WO2003078944A1 - Anordnung und verfahren für ein bildgebendes spektrometer - Google Patents

Anordnung und verfahren für ein bildgebendes spektrometer Download PDF

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WO2003078944A1
WO2003078944A1 PCT/EP2003/001883 EP0301883W WO03078944A1 WO 2003078944 A1 WO2003078944 A1 WO 2003078944A1 EP 0301883 W EP0301883 W EP 0301883W WO 03078944 A1 WO03078944 A1 WO 03078944A1
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imaging
scanning spectrometer
scanning
spectrometer according
grating
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PCT/EP2003/001883
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Inventor
Harald Schadwinkel
Andreas Faulstich
Original Assignee
Carl Zeiss Jena Gmbh
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    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
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    • G—PHYSICS
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    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
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    • G01J3/2823—Imaging spectrometer

Definitions

  • the invention relates to an arrangement and a method for a non-scanning imaging spectrometer.
  • This arrangement is suitable for investigations in which, in addition to the location information, spectral information is also required in each pixel, in particular for fluorescence microscopy on biological samples, preparations and components. With this type of recording of spectral information, specific sample properties can also be determined precisely. By dispensing with the scanning of the sample and the associated sequential image construction, dynamic processes can also be examined particularly suitably.
  • the irradiated photons of a certain energy excite the dye molecules by absorbing a photon from the ground state to an excited state.
  • the dye molecules excited in this way can return to the ground state in various ways.
  • fluorescence microscopy the transition with the emission of a fluorescence photon is most important.
  • the wavelength of the emitted photon is due to the Stokes shift compared to. Excitation radiation generally shifted red, so it has a longer wavelength.
  • the Stokes shift lies in the range from approx. 20 nm to 100 nm, at most up to approx. 200 nm and enables the fluorescence radiation to be separated from the excitation radiation.
  • the fluorescent light is usually split off from the excitation radiation with suitable dichroic beam particles (main color splitters) in combination with block filters and observed separately. This makes it possible to display individual cell parts colored with different dyes. In principle, however, several parts of a preparation can also be colored simultaneously using different specific dyes (multiple fluorescence). Special dichroic beam splitters are used to differentiate the fluorescence signals emitted by the individual dyes. In biomedical applications, certain cell regions are often marked with different dyes at the same time (multifluorescence). With the prior art, the individual dyes can be detected separately either on the basis of different absorption properties or emission properties (spectra).
  • Figure 1a shows the emission spectra of various typical dyes. The emission signal is plotted as a function of the wavelength. It can be seen that the dyes labeled 1 to 4 differ in the position and shape of their emission spectra.
  • the emission spectra of different dyes can also overlap strongly, as shown in FIG. 1b, so that it is difficult or even impossible to separate the emission signals of different dyes with secondary beam splitters. If the position of the emission spectrum of the dyes used is even unknown or if the emission spectrum (Fig. 1 c) is dependent on the environment (e.g. influenced by temperature, concentration, pH value), efficient detection of the dye fluorescence is only possible to a limited extent , The wavelength shift can be up to several 10 nm.
  • non-scanning methods are also known which, for. B. use a grid (Lit. PA Bernhardt, JOSA Vol. A12 (9), S.. 1884-1901 (1995)) or a special hologram (Lit: Descour et al., Optics Letters 22 (16), S. 1271-1273 (1997)) to disperse the spectral image information.
  • the diffraction orders created in this way then contain information about both the spatial and the spectral structure of the observed object.
  • These diffraction orders can then be detected using a spatially resolving detector and, using suitable algorithms, the associated spectrum can also be determined for each point in the spatial area.
  • FIG. 2 shows schematically the structure of such a non-scanning imaging spectrometer according to the prior art, consisting of lens 1, beam splitter 2 and illumination unit 3. Further in the beam path 4 is a field lens 7 and a field diaphragm 8, which limits the image field of the system. A grating or hologram 10 is inserted behind a collimation lens 9 in order to spectrally disperse the image information, and an additional lens 5 takes over the imaging onto the camera 6.
  • Such non-scanning systems offer the advantage of being able to simultaneously detect spatial and spectral information even for fast processes, because the acquisition of a single image is sufficient to capture an entire spectrum.
