusieurs enceintes opératoires 6 peuvent être ménagées et disposées dans le corps 2, en étant comprises en série dans le circuit 5 continu de circulation, de telle sorte que le changement d'orientation contrôlée de la carte 2, permet de faire circuler de manière adaptée l'échantillon liquide dans l'une et/ou l'autre enceinte opératoire;
- plusieurs circuits 5 continus de circulation de liquide peuvent être disposés ou ménagés dans le corps 2, et être reliés entre eux, en série et/ou en parallèle.
A cet égard, les circuits 5 différents peuvent communiquer avec le même orifice d'introduction 3 ou 16, ou respectivement avec deux orifices distincts 3 et 16, pour deux échantillons liquides respectivement. A cet égard, les circuits 5 peuvent communiquer avec la même cuve d'observation 17, ou respectivement chacun avec une cuve 17 d'observation distincte pour chaque échantillon traité.
La carte d'analyse selon le quatrième mode d'exécution de l'invention (conférer Figures 17 à 20), diffère du premier mode d'exécution par les caractéristiques suivantes.
Comme pour la Figure 16, le circuit 5 comporte un segment planaire 51, constitué par deux portions sensiblement circulaires 511 et 512, et concentriques, reliées entre elles en série, et ceci en passant au- dessous de la portion 511, comme montré à la Figure 18, sur sa partie droite.
Il existe deux orifices d'introduction de liquide ou réactif, séparés, à savoir 3 et 16.
Un circuit annexe 23 est disposé ou ménagé dans le corps 2 sur la face 2a de la plaque correspondante, et comprend:
- une cavité 24, ménagée sur la face 2a, reliée par un conduit d'évacuation 67 au circuit continu de circulation 5, et par un conduit 67 à l'évent 8; - un conduit de transfert 65, disposé ou ménagé sur la face inférieure 2b, reliant, d'un côté l'orifice d'introduction 16, et de l'autre côté la cavité 24, en son centre.
Il résulte de la description précédente que le circuit annexe 23 communique d'un côté avec le circuit 5,
et ne comporte de l'autre côté aucune issue ou sortie, autre que 1•évent 8.
Il résulte aussi de la géométrie du circuit annexe 23, et en particulier de la disposition de la cavité 24, montrées à la Figure 17, que :
- tout changement d'orientation de la carte dans un sens de rotation négatif (par rapport au sens trigonométrique) , selon une amplitude limitée, interdit l'introduction de tout liquide contenu dans la cavité annexe 24, dans le circuit 5;
- et inversement, tout changement d'orientation dans l'autre sens de rotation, c'est-à-dire dans le sens positif, permet d'introduire tout liquide contenu dans la cavité 24 dans le circuit 5 principal. La caractéristique précédente est évidemment utile, pour stocker provisoirement un réactif, et l'introduire de manière contrôlée dans le circuit 5, à tout moment du processus d'analyse.
C'est ce que montre en particulier le changement d'orientation entre les Figures 19 et 20, permettant d'introduire le réactif dans la boucle principale.
Par ailleurs, par référence aux figures 17 à 20, le liquide (réactif par exemple) est injecté au niveau de l'orifice d'introduction 16, et grâce au conduit 65 remplit la cavité 24, par un orifice de sortie émergeant au sommet d'un téton, situé sensiblement au centre et aux deux tiers de la hauteur de la cavité 24. Une fois la cavité 24 remplie, lors de la rotation de la carte dans le sens de rotation négatif, le liquide reste confiné dans cette cavité, puis par une nouvelle rotation, toujours dans le sens négatif, le liquide demeure dans cette même cavité, à la condition que la quantité de liquide soit prédéterminée pour ne pas ressortir par l'orifice de sortie, situé aux deux tiers de la hauteur de la cavité 24.
EXEMPLE
Un exemple de mise en oeuvre d'un dispositif d'analyse conforme à la Figure 16 est maintenant décrit.
L'utilisation de ce dispositif pour l'entraînement automatisé et confiné d'étapes biologiques a été validée dans le cadre de la réalisation d'un test de détection de l'agent de la tuberculose : la bactérie MyσoJbacterium tuberculoses .
