JP2005164612A - スペクトル画像システムをアライメントする方法、単色サンプル画像を得るための装置及び方法、スペクトル画像システム、並びに中期スプレッド発見装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 サンプル上の選択された位置における蛍光、ルミネッセンスあるいは吸収を測定するために使うことができる改良されたスペクトル画像システムを実現する。
【解決手段】 スペクトル映像システムのための方法及び装置が提供される。このシステムは、サンプル上の選択された位置において、蛍光、ルミネッセンス若しくは吸収を測定するためのものである。干渉スペクトル分別器は、干渉図面を生成する。このシステムはスリット (５０３) で較正することができる。干渉計の経路長における大きなオフセットは、高い縞の密度の生成をもたらすことができ、それにより単色画像が生成される。中期発見器は、関心のあるエリアの位置を捜すために使われる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、一般的にスペクトル画像システム、特に蛍光画像システムの使用及び較正を簡単化するための方法及び装置に関する。

本願は、譲渡された１９９７年１月７日発行の米国特許第５，５９１，９８１号、並びに、譲渡された同時係属出願である１９９６年１月１１日出願の米国特許出願第０８／５８５，３０３号及び１９９６年１０月１１日出願の米国特許出願第０８／７２９，１１１号に関連し、また、１９９７年９月９日出願の出願番号未割当ての「ＦＩＳＨを利用した蛍光画像装置」と題された出願に関連し、これらの完全なる開示は、全ての目的のために参照されることによって組み込まれる。
バイオ利用の分野では、螢光染料が、高感度で非同位体のラベルとして日常的に使用されている。これらのラベルは、ＤＮＡ配列内の特定の染色体のような種々のセル構造を識別し位置を示すために使用される。１つの用途である蛍光インサイチュウハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization：ＦＩＳＨ）は、まず特定の染色体領域にＤＮＡプローブを取り付け、そして顕微鏡を使ってプローブを画像化する。

「Simultaneous Visualization of Seven Different DNA Probes by In Situ Hybridization Using Combinatorial Fluorescence and Digital Imaging Microscopy 」と題されたThomas Ried 他による論文（Proc.Natl.Acad.Sci.USA:Genetics.89（１９９２年２月））において、著者は、組合わせプローブラベル付け手法について述べている。開示された技術は、所与の数の蛍光色素を使って同時に検出することができる目標配列の数を増加させる。特に、著者は３個の蛍光色素だけを使って７個までのプローブを同時に分析することを開示している。

種々の装置が、蛍光でラベル付けされたサンプルを読み取るために設計されている。蛍光でラベル付けされたサンプルの読取り及び／又は画像化のために設計された装置は、一般的には、１つ又はそれより多い励起波長で発光する少なくとも１つの光源と、１つ又はそれより多い蛍光波長を検出するための手段とを必要とする。

米国特許第５，２９０，４１９号ではマルチカラー蛍光分析器が記載されているが、これは時分割に基づいて動作する２つ又はそれより多い励起源でサンプルを照射するものである。バンドパスフィルタ、イメージスプリッティングプリズム、バンドカットオフフィルタ、波長散乱プリズム及び二色性ミラーは、特定の発光波長を選択的に検出するために使用される。

米国特許第５，２１３，６７３号ではマルチカラー電気泳動パターン読取装置が記載されているが、これは１つ又はそれより多い光源でサンプルを照射するものである。光源を個別に使うことも１つの信号源に結合することもできる。光学フィルタは、サンプルへの照射の結果生じる蛍光を、複数の蛍光波長に分離するのに使われる。

米国特許第５，１９０，６３２号ではマルチカラー電気泳動パターン読取装置が記載されているが、ここでは、１つ又はそれより多い光源が、２つ又はそれより多い蛍光物質を励起することができる光の合成物を生成するのに使われることが記載されている。光フィルタ及び回折格子は、共に波長によって蛍光を分離するのに使われる。

米国特許第５，０６２，９４２号では蛍光検出装置が記載されているが、ここでは、蛍光画像が複数の仮想画像に分離される。バンドパスフィルタは波長によって仮想画像を分離するのに使われる。
米国特許第５，５３９，５１７号では、画像の各ピクセルのスペクトル強度を得るために光学画像を分析する方法が開示されている。

「Gastrointestinal Tissue Diagnosis by Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy at Endoscpy」と題されたCothren 他による記事（Gastrointestinal Endoscopy 36(2)(1990)105-111 ）において、著者は、生体組織からの自己蛍光を研究するのに使われる内視鏡システムについて記述している。励起源は波長が３７０ナノメートルの単色である。光ファイバは、照射された組織によって発せられた蛍光を集めるのに使われる。ゲート光学マルチチャネル分析器(gated optical multi-channel analyzer)に結合された画像分光写真器(imaging spectrograph)を使って、３５０〜７００ナノメートルの発光スペクトルが集められる。同類の自己蛍光システムが「Autofluorescence of Various Rodent Tissues and Human Skin Tumour Samples」(Lasers in Medical Science 2 (41) (1987) 41-49) にAndersson 他によって記述されてある。

上述の蛍光分析器は、性能について数多くの欠点を有する。例えば、回折格子を使ったこれらのシステムは、比較的能率があがらず、発せられた光のうちのわずかな部分だけを検出器アセンブリに渡す。更に、システムの多くは、画像の各ピクセル毎のスペクトル強度を得るのに法外な時間を必要とする。つまるところ、これらシステムの全てにおいては較正が難しいわけである。

