TW201511833A

TW201511833A - 微流體裝置、用於檢測之系統、使用該系統之檢測方法及該系統之用途

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Publication number: TW201511833A
Application number: TW102135445A
Authority: TW
Inventors: Jackie Y Ying; Saravana Kumar Kumarasamy; ren-sheng Deng
Original assignee: Agency Science Tech & Res
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2015-04-01
Also published as: TWI581861B

Abstract

提供一種微流體裝置，其包含：複數個井，各個井具有入口與出口，其中入口與一或多個輸入流道流體連通，以及出口與一或多個輸出流道流體連通，其中出口藉由出口連接流道連接輸出流道，而入口藉由入口連接流道連接輸入流道，其中出口連接流道之尺寸配置以使包含於井的液體表面張力防止液體通過出口連接流道而釋出。於此亦提供此裝置之系統、方法及用途。

Description

微流體裝置

【0001】

本發明涉及生物化學與生醫工程領域，特別係微流體裝置與用以檢測生物化學分子的微流體裝置。

【0002】

醫院主要關注的是疾病的延遲診斷。舉例來說，多重抗藥性細菌(multi-drug resistant bacteria, MDRB)的延遲診斷，因為此些細菌為高傳染性且些細菌感染的比率於幾個小時內以指數級增加，因此可能造成死亡率與發病率的增高。且由於延誤診斷而治療和住院的患者也造成醫療業巨大的經濟負擔。更進一步，特別係每天通常超過300名患者的病原體，如抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)病原體在進行篩選之面對巨大後勤與經濟負擔的中央醫院。

【0003】

舉例來說，抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染每年耗費美國醫療系統超過200億美元。由於抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染的快速增長率，相較於1995年約佔金黃色葡萄球菌感染的22％，於2004年的60％表明此問題進一步地惡化。於新加坡公立醫院的住院期間中，感染抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)細菌的患者相較未感染的患者，其死亡率可為10倍。且其患者的住院時間亦為4.6倍，並面對高於四倍的醫院相關費用。

【0004】

除了挽救生命，病原體的快速檢測使醫護人員能夠進行即時緩解措施，如隔離患者與決定有效的治療方案。

【0005】

目前表型(phenotypic)診斷方法為緩慢的，診斷時間範圍從18至24小時，且某些疾病甚至更長，例如，結核病約為4至6週。這是因為表型(phenotypic)診斷方法，如用於抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)準確檢測之抗生素藥敏試驗(antimicrobial susceptibility testing)，係大幅地取決於細菌培養的生長率。因此，這些方法基本需要耗時1到4天，在此期間，感染和患者的死亡率將會明顯地增加。因此需要以用於檢測抗性基因的方法，如聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)或即時聚合酶鏈鎖反應(real–time polymerase chain reaction, real–time PCR)，補充現行的表型(phenotypic)方法。即使目標抗性基因的存在可能不賦予表型抗性而新穎抗性基因將不被檢測到，聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)無疑是用於檢測已知目標抗性基因的一種快速及靈敏的分析法。

【0006】

然而，聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)需要在高多重(multiplexed)方法下實施，特定涉及任何給定的細菌物種之大量的抗性基因。舉例來說，於抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染的範例中，醫療保健提供者不僅對為 mecA 之主要抗性基因的存在感興趣，此外他們也想確定細菌與特定序列控制基因，例如16SrRNA與 nuc 、以及其他抗生素(antibiotics)抗性基因，例如 ermA 、 blaZ 、以及 msrA 的存在。事實上，單就抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染而言，感興趣的目標基因超過20個。

【0007】

執行正確的治療亦是如檢測病原體的存在般的關鍵性工作。舉例來說，於抗生素耐藥譜(antibiotic resistance profile)不存在時，傳統觀念建議使用廣效性抗生素(broad-spectrum antibiotics)治療抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染。然而，使用廣效性抗生素(broad-spectrum antibiotics)有缺點。再者，如使用噬菌體等新穎治療需要做進一步的研究，以顯示他們在活體環境中為可行。就目前而言，提供給病患而被廣泛地認為對於抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染是可行的治療選擇之窄範圍(narrow spectrum)的抗生素係使用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)快速篩選所有相關之抗生素抗性基因。

【0008】

於使用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 篩選抗生素抗性基因時，執行多重單一像素聚合酶鏈鎖反應(multiple singleplexed Polymerase Chain Reaction)不是可行的選擇，有兩個原因。首先，此顯著增加每位病患之聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)的數量，而因此限制可同時處理之患者樣本的數量。其次，需要分割於幾個反應中但不涉及培養步驟的單一鼻腔棉棒之限制，使得給定的病患樣品係不利地影響分析的靈敏度。更進一步，如上所述，係篩選多個目標基因。另一方面，多重(multiplexed)聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)將解決這些問題，因為多個抗生素抗性目標基因將於單一的聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)中擴增，藉由多個合併(folds)而有效增加病患處理量。

【0009】

即時聚合酶鏈鎖反應(real-time Polymerase Chain Reaction, real-time PCR)有多重(multiplexed)檢測的能力。然而，檢測目標基因的數量低，一般範圍為1至3個目標物，而於部分範例中係4至5個目標物。低多重法(multiplexing)主要是由於光學區別螢光標定DNA探針的數量限制。因而，發射頻寬有效地限制在500至700nm。再者，通常連接在DNA探針5'端之有機螢光團(fluorophore)的激發(excitation)與發光光譜間有明顯重疊。

【0010】

選擇上，因只需檢測抗性基因的存在與否，所以亦可選擇末端多重聚合酶鏈鎖反應(multiplexed polymerase chain reaction, multiplexed PCR)代替即時聚合酶鏈鎖反應(real-time Polymerase Chain Reaction, real-time PCR)。

【0011】

多重聚合酶鏈鎖反應(multiplexed polymerase chain reaction, multiplexed PCR)於各個引子對擴增某些目標基因之單一的反應中結合多個引子對。而後基因擴增後，使用DNA結合染料，藉由末端檢測分析(end-point detection assay)，例如膠體電泳法(gel electrophoresis)及解鏈曲線分析(melt-curve analyses)確認目標基因的存在。目標基因通常以各個擴增產物(amplicons)的尺寸或解鏈溫度(解鏈曲線分析(melt-curve analyses))為基礎判定。然而，因為兩個不同目標基因的擴增可具有相似的尺寸與/或解鏈溫度，或選擇性地，尺寸與解鏈溫度可能在數值上太過相近，使擴增產物可能無法被準確的判別，而使此檢測方法具有受限的特異性。於此情況下，極有可能以多重(multiplexed)分析從而檢測大量的目標基因。此外，膠體電泳法(gel electrophoresis)係高度耗時與耗力。

【0012】

DNA微陣列被看作為一種末端檢測分析(end-point detection assay)，首先執行多重聚合酶鏈鎖反應(multiplexed polymerase chain reaction, multiplexed PCR)以產生單股擴增產物後，使擴增產物與固定於晶片上的特定序列探針雜交。然而，其工作流程耗時且耗力，從而晶片通過聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)花費數小時培養後，通過一系列清洗步驟。且晶片的表面處理亦需要於晶片表面上固定探針且確保於培養期間DNA係位於探針點上。因為使用機械技術定位探針於晶片表面上，且光學裝置結合用以轉換一視野至另一視野的掃描器，以便掃瞄範圍覆蓋整體晶片的區域，使得高設備成本成為另一項考量。

【0013】

DNA定序(DNA sequencing)為另一項能夠作基因體定序並分析以判斷是否存在已知異常與抗性決定因子的平台技術。然而，DNA定序(DNA sequencing)仍然為可能要花費數天的耗時過程，且其亦可能要折衷於定序速度與其可能造成之定序誤差間。對DNA定序而言DNA純化(DNA purification)係關鍵前驅過程，但因首先要執行整夜的培養由其萃取DNA之獲得純化之特定序列細菌的菌落，使其亦為細菌感染(bacterial infection)與抗生素抗性之快速診斷上的限制因素。

【0014】

最後，最新的定序技術可大幅降低定序的時間，但購買這些機器並執行分析的相關成本居高不下。

【0015】

因此，有必要提供克服或至少改善一或多個上述缺點之一種設備和系統。其係需要快速、高通量、以及和精準的檢測目標分子之方法。

【0016】

於第一態樣中，提供一種微流體裝置，其包含：複數個井，各井具有入口與出口，其中入口與一個或多個輸入流道流體連通，以及出口與一或多個輸出流道流體連通，其中出口藉由出口連接流道連接輸出流道，而入口藉由入口連接流道連接輸入流道，其中配置出口連接流道之尺寸以使包含於井之液體之表面張力防止液體通過出口連接流道而釋出。

【0017】

於第二態樣中，提供一種系統，其包含：如文中所揭露之微流體裝置、配置於裝置之上或下以於使用期間檢測井中之可能反應產物發出的訊號之檢測裝置。

【0018】

於第三態樣中，提供一種使用文中所揭露之系統，自液體樣品中檢測至少一目標分子之方法，其中此方法依序包含：藉由自包含可能目標分子之來源以選擇以允許液體樣品流進複數個井，同時避免液體樣品釋出至輸出流道之流率將液體樣品泵進輸入流道來以液體樣品填充複數個井、藉由自與輸入流道連接之真空來源牽引之真空壓力，移除輸入流道中過剩之液體樣品、將密封物泵進輸入流道後，將密封物泵進輸出流道，從而隔絕各井中之液體樣品、以及檢測由目標分子與檢測探針之間之反應產物所發出的可能訊號。

