JP2005181581A

JP2005181581A - レーザー走査型共焦点顕微鏡

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Publication number: JP2005181581A
Application number: JP2003420570A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Nakada; 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2023-12-18
Also published as: JP4567324B2

Abstract

【課題】高速なＦＲＡＰ実験を可能にするレーザー走査型共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】レーザー走査型共焦点顕微鏡１００は顕微鏡部１１０とレーザー光源ユニット１２０と走査ユニット１４０と制御部１８０とを備えている。走査ユニット１４０は、レーザー光源ユニット１２０からの光ビームを走査する走査光学ユニット１４４と、光ビームの収束点に対して共役な位置にある共焦点ピンホール１４７と、共焦点ピンホール１４７を通過した蛍光ビームを分割するダイクロイックミラー１５０と、ダイクロイックミラー１５０で反射された蛍光を検出する分光ユニット１６０と、ダイクロイックミラー１５０を透過した蛍光を検出する分光ユニット１７０とを備えている。ダイクロイックミラー１５０は、標本Ｓから発生する蛍光のうちサイドバンドの波長範囲の成分を透過し、標本Ｓから発生する蛍光のうち中心バンドの波長範囲の成分を反射する。
【選択図】図１

Description

本発明は、レーザー走査型共焦点顕微鏡に関する。

標本中の蛍光を退色させ、退色した蛍光が復帰していく時間経過を検出して、蛍光タンパクの移送を解析するＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching）実験が知られている。

特開２００３−５０８４号公報は、フォトブリーチ実行中の画像観察を可能にするために、レーザー光量に応じて光検出器の感度を変えて検出する手法を提案している。
特開２００３−５０８４号公報

しかし、この手法では、検出感度を時分割で変更しているが、感度調整に使われるフォトマルチプライヤーを駆動する高圧電源は一般的に電圧変更に１ｍｓ以上の時間を必要とするため、高速なＦＲＡＰ実験をすることができない。

また、感度調整ができるダイナミックレンジも限られているため、フォトブリーチ中と画像検出中のレーザー光量の強度比を大きく変えられない。従って、フォトブリーチ中のレーザー強度を強くできず、フォトブリーチ時間が長くなる。フォトブリーチ時間が長くなると、フォトブリーチ中にも蛍光移送が起きているため、フォトブリーチ時間がもっと長くなる。最悪の場合、フォトブリーチを完了できない。すなわち、ＦＲＡＰ実験のデータを取得できない。

本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、高速なＦＲＡＰ実験を可能にするレーザー走査型共焦点顕微鏡を提供することである。

本発明は、ＦＲＡＰ実験に好適なレーザー走査型共焦点顕微鏡であり、レーザー光源と、レーザー光源から射出される光ビームを標本に対して走査するための走査手段と、光ビームを標本内に収束させるための対物レンズと、光ビームの収束点に対して共役な位置に配置された共焦点ピンホールと、標本から発生し共焦点ピンホールを通過した蛍光のうち中心バンドの波長成分を検出する第一検出手段と、標本から発生し共焦点ピンホールを通過した蛍光のうちサイドバンドの波長成分を検出する第二検出手段と、レーザー光源から射出される光ビームの強度を変えるとともに、第一検出手段と第二検出手段で得られる情報に基づいて必要な測定情報を取得するための制御部とを備えている。

本発明のレーザー走査型共焦点顕微鏡によれば、高速なＦＲＡＰ実験が可能になる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

図１は、本発明の一実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡の構成を示している。図１に示されるように、本実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡１００は、顕微鏡部１１０と、レーザー光源ユニット１２０と、走査ユニット１４０と、制御部１８０とを備えている。

顕微鏡部１１０は、対物レンズ１１２と、結像レンズ１１４とを備えている。

レーザー光源ユニット１２０と走査ユニット１４０は光ファイバー１３０によって光学的に結合されている。

レーザー光源ユニット１２０は、レーザー光源１２１、ダイクロイックミラー１２２と、レーザー光源１２３と、ダイクロイックミラー１２４と、レーザー光源１２５と、ダイクロイックミラー１２６と、ＡＯＴＦ１２７とを備えている。

ダイクロイックミラー１２２は、レーザー光源１２１から射出された光ビームを反射する。ダイクロイックミラー１２４は、レーザー光源１２１から射出された光ビームを透過し、レーザー光源１２３から射出された光ビームを反射する。ダイクロイックミラー１２６は、レーザー光源１２１から射出された光ビームとレーザー光源１２３から射出された光ビームとを反射し、レーザー光源１２５から射出された光ビームを透過する。