このようなことから、改良されたスペクトル画像システムが望まれている。

本発明は、サンプル上の選択された位置における蛍光、ルミネッセンスあるいは吸収を測定するために使うことができる改良されたスペクトル画像システムを提供する。発光検出サブアセンブリは、どのような波長に対しても干渉スペクトル弁別器を利用して波長の連続体内に調整することができる。干渉スペクトル弁別器は干渉図形(interferogram：インターフェログラム) を生成するが、そこからアレイの各ピクセル毎の波長スペクトルを、典型的にはフーリエ変換分析を使って計算することができる。

本発明の１つの態様は、システムの色彩精度は、入力リレーレンズの入力口径の一部側に及び一部側の方に位置された「較正スリット」を使って較正されるが、この入力リレーレンズは干渉スペクトル弁別器に入射する光をコリメートする。スリットの画像は弁別器を通過し、そして検出器アレイ上のサンプルの画像として映し出される。較正スリットは、公知の種々の波長源のどれを使っても照射される。スペクトル弁別器の出力は、縞の数を決定し、２つ又はそれより多い波長の投射光についてのスリットに関連する入射光の波長に対する高速フーリエ変換（ＦＦＴ）チャネルのＣＣＤ出力を処理することによって波長の範囲に較正される。

本発明の別の態様では、透過光学部品が、サンプルの単色画像が必要なときはいつでもビーム経路に挿入することができる干渉スペクトル弁別器に含まれる。この光学部品は、干渉スペクトル弁別器内の旋回ミラーのうちの１つの正面に挿入され、それによって干渉計のレッグ間に大きなオフセットを生成する。このオフセットによって、縞の密度が大きくなりすぎるので検出器アレイの個々のピクセルでは分解することはできない。従って、単一のフレームの露光はサンプルの単色画像を提供する。

本発明の別の態様では、干渉スペクトル弁別器は偏光ビームスプリッタを含む。偏光ビームスプリッタは、１つの偏光を選択的に反射する一方でもう１つの偏光を選択的に透過する。それゆえ、１つの偏光が１つのビーム経路を辿り、もう１つの偏光がもう１つのビーム経路を辿る。２つの偏光が、出力リレーレンズの焦点で結合する。そうすることで偏光ビームスプリッタは効率を高めると共にサンプル画像内のゴーストを減少させる。

本発明の別の態様では、中期発見器(metaphase finder)が、関心のあるエリアの位置を捜すのに使われ、これによって、セル屑のような望まれない物質だけを含むエリアについての分析に時間を無駄に費やすことを避けることができる。中期発見器はレイリー拡散を利用して中期スプレッド(metaphase spread)の位置を捜す。関心のある物質を含むサンプルプレート（例えば顕微鏡のスライド）は、中期スプレッド内に含まれる物質（例えば染色体）のサイズの大きさを有する、物質から選択的に拡散するように決定された波長の光で照射される。サンプルプレート上の位置に対する拡散光の強度が監視される。この情報は拡散が増加したエリア、すなわち関心のあるエリアを判定するのに使われる。中期スプレッドと、サンプルプレート上に含まれる他の物質との間により良好な弁別を達成するために、プレートは、第２の波長の光と、監視されている位置に対する拡散光とで照射されてもよい。この第２の波長は、関心のある物質に対して拡散が増加しないように選択し、それゆえにバックグラウンド拡散を示す。初期の拡散の測定値からバックグラウンド拡散を差し引くことによって、ノイズに対して改良された信号を得ることができる。

本発明の性質及び利点の更なる理解は、明細書の残りの部分及び図面を参照することによって実現できる。

蛍光インサイチュウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、中期染色体及び間期核のＤＮＡ配列を視覚化するための重要な技術になりつつある。この方法は、現在、遺伝子位置研究のためのリサーチ実験に日常的に使われている。例えば、ＦＩＳＨは遺伝子を特定の染色体領域にマップしたり、染色体に沿ってクローンにクローンコンティグを生成若しくは確証させるのに使われる。ごく最近では、ＦＩＳＨは、種々の染色体異常を検出するために医療現場にも適用されている。

ＦＩＳＨにおける最近の成果は、プローブ技術の発達に集中している。現在では、プローブは、末端小粒、あるいは大きな単一コピー遺伝子のような種々の染色体領域に利用できる。これらのプローブは分子細胞遺伝学において特に有益であり、ある例では、染色体列挙研究において動原体特定プローブを使用することにより染色体の動原体における反復ＤＮＡが導き出される。しばしばこのような反復配列は特定の染色体に対してユニークであり、従ってセルに含まれる所与の染色体のコピーの数を判定することができる。加えて、染色体ペイントと呼ばれるプローブのクラスが最近利用可能になりつつある。このタイプのプローブは染色体構造を判定するのにとても便利であるが、それはなぜなら、所与の染色体の全長を多かれ少なかれ一様に交配するからである。セルの染色体組、転座のような構造的異常を判定するために、並びに、マーカー染色体の起源を識別するためにペイントが使われる。