【0019】

於第四態樣中，提供一種文中所揭露之系統於檢測對抗抗至少一抗菌試劑之細菌之用途。

100‧‧‧微流體裝置

102‧‧‧井

104‧‧‧出口

106‧‧‧出口連接流道

108‧‧‧輸出流道

110‧‧‧入口

112‧‧‧入口連接流道

114‧‧‧輸入流道

140‧‧‧覆蓋材料

150‧‧‧分子信標探針

202‧‧‧聚合酶鏈鎖反應產物

204‧‧‧感光元件相機

204‧‧‧氣體來源

206‧‧‧蠟來源

206‧‧‧透鏡

208‧‧‧真空來源

208‧‧‧注射幫浦

210‧‧‧液體收集器

300‧‧‧系統

302‧‧‧光源

304‧‧‧電腦

306‧‧‧加熱器

308‧‧‧溫度控制器

310‧‧‧取樣口

312b‧‧‧外螺紋

312a‧‧‧內螺紋

314‧‧‧濾片

350‧‧‧遮光體

a、b‧‧‧角度

A1‧‧‧箭頭

d1、d2‧‧‧直徑

h‧‧‧距離

V1、V2、V3、V4、V5、V6‧‧‧開孔

【0020】

本發明將藉由於結合非限制性之實施例與附圖考量時參照詳細描述而更易於理解，其中：

【0021】

第1a圖係顯示根據本揭露之一特定實施例之各個井的俯視繪示圖。第1b圖係顯示於揭露之微流體裝置100井的剖面繪示圖。第1c圖係顯示繪示經由包含收縮區域(converging zone)之出口連接流道106而連接至輸出流道108之井102的俯視繪示圖。

【0022】

第2圖係顯示根據本揭露之一特定實施例之揭露裝置之部分的俯視繪示圖。

【0023】

第3圖係顯示根據本揭露之一特定實施例之繪示於各個井102中裝載之分子信標探針的剖面繪示圖。

【0024】

第4a圖係顯示根據複數個井102以圓形之輪廓配置的本揭露之一特定實施例之微流體裝置100之繪示圖。第4b圖係顯示複數個井102以方形之輪廓配置之根據本揭露之一特定實施例之微流體裝置100之繪示圖。

【0025】

第5A圖顯示當使用黏合劑時所揭露之裝置的影像。影像證實螢光除了來源及井與流道之中外，可於使用黏合劑處被觀察到。第5B圖顯示具有黑膠帶覆蓋黏合劑所在之區域之裝置的影像，證實黑膠帶有效減少之前由黏合劑發出的自發螢光。

【0026】

第6圖顯示根據本揭露之一特定實施例之系統300的繪示圖。

【0027】

第7a圖顯示根據本揭露之一實施例之遮光體(light insulator)350的示意圖。第7b圖顯示結合遮光體(light insulator)350之光學系統之雛型的照片。第7c圖顯示於來自光源之圓形圖樣之光束入射至微流體裝置上之複數個井上的示意圖。

【0028】

第8圖顯示光入射至具有徑向對稱(radially symmetrical)之微流體裝置之表面上的光學分布。

【0029】

第9A圖顯示於參照範例3之第一裝置中2號與3號井中金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )之mecA、nuc、以及blaZ基因的自發光檢測(spontaneous detection)之影像。第9B圖顯示於參照範例3之第二裝置中5號與6號井中金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )之mecA、nuc、以及blaZ基因的自發光檢測(spontaneous detection)之影像。第9C圖顯示於參照範例3之第三裝置中8號與9號井中金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )之mecA、nuc、以及 blaZ基因的自發光檢測(spontaneous detection)之影像。第9A圖至第9C圖證實分子信標探針(Molecular beacon probes，MB probes)與目標基因之間之雜交(hybridization)為高特異性(specific)且在緊鄰具有預先裝載之分子信標探針(Molecular beacon probes)之相鄰井之間不存在串擾(cross talk)。

【0030】

第10圖顯示於井2號與3號(第一組影像)、於井5號與6號(第二組影像)以及於井8號與9號(第三組影像)中於範例3中各個目標基因之螢光圖表。第10圖證實自對應於感興趣之目標之探針讀取之螢光明顯高於兩個非目標之螢光。

【0031】

第11A圖與第11B圖分別顯示參考範例4之nuc與mecA基因的檢測影像。雜交(hybridization)訊號分別隨著nuc與mecA分子信標探針(Molecular beacon probes)裝載濃度增加而增加，由0.8 pmol/ 井增加至6.4 pmol/ 井。

【0032】

第12圖係顯示相較於包含範例5中之陽性對照組(positive control)之裝置，包含無模板對照組(no-template control)之裝置的螢光圖表。對應於mecA、nuc、以及blaZ目標基因的特定序列分子信標探針(Molecular beacon probes)預先裝載於兩裝置中之井2號與3號、於井5號與6號以及於井8號與9號中。第12圖顯示相較無模板對照組(no-template control, NTC)，陽性對照組(positive control)於對應井具有明顯較高的螢光。

【0033】

第13圖顯示使用於範例6中揭露之裝置，mecA DNA模板濃度於0 ng/µL (無模板對照組(no-template control，NTC))、2×10^-5 ng/µL、2×10^-3 ng/µL、2×10^-1 ng/µL、以及2×10¹ ng/µL變化之螢光的圖表。其顯示mecA目標基因可檢測低至2×10^-3 ng/µL之檢測極限。

【0034】

第14圖顯示相較於範例6，mecA DNA模板濃度於使用CFX96型號作為目標標準之即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，PCR)測定儀中於0 ng/µL (NTC)、2×10^-11 ng/µL、2×10^-9 ng/µL、2×10^-7 ng/µL、2×10^-5 ng/µL、2×10^-3 ng/µL、2×10^-1 ng/µL、以及 2×10¹ ng/µL變化之螢光的圖表。其顯示mecA目標基因可檢測低至2×10^-3 ng/µL之檢測極限。於此，揭露之裝置的檢測靈敏度可媲美於CFX96儀器。

【0035】

於圖式中，相似的符號表示相似的部分。

【0036】

於實施例中，提供一種微流體裝置，其包含：複數個井，各個井具有入口與出口，其中入口與一或多個輸入流道流體連通，而出口與一或多個輸出流道流體連通，其中出口藉由出口連接流道連接輸出流道，而入口藉由入口連接流道連接輸入流道，其中配置出口連接流道之尺寸使包含於井之液體表面張力防止液體通過出口連接流道釋出。

【0037】

好處在於，為液體固有的特性之液體表面張力之使用排除於既有技術之流體裝置中所需之複雜設計之需求。當與既有技術的微流體裝置比較時，由於設計簡單，所揭露裝置因此具有經濟上的優勢。

【0038】

於文中使用之詞語「流體連通(fluid communication)」可指液體或氣體的連通。於此所指的液體可能為溶液，如水溶液。

【0039】

舉例來說，可通過一個或多個輸入流道引入液體進入井。於一範例中，包含單一輸入流道的裝置使液體通過該單一輸入流道而引入至複數個井。於另一範例中，包含複數個輸入流道的裝置使液體通過單一輸入流道而引入至各個井。輸入流道可相互分離或相互連接。

【0040】

輸入流道經由入口連接流道而與井之入口流體連通(fluid communication)。因此，於輸入流道中的液體可通過入口連接流道經由入口而進入井。

【0041】

於範例中，可通過一或多個輸出流道移除井中的液體。於一範例中，裝置僅包含單一個輸出流道。於另一範例中，通過一或多個輸出流道可移除井中的液體。此範例中，液體可引入輸入流道之一端而由輸入流道之另一端移除。

【0042】

輸出流道經由出口連接流道而與井之出口流體連通(fluid communication)。因此，井中的液體可經由出口而流出井，且通過出口連接流道進入輸出流道。輸出流道係可相互分離或相互連接。

【0043】

好處在於，引入液體進入複數個井係簡易且直接的。

【0044】

第1a圖顯示根據本揭露之一特定實施例之各個井的俯視繪示圖，而第1b圖顯示揭露之微流體裝置100中之井的剖面繪示圖。井具有入口110與出口104。入口110經由入口連接流道112而與輸入流道114流體連通(fluid communication)。出口104經由出口連接流道106而與輸出流道108流體連通(fluid communication)。液體以箭頭A之方向流通過井102。當裝置包含單一個輸入流道，液體可以箭頭A之方向流進入輸入流道114。或者，其中裝置僅包含單一輸出流道，液體可以垂直箭頭A之方向流進入輸入流道114。液體可以箭頭A之方向由輸出流道108中移除。或者，其中裝置僅包含單一輸出流道，液體可以垂直箭頭A之方向由輸出流道108中移除。

【0045】

井之幾何形狀可無特別限制。舉例來說，井可為幾何形狀中之實質上圓柱形或實質上立方形。輸入或輸出流道之幾何形狀可無特別限制。輸入流道可為幾何形狀中之實質上圓柱形或實質上立方形。於如第1b圖所示之範例中，井102可具有具平整與光滑的之底部表面之形狀的盲孔(blind hole)且以井之上部分別經由入口連接流道112與出口連接流道106連接輸入流道114於一邊上且輸出流道108於另一邊上。輸入流道114與輸出流道108亦可具有平整的底部表面與方形的剖面形狀。

【0046】

如第1b圖所繪示，微流體裝置可包含形成為複數個井的複數個孔洞之基板。基板亦可包含沿形成於井之一邊上之輸入流道之基板之長度延伸的溝槽，及沿著形成於井之另一邊上之輸出流道之基板之長度延伸的溝槽。基板亦可包含輸入流道或輸出流道與井之間的孔洞以分別形成入口連接流道或出口連接流道。

【0047】

於範例中，輸入流道與複數個井之所有入口相互連接。流通過輸入流道之液體可因此依序進入複數個井。舉例來說，液體將進入與液體開始流動之位置最相近的井，接續下一個井，並此類推。

【0048】

於範例中，輸出流道與複數個井之所有出口相互連接。因此於各個井流出之液體進入輸出流道。

【0049】

為有助於液體之流動，而可施加正壓或負壓。可藉由幫浦或注射器施加的正壓而使液體由泵或填充至裝置中。或者，可泵或填充氣體以提供正壓。而可由真空來源施加負壓。使用真空來源時，可於真空來源之前提供液體收集器(liquid trap)以防止液體進入真空來源。