その結果、レーザー光源１２１からの光ビームとレーザー光源１２３からの光ビームとレーザー光源１２５からの光ビームは、ダイクロイックミラー１２２とダイクロイックミラー１２４とダイクロイックミラー１２６とによって、合成されてＡＯＴＦ１２７に導かれる。

ＡＯＴＦ１２７は、光ビームの通過・遮断を高速に制御したり、光ビームを偏向したり、輝度調光したりする。これにより、ＡＯＴＦ１２７は、光ファイバー１３０に結合する光のオンオフや波長の切り換えや強度の変更を行なう。

従って、レーザー光源ユニット１２０は、少なくとも一つ、最大で三つの波長のレーザー光を含む光ビームを射出することができる。もちろん、レーザー光源を追加すれば三つ以上の波長のレーザー光を含む光ビームを射出することも可能である。

走査ユニット１４０は、光ファイバー１３０から射出された光ビームをほぼ平行光ビームに変えるコリメートレンズ１４２と、コリメートレンズ１４２からの光ビームを偏向するダイクロイックミラー１４３と、光ビームを走査するための走査光学ユニット１４４と、走査光学ユニット１４４からの光ビームを対物レンズ１１２の瞳にリレーするリレーレンズ１４５とを備えている。

ダイクロイックミラー１４３は、レーザー光源ユニット１２０から導入されるレーザー光は反射するが、そのレーザー光の照射によって標本Ｓから発生した蛍光は透過する。

走査ユニット１４０は、さらに、標本Ｓから発生した蛍光ビームを収束させる共焦点レンズ１４６と、対物レンズ１１２にレーザー光ビームの収束点に対して共役な位置に配置された共焦点ピンホール１４７と、共焦点ピンホール１４７を通過した蛍光ビームを平行化するコリメートレンズ１４８と、コリメートレンズ１４８からの蛍光ビームを分割するダイクロイックミラー１５０と、ダイクロイックミラー１５０を透過した蛍光ビームを偏向するミラー１５１と、ダイクロイックミラー１５０で反射された蛍光を検出するための分光ユニット１６０と、ダイクロイックミラー１５０を透過した蛍光を検出するための分光ユニット１７０とを備えている。

分光ユニット１６０は、入射する光ビームを波長に従って分光するグレーティング１６１と、グレーティング１６１の向きを調整するためのガルバノメーター１６２と、グレーティング１６１からの光ビームを収束させる収束レンズ１６３と、検出する光の波長範囲を決めるためのスリット１６４と、スリット１６４を通過した光を検出するための検出器１６５とを備えている。スリット１６４は、開口幅が変更可能であり、開口幅を変えることによって検出器１６５に入射する光の波長範囲を調整することができる。検出器１６５は、入射する光を光電変換して、入射光ビームの強度を反映した電気信号を出力する。

分光ユニット１７０は、分光ユニット１６０と同様の構成であり、グレーティング１７１と、ガルバノメーター１７２と、収束レンズ１７３と、スリット１７４と、検出器１７５とを備えている。

制御部１８０は、ＡＯＴＦ１２７と、走査光学ユニット１４４と、分光ユニット１６０内のガルバノメーター１６２と、分光ユニット１７０内のガルバノメーター１７２とを制御する。また、制御部１８０には、検出器１７５の出力信号と、検出器１６５の出力信号とが入力される。

制御部１８０は、検出器１７５の出力信号と検出器１６５の出力信号と走査光学ユニット１４４の制御信号とから蛍光画像を形成してパソコンに転送する制御を行なう。また、制御部１８０は、フォトブリーチを行なうために、パソコンであらかじめ設定された値に従って、レーザー光源ユニット１２０で発せられるレーザー光の強度を時間経過とともに強めたり弱めたりする制御を行なう。

このようなレーザー走査型共焦点顕微鏡１００において、レーザー光源ユニット１２０内で、ＡＯＴＦ１２７を通過した光ビームは光ファイバー１３０に入射する。光ファイバー１３０に入射したレーザー光は、光ファイバー１３０によって走査ユニット１４０に導かれ、コリメートレンズ１４２に向けて射出される。

光ファイバー１３０から射出された光ビームは、コリメートレンズ１４２によってほぼ平行光ビームに変えられ、ダイクロイックミラー１４３で反射されて走査光学ユニット１４４に方向付けられ、走査光学ユニット１４４とリレーレンズ１４５と結像レンズ１１４とを通過し、対物レンズ１１２によって標本Ｓ内でほぼ一点に収束される。その収束点は、走査光学ユニット１４４によって、一定平面上を走査される。