ＦＩＳＨの利用に対してＤＮＡプローブをラベル付けするのに多くの方法が利用可能であるが、ビオチン若しくはジゴキシゲニンのようなハプテンは酵素反応を使ってＤＮＡに組み入れられる間接的な方法も含んでいる。中期染色体スプレッド若しくは間期核の交配に続いて、免疫学的方法を使うことによって蛍光ラベルが混成物に付けられる。ごく最近では、螢光染料はプローブに直接組み入れられており、中間的なステップを使うこと無く検出される。標準的なＦＩＳＨ染料としては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド及びＣｙ染料がある。種々のハプテン若しくは螢光染料で種々のプローブをラベル付けすることによって、マルチプローブＦＩＳＨ分析を達成することができる。

ＦＩＳＨに便利な染料の数は、比較的制限される。所与の実験で画像化され得るプローブの数を増やすために、組合わせ蛍光手法が開発されている。組合わせ手法においては、蛍光レポータグループが単独あるいは組合わせのいずれかで使用される。下の表は、３つの蛍光レポータＡ、Ｂ及びＣをどのようにして７つまでのプローブに使うことができるかを例示している。検出可能なプローブの数は、４つの蛍光物質では１５、５つの染料では２６、ｎを染料の数に等しいとしたとき２ｎ −１まで増やすことができる。

図１は、蛍光画像装置の機能ブロック図である。光源１０１からの光はフィルタアセンブリ１０２を通過する。フィルタアセンブリ１０２は、光源の発光帯域から望まない波長を除去するが、まず、選択された蛍光色素を励起するのに必要な波長を通し、励起された蛍光の発光帯域を取り除く。次に、選択された放射は、照射サンプル１０４の前のコンデンサ光学部品(condensing optics) １０３を通過する。サンプル１０４を離れた光である、サンプル１０４によって拡散された投射光と発せられた蛍光とは、共に光学部品１０５及びフィルタアセンブリ１０６を通過する。フィルタアセンブリ１０６は拡散光のほとんどを除去し、発せられた蛍光の選択された帯域を通過させる。本発明のいくつかの実施例では、更なるフィルタリングが必要である。このような場合、フィルタ１０６から出た光は、第２のフィルタアセンブリ１０７を通過する。そして、フィルタされた蛍光スペクトルは、デバイス（ＣＣＤ）アレイ１０９に結合されたメガピクセルチャージを使って画像化される前に、スペクトル弁別器１０８を通過する。ＣＣＤアレイからの信号は、サンプル１０５の画像の構成に使われるプロセッサ１１０に送られる。この画像は、ＣＲＴ若しくはその他のモニタ１１１上に表示される。

スペクトル弁別器１０８を設計するのに数多くの技術を利用することができ、それゆえ、発せられた蛍光スペクトルをスペクトル弁別して種々のプローブを区別する装置が可能である。これらの技術は２つの基本的なカテゴリに収まる。すなわち、分散要素及びフィルタである。これらの技術は、同時係属の米国特許出願第０８／５８５，３０３号に詳細に述べられており、その全体がここに編入される。

図２は、染色体を識別し分類するために使うことができるスペクトル画像システムの１つの実施例を例示する図である。サンプル画像からカラー情報を抽出するために使うことができる数多くの技術が存在するが、例示されたシステムは干渉処理を利用する。通常、この手法は解像度、コスト、スペース及び重量要件、並びに処理速度の最良の組合わせを提供する。好適には、サニャック干渉計が、その改良された安定性ゆえに使われる。

例示されたシステムでは、エピフルオレセンス(epifluorescence) ／フェーズ顕微鏡２０１は、サンプル（図示せず）の画像を生成するが、それはリレー光学部品２０５を使ってサニャック干渉計２０３に受け渡される。好適には、光学部品２０５はサンプル画像を含むコリメートされたビームを形成する。サニャック干渉計２０３は、ビームスプリッタ２０７及び旋回ミラー２０９から成る。リレー光学部品２１３の第２のセットは、サンプル画像を検出器２１５へ渡す。好適な実施例では、検出器２１５はＣＣＤアレイである。

図２に例示されるように、ビームスプリッタ２０７は入射光を２つの個別のビームに分割する。これらのビームは、再結合されて検出器アレイ２１５で干渉パターンを形成するが、これは干渉計の２つのレッグの間の位相シフトのためである。それゆえ、干渉図形の縞は、分析されている画像上で重畳される。検出器アレイ２１５を利用して、サンプルの一連の画像は、縞の位相が変化するように撮られる。例えば、サニャック干渉計２０３を使用して、ビームスプリッタ２０７によって軸の周りで干渉計を回転させることによって位相変化が得られる。フーリエ変換はプロセッサ１１０を使って各ＣＣＤピクセル毎に対して計算される。

図３は、本発明にも使うことができる干渉計３００のモノシリック形式を例示する図である。モノシリック干渉計は、他の形式の干渉計に比べて、振動、ミスアライメント及び熱に対して影響を受けない。モノシリック干渉計はまた、とても大きな受光角を有する。
干渉計３００は、ビームスプリッタコーティング３０５の平面に沿って第２のガラス部分３０３に接合された、第１のガラス部分３０１から成る。経路３０７に沿って干渉計に光が投射される。この光線がビームスプリッタコーティング３０５に当ったとき、光線は２つの光線に分離するが、一方の光線は経路３０９を辿り、もう一方の光線は経路３１１を辿る。光線は、干渉計ミラー３１３によって反射した後、距離３１７を隔てた各経路３１５に沿って光学部品を抜け出す。

