DE10212554A1

DE10212554A1 - Anordnung und Verfahren für ein bildgebendes Spektrometer

Info

Publication number: DE10212554A1
Application number: DE2002112554
Authority: DE
Inventors: Harald Schadwinkel; Andreas Faulstich
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2002-03-16
Filing date: 2002-03-16
Publication date: 2003-10-30
Also published as: WO2003078944A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer mit einem Gitter oder computer-generierten Hologramm. DOLLAR A Dabei werden kompakte Bauform und variable Einsetzbarkeit ermöglicht sowie ein einfaches Kalibrierverfahren angegeben.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung und ein Verfahren für ein nicht- scannendes bildgebendes Spektrometer. Diese Anordnung eignet sich für Untersuchungen, bei denen neben der Ortsinformation zusätzlich in jedem Bildpunkt noch spektrale Information benötigt wird, also insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie an biologischen Proben, Präparaten und Komponenten. Durch diese Art der Aufnahme von spektraler Information lassen sich spezifische Probeneigenschaften auch ortsgenau bestimmen. Durch den Verzicht auf das Abscannen der Probe und den damit verbundenenzeitlich sequenziellen Bildaufbau lassen sich auch dynamische Prozesse besonders geeignet untersuchen.

Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Proben ist die Fluoreszenzmikroskopie (Lit.: D. L. Taylor, Y. Wang, Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Academic Press (1989)), bei der bestimmte Farbstoffe zur spezifischen Markierung von Zellteilen verwendet werden.

Die eingestrahlten Photonen einer bestimmten Energie regen die Farbstoffmoleküle durch die Absorption eines Photons aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand an. Die so angeregten Farbstoffmoleküle können auf verschiedene Weise in den Grundzustand zurück gelangen. In der Fluoreszenzmikroskopie ist der Übergang unter Aussendung eines Fluoreszenzphotons am wichtigsten. Die Wellenlänge des emittierten Photons ist aufgrund der Stokes-Verschiebung im Vergleich zur Anregungsstrahlung generell rot verschoben, besitzt also eine größere Wellenlänge. Die Stokes-Verschiebung liegt für die meisten Farbstoffe im Bereich von ca. 20 nm bis 100 nm, maximal bis ca. 200 nm und ermöglicht die Trennung der Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung.

Das Fluoreszenzlicht wird in der Regel mit geeigneten dichroitischen Strahlteilern (Hauptfarbteilern) in Kombination mit Blockfiltern von der Anregungsstrahlung abgespalten und getrennt beobachtet. Dadurch ist die Darstellung einzelner, mit verschiedenen Farbstoffen eingefärbten Zellteilen, möglich. Grundsätzlich können jedoch auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen sich spezifisch anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden (Mehrfachfluoreszenz). Zur Unterscheidung, der von den einzelnen Farbstoffen ausgesendeten Fluoreszenzsignale, werden wiederum spezielle dichroitische Strahlteiler verwendet.

In biomedizinischen Applikationen werden häufig bestimmte Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffen gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit dem Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Fig. 1a zeigt die Emissionsspektren von verschiedenen typischen Farbstoffen. Aufgetragen ist das Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Zu erkennen ist, dass sich die mit 1 bis 4 bezeichneten Farbstoffe in der Lage und Form ihrer Emissionsspektren unterscheiden.

Zum getrennten Nachweis erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit Nebenstrahlteilern und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen mit verschiedenen Detektoren (Lit.: Gerini et al., Cytometry 35, S. 214-226 (1999)) oder in unterschiedlichen Bereichen eines bildgebenden Detektors (Lit.: R. Kerr, Neuron, Vol. 26, S. 583-594 (2000)).

Die Emissionsspektren verschiedener Farbstoffe können sich auch stark überlagern, wie in Fig. 1b dargestellt, so dass eine Trennung der Emissionssignale verschiedener Farbstoffe mit Nebenstrahlteilern schwierig oder sogar unmöglich ist. Ist die Lage des Emissionsspektrums der verwendeten Farbstoffe sogar unbekannt oder tritt eine von der Umgebung (z. B. durch Temperatur, Konzentration, pH-Wert beeinflusst) abhängige Verschiebung des Emissionsspektrums (Fig. 1c) auf, so ist eine effiziente Detektion der Farbstofffluoreszenzen nur bedingt möglich. Die Wellenlängenverschiebung kann bis zu mehreren 10 nm betragen.