  • practical use e.g. B. in fluorescence microscopy and for integration into a standard microscope, however, they have a number of disadvantages.
  • the object of the invention is to eliminate the listed disadvantages of the prior art and to provide a versatile and compact imaging spectrometer.
  • such an adaptation of the system can be carried out with the aid of a variable grating or hologram: it is advantageous to use a mechanical device which allows the grating / hologram to be changed. This device allows at least two different gratings / holograms to be recorded, so that these gratings / holograms can be guided alternately into the optical beam path by mechanical adjustment of the device.
  • this adjustment can be realized by a translational movement (slide) or in another variant according to the invention by a rotational movement (turret).
  • a translational movement silica
  • a rotational movement turret
  • Another advantageous solution is obtained if the grid or hologram itself can be changed.
  • Technical implementation options for this are, for example, microelectronic-micromechanical components (MEMS) such as DMDs (Digital Mirror Devices - from Texas Instruments) or switchable light valves (Gräting Light Valves - from Silicon Light Machines).
  • MEMS microelectronic-micromechanical components
  • DMDs Digital Mirror Devices - from Texas Instruments
  • switchable light valves Gräting Light Valves - from Silicon Light Machines
  • Another option is to use a changeable grid based on liquid crystals.
  • a further advantageous embodiment of the invention results if the excitation filter and beam splitter are combined in an exchangeable module. These exchangeable modules can be equipped with various excitation filters / beam splitter combinations.
  • Another advantage is the use of a multi-bandpass filter as an excitation filter.
  • An advantageous method for measuring object properties with such an imaging spectrorneter is to record several images sequentially and to switch the excitation filter or the excitation filter / beam splitter module between the images.
  • the restrictions described by the condition ⁇ excitation ⁇ long pass ⁇ detection are thus eliminated and almost any combination of fluorescent markers can be used.
  • These excitation wavelengths are adapted to different dyes (with Stokes shift ⁇ j). The above condition for the wavelengths is then fulfilled for each individual exposure, but the method now offers an increased spectral bandwidth which corresponds at most to the sum ⁇ of the individual Stokes shifts.
  • a further advantageous embodiment of the invention results if the camera used for image recording has a variable resolution. This allows the spectral or spatial resolution of the measurement result to be adjusted depending on the application.
  • a particularly simple method for calibrating an imaging spectrometer consists in illuminating a sample, which has known spatial and spectral properties, with light of known spectral composition, comparing the measurement values thus determined with target values and deriving correction values from the results of this comparison.
  • the known spectral composition of the light can be generated by a light source with known spectral lines, by a color filter or by the main color splitter.
  • FIG. 3 shows a preferred solution in which color filters for a non-scanning imaging spectrometer according to the invention are combined in a compact form.
  • An excitation filter 11 is part of the holds back part 16 of the excitation light and lets another part 17 pass. This part then falls on a beam splitter 12, which reflects a part 18 of the radiation to the sample. The radiation coming from the sample in turn partly passes this beam splitter and still partly passes through an emission filter 13 and a field lens 14.
  • Emission filter 13 and field lens 14 are mounted in a common unit 15.
  • This embodiment according to the invention enables simple integration into commercial microscopes, since these provide for the use of different filters in beam splitter cubes.
  • the field lens 14 is integrated into the compact unit 15, the field lens 7 shown in the diagram is omitted.
  • FIG. 4 shows different variants of how the grid or hologram can be designed to be exchangeable, in order to be able to easily adapt to different requirements. For example, it is necessary to use adapted computer-generated holograms for different resolutions or enlargements.
  • the various grids or holograms are attached to a slide 20, which is introduced alternately into the beam path 4 by a transverse displacement of the slide 20.
  • the various gratings or holograms are mounted on a rotatable holder 21 Revolver) attached and are alternately positioned in the beam path 4 by a rotary movement.
  • Another variant of the invention to circumvent the condition ⁇ excitation " ⁇ ⁇ long pass ** ⁇ detection is to use a color splitter that is a few narrow
  • multi-bandpass filter Reflection bands and high transmission in the rest of the spectral range. This means that in incident light fluorescence (the structure is shown schematically in FIG. 3), a few excitation lines are reflected from the light source via the divider to the sample. The light emitted by the sample passes the divider and is then detected. The excitation wavelengths are suppressed (Fig. 5).