アレイ２１５の各ピクセル毎のスペクトルデータが一旦決定されると、スクリーン１１１上に種々の有益な画像を生成するのにプロセッサ１１０を使うことができる。識別されたプローブは、個別にでも種々の組合わせにでもどちらでも見ることができ、識別された全プローブを同時に示すこともできる。それゆえ、少なくとも５つの異なる染料が使われた場合、個別に識別された各染色体でＦＩＳＨ核型を生成することができる。プローブの多くが複数の染料（すなわち、１つのプローブにおける染料の組合わせ）を含むことになるので、表示された画像を簡単化するのに擬似カラーを使うことができる。この手法では、各プローブには、簡単に区別可能なカラーが割り当てられる。例えば、３つの染料が７つのプローブを形成するのに使われた場合、プローブのうちの４つは、染料のいくつかの組合わせによって形成されるであろう。複数の染料を有するものも含むが、各プローブに個別のカラーを割り当てることによって、ユーザに表示された画像は極めて簡潔で簡単なものとなる。画像を拡張し、また強い外縁を得るのにコンピュータを使うことができる（例えば、異なる測定強度には異なる色を割り当てる）。
アライメント手順
適切な結果を得るために、スペクトル弁別器の干渉計は、適切にアライメントされなければならない。種々のアライメント手順を使ってもよいが、以下の手順は、迅速かつ正確に決定される。図４を参照すると、アライメント手順はサニャック干渉計４００、コリメーティング入力及び出力リレーレンズ４０１及び４０３のそれぞれを使用する。

初めに、レーザ４０７のレーザビーム４０５は、ミラー４１１を使って顕微鏡４０９に注入される。ミラー４１１は、顕微鏡のフィールド開口とコンデンサ(condenser) との間に置かれる。種々のレーザが使われるが、約０．５ミリワット出力のＨｅＮｅレーザが、好適な実施例で使われる。１０倍の対物レンズを使って、顕微鏡は焦点合わせされる。そして、顕微鏡の接眼レンズから投射されるビームは、顕微鏡から近い距離、通常は２〜３メートルの距離に位置する内壁若しくは外面に焦点が合わせられる。焦点合わせは、コンデンサレンズを調節することによってなされる。レーザアライメント手順を完成するために、接眼レンズを取り除き、焦点が合わされたスポットを巧みに操作することで、焦点が合わされていないスポットに比べて適切な位置に入れる。適切な位置は、接眼レンズを取り除く前の、焦点が合わされた２つのスポットの間隔及び方向によって定義される。スポットの移動は、ミラー４１１を回転し、コンデンサレンズを調節することによってなされる。このステップが終わって接眼レンズが交換された後、焦点合わせされた２つのスポットの間隔は、顕微鏡の２つの接眼レンズの間隔と同じにしなければならない。

次に、ビーム４０５は、接眼レンズの通過からＣマウント４１３の通過に切り替えられ、これによって、ビームは干渉計４００を通過する。この段階で、ビームスプリッタ４１５は干渉計４００から取り除かなければならない。焦点合わせされたビームがシステムの光学部品テーブルを回転させることによって旋回ミラー４１９の中心に合わされた後、ミラー４１７は、旋回ミラー４１７の中心にビームをアライメントするように調節される。そしてミラー４１９は、出力リレーレンズ４０３の中心にビームが位置するように調節される。レーザビームを検出器アレイ４２１にアライメントする前、ニュートラルデンシティフィルタは、例えば位置４２３において、レーザビームに対して挿入されなければならない。０．５ミリワットＨｅＮｅレーザに対して、検出器アレイ４２１がダメージを受けるのを防ぐのには、通常、ＮＤ７．０フィルタで十分である。ニュートラルデンシティフィルタがビーム経路に挿入され、パワーが検出器４２１に印加された後は、レーザビームによって照射されるアレイ４２１上のピクセルに対応するモニタ４２５上にスポットが現れるであろう。ミラー４１９は、検出器アレイ４２１の中心にビームがアライメントされるように調整されてもよい。

干渉計４００のアライメントを完成するためには、検出器アレイ４２１は、まずオフされ、ニュートラルデンシティフィルタ４２３が取り除かれ、ビームスプリッタ４１５が干渉計に再挿入されなければならない。単一のビームだけが出力リレーレンズ４０３に入力されるまで、ビームスプリッタ４１５は調節される。そして、１０倍の対物レンズが取り除かれ、２つのビームが出力リレーレンズ４０３の入口で同心円をなしかつシステムの光学軸と同軸になるように、コンデンサレンズと共にミラー４１７及び４１９がミラー調節される。この段階で、縞を見るためにはレンズ４０３の正面に白いカードを挿入する必要があるが、縞はリレーレンズ４０３において可視であるべきである。代わりに、レーザを取り除き、１０倍の対物レンズを交換することができ、アレイ４２１に投射する顕微鏡４０９のソース４２７に起因する縞を、モニタ４２５を介して観察することができる。

次に、レーザ４０７及びミラー４１１は取り除かれ、１０倍の対物レンズがシステムに再挿入され、暗視野光源４２７及び検出器アレイ４２１がオンする。干渉計４００に接続された顕微鏡４０９の出力は、ミラー４１７及び４１９を調節することによってアレイ４２１に集中させられる。傾斜したミラー４１７及び４１９は、２つのものを達成する。２つのミラーがビーム経路と同じ方向に傾けられれば、縞が変化するだろう。２つのミラーがビーム経路と反対の方向に傾けられれば、画像がシフトするであろう。このことは画像のｘ及びｙ軸の両方について成り立つ。