標本Ｓは、レーザー光源ユニット１２０から発せられるレーザー光に対応した蛍光色素が導入されている。レーザー光が照射された標本Ｓの部分は、蛍光色素が励起されて、蛍光を発する。対物レンズ１１２に入射した蛍光は、結像レンズ１１４に向かうビームとなり、結像レンズ１１４とリレーレンズ１４５と走査光学ユニット１４４とダイクロイックミラー１４３を通過し、共焦点レンズ１４６によって収束される。

共焦点レンズ１４６によって収束された蛍光ビームのうち、対物レンズ１１２によるレーザー光ビームの収束点とその近傍から発生した蛍光は共焦点ピンホール１４７を通過できるが、それ以外の部分から発生した蛍光は共焦点ピンホール１４７を通過できない。

共焦点ピンホール１４７を通過した蛍光ビームは、コリメートレンズ１４８を通過したあと、ダイクロイックミラー１５０によって二本の蛍光ビームに分割される。ダイクロイックミラー１５０で反射された蛍光ビームは分光ユニット１６０に入射し、ダイクロイックミラー１５０を透過した蛍光ビームはミラー１５１で反射されて分光ユニット１６０に入射する。

分光ユニット１６０に入射した蛍光ビームは、グレーティング１６１で回折され、波長に従って分光され、波長ごとに異なる方向に偏向される。グレーティング１６１からの蛍光のうち、収束レンズ１６３に入射した蛍光は、収束性ビームとなり、スリット１６４を通り検出器１６５に入射する。検出器１６５は入射した蛍光の強度に応じた電気信号を制御部１８０に出力する。

収束レンズ１６３に入射する蛍光の波長は、ガルバノメーター１６２でグレーティング１６１の向きを変えることによって変更することができる。スリット１６４の開口幅を変えることによって、検出器１６５で検出される蛍光の波長範囲を変更することができる。つまり、グレーティング１６１の向きによって検出器１６５で検出される蛍光の中心波長が決められ、スリット１６４の開口幅によって検出器１６５で検出される蛍光の波長範囲が決められる。例えば、スリット１６４の開口幅を広めれば、広い波長範囲の蛍光が検出され、スリット１６４の開口幅を狭めれば、狭い波長範囲の蛍光が検出される。

分光ユニット１７０に入射した蛍光ビームも、分光ユニット１６０に入射した蛍光ビームと同様にして検出される。

図２は、蛍光ビームを分割するダイクロイックミラー１５０の透過率特性を示している。図２に示されるように、ダイクロイックミラー１５０は、標本Ｓから発生する蛍光のうちサイドバンドの波長範囲の成分は透過し、標本Ｓから発生する蛍光のうち中心バンドの波長範囲の成分は透過せずに反射する。もちろん、標本Ｓ内の蛍光色素を励起するレーザー光は透過しない。

このため、分光ユニット１６０には、標本Ｓから発生する蛍光のうち中心バンドの波長範囲の成分の蛍光が入射し、分光ユニット１７０には、標本Ｓから発生する蛍光のうちサイドバンドの波長範囲の成分の蛍光が入射する。従って、分光ユニット１６０では、中心バンドの蛍光が検出され、分光ユニット１７０では、サイドバンドの蛍光が入射する。

フォトブリーチを行なうため、レーザー光源ユニット１２０で発せられるレーザー光は、パソコンであらかじめ設定された値に従って、時間経過とともにその強度が強められたり弱められたりする。レーザー光の強度変化に応じて、標本Ｓから発生する蛍光の強度も変化する。また、標本Ｓで反射されたレーザー光は、わずかであるが、その一部は分光ユニット１６０と分光ユニット１７０に達している。分光ユニット１６０と分光ユニット１７０に達するレーザー光の強度も、レーザー光の強度変化に応じて変化する。

このため、レーザー光の強度が強められるフォトブリーチの最中では、分光ユニット１６０に入射する光（蛍光とレーザー光）の強度が、検出器１６５の測定可能範囲を超えることがある。この状態では、分光ユニット１６０はもはや入射光の強度を検出することはできない。

しかし、分光ユニット１７０は、サイドバンドの蛍光を検出しており、サイドバンドの蛍光は中心バンドの蛍光に比べて輝度値が大幅に低いため、フォトブリーチの最中であっても、分光ユニット１７０に入射する光（蛍光とレーザー光）の強度が、検出器１７５の測定可能範囲を超えることはない。

つまり、本実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡１００では、フォトブリーチの最中でも、蛍光を良好に検出することができる。

これにより、レーザー走査型共焦点顕微鏡１００は、蛍光画像による退色前と退色後の蛍光の復帰具合を検出できる。また、フォトブリーチ中の退色過程を検出できる。その結果、蛍光タンパクの移送を解析するＦＲＡＰ実験において重要な退色過程のデータを取得することが可能となる。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