Pour ce faire, des composants de la trousse de diagnostic "MTD-2" disponible auprès de la société Gen- Probe (San Diego, Californie) , ont été utilisés. Le principe de ce test repose sur l'amplification sélective in vitro d'acides nucléiques cibles (ARN ribosomique 16S) par la technique "Transcription-Mediated Amplification" (TMA) , suivie de la détection luminescente des produits d'amplification par la technique homogène "Hybridization Protection Assay " (HPA) .
Le test d'amplification "MTD-2" a été réalisé selon le protocole manuel du fournisseur avec quelques modifications. Brièvement, la réaction a été assemblée en combinant 25 μl d'un contrôle positif (10 exp 6 copies d'une molécule d'ARNr 16S synthétisée in vitro, correspondant environ à 100 cellules bactériennes) ou 25 μl d'un contrôle négatif (eau ultrapure, de résistivité supérieure ou égale à 18 MegaOhms), à 12,5 μl de réactif d'amplification reconstitué, dans un tube 12 x 75 mm de 5 ml (polypropylène) et l'ensemble est recouvert de 200 μl d'huile minérale. Le tube est chauffé pendant 5 minutes à 95°C, refroidi à 42°C pendant 5 minutes (bains secs thermostatés) , puis 12,5 μl de réactif enzymatique sont ajoutés et mélangés par agitation douce. La réaction est incubée pendant une heure à 42°C (bain marie), puis disposée sur glace en attendant d'être soumise à l'étape de détection par HPA. La détection HPA a été réalisée dans un tube séparé sur 10 μl de mélange reactionnel (1/5 de réaction)
complétés par 90 μl d'eau, auxquels sont ajoutés 100 μl de sonde ester d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15 minutes à 60°C (bain marie) pour réaliser l'hybridation de la sonde, et une étape de sélection est réalisée par 300 μl de réactif de sélection. Chaque tube est alors incubé 15 minutes à 60°C. Les réactions sont ensuite refroidies à température ambiante (5 minutes) , puis directement lues sur le luminomètre Gen-Probe pendant 3 secondes. Les résultats de luminescence obtenus (en Unités de Luminescence Relative, RLU) sont de 4 319 456 RLU pour le contrôle positif et de 1 282 RLU pour le contrôle négatif, le seuil de positivité indiqué par le fabricant étant de 30 000 RLU. L'automatisation des étapes d'amplification a été réalisée avec une carte ou dispositif 1 selon la Figure 21, obtenue dans un corps 2, usiné dans une plaque carrée de 10 cm de coté et 3 mm d'épaisseur. La carte est rendue fonctionnelle par apposition d'un film adhésif 22 transparent de type BOPP sur le corps, afin de réaliser la fermeture étanche du circuit de circulation 5. Au préalable, une bille solide de réactif enzymatique est déposée et contenue dans une mini-cuvette prévue à cet effet, en position "R2" du circuit de circulation. Cette bille de 2 mm de diamètre est obtenue par lyophilisation de gouttelettes d'une solution de tréhalose (20%) contenant l'équivalent d'une dose unitaire d'enzyme nécessaire à la réalisation d'une réaction d'amplification TMA. Une telle forme de réactif présente l'avantage d'être stable pendant des mois à température ambiante et de se dissoudre instantanément au contact d'une solution aqueuse. La carte ainsi constituée est considérée comme le dispositif d'analyse au sein duquel les étapes d'amplification à partir d'un échantillon sont réalisées de manière automatique.
L'essai au sein du dispositif débute par une phase d'introduction initiale unique de réactifs par le manipulateur ou un appareil de distribution de liquides. 150 μl de tampon de lavage (PBS IX, Tween-20 0,5%) sont introduits dans le segment circulaire externe de la carte, par l'orifice 81 communiquant avec le circuit 5, au dessous de la position selon le segment circulaire interne "RI". L'échantillon a tester est composé de 25 μl contrôle positif ou négatif comme précédemment décrit, additionnés de 12,5 μl de tampon de dilution d'enzyme (Enzyme Dilution Buffer, Gen-Probe) et 12,5 μl de réactif d'amplification reconstitué. L'ensemble est injecté par l'orifice 8 en position "RI" de la carte.