【0050】

為有助於在輸入流道中液體之流動，則可於輸入流道之一端施加正壓用以推動液體或可於輸入流道之另一端施加負壓用以拉動液體、或根據使液體朝施加負壓之一端移動而施加正壓與負壓兩者。為提供正壓於輸入流道之一端，液體可泵進輸出流道之一端。或者，液體可藉由注射器注入輸入流道之一端。液體之來源可與輸入流道之第一端流體連通。液體之來源可為以泵或注入至輸入流道之第一端之液體填充之腔室、管路或注射器。氣體來源可與輸入流道之第一端流體連通(fluid communication)。氣體來源可為以注入至輸入流道之第一端之氣體填充的注射器以推動液體通過輸入流道。氣體可為不與液體反應的惰性氣體或可為空氣。為提供負壓於輸入流道之另一端，可使用例如注射器，施加真空壓力。真空來源可與輸入流道之第二端流體連通(fluid communication)。真空來源可經由液體收集器而連接輸入流道之一端。

【0051】

於範例中，為有助於來自輸入流道之液體流動進入井，則可於輸出流道施加負壓。

【0052】

為有助於來自井之液體流動進入輸出流道，則可於輸出流道之一端施加正壓用以推動液體或可於輸出流道之另一端施加負壓用以拉動液體、或根據使液體朝施加負壓之一端移動而施加正壓與負壓兩者。為提供正壓於輸出流道之一端，氣體來源可與輸出流道之第一端流體連通(fluid communication)。氣體來源可為以注入至輸出流道之第一端之氣體填充的注射器以推動液體通過輸出流道。氣體可為不與液體反應的惰性氣體或可為空氣。為提供負壓於輸出流道之另一端，可例如使用注射器，施加真空壓力。真空來源可與輸出流道之第二端流體連通(fluid communication)。真空來源可經由液體收集器而連接輸出流道之一端。

【0053】

當液體通過入口連接流道與入口進入並注入時，液體由於出口連接流道之尺寸而保持於井中。出口連接流道之尺寸可配置以防止於填充時井之液體釋出。由於出口連接流道之尺寸的配置，於填充期間包含於井中之液體之表面張力於出口連接流道高於推動液體進入輸出流道之氣體壓力。推動液體進入輸出流道的壓力可取決於氣體與液體之間壓力差，而其可涉及流速、流道變化之尺寸、以及其他因素。填充之速度係如於此描述之填充步驟期間液體之流率。

【0054】

於文中所使用之詞語「表面張力(surface tension)」指的係液體與出口連接流道之表面之間之分隔表面的張力，即液體-固體中間界面(liquid-solid interface)。表面張力賦予液體濕潤出口連接流道之表面的能力。當液體濕潤表面時，液體實質地擴散於表面。一般而言，假使於液體小水滴與該表面之間之接觸角度大於90°，則液體-固體中間界面(liquid-solid interface)具有高表面張力且液體不由井釋出至輸出流道。相反地，假使於液體小水滴與該表面之間之接觸角度小於90°，則液體-固體中間界面(liquid-solid interface)具有低表面張力且液體由井釋出至輸出流道。於一範例中，當於液體與出口連接流道之表面之間之接觸角度小於90°，則液體於填充期間釋出於井外。

【0055】

當於井中之液體之壓力增加至壓力實質上相等於出口連接流道之液體之表面張力時，井可實質上完全填充，例如填充至井的容量之90%、95%、99%、或100%。而後可暫停引入液體至裝置。於一範例中，當於液體之壓力高於出口連接流道之液體之表面張力時，液體釋出至輸出流道。

【0056】

於輸入流道中過量的液體可藉由於輸入流道之第一端施加正壓以將液體推出輸入流道之第二端而移除。正壓可為泵或填充氣體之形式。或者，可於輸入流道之第二端施加負壓用以拉動液體或根據使液體朝施加負壓之一端移動而施加正壓與負壓兩者。可同樣地移除輸出流道中任何過量的液體。

【0057】

第2圖顯示根據本揭露之一特定實施例所揭露之裝置之部分的俯視繪示圖。首先，液體以箭頭A1之方向流通過輸入流道114並進入井102。於填充液體於井102時，出口連接流道106之尺寸防止井102中的液體流出至輸出流道108。當井102被實質地填充完整時，則液體流流向第二井102'。於填充第二井102'時，出口連接流道106'之尺寸防止第二井102'中的液體流出至輸出流道108。於完整填充第二井102'後，則液體流流向第三井102''。無論進入之液體係由一個填充之井，例如井102，進入輸出流道還是繼續填充未填滿之井，例如井102'，都係取決於兩井之相對阻抗(relative resistance)。而相對阻抗(relative resistance)係取決於揭露之微流體裝置的設計。於一範例中，由於出口連接流道的尺寸，所有井中的液體不會進入輸出流道，直到所有井中被實質地填充完整。於另一範例中，由於出口連接流道的尺寸與輸入流道的尺寸，所有井中的液體不會進入輸出流道，直到所有井中被實質地填充完整。假使出口連接流道之尺寸係足夠地小且輸入流道之尺寸係足夠地大，這樣離開井的相對阻抗(relative resistance)係高於進入下一個井的相對阻抗(relative resistance)，則進入之液體可能不會由填充之井進入輸出流道，而是可係繼續填充下一個井。相反地，假使出口連接流道之尺寸不夠小而輸入流道之尺寸太窄，這樣離開井的相對阻抗(relative resistance)低於進入下一個井的相對阻抗(relative resistance)，則可能有在所有井填滿前，進入之液體進入輸出流道的風險。

【0058】

因此，輸入流道之尺寸可因此與出口連接流道之尺寸相關聯地配置，使得包含在井中之液體通過出口連接流道釋出而進入輸出流道之前，實質地填充完整所有的井。輸入流道的剖面可於約略0.5mm至1mm乘以約略0.5mm至1mm之間。輸入流道的直徑或寬度可於約略0.5mm至1mm、約略0.6mm至1mm、約略0.7mm至1mm、約略0.5mm至0.9mm、或約略0.5mm至0.8mm之間。輸入流道的深度可於約略0.5mm至1mm、約略0.6mm至1mm、約略0.7mm至1mm、約略0.5mm至0.9mm、或約略0.5mm至0.8mm之間。於一範例中，輸入流道的寬度為0.6mm而輸入流道的深度為0.5mm。更進一步，因輸入流道中過量的液體可能無法被利用或被移除，則輸入流道在尺寸上可被配置為較小以最小化溶液的浪費。

【0059】

輸出流道在尺寸上可配置大於輸入流道用以最小化移除之溶液或引入之密封物的流動阻抗(flow resistance)。輸出流道的剖面可於約略0.7mm至1.5mm乘以約略0.5mm至1.5mm之間。輸出流道的直徑或寬度可約略為0.7mm至1.5mm、約略0.8mm至1.5mm、約略0.9mm至1.5mm、約略1mm至1.5mm、約略1.1mm至1.5mm、約略1.2mm至1.5mm、約略0.7mm至1.4mm之、約略 0.7mm至1.2mm、或約略 0.7mm至1mm之間。輸出流道的深度可於約略0.5mm至1.5mm、約略0.6mm至1.5mm、約略0.7mm至1.5mm、約略0.8mm至1.5mm、約略0.9mm至1.5mm、約略0.5mm至1.3mm、約略0.5mm至1.1mm、或約略0.5mm至0.9mm之間。於一範例中，輸出流道的寬度為1mm而輸出流道的深度為0.7mm。

【0060】

出口連接流道之尺寸可相對於井之尺寸為足夠地小以提供充分的表面張力以停止液體進入輸出流道。如上所述，相較於輸入流道之尺寸，出口連接流道之尺寸可為充分地小，以防止液體於液體填充至剩下之井前釋出至出口連接流道。出口連接流道之尺寸可為小於輸入流道。出口連接流道之尺寸或剖面可於約略0.05mm至3mm乘以約略0.05mm至3mm之間。出口連接流道具有圓筒形之幾何形狀，出口連接流道之尺寸可於約略0.05mm至3mm、約略0.1mm至3mm、約略0.1mm至1.5mm、約略0.2mm至3mm、約略0.2mm至2.5mm、約略0.2mm至2mm、約略0.2mm至1.5mm、約略0.3mm至3mm、約略0.3mm至2.5mm、約略0.3mm至2mm、約略0.3mm至1.5mm、約略0.4mm至3mm、約略0.4mm至2.5mm、約略0.4mm至2mm、約略0.4mm至1.5mm、約略0.5mm至3mm、約略0.5mm至2.5mm、約略0.5mm至2mm、約略0.5mm至1.5mm、約略0.8mm至3mm、約略0.8mm至2.5mm、約略0.8mm至2mm、約略0.8mm至1.5mm、約略0.1mm至1mm、約略0.1mm至0.8mm、約略0.1mm至0.5mm、約略0.1mm至0.4mm、以及約略0.1mm至0.3mm之間。出口連接流道具有矩形之幾何形狀，出口連接流道之長度可於約略0.05mm至3mm、約略0.1mm至3mm、約略0.1mm至1.5mm、約略0.2mm至3mm、約略0.2mm至2.5mm、約略0.2mm至2mm、約略0.2mm至1.5mm、約略0.3mm至3mm、約略0.3mm至2.5mm、約略0.3mm至2mm、約略0.3mm至1.5mm、約略0.4mm至3mm、約略0.4mm至2.5mm、約略0.4mm至2mm、約略0.4mm至1.5mm、約略 0.5mm至3mm、約略0.5mm至2.5mm、約略 0.5mm至2mm、約略0.5mm至1.5mm、約略 0.8mm至3mm、約略0.8mm至2.5mm、約略 0.8mm至2mm、約略0.8mm至1.5mm、約略 0.1mm至1mm、約略0.1mm至0.8mm、約略 0.1mm至0.5mm、約略 0.1mm至0.4mm、約略 0.1mm至0.3mm；且出口連接流道的寬度可約略為0.05mm至3mm、約略0.1mm至3mm、約略0.1mm至1.5mm、約略0.2mm至3mm、約略0.2mm至2.5mm、約略0.2mm至2mm、約略0.2mm至1.5mm、約略0.3mm至3mm、約略0.3mm至2.5mm、約略0.3mm至2mm、約略0.3mm至1.5mm、約略 0.4mm至3mm、約略 0.4mm至2.5 mm、約略0.4mm至2mm、約略 0.4mm至1.5 mm、約略 0.5mm至3mm、約略 0.5mm至2.5 mm、約略0.5mm至2mm、約略0.5mm至1.5mm、約略0.8mm至3mm、約略0.8mm至2.5mm、約略0.8mm至2mm、約略0.8mm至1.5 mm、約略 0.1mm至1mm、約略0.1mm至0.8mm、約略0.1mm至0.5mm、約略0.1mm至0.4mm、約略0.1mm至0.3mm之間。出口連接流道的深度可約略為0.2mm至0.5mm、約略0.3mm至0.5mm、約略0.4mm至0.5mm、約略0.2mm至0.4mm、約略0.2mm至0.3mm之間。於一範例中，出口連接流道的尺寸或剖面為0.2mm乘以0.2mm。於另一範例中，出口連接流道的剖面為0.2mm乘以0.2mm且出口連接流道的長度為0.35 mm。出口連接流道可包含平滑地連接井至出口連接流道的收縮區域(converging zone)。收縮區域(converging zone)可具有由通過出口連接流道之縱軸至收縮區域(converging zone)之側壁測量於約為30度至60度之間，例如45度的角度(角度a)與由井之底部至出口連接流道之底部量測於約為40度至70度之間，例如56度的角度(角度b)。於第1c圖中繪示之出口連接流道106之收縮區域(converging zone)，其中於收縮區域(converging zone)至出口連接流道之側壁的角度被稱為角度a，其可能為45度，而收縮區域(converging zone)至出口連接流道之底部的角度被稱為角度b，其可能為56度。