  • the multi-bandpass filter can advantageously also be designed as a tunable filter (Lyot filter).
  • this beam splitter can be designed as a coated substrate, that is, for. B. use dielectric multilayers (e.g. multi-band filters from Carl Zeiss or Omega Optical Inc.).
  • the grating / hologram 10 itself is of variable design, the basic structure is shown in FIG. 3.
  • variable grid or hologram based on liquid crystal A variable grid or hologram based on liquid crystal:
  • Such liquid crystal elements consist of an arrangement of one or more pairs of electrodes, between which there is a liquid crystal substance which has the property of changing its refractive index as a function of the voltage applied between the electrodes.
  • Different variants of such variable liquid crystal-based gratings have been developed e.g. B. C. Slinger et al. SPIE Proc. 3015, pp. 72-83 (1997) or the Science Applications International Corporation (patent US 5 942 157).
  • MEMS microelectronic mechanical components
  • Such a component consists of a plurality of miniaturized movable elements (e.g. micromirrors, membranes or metal strips), which are individually controlled electromagnetically or mostly electrostatically.
  • miniaturized movable elements e.g. micromirrors, membranes or metal strips
  • Such elements are so-called digital mirror devices (Texas Instruments, US Pat. No. 5,661,591), as used in video projectors, or the Grating Light Valve (Silicon Light Machines, US Pat. No. 5,311,360), which implements an electronically switchable diffraction grating , c)
  • the period of the diffraction grating can be changed and adapted to the desired diffraction angle.
  • desired diffraction orders can be emphasized.
  • By overlaying several acoustic waves, standing waves and two-dimensional lattice structures are also feasible.
  • Another variant according to the invention for changing the resolution of the system is the use of a detector which has a variable resolution.
  • An advantageous embodiment uses a camera whose detector chip can be moved by means of (piezo) actuators (e.g. Axiocam from Carl Zeiss).
  • This uses a sensor that has 1300 x 1030 elements arranged in a matrix, the spacing of which is 6.7 ⁇ m in the row and column direction. If you move the sensor by half an element spacing, four different sensor positions can be realized in this way. If you take a separate picture in each of these four positions, they can be combined to form an overall picture that has an effective resolution of 2600 x 2060 elements. Other resolutions can also be achieved by shifting the sensor by different lengths.
  • the effective resolution of the camera the spatial and spectral resolution of the entire non-scanning imaging spectrometer can be modified.
  • the calibration of imaging spectrometers is usually carried out with the aid of narrowband illumination and a second spectrorneter of higher accuracy, which serves as a reference.
  • the system is calibrated without having to use a separate spectrorneter.
  • the known spectral characteristic of the main color splitter or the known spectral characteristic of the light source should be used for calibration.
  • the spectrum of which is known a well-defined sample is now illuminated and detected with the imaging spectrometer.
  • the system can be calibrated by comparing the result obtained in this way with the expected result. Strictly speaking, this calibration only applies to the wavelengths emitted by the defined sample.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer mit einem Gitter oder computer-generierten Hologramm. Dabei werden kompakte Bauform und variable Einsetzbarkeit ermöglicht sowie ein einfaches Kalibrierverfahren angegeben.

Description

Anordnung und Verfahren für ein bildgebendes Spektrorneter
Die Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung und ein Verfahren für ein nicht- scannendes bildgebendes Spektrorneter. Diese Anordnung eignet sich für Untersuchungen, bei denen neben der Ortsinformation zusätzlich in jedem Bildpunkt noch spektrale Information benötigt wird, also insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie an biologischen Proben, Präparaten und Komponenten. Durch diese Art der Aufnahme von spektraler Information lassen sich spezifische Probeneigenschaften auch ortsgenau bestimmen. Durch den Verzicht auf das Abscannen der Probe und den damit verbundenenzeitlich sequenziellen Bildaufbau lassen sich auch dynamische Prozesse besonders geeignet untersuchen.
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Proben ist die Fluoreszenzmikroskopie (Lit: D. L. Taylor, Y. Wang, Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Academic Press (1989)), bei der bestimmte Farbstoffe zur spezifischen Markierung von Zellteilen verwendet werden.