Neben den bekannten Laser-Scanning-Verfahren zur Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Proben sind auch nicht-scannende Verfahren bekannt, die z. B. ein Gitter (Lit. P. A. Bernhardt, JOSA Vol. A12 (9), S. 1884-1901 (1995)) oder ein spezielles Hologramm verwenden (Lit.: Descour et al., Optics Letters 22 (16), S. 1271-1273 (1997)) um die spektrale Bildinformation zu dispergieren. Die auf diese Weise entstehenden Beugungsordnungen enthalten dann sowohl Informationen über die räumliche wie auch über die spektrale Struktur des beobachteten Objekts. Diese Beugungsordnungen können dann mit einem ortsauflösenden Detektor nachgewiesen werden und mittels geeigneter Algorithmen kann für jeden Punkt im Ortsraum auch das zugehörige Spektrum bestimmt werden.

Fig. 2 zeigt schematisch den Aufbau eines solchen nicht-scannenden bildgebenden Spektrometers gemäß dem Stand der Technik, bestehend aus Objektiv 1, Strahlteiler 2 und Beleuchtungseinheit 3. Weiter im Strahlengang 4 liegt eine Feldlinse 7 und eine Feldblende 8, die das Bildfeld des Systems begrenzt. Hinter einer Kollimationslinse 9 wird ein Gitter bzw. Hologramm 10 eingesetzt, um die Bildinformation spektral zu dispergieren, eine Zusatzlinse 5 übernimmt die Abbildung auf die Kamera 6.

Solche nicht-scannenden Systeme bieten den Vorteil, auch für schnelle Vorgänge simultan räumliche und spektrale Information detektieren zu können, weil die Aufnahme eines einzelnen Bildes ausreicht, um ein gesamtes Spektrum zu erfassen. Für die praktische Anwendung z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie und für die Integration in ein Standardmikroskop weisen sie jedoch eine Reihe von Nachteilen auf.

Um die Strahlung, die von der Probe emittiert wird, spektral unverfälscht zu detektieren ist es nötig, diese von der anregenden Strahlung zu trennen. Eine Möglichkeit dies sicherzustellen ist die Forderung, dass die Anregungswellenlängen nicht in den Bereich der detektierten Wellenlängen fallen dürfen. Letztere liegen infolge der Stokes-Verschiebung bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen stets oberhalb der Anregungswellenlänge.

Erfolgt die Anregung mit Hilfe einer breitbandigen Lichtquelle (z. B. einer Gasentladungslampe) ist gemäß dem Stand der Technik die Verwendung eines Langpassfilters nötig, der die Einhaltung der Bedingung

λ_Anregung < λ_Langpass < λ_Detektion

sicherstellt (Lit. Descour a. a. O.). Da für die meisten Farbstoffe die Stokes- Verschiebung im Bereich von ca. 20 nm bis 100 nm, maximal bis ca. 200 nm liegt, stellt diese Bedingung in der Praxis eine starke Einschränkung bezüglich der verwendbaren Farbstoffe und der spektralen Detektionsbandbreite des Systems dar. Beide oben genannten Verfahren dispergieren die Bildinformation derart, dass auf einem ortsaufgelösten Detektor (z. B. einer CCD-Kamera) ein Roh-Bild aufgenommen werden kann, in dem mit Hilfe eines dispersiven Elements spektrale und räumliche Information enthalten sind. Bei gegebener Sensorgröße bzw. -auflösung gilt: Je mehr Beugungsordnungen dabei erzeugt und aufgefangen werden, desto höher wird die spektrale Auflösung und desto geringer die räumliche (bei vorgegebener Kamera-Auflösung). Die bisherigen Verfahren verwenden ein festes dispersives Element, das auf das optische System (bestehend aus Objektiv, Zwischenabbildungen und Sensor) abgestimmt ist. Die Verwendung von variablen Optiken (Zoom-Objektiven) wird dabei diskutiert um entweder eine Justierung des Systems (Lit. Descour) oder eine Anpassung von spektraler und räumlicher Auflösung zu erreichen (Lit. Bernhardt).