【0061】

詞語「直徑(diameter)」指的係目標物的最大長度。對於具有不規則形狀的目標物而言，直徑為目標物之剖面最長的長度。

【0062】

井之直徑可於約略1mm至4mm、約略1.5mm至4mm、約略1.7mm至4mm、約略2mm至4mm、約略2.2mm至4mm、約略2.5mm至4mm、約略3mm至4mm、約略1mm至3mm、約略1mm至2.5mm、約略1mm至2.2mm、約略1mm至2mm、約略1.5mm至3mm、約略2mm至3mm、約略2mm至2.5mm之間；以及井之深度或高度可於約略0.5mm至1.5mm、約略0.6mm至1.5mm、約略0.7mm至1.5mm、約略0.8mm至1.5mm、約略0.9mm至1.5mm、約略1mm至1.5mm、約略0.5mm至1mm、約略0.5mm至0.9mm、約略0.5mm至0.8mm、約略0.8mm至1mm之間。

【0063】

可調整井之深度或直徑用以配合微流體裝置之應用。在利於減少井的容量之範例中。井的容量可於約略1 µL至10 µL、約略2 µL至10 µL、約略2 µL至5 µL、以及約略3 µL至5 µL之間。於一範例中，於井的直徑可減少至2mm且井的深度可減少至1mm的範例中，以減少井的容量至3.1µL。

【0064】

複數個井之數量可於約略2個至超過100個、約略2個至100個、約略5個至100個、約略10個至100個、以及約略5個至50個之間的範圍。於一範例中，具有31個井。因此，於裝置中所包含的所有液體容量可於約略30 µL至100 µL、約略30 µL至約略90 µL、以及約略40 µL至約略70 µL之間。於揭露之裝置中包含10個井的範例中，具有的所有液體容量約略為46µL。有利的是，所揭露裝置之所有液體容量可為先前技術之裝置中所需要的部分。舉例來說，具有10個井之所揭露裝置的所有液體容量係為於10個傳統聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)管所需之所有液體容量的約略20%。藉由再引入(re-introducing)由輸入流道排除的過量液體而可進一步減少所有液體的容量。於此所有液體的容量包含井中的容量與於輸入流道中液體的容量。

【0065】

可配置入口連接流道的尺寸使得無法藉由液體的表面張力防止液體流進入井。相對於輸入流道之尺寸，入口連接流道可能具有充分地大的尺寸使得液體的表面張力無法防止液體流進入井，且於填充時井中的液體不會釋出。

【0066】

於一範例中，只可經由輸入流道與輸出流道進入複數個井。於一範例中，井可防止經由輸入流道與輸出流道進入而可隔離井。「隔絕(isolate)」係指由混合物、樣品、或生物樣本中分隔的特定種類或物質。有利的是，井中液體於隔絕後，可不逸失於環境中，例如藉由蒸發。更加有利的是，於隔絕後，各個井中所包含的液體將不會汙染其他井中的液體。亦可減少導致偽陽性(false-positive)發射讀數之偏離訊號發射的發生。於一範例中，不會發生偽陽性(false positives)或偽陰性(false negatives)。

【0067】

密封物可用於隔絕井中液體。密封物可引入至輸入流道或輸出流道以密封與隔絕井中的液體。密封物可被泵或填充入輸入流道的一端或輸出流道的一端。密封物亦可藉施加真空壓力於輸入流道或輸出流道的另一端而自密封來源引入至輸入流道的一端或輸出流道的一端。密封來源可與輸入流道的一端或輸出流道的一端流體連通(fluid communication)。密封來源可為填充有密封物的管路或腔室。

【0068】

可為任何類型的可至少阻擋或防止井中液體滲漏的物質以有效隔絕井中的液體之密封物。「有效(effective)」係指充分地分隔包含輸入流道或輸出流道中之井中液體與井，例如入口或出口連接流道外之混合物、樣品、或樣本。密封物可為汽化(vaporization)率低於井中之液體的任何材料。密封物可為與井中之液體不互溶的任何材料。密封物可為不允許井中之液體的蒸氣通過的任何材料。密封物可為蠟(wax)、聚合物(polymers)、明膠(gelatin)、膠料(gum)、澱粉漿(starch)、或其衍生物。

【0069】

於一範例中，密封物可為液態蠟(wax)。文中使用的詞語「蠟(wax)」係包含天然存在的脂肪酸酯，如棕櫚蠟(carnauba)、小燭樹蠟(candelilla)、蜜蠟(beeswax)等，石油(mineral oil)與具有蠟(wax)之物理態性的其他有機材料，如聚乙烯(polyethylenes)、石蠟(paraffins)、地蠟(ozokerites)等。石蠟(paraffins)一般用以界定為堅硬、通常由石油餾出物(petroleum distillates )中獲得，由混合基(mixed base)或石蠟基(paraffin base)類型之石油(mineral oil)所衍生之小燭樹蠟(candelilla)，且可包含，如高沸點餾出蠟(distillate wax)與微晶蠟(microcrystalline wax)之材料。於一範例中，液態蠟(wax)係來自Bio-Rad Laboratories公司，CA，USA的Chill-out TM 液態蠟(wax)。

【0070】

於範例中，各個井可包含檢測探針。一般來說，詞語「檢測探針(detection probe)」係指具有與目標分子鍵結之能力的分子，而「檢測探針(detection probe)」可包含固定於支撐物的探針分子或未固定於支撐物的探針分子。檢測探針可固定於包含表面、薄膜、或粒子之支撐物。於一範例中，檢測探針未固定於支撐物。因此可避免固定之探針的空間位阻(steric hindrance)。

【0071】

檢測探針可具有經由共價鍵、氫鍵、靜電鍵結(electrostatic bonding)、或其他相互之吸引力而鍵結目標分子，如目標核酸的特定序列之至少一部分以便檢測目標分子的能力。於一範例中，檢測探針可為鍵結至亦可為蛋白質之目標分子的蛋白質。因此，於此範例中的鍵結係經由蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interactions)以檢測，舉例來說，檢測蛋白質結構的型態改變。於另一範例中，檢測探針可為鍵結至亦可為核酸之目標分子的核酸。因此，於此範例中的鍵結係經由雜交作用(hybridization)以檢測，舉例來說，目標核酸的存在與否、或於核酸中突變之單一核甘酸(nucleotide)的存在。而於目標分子與檢測探針之間的反應產物可發出可經由檢測系統檢測到的訊號。

【0072】

於本文中所使用的詞語「目標核酸(target nucleic acid)」係指包含可與檢測探針之互補區域(complementary region)鍵結的序列區域(sequence region)之核酸序列。目標核酸序列可被擴增(amplified)且當其與檢測探針之互補區域(complementary region)雜交(hybridized)時，其可能得以檢測目標核酸的存在與否與目標核酸量化(quantitative)數量。於此應用中所使用之詞語「雜交作用(hybridization)」係指完全或部分互補的兩個單核酸股(single nucleic acid strand)以反平行方向(antiparallel orientation)聚在一起，以形成具有雙股(double-stranded)區域的穩定結構之能力。有時稱雙股(double-stranded)結構中兩個組成的股為雜交(hybrid)係以氫鍵維持在一起。儘管這些氫鍵最普遍地形成於含有腺嘌呤(adenine, A)與胞腺嘧啶(thymine, T)或尿嘧啶(uracil, U)、或胞嘧啶(cytosine, C)與鳥糞嘌呤(guanine, G)鹼基(base)在單股核酸(single nucleic acid strand)上的核甘酸(nucleotide)之間，但鹼基對(base pairing)可形成於非「標準(canonical)」配對的構件之鹼基(base)間。於技術領域中非標準鹼基配對(base pairing)係眾所皆知的。例如，請見核酸之生物化學(Biochemistry of the Nucleic Acids, Adams et al., eds., 1992)。

【0073】

檢測探針可與檢測方法，如標定(label)結合，以量測目標對檢測探針之雜交作用(hybridization)。而標定(label)可為放射性同位素或螢光團(fluorophore)。於一範例中，各個檢測探針可與不同的螢光團(fluorophore)結合，使得可區別不同的探針。