例えば、実施形態では、分光ユニット１６０と分光ユニット１７０は、グレーティングを利用して分光する構成であるが、光学フィルターを利用した構成であってもよく、または、ほかの分光方式による構成であっても構わない。

また、実施形態では、フォトブリーチを完了するタイミングはパソコンであらかじめ設定された値で決まるが、サイドバンドの蛍光輝度値とパソコンであらかじめ設定された輝度値とからフォトブリーチを完了するタイミングを自動的に決めてもよい。つまり、制御部１８０は、サイドバンドの蛍光輝度値があらかじめ設定された輝度値よりも小さくなった時点でフォトブリーチが完了したと判断してレーザー光の強度をフォトブリーチ前の状態に戻す制御を行なってもよい。その結果、フォトブリーチ後の画像取得を無駄なく実行できるようになる。

ＦＲＡＰ実験では、細胞中の指定部位だけに対してフォトブリーチが行なわれる。分光ユニット１６０と分光ユニット１７０のいずれか一方だけを使用し、指定部位に対しては、検出する蛍光の波長を変化させて、フォトブリーチの前後では蛍光中の中心バンドの成分を検出し、フォトブリーチの最中はサイドバンドの成分を検出するようにしてもよい。この手法に従えば、レーザー走査型共焦点顕微鏡は、分光ユニット１６０と分光ユニット１７０のいずれか一方が省かれた構成であってもよい。

本発明の一実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡の構成を示している。蛍光ビームを分割するダイクロイックミラーの透過率特性を示している。

符号の説明

１００…レーザー走査型共焦点顕微鏡、１１０…顕微鏡部、１１２…対物レンズ、１１４…結像レンズ、１２０…レーザー光源ユニット、１２１…レーザー光源、１２２…ダイクロイックミラー、１２３…レーザー光源、１２４…ダイクロイックミラー、１２５…レーザー光源、１２６…ダイクロイックミラー、１３０…光ファイバー、１４０…走査ユニット、１４２…コリメートレンズ、１４３…ダイクロイックミラー、１４４…走査光学ユニット、１４５…リレーレンズ、１４６…共焦点レンズ、１４７…共焦点ピンホール、１４８…コリメートレンズ、１５０…ダイクロイックミラー、１５１…ミラー、１６０…分光ユニット、１６１…グレーティング、１６２…ガルバノメーター、１６３…収束レンズ、１６４…スリット、１６５…検出器、１７０…分光ユニット、１７１…グレーティング、１７２…ガルバノメーター、１７３…収束レンズ、１７４…スリット、１７５…検出器、１８０…制御部。

Claims

レーザー光源と、
レーザー光源から射出される光ビームを標本に対して走査するための走査手段と、
光ビームを標本内に収束させるための対物レンズと、
光ビームの収束点に対して共役な位置に配置された共焦点ピンホールと、
標本から発生し共焦点ピンホールを通過した蛍光のうち中心バンドの波長成分を検出する第一検出手段と、
標本から発生し共焦点ピンホールを通過した蛍光のうちサイドバンドの波長成分を検出する第二検出手段と、
レーザー光源から射出される光ビームの強度を変えるとともに、第一検出手段と第二検出手段で得られる情報に基づいて必要な測定情報を取得するための制御部とを備えている、レーザー走査型共焦点顕微鏡。
請求項１において、制御部は、あらかじめ設定された値に従ってレーザー光源から射出される光ビームの強度を変える、レーザー走査型共焦点顕微鏡。
請求項１において、制御部は、第一検出手段と第二検出手段で得られる情報に基づいて、レーザー光源から射出される光ビームの強度を変える、レーザー走査型共焦点顕微鏡。
請求項１において、第一検出手段と第二検出手段は、標本から発生し共焦点ピンホールを通過した蛍光のビームを、中心バンドの波長成分の蛍光ビームとサイドバンドの波長成分の蛍光ビームとに分割するビームスプリッターを含み、第一検出手段は、中心バンドの波長成分の蛍光を検出する検出器を備え、第二検出手段は、中心バンドの波長成分の蛍光を検出する検出器を備えている、レーザー走査型共焦点顕微鏡。
請求項１において、第一検出手段と第二検出手段は、標本から発生し共焦点ピンホールを通過した蛍光を波長に従って分光する分光機構と、分光された特定の波長成分の蛍光を検出する検出器と、検出器で検出される蛍光の波長成分を変更する波長変更手段とを備えている、レーザー走査型共焦点顕微鏡。