Für die notwendige Kalibrierung von bildgebenden Spektrometern wird gemäß dem Stand der Technik eine schmalbandige Beleuchtung und ein zweites Spektrometer höherer Genauigkeit, das als Referenz dient, benötigt.

Aufgabe der Erfindung ist die Beseitigung der aufgeführten Nachteile des Standes der Technik und die Angabe eines vielfältig einsetzbaren und kompakt ausführbaren bildgebenden Spektrometers.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale der Patentansprüche gelöst, vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Für die Untersuchung von verschiedenen Objekten oder biologischen Proben ist es von Vorteil, das System an diese Proben anpassen zu können. Das bedeutet z. B. eine Anpassung an verschiedene Probengrößen zu erreichen oder verschiedene Objektive verwenden zu können oder auch die räumliche und spektrale Auflösung des Systems anzupassen.

Gemäß einer Variante der vorliegenden Erfindung kann eine solche Anpassung des Systems mit Hilfe eines variablen Gitters bzw. Hologramms vorgenommen werden: Dabei ist es vorteilhaft, eine mechanische Vorrichtung einzusetzen, die es erlaubt das Gitter/Hologramm zu wechseln. Diese Vorrichtung erlaubt mindestens zwei verschiedene Gitter/Hologramme aufzunehmen, derart dass diese Gitter/Hologramme durch mechanische Verstellung der Vorrichtung abwechselnd in den optischen Strahlengang geführt werden können. Diese Verstellung kann entsprechend einer erfindungsgemäßen Variante durch eine Translationsbewegung (Schieber) realisiert sein oder in einer anderen erfindungsgemäßen Variante durch eine Rotationsbewegung (Revolver).

Eine weitere vorteilhafte Lösung ergibt sich, wenn das Gitter bzw. Hologramm selbst veränderbar ist. Technische Realisierungsmöglichkeiten dafür sind z. B. mikroelektronisch-mikromechanische Bauelemente (MEMS) wie DMDs (Digital Mirror Devices - Fa. Texas Instruments) oder schaltbare Lichtventile (Grating Light Valves - Fa. Silicon Light Machines). Eine weitere Möglichkeit ist die Nutzung eines veränderbaren Gitters auf Flüssigkristall-Basis.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ergibt sich, wenn Anregungsfilter und Strahlteiler in einem wechselbaren Modul zusammengefasst werden. Diese wechselbaren Module können mit verschiedenen Anregungsfilter/Strahlteiler-Kombinationen bestückt sein.

Ebenfalls von Vorteil ist die Nutzung eines Multi-Bandpass-Filters als Anregungsfilter. Ein vorteilhaftes Verfahren zum Messen von Objekteigenschaften mit einem solchen bildgebenden Spektrometer besteht darin, sequenziell mehrere Bilder aufzunehmen und zwischen den Bildern das Anregungsfilter oder das Anregungsfilter/Strahlteiler- Modul zu wechseln. Damit werden die beschriebenen Beschränkungen durch die Bedingung λ_Anregung < λ_Langpass < λ_Detektion aufgehoben und es können nahezu beliebige Fluoreszenzmarker-Kombinationen benutzt werden.

Diese Anregungswellenlängen sind dabei an unterschiedliche Farbstoffe (mit Stokes- Verschiebung λ_i) angepasst. Obige Bedingung für die Wellenlängen ist dann für jede Einzelaufnahme erfüllt, das Verfahren bietet aber nun eine erhöhte spektrale Bandbreite, die maximal der Summe Σλ_i der einzelnen Stokes-Verschiebungen entspricht.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ergibt sich, wenn die zur Bildaufnahme dienende Kamera eine variable Auflösung aufweist. Dadurch lässt sich je nach Anwendungszweck die spektrale bzw. räumliche Auflösung des Messergebnisses anpassen.