【0074】

於一範例中，檢測探針包含DNA或RNA。於另一範例中，檢測探針包含具有能夠與樣本多核苷酸(polynucleotides)之區域形成形成雙股複合物之髮夾環(hairpin loop)結構的單股多核苷酸(polynucleotides)。於一範例中，檢測探針係包含螢光團(fluorophore)與消光劑(quencher)的分子信標探針(Molecular beacon probes, MB probes)。有利的是，在使用分子信標探針(Molecular beacon probes, MB probes)前係不需要作任何更進一步的修飾。更加有利的是，檢測分析不須額外的單價(monovalent)或二價(divalent)鹽類或添加物，如牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。於不存在目標分子時，信標探針(Molecular beacon probes，MB probes)維持在穩定髮夾狀之型態，而使得來自螢光團(fluorophore)之螢光由於位於多核苷酸(polynucleotides)之一端的螢光團(fluorophore)與位於多核苷酸(polynucleotides)之另一端的消光劑(quencher)接近而完全地消光。舉例來說，位於分子信標探針(Molecular beacon probes)之5'端的6-羧基(6-carboxyfluorescein, 6-FAM)螢光團(fluorophore)係與位於分子信標探針(Molecular beacon probes)之3'端的黑洞消光劑-1 (Black Hole Quencher-1, BHQ1)接近會消光任何螢光。於存在目標分子時，探針之部分與目標分子之互補序列雜交，導致螢光團(fluorophore)與消光劑(quencher)分離，並隨後導致來自螢光團(fluorophore)的螢光發光。

【0075】

於一範例中，目標分子包含DNA或RNA。於一範例中，目標分子包含感興趣的基因。於一範例中，感興趣的基因可為授予反抗治療抗病毒(anti-viral)或抗細菌(anti-bacterial)的基因，如一或多種抗生素(antibiotics)的治療。於另一範例中，感興趣的基因可為細菌與特定物種的控制基因。於一特定的範例中，感興趣的基因可為16SrRNA 與nuc。於另一特定的範例中，感興趣的基因為mecA、ermA、blaZ、以及msrA。

【0076】

有利的是，於室溫下，如30^o C檢測探針與目標分子間之反應實質上係瞬間的。感興趣的目標分子可與發出之訊號於30^o C之最佳溫度時實現微小雜訊之個別檢測探針雜交。更加有利的是，沒有任何培養檢測探針與目標分子以產生反應產物的需求。亦無在可能之反應的前後做任何的清洗的需求。目標基因之存在與不存在之檢測係必要地，有利的是，無解鏈曲線分析(melt curve analyses)與相關設備的需求。

【0077】

於範例中，檢測探針係冷凍乾燥的檢測探針。有利的是，檢測探針的冷凍乾燥(lyophilization)避免將檢測探針固定於支撐物之需求。當需要以清洗步驟移除未鍵結的檢測探針時，則需要檢測探針的固定。然而，於一範例中，因為只在檢測探針與目標分子鍵結時才發出訊號，所以不需要清洗步驟。更進一步，亦可避免提供檢測探針的機器介入的需求。而在液體或樣品引入前井可以檢測探針預先裝載(pre-loaded)。預先裝載(pre-loaded)的檢測探針可冷凍乾燥於各個井中。於引入包含可能地目標分子之樣品至井後，可能的目標分子與預先裝載(pre-loaded)於井中之檢測探針之間可因此為瞬間的反應。

【0078】

井可以平衡雜交作用(hybridization)強度之基準線的數量預先裝載(pre-loaded)檢測探針。於一範例中，井可以約略為0.5pmol/井至7pmol/井之間的數量預先裝載(pre-loaded)檢測探針。而所需之探針的濃度可取決於目標分子。為增強螢光強度與均勻度，可最佳化探針的濃度。有利的是，於固體支撐物上的裝載容積為有限的傳統微陣列(microarray)方法中，此種最佳化係不可能的。

【0079】

於範例中，各個井包含獨特的特定序列檢測探針。各個獨特的檢測探針可特定地與不同的目標分子鍵結。有利的是，各個井可具有檢測有興趣地特定目標物之能力，因此所揭露之裝置係具有檢測與井之數量一樣多之特定目標物的能力。

【0080】

於範例中，目標分子係擴增反應(amplification reaction)的產物。擴增反應(amplification reaction)藉由模板依賴型(template-dependent)製程導致核酸分子之濃度相較於原濃度增加。詞語「模版依賴型製程(template-dependent process)」係指牽涉模版依賴型(template-dependent)之引子(Primer)分子之擴大的製程。擴增方法包含聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)、DNA接合酶連鎖反應(DNA ligase chain reaction)、以及其他所屬領域具有通常知識者所知悉之擴增反應(amplification reaction)，但不為此些反應所限制。擴增反應(amplification reaction)的組成包含用以擴展目標核酸的試劑，例如擴增引子(amplification primers)、多核苷酸模板(polynucleotides template)、三磷酸去氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide triphosphate)、聚合酶(polymerase)、以及核甘酸(nucleotides)。

【0081】

於範例中，使用不對稱聚合酶鏈鎖反應(Asymmetric Polymerase Chain Reaction, Asymmetric PCR)或指數後線性擴增聚合酶鏈鎖反應(Linear After The Exponential Polymerase Chain Reaction, LATE PCR)。不對稱聚合酶鏈鎖反應(Asymmetric Polymerase Chain Reaction, Asymmetric PCR)優先擴增雙股DNA模板中之一股DNA。有利的是，因為目標分子藉由高多重不對稱聚合酶鏈鎖反應(Multiplexed Asymmetric Polymerase Chain Reaction, Multiplexed Aasymmetric PCR)擴增，而可達到高生產量。更加有利的是，擴增產物不需要任何更進一步的修飾以附加任何官能基(functional groups)或螢光團(fluorophore)。

【0082】

本方法涉及散佈擴增產物至因為具有特定序列檢測探針於其中之各個井能夠瞬間檢測有興趣之特定目標物而可實現高程度之多重(multiplexed)之井之陣列。

【0083】

於範例中，上述中所指之液體係包含目標分子或可能包含目標分子的溶液。其液體可能係生物樣品，例如實驗對象取得的口腔棉棒(cheek swab)，用以檢測特定基因的存在與否。

【0084】

於樣品中之目標分子的濃度可能低於0.01 ng/µL、低於0.005 ng/µL、低於0.004 ng/µL、低於0.003 ng/µL、低於0.002 ng/µL、或低於0.001 ng/µL。

【0085】

於範例中，密封物被用以隔絕井中液體。於其中未使用密封物之範例中，當微流體裝置加熱時，則於井中之液體蒸發。其係因為溶液周圍之空氣促使溶液蒸發。於蒸發發生時，檢測探針與溶液中目標分子之間之反應產物發射訊號的強度，例如螢光可能降低。螢光強度的衰減可能發生在溫度低至40℃至50℃時。當微流體裝置加熱至高於約略95℃時，可觀察到於密封物與溶液中形成明顯的氣泡，對於螢光的定量分析造成不利之影響。因此，最好使用密封物。

【0086】

因此，於範例中，輸入流道流體連通(fluid communication)與下述之構件，包含與輸入流道之第一端連接之真空來源、或經由液體收集器而與輸入流道之第一端連接之真空來源、，與輸入流道之第二端連接之密封來源、與輸入流道之第二端連接氣體來源、以及與輸入流道之第二端連接之包含可能地目標分子之來源連結，但不以此為限。於範例中，輸出流道流體連通(fluid communication)與下述之構件，包含與輸出流道之第一端連接之真空來源、或經由液體收集器而與輸出流道之第一端連接之真空來源、與輸出流道之第二端連接之密封來源連結，但不限於此。於所有的範例中，藉由可分別控制之一或多個閥控制控制輸入流道和輸出流道與各式來源的連接。閥可為電磁或迴轉閥。而閥之控制可自動化，因而便於裝置內各種流體運輸。舉例來說，可便於自動輸出目標分子至用以與特定序列之檢測探針的雜交(hybridization)個別井中。

【0087】

第4a圖顯示根據本揭露之一特定實施例之裝置100之繪示圖。於此實施例中之複數個井以圓形之輪廓配置。而擴增之聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202係沿輸入流道114引入，而依序進入井，即井102，而隨後至井102'等。為促進產物202的流動，氣體來源 204於輸入流道114之第一端提供氣體用以推動產物202通過流道，而真空來源 208於輸入流道114之第二端提供真空壓力用以拉動產物202通過流道。一般來說液體運動之方向係箭頭A之方向。真空來源208經由液體收集器(liquid trap)210與輸入流道114之第二端連接，以防止任何過量的液體進入真空來源。當完整填充聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202於複數個井時，為了防止不同井之間串擾(cross talk)，例如藉由預先裝載的檢測探針由一個井擴散至另一個井，而自輸入流道114移除過量之聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物。輸入流道與輸出流道皆以來自液態蠟(wax)來源206之液態蠟(wax)填充，用以密封聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202於井102中，因而防止樣品的蒸發。聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202來源、氣體來源204、液態蠟(wax)來源206、以及真空來源208可經由具有閥關管路而與輸入流道114或輸出流道108連接。當使用時，聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202藉由開孔V4與開孔V6而引入。於完整填充井後，過量之聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202藉由開孔V3與開孔V6而移除。液態蠟(wax)藉由開孔V2與開孔V6而引入至輸入流道114，用以防止於井102中聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202的蒸發。液態蠟(wax)藉由開孔V1與開孔V5而引入至輸出流道108。第4b圖顯示根據本揭露之另一特定實施例之其中複數個井102以方形之輪廓配置的微流體裝置100之繪示圖。

【0088】

目標分子與檢測探針的鍵結可能導致發出訊號之反應產物。於範例中，目標分子與檢測探針的鍵結導致發出螢光。有利的是，所揭露之裝置不需要浪費時間培養、清洗、或者裝置表面之表面修飾。且亦不需要於塗層裝置表面，從而防止來自塗層材料的任何散射或背景螢光。