干渉計４００によって生成された縞は、その後、出力リレーレンズ４０３を調節することによって焦点が合わせられる。この調節により、ＣＣＤカメラ上の画像全体が、縞の変調が増すにつれて暗くなる。テストパターンのレチクルは、顕微鏡４０９のステージにあり、入力リレーレンズ４０１は最適な画像焦点を得るように調節される。最後に、５２０ナノメートルバンドパスフィルタはビーム経路に置かれ、ビームスプリッタ４１５とミラー４１９との間隔が、アレイ４２１の５１２ピクセルにわたって約５０縞の縞の数を得るように調節される。
スリット較正
上述のように、スペクトル弁別器が干渉計であって、その干渉計がサンプルの干渉画像を形成するのに使われるとき、干渉画像を色彩空間に変換する１つの方法は、フーリエ変換を使うことである。フーリエ変換チャネル数を波長に変換するのにいくつかの較正手段を必要とする。較正の１つの方法は、図５に例示されたスリットを使うことである。

図５の顕微鏡４０９はＣマウント４１３を含む。サンプルの画像は、Ｃマウント４１３上方の画像平面５０１に顕微鏡４０９によって画像化される。画像平面５０１に含まれる画像はリレーレンズ４０１によって集められスペクトル弁別器４００（この場合、サニャック干渉計である）を通過する。本発明の実施例では、較正スリット５０３は画像平面５０１内に置かれる。

較正スリット５０３は、光源５０５によって照射される。通常、ソース５０５からの光は、１つ又はそれより多い焦点合わせ光学部品５０７で、スリット５０３上に焦点合わせされる。スリット５０３の画像は、光学部品４０１によって集められ、スペクトル弁別器４００を通過し、出力リレー光学部品４０３によって検出器４２１上に画像化される。サンプル画像よりも大きい検出器アレイ４２１を利用して、スリット５０３の画像は、アレイ４２１の隣接した使われていない一部分に記録することができる。

図６は、画像平面５０１の上面図である。画像平面５０１の一部分６０１は、ＣＣＤ検出器アレイの画像平面５０１上の投影画である。エリア６０１内には画像開口６０３がある。画像開口６０３は、検出器４２１上に画像化するために、弁別器４００を通じて顕微鏡４０９からのサンプルの画像を通過させる。画像開口６０３の外側でありかつＣＣＤアレイ６０１の投影画の内側は、スリット５０３である。それゆえ、スリット５０３は検出器アレイ上に画像化されるにもかかわらず、その画像はサンプル画像とは一致しない。

ソース５０５は、好適にはレーザであり、例えばレーザダイオードである。スリット５０３を照射する光は、既知の波長であるべきであり、それゆえ、システムを較正することが可能となる。所望の波長スペクトルによってサンプル画像を較正するために、少なくとも２つ、好適には３つの波長をシステム較正中に使わなければならない。これにより、波長の範囲を、２つ又はそれより多い既知の波長から挿入することができる。ある実施例では、複数のレーザダイオード５０５が利用され、そのそれぞれが、異なる既知の周波数で動作する。別の実施例では、ソース５０５が複数の波長を発し、１つ又はそれより多いバンドパスフィルタ５０９が、所望の波長を選択するのに使われる。

本発明の１つの利点は、各サンプル画像毎に較正データを提供する点にある。それゆえ、もし画像から画像へのシステムが不安定であれば、不安定性は最後のデータから較正され得る。更に、本発明は完全に自動であってもよい。本実施例ではアレイ４２１の出力は、プロセッサ１１０に結合される。プロセッサ１１０は、サンプル画像を較正するために、スリット５０３の画像の照射波長を知ると共にスリット５０３の画像を使ってもよい。所望ならば、フィルタ５０９を自動化し、プロセッサ１１０の制御下に置いてもよい。
縞無しサンプル画像
スペクトル画像システムを使用している間、サンプルの簡単な単色画像を観測したくなることもしばしばある。例えば、ユーザが関心のある位置を簡単に識別したいような場合である。関心のある位置が識別された後は、サンプルのその一部分のフルカラー分析を実行することができる。このように任意に可視であるようにするためには、フルカラー画像と比較して比較的高速に単色画像を得ることができなければならない。従って、まず完全な干渉画像を得て、そして次にグレースケールを導き出しあるいは縞の筋を計算して取り除くことによって、単色画像を生成することは、実際の解決策ではない。

図７は、サンプルの縞の無い画像を早急に得るために使われ得る本発明の１つの態様を例示する図である。図７のスペクトル弁別器７００は、図２、４及び５に例示されるようなスペクトル画像システム内に含まれるのに適している。上述のようにスペクトル弁別器７００はビームスプリッタ７０１、第１の旋回ミラー７０３及び第２の旋回ミラー７０５を含む。加えて、このシステムは、どちらの旋回ミラーの位置も変えることなく、ミラーのうちの１つ、この場合はミラー７０３の正面に挿入され得る光学部品７０７を有する。光学部品７０７の挿入により干渉計のレッグ間に非常に大きなオフセットが発生し、それゆえ、この縞の密度では大きすぎるようになるので検出器アレイの個々のピクセルでは分解することができない。それゆえ、縞の筋を計算して取り除く必要も無く、サンプルの単色画像は、単一のフレーム露光で得られる。