Ein besonders einfaches Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden Spektrometers besteht in der Beleuchtung einer Probe, welche bekannte räumliche und spektrale Eigenschaften aufweist, mit Licht bekannter spektraler Zusammensetzung, dem Vergleich der so ermittelten Messwerte mit Sollwerten und der Ableitung von Korrekturwerten aus den Ergebnissen dieses Vergleichs. Dabei kann die bekannte spektrale Zusammensetzung des Lichtes durch eine Lichtquelle mit bekannten Spektrallinien, durch einen Farbfilter oder durch den Hauptfarbteiler erzeugt werden.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der schematischen Darstellungen in den Fig. 3 bis 5 näher erläutert.
In Fig. 3 ist eine bevorzugte Lösung dargestellt, bei der Farbfilter für ein erfindungsgemäßes nicht-scannendes bildgebendes Spektrometer in einer kompakten Form zusammengefasst sind. Bestandteil ist ein Anregungsfilter 11, der einen Teil 16 des Anregungslichts zurückhält und einen anderen Teil 17 passieren lässt. Dieser Teil fällt dann auf einen Strahlteiler 12, der einen Teil 18 der Strahlung zur Probe reflektiert. Die von der Probe kommende Strahlung passiert diesen Strahlteiler wiederum teilweise und passiert noch teilweise einen Emissionsfilter 13 und eine Feldlinse 14. Die Komponenten Anregungsfilter 11, Strahlteiler 12, Emissionsfilter 13 und Feldlinse 14 sind in einer gemeinsamen Einheit 15 montiert. Diese erfindungsgemäße Ausführung erlaubt die einfache Integration in kommerzielle Mikroskope, da diese den Einsatz verschiedener Filter in Strahlteilerwürfeln vorsehen. Bei Integration der Feldlinse 14 in die kompakte Einheit 15 entfällt die im Schema dargestellte Feldlinse 7.
In Fig. 4 sind verschiedene Varianten dargestellt, wie das Gitter bzw. Hologramm an wechselbar gestaltet sein können, um so eine einfache Anpassung an verschiedene Anforderungen realisieren zu können. Z. B. ist es notwendig für verschiedene Auflösungen oder Vergrößerungen auch jeweils angepasste computergenerierte Hologramme zu benutzen. In Fig. 4a sind die verschiedenen Gitter bzw. Hologramme auf einem Schieber 20 angebracht, das wechselweise Einbringen in den Strahlengang 4 erfolgt durch eine transversale Verschiebung des Schiebers 20. In Fig. 4b sind die verschiedenen Gitter bzw. Hologramme auf einem drehbaren Halter 21 (Revolver) angebracht und werden durch eine Drehbewegung wechselweise im Strahlengang 4 positioniert.
Eine weitere erfindungsgemäße Variante die Bedingung

λ_Anregung < λ_Langpass < λ_Detektion

zu umgehen ist, einen Farbteiler zu verwenden, der einige schmale Reflektionsbänder und im übrigen Spektralbereich hohe Transmission aufweist (Multi-Bandpass-Filter). Das bedeutet, dass in Auflicht-Fluoreszenz (der Aufbau ist schematisch in Fig. 3 dargestellt) von der Lichtquelle einige wenige Anregungslinien über den Teiler zur Probe reflektiert werden. Das von der Probe emittierte Licht, passiert den Teiler und wird anschließend detektiert. Dabei werden gerade die Anregungswellenlängen unterdrückt (Fig. 5). Das Multi-Bandpass-Filter kann dabei vorteilhafterweise auch als durchstimmbares Filter ausgelegt sein (Lyot-Filter). In einer erfindungsgemäßen Form kann dieser Strahlteiler als beschichtetes Substrat ausgeführt sein, also z. B. dielektrische Vielfachschichten benutzen (z. B. Multibandfilter von Carl Zeiss oder Omega Optical Inc.).
In einer weiteren Ausführungsform ist das Gitter/Hologramm 10 selbst variabel ausgeführt, der Grundaufbau ist in Fig. 3 dargestellt.
Für die Realisierung eines variablen Gitters bzw. Hologramms sind eine Reihe technischer Möglichkeiten prinzipiell bekannt.