【0089】

第3圖顯示根據本揭露之一特定實施例之裝載於各個井102中之分子信標探針150的剖面繪示圖。輸入流道114傳送包含將只與特定地互補於目標分子的一個分子信標探針150鍵結之特定目標分子的生物樣品。

【0090】

螢光發光之檢測表示可判定目標分子的存在與否之聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)檢測方法學的末端。因此可避免即時聚合酶鏈鎖反應(real-time Polymerase Chain Reaction, real-time PCR)的缺點。

【0091】

擴增產物和檢測探針之間之反應產物之擴增反應與檢測可於不同的步驟中施行。有利的是，於分配擴增產物至微流體裝置中複數個井前，擴增產物複製大量且充分地的複製。因此，所揭露之裝置之多重能力(multiplexing capability)單純取決於井的數量。

【0092】

如於此所述之目標分子可為授予反抗抗細菌治療的核酸。

【0093】

可以覆蓋材料覆蓋裝置以包圍複數個井或流道。而覆蓋材料可與裝置中之液體相溶。此種覆蓋之範例係如第1b圖與第3圖中所繪示之覆蓋材料140。或者，裝置可包含包體(enclosure)，用以包圍複數個井或流道。包圍複數個井或流道之材料可為透明。於一範例中，複數個井或流道可以透明且薄的膠帶，例如相容於聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)的MicroAmpTM膜狀黏膠、以及DNA/RNA/RNase-free(美國加利福尼亞州Applied Biosystems公司)覆蓋。裝置剩餘之部分可由半透明材料或不透明材料製作。

【0094】

裝置可由不抑制檢測探針與目標分子鍵結的材料製作。材料可為聚甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate, PMMA)、聚碳酸酯(polycarbonate, PC)、聚丙烯(polypropylene, PP)、聚乙烯(polyethylene)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、丙烯睛-丁二烯-苯乙烯(acrylonitrile butadiene styrene)、或聚苯乙烯(polystyrene)。有利的是，裝置可與市場上常見之聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)反應物，例如於荷蘭的Qiagen公司 (Taq酶聚合酶鏈鎖反應主要混和物套件)、美國威斯康辛州的Promega公司(GoTaq Hot Start Colorless 主要混和物套件)、以及美國加利福尼亞州的Invitrogen公司 (Platinum PCR SuperMix)的聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)主要的混合物相容。

【0095】

覆蓋材料可能亦為不透明材料或另外又由以半透明材料或不透明材料覆蓋。於一範例中，不透明材料為黑色膠帶。有利的是，不透明材料以防止或減少可能干擾由目標分子與檢測探針之間之反應產物發出的訊號的背景訊號之發出。於一範例中，用以覆蓋複數個井與流道的透明黏合劑係綠色自發螢光來源，其可能會與檢測探針的螢光發射波段重疊，而導致於井與流道中之偽陽性訊號。第5A圖顯示證實於影像底部之螢光來自於來源與黏合劑所在之井與流道中的揭露裝置之影像。第5B圖具有覆蓋黏合劑所在之區域之黑膠帶之揭露裝置的影像。當比較第5A圖與第5B圖時，明顯可見黑膠帶有效減少之前由黏合劑發出的自發螢光。

【0096】

輸入流道與輸出流道可藉由墊圈(O-rings)固定至微流體裝置。

【0097】

當使用液態蠟(wax)作為密封物時，其亦可能發出自發螢光。然而，其發出之波長為藍色，而因此可輕易過濾。更進一步，檢測探針可能發出低到幾乎沒有的自發螢光。

【0098】

於一實施例中，提供包含所揭露之微流體裝置的系統。而系統可包含配置於使用時藉由包含於井中之可能反應產物檢測發出的訊號之揭露之微流體裝置之上或下之檢測裝置。

【0099】

檢測裝置可能為光學系統。光學系統可包含光源、能夠擷取檢測探針與目標分子之反應產物所發出之訊號之濾片。光源可能為紫外-可見光寬帶之水銀/LED光源，而濾片可為激發濾片(excitation filters)、發散濾片(emission filters)、以及二向色濾片(dichroic filters)，而各個濾片與分子信標探針(molecular beacon probes, MB)之標的6-FAM螢光團(fluorophore)有相容的波段。此濾片可由Semrock公司，美國，紐約獲得。光源可具有照亮微流體裝置的能力，以使相機可擷取發出可能訊號的影像。而包含於檢測裝置中的光源與濾片亦可能得以藉由透鏡與相機發出訊號以激發反應產物以產生螢光。於適合的相機為由灰點公司(Point Grey Research Inc., Richmond BC, 加拿大)獲得的基本Grasshopper2感光元件(Charge-coupled Device, CCD)之紅綠藍色(RGB)相機，其具有由Edmund Optics公司(美國紐澤西州)獲得的25mm的聚焦透鏡之範例中。由相機擷取之影像可藉由處理程式處理。舉例來說，可使用於The Mathworks 公司(美國麻薩諸塞州)之Matlab影像擷取工具箱(Image Acquisition Toolbox) 的客製化影像分析軟體。而處理程式可藉由處理器，如電腦執行。有利的是，光學系統提供發出之訊號，如螢光之一次成像的非機動化設置(non-motorized setup)。

【0100】

包含於揭露之微流體裝置之複數個井可配置為與發熱構件熱連通。此系統可包含加熱模組，以致使可執行可能目標分子與檢測探針之間之反應產物之末端解鏈曲線分析(end-point melt curve analyses)。有利的是，可檢測目標序列中單點或多點突變(point mutations)。於一範例中，假使只需要檢測目標基因的存在與否時，系統不包含加熱模組。而檢測單核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism, SNP)時，亦可不需要解鏈曲線分析(melt curve analyses)。於一範例中，檢測探針對於其中相較於完全匹配，檢測探針與DNA序列之間有單鹼基對(base pair)錯配導致較低螢光強度之單核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism, SNP)靈敏。於此實施例中，探針可以原株/正常序列(wild type/normal sequence)冷凍乾燥於一個井(井A)中，而具有包含單核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism, SNP)之突變序列的探針位於另一井(井B)中。假使擴增產物具有原株序列，則相較於井B，井A將顯示較高的螢光強度。相反地，假使擴增產物具有包含單核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism, SNP)的突變序列時，則相較於井A，井B將顯示較高的螢光強度。有利的是，缺少加熱模組將允許揭露系統變得精簡並具成本效益。更加有利的是，揭露之系統可具有特異性與可與所前案系統媲美之靈敏性。於微流體裝置上直接發生的檢測探針與目標分子的末端雜交(hybridization)可具有可與即時擴增反應中相同探針之末端雜交(hybridization)的檢測媲美之靈敏度。有利的是，揭露系統可能得以檢測低至0.02 ng/µL的DNA濃度。揭露系統的特定性可歸因於使用特定序列檢測探針，因此不需要做解鏈曲線分析(melt curve analyses)。

【0101】

加熱模組(heating module)可為帕耳帖加熱模組(Peltier heating module)。加熱模組(heating module)可包含風扇、熱電效應(thermoelectric, TE)加熱器/冷卻器(例如，於美國加利福尼亞州FerroTec飛羅得股份有限公司的9501/127/030)。熱電效應(thermoelectric, TE)控制套件(kit)且包含放大器(amplifier)(例如，於美國加利福尼亞州FerroTec飛羅得股份有限公司的FTA600 H-bridge放大器)與溫度控制器(例如，於美國加利福尼亞州FerroTec飛羅得股份有限公司的FTC100溫度控制器)。熱電效應(thermoelectric, TE)加熱器可由由溫度控制器控制之放大器(amplifier)供電。T型熱電偶元件(例如，美國康涅狄格州OMEGA Engineering公司的5TC-TT-T-40-36號產品)可安裝於熱電效應(thermoelectric, TE)加熱器上以量測溫度且可用作為對溫度控制器的回饋。熱電效應(thermoelectric, TE) 加熱器與井內實際溫度之間之溫度差，可藉由量測井中的溫度而直接以等量聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物校準。

【0102】

第6圖顯示根據本揭露之一特定實施例之系統300的繪示圖。位於感光元件(Charge-coupled Device, CCD)相機204的光源302係具有投射圓錐狀之光束至微流體裝置100上的透鏡206。而感光元件(Charge-coupled Device, CCD)相機204係與電腦304連接。蠟(wax)來源206中之液態蠟(wax)係經由管路(未繪示)提供並連接至微流體裝置100。亦提供含有聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202的取樣管且其能夠經由取樣口310連接至微流體裝置100。注射幫浦208形式之真空來源與液體收集器(liquid trap) 210一同提供。微流體裝置100可藉由溫度控制器308控制之加熱器306而加熱。使用時，預先裝載有分子信標探針(Molecular beacon probes，MB probes)的微流體裝置100係插入於加熱器306的頂部上。含有聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物202溶液的取樣管連接至取樣口310，且聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物藉由閥(為繪示)之控制且由注射幫浦208產生之真空壓力而輸送至井。而後，藉由來自蠟(wax)來源206，填充至微流體裝置100的輸入流道與輸出流道之液態蠟(wax)而密封聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物於井中。根據預設於溫度控制器308中的程式，加熱器306逐步增加於井中混和之聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)產物的溫度，浸於各溫度中數分鐘。於數分鐘這段期間中，來自光源302的激發光束照亮微流體裝置100上所有的井，且由透鏡與感光元件(Charge-coupled Device, CCD)相機擷取產生的螢光。而後將影像資料送至電腦做進一步的處理，用以提供光學檢測的結果。

【0103】

於一範例中，由光源產生的光束可由絕緣體圍住，以防止光能損失至周圍環境。有利的是，可因此利於螢光成像。絕緣體之形狀可根據光束之形狀而配置。於一範例中，絕緣體為圓錐狀且可直接與相機之透鏡連接。且其接頭可為螺紋接頭。於一範例中，絕緣體具有長4mm的C連接座外螺紋(C-mount male thread)，而螺紋之直徑為1英寸且每1英吋具有32圈螺紋，且透鏡具有相對應的內螺紋。可調整透鏡與微流體裝置之間的距離，使得到達該裝置之光束足以覆蓋複數個井。於一範例中，可調整透鏡與微流體裝置之間的距離，使得到達該裝置之光束足以覆蓋96個井的盤。