好適な実施例では、光学部品７０７は、弧の３分より小さいくさびを有するＢＫ−７で形成されウィンドウが８ミリメートルの厚さである。好適には、光学部品７０７は、無反射コーティングで覆われる。光学部品７０７をビーム経路に手動で挿入することもできるが、好適な実施例では光学部品７０７は、モータ７１３に結合された変換ステージ７１１に取り付けられる。ステージ７１１及びモータ７１３によって、ユーザは、サンプルについて縞の無い単色画像を望むときはいつでも光学部品７０７を簡単に挿入することができる。
偏光ビームスプリッタ
前出の図に示されるサニャック干渉計におけるビームスプリッタ（すなわち、図２のビームスプリッタ２０７、図４及び５のビームスプリッタ４１５、並びに図７のビームスプリッタ７０１）は、図８に例示されるような偏光ビームスプリッタ８０１によって置き換えることができる。偏光ビームスプリッタ８０１は、効率が増しゴーストが減るといういくつかの利点を提供する。本実施例におけるビームスプリッタ８０１は、例えば偏光ビームスプリッタキューブが、１つの偏光（例えばｓ偏光）を選択的に反射し、もう１つの偏光（例えばｐ偏光）を選択的に透過する。それゆえ、１つの偏光が干渉計ビーム経路８０３を選択的に辿る一方で、もう１つの偏光がもう１つの干渉計ビーム経路８０５を選択的に辿る。この２つの偏光は、その後、干渉計出力ビーム経路８０７において結合される。旋回ミラー４１７及び４１９上の絶縁コーティングは、投射ビームの偏光の影響を最小限にするよう設計される。
中期発見器
本発明のスペクトル画像システムを使うときは、関心のある特定のエリアの位置を捜すことができることがしばしば望まれる。例えば、染色体を研究し識別するために設計されたシステムでは、中期スプレッドの位置を捜す能力が望まれる。このようなエリアの位置を高速にかつ効果的に捜すことができるならば、ユーザはサンプル全体を細かく処理するタスクに費やす時間を避けることができる。高速位置捜索技術は、干渉図形の処理に必要な時間のために、本発明に関しては特に重要である。

本発明は、投射光の波長に比べて小さい物体によって光が散乱する、レイリー散乱として一般に知られる現象を利用している。図９は、本発明の基本的な考えを例示する図である。１つ又はそれより多い中期スプレッドは、種々の他のセル物質及び屑と共に、顕微鏡スライド９０１上に含まれる。ソース９０３からの第１の波長の光はスライド９０１に照射され、検出器９０５は、位置に対する散乱光の強度を監視する。ソース９０３の波長は、当該中期スプレッド（あるいは他のオブジェクト）のディメンジョンが与えられる最大限の散乱を達成するように選択される。好適には、より良好な弁別を得るために、スライド９０１はまた、ソース９０３の波長を変えたり単に異なるソースに取り替えたりすることで、第２の波長の光によって照射される。第２の波長は、当該オブジェクトに対して散乱が増加しないように選択される。バックグラウンドすなわち第２の波長の散乱光を、初期散乱光から差し引くことによって、中期スプレッド（あるいは他のオブジェクト）の位置を識別することができる。関心のあるエリアが一旦識別されると、スペクトル画像化のような他の技術を、より詳しくこれらのエリアを研究するために使うことができる。

中期発見器の多くの変形を使うことができるが、本発明が利用されるべきであるシステムの制約に主に依存することになる。例えば、検出器はまた位置９０７に位置することができ、そうして、スライド９０１を通過する散乱光を監視する。本実施例におけるスライド９０１は、散乱波長において高透過になるように設計されるべきであり、これによると反射損を最小限にするために光学コーティングを利用する。スライド９０１を通過する散乱光を単独で使用することができるが、より良好な信号対雑音比を得るために、反射した散乱光に関連してそれを使用することができる。この構造は少なくとも２つの検出器を必要とするが、それは１つは反射した散乱光を監視するために、もう１つは透過した散乱光を監視するために必要である。

関心のあるオブジェクト（例えば中期スプレッド）に関する位置データを、様々な方法で得ることができる。例えば、レーザを光源として使うことができ、レーザと検出器との相対位置は一定のままできる。レーザのビームの下でｘｙ変換ステージ（例えば、数の上で制御されるステージ）を使ってサンプルをラスター走査することによって、サンプル全体からの散乱をマップすることができる。代わりに、レーザからのビームで、サンプルに対してラスター走査することができる。しかし、この手法は、関心のあるオブジェクト（例えば中期スプレッド）を含む位置に後で戻すことができるようにするために、サンプル上におけるビーム位置を正確に知る必要がある。代わりに、サンプルからの散乱光は、検出器アレイ上に画像化することができ、それによって、サンプルと検出器アレイとの各位置を一対一に対応させる。この構造では、サンプルはレーザソースを使ってラスター走査され得るか、サンプル全体は関心のある１つ若しくは複数の波長の大きいエリアソースによって照査され得るかする。例えば、図１０に例示されるように、サンプル全体１００１は、単一のソース１００３によって照射され得る。検出器アレイ１００５は、サンプル１００１を通過する散乱した放射を監視し、それによって、散乱した放射の強度及び最大散乱の位置の両方を提供することができる。