a) Ein variables Gitter bzw. Hologramm auf Flüssigkristall-Basis:
Solche Flüssigkristallelemente bestehen aus einer Anordnung von einem oder mehreren Paaren von Elektroden, zwischen denen sich eine Flüssigkristallsubstanz befindet, die die Eigenschaft besitzt, ihren Brechungsindex als Funktion der zwischen den Elektroden angelegten Spannung zu verändern. Verschiedene Varianten solcher variablen Flüssigkristall-basierten Gitter wurden z. B. bei C. Slinger et al. SPIE Proc. 3015, S. 72-83 (1997) oder der Science Applications International Corporation (Patent US 5 942 157) vorgeschlagen bzw. realisiert.
b) Ein variables Gitter bzw. Hologramm mit Hilfe mikroelektronisch-mechanischer Bauelemente (MEMS):
Ein solches Bauelement besteht aus einer Mehrzahl miniaturisierter beweglicher Elemente (z. B. Mikrospiegel, Membranen oder Metallstreifen), die einzeln elektromagnetisch oder meist elektrostatisch angesteuert werden. Beispiele für solche Elemente sind so genannte Digital Mirror Devices (Texas Instruments, Patent US 5 661 591), wie sie in Videoprojektoren eingesetzt werden oder das Grating Light Valve (Silicon Light Machines, Patent US 5 311 360), das ein elektronisch schaltbares Beugungsgitter realisiert.
c) Ein variables Gitter bzw. Hologramm mit Hilfe eines akustooptischen Modulators:
Akusto-optische Modulatoren erlauben die Beugung optischer Strahlung an laufenden oder stehenden akustischen Wellen in einem Kristall. Da die akustische Frequenz in Bereichen verstellbar ist, kann damit die Periode des Beugungsgitters verändert und dem gewünschten Beugungswinkel angepasst werden. Durch die Wahl unterschiedlicher Pulsformen abweichend von der Sinuswelle können gewünschte Beugungsordnungen hervorgehoben werden. Durch Überlagerung mehrerer akustischer Wellen sind auch Stehwellen und zweidimensionale Gitterstrukturen machbar.

Eine weitere erfindungsgemäße Variante zur Veränderung der Auflösung des Systems ist die Verwendung eines Detektors, der eine variable Auflösung besitzt.
Eine vorteilhafte Ausführungsform benutzt eine Kamera, deren Detektor-Chip sich mittels (Piezo-)Aktuatoren verschieben lässt (z. B. Axiocam von Carl Zeiss). Diese verwendet einen Sensor, der 1300 × 1030 matrix-artig angeordnete Elemente aufweist, deren Abstand jeweils 6,7 µm in Zeilen- und Spaltenrichtung beträgt. Verschiebt man nun den Sensor um jeweils einen halben Elementabstand, so lassen sich auf diese Weise vier verschiedene Sensorpositionen realisieren. Nimmt man in jeder dieser vier Positionen ein separates Bild auf, lassen sich diese zu einem Gesamtbild kombinieren, das eine effektive Auflösung von 2600 × 2060 Elementen besitzt. Es lassen sich auch andere Auflösungen durch Sensorverschiebungen um andere Längen erreichen. Durch Veränderung der effektiven Auflösung der Kamera kann die Orts- und Spektralauflösung des gesamten nicht-scannenden bildgebenden Spektrometers modifiziert werden.
Die Kalibrierung von bildgebenden Spektrometern erfolgt für gewöhnlich mit Hilfe von schmalbandiger Beleuchtung und einem zweiten Spektrometer höherer Genauigkeit, das als Referenz dient. Es ist erfindungsgemäß vorgesehen das System zu kalibrieren, ohne dabei ein separates Spektrometer verwenden zu müssen. Stattdessen soll mit Hilfe der bekannten spektralen Charakteristik des Hauptfarbteilers oder der bekannten spektralen Charakteristik der Lichtquelle kalibriert werden. Mit Hilfe einer solchen Beleuchtung, deren Spektrum bekannt ist, wird nun eine wohl definierte Probe beleuchtet und mit dem bildgebenden Spektrometer detektiert. Durch den Vergleich des auf diese Weise erhaltenen Resultats mit dem erwarteten Ergebnis kann das System kalibriert werden. Diese Kalibrierung gilt streng genommen nur für die Wellenlängen, die von der definierten Probe emittiert wurden.
Durch eine Interpolation zwischen diesen Wellenlängen lässt sich eine Kalibrierung realisieren, die den gesamten Wellenlängenbereich umfasst, der von diesen einzelnen Messpunkten aufgespannt wird.
Die Realisierung der Erfindung ist nicht an die dargestellten Ausführungsbeispiele gebunden, fachmännische Weiterentwicklungen führen nicht zu einem Verlassen der erfinderischen Lösung.