Le dispositif est inséré verticalement dans un automate piloté par ordinateur, dont un programme permet le contrôle simultané des étapes de rotation de la carte autour de son axe central (vitesse, amplitude, accélération, polarité, enchaînements) et de la température des liquides contenus dans les segments circulaires externe et interne de la carte, par le biais d'un patin chauffant. Ce patin chauffant est en contact direct avec le film adhésif du dispositif, la faible épaisseur de celui-ci assurant un parfait échange thermique pour le contrôle de la température à l'intérieur du segment liquide situé à son niveau. Le patin recouvre les segments circulaires sur une amplitude angulaire de 45° de part et d'autre de la position inférieure du dispositif (aplomb de la position "RI") , position où se trouvent en permanence les liquides, quelle que soit la rotation du dispositif, du fait de l'effet combiné de la gravité et du piston liquide, propre à la présente invention. Le patin chauffant est régulé par une sonde thermocouple; son chauffage est actif, tandis que son refroidissement est passif, sous l'action d'un flux d'air à température ambiante (20-25°C) véhiculé par une pompe sous une pression de 0,5 bar.
Le programme de traitement du dispositif ou carte s'effectue comme suit : la carte venant d'être remplie avec le tampon de lavage et l'échantillon, comme précédemment décrit, est insérée dans l'automate dont la consigne de température est de 65°C (préchauffage effectué) . La position initiale de la carte est celle ou l'échantillon et le tampon de lavage sont centrés sur la position RI. L'échantillon est homogénéisé par 30 oscillations continues d'amplitude ± 30°, centrées sur la position "RI" (soit une amplitude totale maximum de 60° par oscillation) , et incubé simultanément pendant 5 minutes à 65°C. La température est ensuite stabilisée à 42°C pendant 2 minutes, la carte étant alors immobile, en position initiale. La température du patin restant à 42°C, une rotation de 140°C (sens inverse des aiguilles d'une montre) est effectuée, ce qui permet à la fraction de liquide d'être centrée sur la position "R2". 6 oscillations continues d'amplitude ± 45° centrée sur la position "R2" (soit une amplitude totale maximum de 90°) assurent la parfaite dissolution de la bille de réactif enzymatique, puis une rotation de 140° (sens des aiguilles d'une montre) est effectuée afin de repositionner le milieu reactionnel au niveau de "RI". La carte est incubée à 42°C en position fixe pendant une heure. Afin de déterminer l'efficacité du procédé d'amplification TMA automatisé au sein du dispositif à usage unique de la présente invention, le milieu reactionnel est prélevé et disposé sur glace avant d'être dosé selon la méthode HPA de référence. Pour des raisons d'instrumentation propres à la méthode de référence, le processus de détection n'est pas réalisé ici à l'intérieur de la carte, mais l'incorporation durant le procédé d'amplification TMA de marqueurs (par exemple fluorescents) permet, par la présence de tampons de lavage au sein de la carte, de réaliser la détection des produits d'amplification par capture spécifique sur des sondes
immobilisées dans la cuve d'observations. La détection HPA a ici été réalisée dans un tube séparé sur 10 μl de mélange reactionnel (1/5 de réaction) complétés par 90 μl d'eau, auxquels sont ajoutés 100 μl de sonde ester d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15 minutes à 60°C (bain marie) pour réaliser l'hybridation de la sonde, et une étape de sélection est réalisée par 300 μl de réactif de sélection. Chaque tube est lors incubé 15 minutes à 60°C. Les réactions sont ensuite refroidies à température ambiante (5 minutes) , puis directement lues sur le luminomètre Gen-Probe pendant 3 secondes, comme dans le cadre des essais manuels, selon le protocole préconisé pour l'utilisation de la trousse de diagnostic "MTD-2" (Gen-Probe) . Les résultats de luminescence obtenus (en Unités de Luminescence Relative, RLU) sont, dans le cas du processus précédemment décrit, de 3 822 510 RLU pour le contrôle positif et de 2 357 RLU pour le contrôle négatif, le seuil de positivité indiqué par le fabricant étant de 30 000 RLU. Ces résultats montrent donc que la détection du contrôle positif s'effectue correctement, tandis que le contrôle négatif ne génère aucun signal significatif.