当業者は理解できるであろうが、本発明の精神及び本質的な特徴から逸脱すること無く、本発明を他の特定の形式で実施することができる。それに応じて、本発明の好適な実施例の開示は、例示的であって限定的ではなく、添付する請求項に示される本発明の範囲に意図される。

蛍光画像装置の機能ブロック図である。 スペクトル画像システムの実施例を例示する図である。 サニャック干渉計のモノシリック形式を例示する図である。 本発明によるアライメント手順を例示する図である。 バックライトスリットを利用した較正システムを例示する図である。 図５に示される較正システムの画像平面を例示する図である。 サンプルの縞無しの画像を早急に得るのに使うことができる本発明の１つの態様を例示する図である。 本発明の特定の実施例において使われる偏光ビームスプリッタを例示する図である。 本発明による中期発見器を例示する図である。 本発明による中期発見器の特定の実施例を例示する図である。

符号の説明

１０１ 光源
１０２ フィルタアセンブリ
１０３ コンデンサ光学部品
１０４ サンプル
１０５ 光学部品
１０６ フィルタ
１０７ フィルタアセンブリ
１０８ スペクトル弁別器
１０９ デバイス（ＣＣＤ）アレイ
１１０ プロセッサ
１１１ モニタ

Claims (18)

1. 干渉計を利用してスペクトル画像システムをアライメントする方法であって、
   前記スペクトル画像システム内の顕微鏡にレーザビームを注入するステップと、
   前記顕微鏡の一部分に焦点合わせするステップと、
   前記顕微鏡の一部分に関連する一対の接眼レンズを通じて投光するビームを焦点合わせするステップであって、前記焦点合わせされたビームは設定方向及び設定空間を有するステップと、
   接眼レンズハウジングから前記一対の接眼レンズのうちの１つを取り除くステップと、
   前記接眼レンズハウジングを通過する焦点合わせされていないビームに対して前記焦点合せされたビームを操作して、前記焦点合わせされたビーム及び前記焦点合わせされていないビームが前記設定方向及び設定空間を有するようにするステップと、
   前記スペクトル画像装置内の前記顕微鏡に結合された干渉計を通過するように前記レーザビームを切り換えるステップと、
   前記干渉計内のビームスプリッタを取り除くステップと、
   前記干渉計に関連する各旋回ミラー毎の中心に前記レーザビームをアライメントするステップと、
   前記干渉計に関連する出力リレーレンズ及び検出器アレイの中心に前記レーザビームをアライメントするステップと、
   前記ビームスプリッタを前記干渉計へ再挿入するステップと、
   前記ビームスプリッタを調整して単一のビームだけが前記出力リレーレンズへ入射するようにするステップと、
   前記システムから前記レーザビームを取り除くステップと、
   前記顕微鏡の出力を前記検出器アレイ上に集中させるステップと、
   前記出力リレーレンズを使って前記干渉計により生成される縞を焦点合わせするステップと、
   テストパターンを前記顕微鏡に挿入するステップと、
   入力リレーレンズを調整して前記テストパターンの最適な焦点を得るステップとを備える、干渉計を利用してスペクトル画像システムをアライメントする方法。
2. 前記レーザビームを前記検出器アレイの中央にアライメントする前に、ニュートラルデンシティフィルタが前記システム内に挿入される請求項１に記載の方法。
3. 干渉計を含むスペクトル画像システムにおいて単色サンプル画像を得るための装置であって、
   サンプルと、
   該サンプルを第１の波長帯域内の放射で照射するためのソースであって、前記第１の波長帯域は、前記サンプル内の領域を励起して前記領域が第２の波長帯域内の放射を発するようにするソースと、
   前記第２の波長帯域内の前記波長をスペクトル分析するための干渉計であって、該干渉計は、前記サンプルの干渉図形を生成し、前記干渉図形は前記干渉計が透過する前記サンプルの画像に重畳され、前記干渉計は、少なくとも一対の旋回ミラーと前記干渉計に対して一対のレッグを形成するビームスプリッタとから成る、干渉計と、
   検出器アレイであって、前記サンプル及び該サンプルの前記干渉図形は、前記検出器アレイ上に画像化され、前記検出器アレイは、該検出器アレイの各ピクセル毎の強度に対応する複数の信号を出力する検出器アレイと、
   第１の位置及び第２の位置を有する光学系であって、前記第１の部分における前記光学系は、前記一対の旋回ミラーのうちの１つに隣接し、前記一対の旋回ミラーのうちの前記１つへ及び該１つから受け渡す前記干渉計内に光ビームを遮断し、それによって前記干渉計の前記一対のレッグに大きなオフセットを形成し、前記第２の部分における前記光学系は、前記干渉計内に光ビームを遮断せず、前記干渉図形内に生成される縞の密度は、前記大きなオフセットによって前記検出器アレイの解像度限界よりも大きくなる光学系と、
   前記検出器アレイに結合されるプロセッサであって、前記光学系が前記第１の位置にあるときに、前記検出器アレイが出力した前記複数の信号から前記サンプルの前記単色画像を生成するプロセッサとを備える、干渉計を含むスペクトル画像システムにおいて単色サンプル画像を得るための装置。