Claims

1. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei Anregungsfilter und Strahlteiler in einem wechselbaren Modul zusammengefasst sind.

2. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, welche einen optischen Strahlengang definieren, wobei mehrere dispersive Elemente vorgesehen sind, welche wahlweise in den Strahlengang einbringbar sind.

3. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei die dispersiven Eigenschaften des dispersiven Elements gezielt veränderbar sind.

4. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 1, wobei in das wechselbare Modul eine Linse integriert ist.

5. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 2, wobei die dispersiven Elemente auf einem Schieber angebracht sind.

6. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 2, wobei die dispersiven Elemente auf einer drehbaren Einheit angebracht sind.

7. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 3, wobei das dispersive Element aus einem veränderbaren Gitter oder Hologramm besteht.

8. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus einem Flüssigkristall-Array besteht.

9. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus mikroelektronisch-mechanischen Bauelementen besteht.

10. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 9, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus einem DMD-Array besteht.

11. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 9, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus steuerbaren Lichtventilen (Grating light valve) besteht.

12. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus einem Flüssigkristall-Gitter besteht.

13. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter mittels akusto-optischer Modulatoren (AOM) generiert wird.

14. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 3, wobei das veränderbare dispersive Element ein mittels akusto-optischer Modulatoren veränderbares Gitter ist.

15. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei die Bildaufnahmeeinrichtung eine variable Auflösung aufweist.

16. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei das Anregungsfilter als Multi-Bandpass-Filter ausgeführt ist.

17. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, welche einen optischen Strahlengang definieren, wobei mehrere Anregungsfilter vorgesehen sind, welche wahlweise in den Strahlengang einbringbar sind.

18. Verfahren zum Betrieb eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers nach Anspruch 17, wobei mit der Bildaufnahmeeinrichtung mehrere Bilder sequentiell aufgenommen werden und zwischen den Aufnahme das Anregungsfilter gewechselt wird.

19. Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers, wobei eine Probe, deren räumliche und spektrale Eigenschaften bekannt sind, mit Licht bekannter spektraler Zusammensetzung beleuchtet wird und die so entstehende Messung mit einem Soll-Ergebnis verglichen wird und aus der Abweichung der Messung von dem Soll-Ergebnis Korrekturwerte bestimmt werden.

20. Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers nach Anspruch 19, wobei das Licht bekannter spektraler Zusammensetzung von einer Lichtquelle mit bekannten Spektrallinien erzeugt wird.

21. Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers nach Anspruch 19, wobei die bekannte spektrale Zusammensetzung des Lichts durch einen Farbfilter erzeugt wird.

22. Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers nach Anspruch 19, wobei die bekannte spektrale Zusammensetzung des Lichts durch einen Hauptfarbteiler erzeugt wird.

23. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 16, wobei das Multi-Bandpass-Filter abstimmbar ist.

24. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 16, wobei das Multi-Bandpass-Filter aus dielektrischen Schichten aufgebaut ist.