【0104】

第7a圖顯示根據本揭露之一實施例之遮光體(light insulator)350的示意圖。具有直徑d1之遮光體(light insulator)350的外螺紋312b可直接與對應之相機透鏡(如第6圖所示)的內螺紋312a連接。而透鏡與微流體裝置之間的距離h約略為25cm且光束的直徑約略為21.2cm。第7b圖顯示結合遮光體(light insulator)350之光學系統之雛型的照片。光學系統包含相機204與藉由準直之光學透鏡206而與濾片314連接之光源302。光學系統經由C連接座(C-mount)之界面(未繪示)而直接安裝於遮光體(light insulator)350之上。

【0105】

無論是否具有絕緣體，由光源射出至微流體裝置上之複數個井上之光束可為如第7c圖所示之圓形圖樣。入射至裝置上之光的直徑為d2，當使用絕緣體時其直徑亦為d2。當絕緣體具有用以與透鏡連接的接頭時，接頭之下將不具有任何的入射光。因此，入射光之中心區域之暗點將具有實質上與接頭之直徑相等之直徑為d1。

【0106】

於範例中，複數個井以一圖樣排列於微流體裝置上以確保入射光實質上均勻地橫越所有的井。由於於入射光之中心區域之暗點，因此複數個井可配置圍繞該暗點，如以對稱的圖樣圍繞暗點。井可以圍繞暗點之方形圖樣配置或以圍繞暗點之圓形圖樣配置。於一範例中，複數個井以圍繞暗點的徑向對稱(radially symmetrical)圖樣配置。有利的是，因為當投影至微流體裝置之表面時，來自光源之激發光亦具有徑向對稱(radially symmetrical)之分佈，則激發之檢測探針可實質上均勻橫越所有的井。此有助於使整體裝置能夠一次成像，因此避免各個井需要以光學掃描器進行多次掃描。揭露之系統大幅地降低系統的複雜性與成本。有利的是，小型尺寸之微流體裝置亦利於使所有井能夠在單一視野下成像。

【0107】

第8圖證實入射至微流體裝置之表面上的光分佈具有徑向對稱性。此分佈具有以光軸（0,0）為中心圍繞之徑向對稱性。

【0108】

系統可包含如上述之描述之密封來源，其可連接至裝置用以與輸入流道之端部或輸出流道之端部、或輸入流道之端部與輸出流道之端部流體連通(fluid communication)。

【0109】

系統可包含如上述之描述之氣體來源，其可連接至裝置用以與輸入流道之端部流體連通(fluid communication)。

【0110】

系統可包含如上述之描述之包含可能目標分子之來源，其可連接至裝置用以與輸入流道之端部流體連通(fluid communication)。

【0111】

系統可包含如上述之描述之真空來源，其連接至輸出流道之端部或輸入流道之端部、或輸入流道之端部與輸出流道之端部。系統可包含經由如上述之描述之液體收集器而連接至輸出流道之端部或輸入流道之端部、或輸入流道之端部與輸出流道之端部之真空來源。

【0112】

於一實施例中，提供使用文中所揭露之系統自液體樣品中檢測至少一個目標分子的方法，其中該方法依序包含：藉由以選定以允許液體樣品流入複數個井中，同時避免液體釋出至輸出流道的流率，將來自包含可能目標分子之來源的液體泵進輸入流道，以液體樣品填充於複數個井、藉由連接輸入流道的真空來源抽真空，移除輸入流道中過量的液體、將密封物泵進輸入流道後，將密封物泵進輸出流道，從而隔絕各個井中的液體樣品、以及檢測目標分子與檢測探針之間之反應產物發出的可能訊號。

【0113】

於範例中，步驟是依序執行地。

【0114】

複數個井可以液體樣品如文中所述地依序填充。目標分子可能為如文中所述之擴增反應(amplification reaction)的反應產物。擴增反應(amplification reaction)可為如文中所述之反應，如不對稱聚合酶鏈鎖反應(Asymmetric Polymerase Chain Reaction, Asymmetric PCR)。

【0115】

於填充的步驟中，液體樣品可自液體來源以使液體樣品在填充所有井前不會進入輸出流道之選定的流率泵通過輸入流道。液體樣品可自液體來源以約略10 mL/h至120 mL/h、約略10 mL/h至100 mL/h、約略10 mL/h至80 mL/h、約略10 mL/h至60 mL/h、約略30 mL/h至120 mL/h、約略30 mL/h至100 mL/h、約略30 mL/h至80 mL/h之間的流率泵通過輸入流道而填充井。於一範例中，流率係於約略10 mL/h至100 mL/h之間。於一範例中，流率係40 mL/h至60 mL/h。有利的是，於流率的範圍內提供穩定的填充作業。假使流率高於上限時，則填充作業將變得不穩定，而導致部分井未填充或未完整填充。流速的範圍可以通過由連接至輸出流道的真空源抽真空而實現。

【0116】

於填充的步驟中，井中檢測探針的擾動可能補償檢測探針和目標分子混合物的混合或漩渦之不存在。有利的是，擾動可足以使探針恢復原狀且量化來自任何給定井所得的螢光信號。

【0117】

於移除步驟中，可藉由連接輸入流道之一端的真空來源抽真空而由輸入流道中移除過量的液體。氣體可自連接輸入流道之另一端的氣體來源引入以助於移除過量的液體。移除步驟之流率可高於填充步驟之流率。於一範例中，液體可以140 mL/h的流率由輸入流道中移除。於其他範例中，液體可以約略10 mL/h至140 mL/h、約略10 mL/h至120 mL/h、約略10 mL/h至100 mL/h、約略10 mL/h至80 mL/h、約略30 mL/h至140 mL/h、約略30 mL/h至120 mL/h、約略30 mL/h至100 mL/h、約略50 mL/h至140 mL/h、或約略50 mL/h至120 mL/h之間的流率由輸入流道中移除。於一範例中，流率係40至60 mL/h。

【0118】

將密封物泵進輸入流道之步驟可以取決於輸入流道之尺寸之流率實施。將密封物泵進輸入流道之步驟可以約略為10 mL/h至40 mL/h、約略10 mL/h至30 mL/h、約略20 mL/h至40 mL/h、或約略20 mL/h至30 mL/h之間之流率實施。於一範例中，流率可約略為10 mL/h至20 mL/h之間，以確保穩定引入密封物進入輸入流道。於一範例中，流率可為10 mL/h至15 mL/h。

【0119】

將密封物泵進輸出流道之步驟可以取決於輸出流道之尺寸之流率實施。將密封物泵進輸入流道之步驟可以約略為10 mL/h至80 mL/h、約略10 mL/h至70 mL/h、約略10 mL/h至60 mL/h、約略20 mL/h至80 mL/h、約略20 mL/h至70 mL/h、或約略30 mL/h至80 mL/h之間之流率實施。於一範例中，流率為20 mL/h至40 mL/h。由於輸出流道之尺寸較大，因此此步驟之流率可高於將密封物泵進輸入流道之步驟的流率。

【0120】

於一範例中，將密封物泵進輸入流道之步驟係於將密封物泵進輸出流道之步驟的之前實施，以有效隔絕於井中之液體。

【0121】

其中將密封物泵進輸出流道之步驟係於將密封物泵進輸入流道之步驟的之前實施，具有約略44 dynes/cm的界面張力的油/水界面形成於井之出口。然而於相較之下，於20℃時，井之出口之水的界面張力約略為72.8 dynes/cm，係高於油/水界面許多。因此，當液態蠟(wax)填充於內部流道時，於井之出口之油/水界面的界面張力可能不足以限制壁板中的溶液。而溶液可能因此進入出口通道，從而影響井之光學檢測的精準度。

【0122】

密封物可為本文揭露的密封物，如液體蠟(wax)。

【0123】

此步驟可於室溫下實施。有利的是，各個井於低至30°C的溫度下可能產生對流，因而有助於檢測探針和目標分子的混合，以產生完全均勻的混合物。

【0124】

假使需要做解鏈曲線分析(melt curve analyses)。則製程可於低於75℃或70℃的溫度下實施，以防止密封物與液體中形成氣泡。

【0125】

有利的是，揭露之方法可在於1分鐘內、40秒內、30秒內、20秒內、15秒內、或12秒內完成。而整個樣品-檢測的工作流成可在5小時內、3小時內、或2小時內完成。有利的是，所揭露之方法提供可能目標分子快速和高通量篩選的方法。可提供賦予抗生素處理治療抗性以對抗抗藥性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )的基因的平台之快速檢測。

【0126】

於一實施例中，提供所揭露之系統於抗藥性對抗至少一種抗菌劑之細菌的檢測的使用上。所揭露之系統可用於賦予對抗抗病毒或抗細菌感染的治療之抗性之基因的檢測。其中細菌可為抗藥性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )。

【0127】

本發明之詞語「細菌感染(bacterial infection)」係指致病菌(pathogenic bacteria)侵入宿主哺乳類動物。此包含通常存在於哺乳動物體內或上之細菌的快速增長。更廣泛來說，細菌感染可以係其中任何存在之細菌相(bacterial population)損害宿主哺乳類動物的情況。詞語中「抗菌劑(antibacterial agent)」係指由微生物產生以抑制其它微生物生長之天然存在的抗生素，及於實驗室中合成或修飾具有殺菌性(bactericidal)或抑制菌的活性之抗菌劑(antibacterial agent)，例如β內醯胺抗菌劑(β-lactam antibacterial agents)、糖肽(glycopeptides)、大環內酯(macrolides)、奎諾酮類藥物(quinolones)、四環素類抗生素(tetracyclines)、以及氨基配糖類(aminoglycosides)。一般來說，假使抗生素係抑菌劑時，係意味著抑菌劑本質上係停止細菌細胞生長（但不殺死細菌）; 假使抗生素為殺菌性時，其意味著此劑可殺死細菌細胞（且可能在殺死細菌前停止細菌生長）。於一範例中，抗菌劑係一種抗生素。