Die eingestrahlten Photonen einer bestimmten Energie regen die Farbstoffmoleküle durch die Absorption eines Photons aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand an. Die so angeregten Farbstoffmoleküle können auf verschiedene Weise in den Grundzustand zurück gelangen. In der Fluoreszenzmikroskopie ist der Übergang unter Aussendung eines Fluoreszenzphotons am wichtigsten. Die Wellenlänge des emittierten Photons ist aufgrund der Stokes-Verschiebung im Vergleich zur . Anregungsstrahlung generell rot verschoben, besitzt also eine größere Wellenlänge. Die Stokes-Verschiebung liegt für die meisten Farbstoffe im Bereich von ca. 20 nm bis 100 nm, maximal bis ca. 200 nm und ermöglicht die Trennung der Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung.
Das Fluoreszenzlicht wird in der Regel mit geeigneten dichroitischen Strahlteiiern (Hauptfarbteilern) in Kombination mit Blockfiltern von der Anregungsstrahlung abgespalten und getrennt beobachtet. Dadurch ist die Darstellung einzelner, mit verschiedenen Farbstoffen eingefärbten Zellteilen, möglich. Grundsätzlich können jedoch auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen sich spezifisch anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden (Mehrfachfiuoreszenz). Zur Unterscheidung, der von den einzelnen Farbstoffen ausgesendeten Fluoreszenzsignale, werden wiederum spezielle dichroitische Strahlteiler verwendet. In biomedizinischen Applikationen werden häufig bestimmte Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffen gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit dem Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Fig. 1a zeigt die Emissionsspektren von verschiedenen typischen Farbstoffen. Aufgetragen ist das Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Zu erkennen ist, dass sich die mit 1 bis 4 bezeichneten Farbstoffe in der Lage und Form ihrer Emissionsspektren unterscheiden.
Zum getrennten Nachweis erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit Nebenstrahlteilern und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen mit verschiedenen Detektoren (Lit,: Gerini et al., Cytometry 35, S. 214-226 (1999)) oder in unterschiedlichen Bereichen eines bildgebenden Detektors (Lit: R. Kerr, Neuron, Vol. 26, S. 583-594 (2000)).
Die Emissionsspektren verschiedener Farbstoffe können sich auch stark überlagern, wie in Fig. 1b dargestellt, so dass eine Trennung der Emissionssignale verschiedener Farbstoffe mit Nebenstrahlteilern schwierig oder sogar unmöglich ist. Ist die Lage des Emissionsspektrums der verwendeten Farbstoffe sogar unbekannt oder tritt eine von der Umgebung (z.B. durch Temperatur, Konzentration, pH-Wert beeinflusst) abhängige Verschiebung des Emissionsspektrums (Fig. 1 c) auf, so ist eine effiziente Detektion der Farbstofffluoreszenzen nur bedingt möglich. Die Wellenlängenverschiebung kann bis zu mehreren 10 nm betragen.
Neben den bekannten Laser-Scanning-Verfahren zur Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Proben sind auch nicht-scannende Verfahren bekannt, die z. B. ein Gitter (Lit. P. A. Bernhardt, JOSA Vol. A12 (9), S. .1884-1901 (1995)) oder ein spezielles Hologramm verwenden (Lit: Descour et al., Optics Letters 22(16), S. 1271-1273 (1997)) um die spektrale Bildinformation zu dispergieren. Die auf diese Weise entstehenden Beugungsordnungen enthalten dann sowohl Informationen über die räumliche wie auch über die spektrale Struktur des beobachteten Objekts. Diese Beugungsordnungen können dann mit einem ortsauflösenden Detektor nachgewiesen werden und mittels geeigneter Algorithmen kann für jeden Punkt im Ortsraum auch das zugehörige Spektrum bestimmt werden. Fig. 2 zeigt schematisch den Aufbau eines solchen nicht-scannenden bildgebenden Spektrometers gemäß dem Stand der Technik, bestehend aus Objektiv 1, Strahlteiler 2 und Beleuchtungseinheit 3. Weiter im Strahlengang 4 liegt eine Feldlinse 7 und eine Feldblende 8, die das Bildfeld des Systems begrenzt. Hinter einer Kollimationslinse 9 wird ein Gitter bzw. Hologramm 10 eingesetzt, um die Bildinformation spektral zu dispergieren, eine Zusatzlinse 5 übernimmt die Abbildung auf die Kamera 6.