L'analyse comparée des résultats du test "MTD-2", dont la partie amplification TMA a été réalisée manuellement, ou automatiquement selon l'invention, démontre donc que la transposition d'un essai manuel vers un dispositif selon l'invention est réalisable et que la carte à usage unique selon invention permet de réaliser l'ensemble des étapes biologiques d'un test réalisant, comme en mode manuel et de manière aussi sensible, la détection de l'équivalent de 100 bactéries.
L'intérêt d'un tel dispositif selon l'invention est important, en particulier dans le domaine de la biologie moléculaire, dont des techniques telles que la TMA permettent de réaliser de manière sensible et rapide la détection d'agents pathogènes. Néanmoins, ces
techniques, étant données leurs performances, sont très sensibles aux contaminations de l'environnement ou amenées lors des manipulations pour la réalisation des étapes intermédiaires d'addition ou de mélange de réactifs, conduisant alors à des essais faussement positifs. La présente invention permet de réaliser les étapes d'amplification de manière confinée et isolée, et de les enchaîner éventuellement avec les étapes de détection, à partir de l'introduction d'un échantillon au sein du dispositif à usage unique. Ce dernier peut donc contenir sous forme stabilisée des réactifs prêts à l'emploi, dont le conditionnement et la préparation sont réalisables dans un environnement contrôlé exempt de contaminations. L'expérimentateur doit s'assurer simplement de l'absence de contamination lors des étapes de préparation de l'échantillon, préalablement à la réalisation du test et lors de son introduction au sein de la carte. De manière plus générale, lorsque les étapes de détection sont également intégrées au sein de la carte, l'élimination et destruction de la carte du laboratoire sans jamais ouvrir cette dernière, autorisent la réalisation de toutes les étapes situées en amont d'un tel test d'amplification et détection ; prétraitement des échantillons cliniques, lyse des micro-organismes, extraction des acides nucléiques peuvent s'effectuer dans un même environnement de travail, sans risque de production de résultats erronés.
Claims
REVENDICATIONS
1/ Dispositif d'analyse (1) comprenant un corps (2) dans lequel sont disposés ou ménagés :
- un orifice (3) d'introduction d'un échantillon liquide de départ, un circuit (5) de circulation de liquide, comprenant au moins une enceinte opératoire (6) pour un échantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, communiquant avec ledit orifice d'introduction (3), ledit circuit de circulation décrivant, dans au moins deux dimensions de la carte, une ligne géométrique déterminée, en sorte que tout changement d'orientation de la carte dans un référentiel tridimensionnel, comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide par gravité uniquement, d'une section à une autre dudit circuit, par exemple d'un côté ou de l'autre avec l'enceinte opératoire (6), caractérisé en ce que, le circuit (5) de circulation est continu, et bouclé sur lui-même entre ledit orifice d'introduction (3) et ladite enceinte opératoire (6) .
2/ Dispositif selon la revendication l, comprenant au moins un conduit de transfert (7) de liquide, disposé ou ménagé dans ledit corps (2), communiquant d'un côté avec l'orifice d'introduction (3), et de l'autre côté avec l'enceinte opératoire (6), caractérisé en ce que le circuit (5) de circulation est bouclé sur le conduit de transfert (7) . 3/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ligne géométrique décrite par le circuit (5) continu de circulation comprend au moins un segment planaire (51) situé dans un plan, et ledit segment décrit lui-même une ligne régulière ou brisée, en sorte que la plaque (2) étant disposée verticalement, le changement d'orientation de la carte dans le plan vertical
fait circuler le liquide d'une section à une autre du circuit (5) continu de circulation.
4/ Dispositif selon la revendication 3, carac¬ térisé en ce que le segment planaire (51) comprend au moins une portion sensiblement sinusoïdale.
5/ Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que le segment planaire (51) comprend au moins une portion sensiblement circulaire, en sorte que le changement d'orientation de la carte, autour d'un axe (77) perpendiculaire à la plaque (2) , et passant sensiblement par le centre de ladite portion circulaire, fait circuler le liquide d'une section à une autre du circuit (5) continu de circulation.
6/ Dispositif selon la revendication 5, carac- térisé en ce que le segment planaire (51) décrit une ligne constituée par au moins deux portions (511,512) sensiblement circulaires, éventuellement concentriques, reliées entre elles en série.