4. 前記光学部品はＢＫ−７で形成され、少なくとも５ｍｍの厚さである請求項３に記載の装置。
5. 前記光学部品は変換機構に結合され、前記変換機構は前記光学部品を前記第１の位置から前記第２の位置へ移動させる請求項３に記載の装置。
6. 前記変換機構は前記プロセッサにより制御される請求項５に記載の装置。
7. 干渉計を含むスペクトル画像システムにおいて単色サンプル画像を得るための方法であって、前記干渉計は、少なくとも一対の旋回ミラーと一対のレッグを形成するビームスプレッタとから成る方法において、
   前記一対の旋回ミラーのうちの１つに隣接する光学部品を挿入するステップであって、前記光学部品は、前記干渉計内に光ビームを遮断し、それによって前記干渉計の前記一対のレッグに大きなオフセットを形成し、前記干渉計によって生成される干渉図形内の縞の密度は、前記大きなオフセットによって前記検出器アレイの解像度限界よりも大きくなり、前記検出器アレイは、前記干渉計の出力を監視するステップと、
   前記検出器アレイに結合されたプロセッサで前記サンプルの前記単色画像を生成するステップと、
   前記プロセッサに結合されたモニタ上に前記単色画面をディスプレイするステップとを備える、干渉計を含むスペクトル画像システムに単色サンプル画像を得るための方法。
8. スペクトル画像システムであって、
   サンプルと、
   該サンプルを第１の波長帯域内の放射で照射するためのソースであって、前記第１の波長帯域が、前記サンプル内の領域を励起して前記領域が第２の波長帯域内の放射を発するようにするソースと、
   前記第２の波長帯域内の前記波長をスペクトル分析するための干渉計であって、該干渉計は、前記サンプルの干渉図形を生成し、前記干渉図形は、前記干渉計が透過する前記サンプルの画像に重畳され、前記干渉計は、少なくとも２つの旋回ミラーと１つの偏光ビームスプリッタとを含み、前記偏光ビームスプリッタは、第１の偏光を選択的に反射し第２の偏光を選択的に透過する、干渉計と、
   検出器アレイであって、前記サンプル及び該サンプルの前記干渉図形は、前記検出器上に画像化され、前記検出器アレイは、該アレイの各ピクセル毎の強度に対応する複数の信号を出力する検出器アレイと、
   前記検出器アレイに結合されるプロセッサであって、該プロセッサは前記モニタ上に前記サンプルの画像をディスプレイするプロセッサとを備えるスペクトル画像システム。
9. 前記偏光ビームスプリッタは偏光キューブである請求項８に記載のスペクトル画像システム。
10. 中期スプレッド発見装置であって、
    少なくとも１つの中期スプレッドを有するサンプルを含むサンプルプレートと、
    該サンプルプレートを第１の波長の放射で照射する第１のソースであって、前記第１の波長は、前記中期スプレッドから選択的に散乱する第１のソースと、
    前記サンプル上の複数の位置から散乱する放射を監視するための検出器であって、該検出器は、前記複数の位置における前記散乱された放射の強度に対応する第１の複数の信号を出力する検出器と、
    該検出器に結合されるプロセッサであって、該プロセッサは、前記第１の複数の検出器出力信号から前記サンプル上の前記複数の位置からの中期スプレッドに対応する位置を判定するプロセッサとを備える中期スプレッド発見装置。
11. 前記サンプルプレートを第２の波長の放射で照射する第２のソースであって、前記第２の波長は、前記中期スプレッドによっては選択的に散乱されず、前記検出器は、前記複数の位置の前記第２の波長の前記散乱された放射の前記強度に対応する第２の複数の信号を出力し、前記プロセッサは、前記中期スプレッドの前記位置を判定するために、前記第１の複数の信号から前記第２の複数の信号を差し引く第２のソースを更に備える請求項１０に記載の中期スプレッド発見装置。
12. 前記第１のソースからの放射で、前記サンプルプレートをラスター走査する請求項１０に記載の中期スプレッド発見装置。
13. 前記検出器は反射した散乱光を監視する請求項１０に記載の中期スプレッド発見装置。
14. 前記サンプルプレートは、前記第１の波長に対しては実質的に透明であり、前記検出器は透過した散乱光を監視する請求項１０に記載の中期スプレッド発見装置。
15. 前記サンプル上の前記複数の位置から散乱されて前記サンプルプレートを通過する放射を監視する第２の検出器であって、前記サンプルプレートは、前記第１の波長に対しては実質的に透明であり、前記第２の検出器は、前記複数の位置における前記散乱した放射の強度に対応する第２の複数の信号を出力し、前記プロセッサは、前記第１の検出器からの前記第１の複数の出力信号と前記第２の検出器からの前記第２の複数の出力信号とから、前記複数の位置からの前記中期スプレッドに対応する前記位置を判定する、第２の検出器を更に備える請求項１３に記載の中期スプレッド発見装置。
16. 前記検出器は、前記サンプル上の前記複数の位置に対応する複数のピクセルから成る検出器アレイである請求項１０に記載の中期スプレッド発見装置。
17. 前記サンプルプレート全体は、前記第１のソースによって同時に照射される請求項１６に記載の中期スプレッド発見装置。
18. 前記中期スプレッド発見装置は、スペクトル画像システムに結合される請求項１０に記載の中期スプレッド発見装置。

Images