【0128】

揭露系統之實施可為傳統於醫院所執行的抗生素敏感性(antibiotic susceptibility)測試之可行替代品。

【0129】

本文描述之發明說明可適當地在沒有不特別揭露於本文中之任何構件或數個構件、一種限制或數個限制下實施。因此，例如詞語「包含(comprising)」、「包含(including)」、「包含(containing)」等，應廣泛地解讀而非有所限制。此外，本文所使用的詞語與表達係作為描述詞語而非有所限制，詞語之使用不意圖排除顯示與描述的特徵或等效物或其部份，但應意識到的是，在申請專利範圍的範疇內各種微流體裝置皆為可能。因此，應當理解，雖然本發明已藉由參照優先地實施例與必要特徵具體地揭露，於文中所揭露的發明實施例可憑藉所屬領域通常知識者修改與變化，而此修改和變化被認為係在本發明的範疇內。

【0130】

於文中已廣泛與普遍地描述此發明。落入所屬揭露範圍內的各個較窄隘的種類和亞組亦為本發明構成的一部分。本發明包含以要件所為之一般描述與無論排除材料是否於具體記載於本文中，自類別中移除任何標的事項(subject matter)之反面限制(negative limitation)。

【0131】

其他實施例係於申請專利範圍與非限制範例內。此外，本發明之特徵或態樣係以馬庫西群組(Markush groups)的方式進行描述，本領域技術人員將認識到本發明亦因此以馬庫西群組(Markush groups)之構件之亞組或任何單獨構件形式描述。

實施例

範例1

【0132】

有興趣之目標DNA的不對稱擴增於此範例中實施。而有興趣之目標DNA為nuc、mecA、以及blaZ基因。

【0133】

先前nuc基因的過量引子係由SEQ ID NO: 1表示，而nuc基因之反向限制引子係由SEQ ID NO: 2表示，而nuc基因的分子信標探針(Molecular beacon probes，MB probes)係由6-FAM-SEQ ID NO: 3-BHQ1表示。

【0134】

先前mecA基因的過量引子係由SEQ ID NO: 4表示，而mecA基因之反向限制引子係由SEQ ID NO: 5表示，mecA基因的分子信標探針(Molecular beacon probes，MB probes)係由6-FAM-SEQ ID NO: 6-BHQ1表示。

【0135】

先前blaZ基因的過量引子係由SEQ ID NO: 7表示，而bla Z基因之反向限制引子係由 SEQ ID NO: 8表示，bla Z基因的分子信標探針(Molecular beacon probes，MB probes)係由6-FAM-SEQ ID NO: 9-BHQ1表示。

【0136】

多重(multiplexed)聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)之反應溶液係由100 µL的過量引子(2 µM)與有興趣之各個DNA目標物之限制引子(0.2 µM)、200 µM的各個三磷酸去氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP )、2mM的MgCl 2、於2×無色GoTaq®反應緩衝液(pH 8.5)中的熱啟動DNA聚合酶(GoTaq®)、以及2 µL的DNA模板所組成。

【0137】

聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)的擴增反應係於儀器PTC 200 thermal cycler(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)上執行。

【0138】

於95°C下之2分鐘之最初變性(denaturation)的步驟後，係於60個95°C下30秒的循環、50°C下30秒(退火步驟)、以及72°C下30秒(退火步驟)。於72°C下10分鐘之最後延伸步驟包含於60個循環末端。

【0139】

範例2

【0140】

均勻入射光僅於假使微流體裝置之表面之平面上的光強度分佈為徑向對稱(radially symmetrical)下為可能。而入射光的徑向對稱(radially symmetrical)係通過實驗證明。

【0141】

功率計(Model 841-PE, Newport Corp., Irvine, CA, USA)係用於檢測入射至具光纖(400 µm, 0.75 m UV-SR, Ocean Optics)出口10cm距離之樣品平面上的光強度(µW/cm² )。使用固態可切換式光源(Lumencor, Spectra Light Engine, Lumencor Inc., Beaverton, OR, USA)，量測係於來自光軸之0-15mm的各個徑向位移執行。

【0142】

第8圖證實入射至樣品平面，例如晶片上的光分佈具有徑向對稱。因為井係以徑向對稱的圖樣排列，此確保入射光均勻橫越所有的井。

範例3

【0143】

揭露之微流體裝置係用於檢測金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )的 mecA、nuc、以及blaZ基因。而實驗於三個裝置上重複三次。

【0144】

於第一裝置中，預先裝載特定mecA、nuc、以及blaZ基因的分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)於2號與3號井中(由第9A圖中白色箭頭表示)。於第二裝置中，預先裝載特定mecA、nuc、以及blaZ基因的分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)於5號與6號井中(由第9B圖中白色箭頭表示)。於第三裝置中，預先裝載特定mecA、nuc、以及blaZ基因的分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)於8號與9號井中(由第9C圖中白色箭頭表示)。於所有三個裝置中，預先裝載1.6 pmoles的特定mecA、nuc、以及blaZ基因之分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)於個別的2號與3號井中。

【0145】

分別於不對稱單一像素聚合酶鏈鎖反應(Asymmetric single-plex Polymerase Chain Reaction)擴增 mecA、nuc、以及blaZ目標物，而後輸出單股聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)的產物至三個裝置。於輸出放大聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)的產物上，分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)將與其互補目標物雜交，而導致於488nm藍光的激發下於520nm發出的螢光。

【0146】

第9A圖至第9C圖顯示於室溫下於三個裝置中金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )之mecA、nuc、以及blaZ基因之自發性檢測(spontaneous detection)。

【0147】

如於第9A圖至第9C圖中所觀察到的，檢測分析為高特異性。特定的探針僅於假使其互補之目標物出現時發出螢光。如第9A圖所示，螢光被檢測到於分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)與基因發生雜交(hybridization)之2號與3號井中。如第9B圖之部分所示，螢光被檢測到於分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)與基因發生雜交(hybridization)之5號與6號井中。如第9圖C所示，螢光被檢測到於分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)與基因發生雜交(hybridization)之8號與9號井中。

【0148】

第10圖證實來自對應於有興趣之目標物之探針之螢光讀數明顯高於其他兩個非目標物。儘管nuc基因的雜交訊號明顯低於mec A基因與blaZ基因，但其仍然明顯高於在其互補目標物存在中的其他兩個基因。於第10圖中，「*」表示p ≦ 0.01。

【0149】

第9A圖至第9C圖亦證實於相鄰之井之間串擾(cross talk)的存在。緊鄰於具有預先裝載分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)之井的相鄰之井(以虛線箭頭表示)顯示無螢光訊號顯示。此可證實無一個井至另一個井的螢光團(fluorophore) (carry-over)轉移。

範例4

【0150】

於此將研究nuc與mecA雜交訊號上分子信標探針(molecular beacon probes, MB probes)的數量。

【0151】

第11A圖與第11B圖顯示當nuc與mecA分子信標探針(Molecular beacon probes)裝載的濃度分別由0.8 pmol/ 井增加至訊號由增加至6.4 pmol/ 井時，雜交訊號的強度上之增加。

【0152】

此建議在樣品中互補ssDNA的數量可為過量，而因此雜交之數量隨探針數量增加而增加。

【0153】

其他建議為ssDNA可為二級結構，以限制與其雜交之探針的比例。而高濃度探針的供應可能增加雜交的可能性。

【0154】

無論何種方式，不同的目標物傾向顯示不同基準線的雜交強度，而其可藉由改變分子信標探針(Molecular beacon probes)的濃度而做某些程度的調整。

範例5

【0155】

於此範例中，包含無模板對照組(no-template control, NTC)之裝置的螢光與包含陽性對照組(positive control)的裝置做比較。

【0156】

對應至mecA、nuc、以及blaZ目標基因的1.6 pmoles的冷凍乾燥特定序列分子信標探針(Molecular beacon probes)預先裝載於兩裝置之2號與3號、5號與6號、以及8號與9號井中。

【0157】

如預期，相較於無模板對照組，陽性對照組( positive control ) ( no-template control, NTC )於對應之井顯示明顯較高的螢光訊號(參見第12圖)。於此，可輕易定義合適的閥值用以區別偽陽性(false positives)與有效之雜交訊號。

範例6

【0158】

於一範例中，變化DNA模板之濃度。

【0159】

mecADNA模板之濃度變於0 ng/µL (無模板對照組NTC), 2×10^-5 ng/µL、2×10^-3 ng/µL、2×10^-1 ng/µL、以及2×10¹ ng/µL變化。且分子信標探針(Molecular beacon probes)以1.6 pmol/well裝載。

【0160】

第13圖係顯示揭露之裝置可檢測低至檢測極限2×10^-3 ng/µL之mecA目標基因。

【0161】

相同的目標基因使用由Bio-Rad Laboratories公司(CA, USA)獲得的CFX96儀器即時檢測，以作為目標的標準比對。使用相同之引子對與分子信標探針(Molecular beacon probes)。mecADNA模板之濃度於0 ng/µL (NTC)、2×10^-11 ng/µL、2×10^-9 ng/µL、2×10^-7 ng/µL、2×10^-5 ng/µL、2×10^-3 ng/µL、2×10^-1 ng/µL、以及 2×10¹ ng/µL變化。而即時聚合酶鏈鎖反應(real-time Polymerase Chain Reaction, real-time PCR)各以25 µL重複執行三次。

【0162】

第14圖顯示CFX96儀器可檢測低至檢測極限2×10^-3 ng/µL之mecA目標基因。於第14圖中，「*」表示 p ≦ 0.05。

【0163】

於此，揭露之裝置的檢測靈敏度可媲美於CFX96儀器。

國內寄存資訊【請依寄存機構之間、日期之間、號碼順序註記】

無

國外寄存資訊【請依寄存國家之間、機構之間、日期之間、號碼順序註記】

無

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