7/ Dispositif selon la revendication 1, comprenant un orifice d'évent (8), caractérisé en ce que ce dernier communique avec le circuit (5) continu de circulation, en un point de jonction différent du point de jonction de l'orifice d'introduction (3) avec ledit circuit.
8/ Dispositif selon la revendication 7, carac- térisé en ce que l'orifice d'introduction (3) et/ou l'orifice d'évent (8) comportent ou sont associés à des moyens (9) d'obturation définitive, par exemple scellement.
9/ Dispositif d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une cuve (15) de décantation est ménagée ou disposée dans le corps (2) , en aval d'un orifice d'introduction (16), dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, et le circuit continu (5) de circulation est éventuellement bouclé sur ladite cuve. 10/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une cuve d'observation (17)
est disposée ou ménagée dans le corps (2) , et le circuit (5) continu de circulation du liquide comprend ladite cuve d'observation.
11/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que plusieurs circuits (5) continus de circulation de liquide sont disposés, ou ménagés dans le corps (2) , et sont reliés entre eux, en série et/ou en parallèle.
12/ Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que lesdits circuits (5) continus de circulation communiquent avec le même orifice d'introduction (3,16), ou respectivement avec deux orifices d'introduction (3,16) distincts, pour deux échantillons liquides respectivement. 13/ Dispositif selon les revendications 10 et 11, caractérisé en ce que lesdits circuits (5) continus de circulation communiquent avec la même cuve (17) d'observation, ou respectivement avec deux cuves (17) d'observation distinctes. 14/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enceinte opératoire (6) est délimitée dans le circuit (5) continu de circulation par au moins un moyen (18) d'arrêt du liquide, agencé pour libérer le passage dudit liquide sous l'effet d'une charge minimum.
15/ Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le moyen d'arrêt (18) est un agencement local du circuit (5) continu de circulation, générant une perte de charge, par exemple un étranglement (19) ou une chicane (20) .
16/ Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le moyen d'arrêt (18) est constitué par un revêtement local hydrophobe du conduit (5) continu de circulation. 17/ Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le moyen d'arrêt (18) est constitué
par deux encoches disposées en face l'une de l'autre, de part et d'autre du conduit (5) continu de circulation, et formant avec lui une zone locale de rétention du liquide.
18/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une enceinte (21) est disposée ou ménagée dans le corps (2) , et est comprise dans le circuit continu de circulation (5) .
19/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un autre orifice (16) d'introduction d'un échantillon liquide est ménagé dans le corps (2) , et comporte ou est associé à des moyens (9) d'obturation définitive.
20/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que plusieurs enceintes opératoires (6) sont ménagées et disposées dans le corps (2) , et sont comprises en série dans le circuit (5) continu de circulation.
21/ Dispositif selon la revendication 1, le corps
(2) comprenant deux faces (2a,2b) planes en vis-à-vis, par exemple parallèles l'une à l'autre, caractérisé en ce que le circuit continu de circulation s'étend sur l'une (2a) et/ou l'autre face (2b) du corps, en traversant (Fig 11) éventuellement de part en part ledit corps.
22/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'une et/ou l'autre face (2a,2b) du corps sont revêtues chacune, de manière étanch'e, par une feuille (22) , et le circuit (5) continu de circulation est formé au moins pour partie, par un canal (25) ménagé pour partie en surface, sur l'une et/ou l'autre face (2a, 2b) du corps, et par la ou lesdites feuilles fermant ledit canal, de manière étanche par rapport à l'extérieur de la plaque. 23/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enceinte opératoire (6) comprend, de manière libre ou fixée par rapport au corps (2) , un réactif.
24/ Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cuve d'observation (17) est agencée pour permettre une lecture optique.
25/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que, premièrement au moins un circuit annexe (23) est disposé ou ménagé dans le corps, et communique d'un côté avec le circuit (5) continu de circulation du liquide, et ne comporte aucune issue de l'autre côté, deuxièmement une cavité (24) ménagée et disposée dans le corps (2) est comprise dans le circuit annexe (23) , et troisièmement la géométrie du circuit annexe (23) et de la cavité (24) annexe est déterminée en sorte que tout changement d'orientation de la carte dans un sens de référence, interdit l'introduction d'un liquide contenu par la cavité annexe dans le circuit continu (5) de circulation, et tout changement d'orientation dans l'autre sens permet ladite introduction.
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