Solche nicht-scannenden Systeme bieten den Vorteil, auch für schnelle Vorgänge simultan räumliche und spektrale Information detektieren zu können, weil die Aufnahme eines einzelnen Bildes ausreicht, um ein gesamtes Spektrum zu erfassen. Für die praktische Anwendung z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie und für die Integration in ein Standardmikroskop weisen sie jedoch eine Reihe von Nachteilen auf.
Um die Strahlung, die von der Probe emittiert wird, spektral unverfälscht zu detektieren ist es nötig, diese von der anregenden Strahlung zu trennen. Eine Möglichkeit dies sicherzustellen ist die Forderung, dass die Anregungswellenlängen nicht in den Bereich der detektierten Wellenlängen fallen dürfen. Letztere liegen infolge der Stokes-Verschiebung bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen stets oberhalb der Anregungswellenlänge. Erfolgt, die Anregung mit Hilfe einer breitbandigen Lichtquelle (z. B. einer Gasentladungslampe) ist gemäß dem Stand der Technik die Verwendung eines Langpassfilters nötig, der die Einhaltung der Bedingung λ Anregung ** λ Langpass ** λ Detektion sicherstellt (Lit Descour a.a.O.) . Da für die meisten Farbstoffe die Stokes- Verschiebung im Bereich von ca. 20 nm bis 100 nm, maximal bis ca. 200 nm liegt, stellt diese Bedingung in der Praxis eine starke Einschränkung bezüglich der verwendbaren Farbstoffe und der spektralen Detektionsbandbreite des Systems dar. Beide oben genannten Verfahren dispergieren die Bildinformation derart, dass auf einem ortsaufgelösten Detektor (z. B. einer CCD-Kamera) ein Roh-Bild aufgenommen werden kann, in dem mit Hilfe eines dispersiven Elements spektrale und räumliche Information enthalten sind. Bei gegebener Sensorgröße bzw. -auflösung gilt: Je mehr Beugungsordnungen dabei erzeugt und aufgefangen werden, desto höher wird die spektrale Auflösung und desto geringer die räumliche (bei vorgegebener Kamera-Auflösung). Die bisherigen Verfahren verwenden ein festes dispersives Element, das auf das optische System (bestehend aus Objektiv, Zwischenabbildungen und Sensor) abgestimmt ist. Die Verwendung von variablen Optiken (Zoom-Objektiven) wird dabei diskutiert um entweder eine Justierung des Systems (Lit. Descour) oder eine Anpassung von spektraler und räumlicher Auflösung zu erreichen (Lit. Bernhardt). Für die notwendige Kalibrierung von biidgebenden Spektrometern wird gemäß dem Stand der Technik eine schmalbandige Beleuchtung und ein zweites Spektrorneter höherer Genauigkeit, das als Referenz dient, benötigt.
Aufgabe der Erfindung ist die Beseitigung der aufgeführten Nachteile des Standes der Technik und die Angabe eines vielfältig einsetzbaren und kompakt ausführbaren bildgebenden Spektrometers.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale der Patentansprüche gelöst, vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Für die Untersuchung von verschiedenen Objekten oder biologischen Proben ist es von Vorteil, das System an diese Proben anpassen zu können. Das bedeutet z. B. . eine Anpassung an verschiedene Probengrößen zu erreichen oder verschiedene Objektive verwenden zu können oder auch die räumliche und spektrale Auflösung des Systems anzupassen. Gemäß einer Variante der vorliegenden Erfindung kann eine solche Anpassung des Systems mit Hilfe eines variablen Gitters bzw. Hologramms vorgenommen werden: Dabei ist es vorteilhaft, eine mechanische Vorrichtung einzusetzen, die es erlaubt das Gitter/ Hologramm zu wechseln. Diese Vorrichtung erlaubt mindestens zwei verschiedene Gitter / Hologramme aufzunehmen, derart dass diese Gitter/ Hologramme durch mechanische Verstellung der Vorrichtung abwechselnd in den optischen Strahlengang geführt werden können. Diese Verstellung kann entsprechend einer erfindungsgemäßen Variante durch eine Translationsbewegung (Schieber) realisiert sein oder in einer anderen erfindungsgemäßen Variante durch eine Rotationsbewegung (Revolver). Eine weitere vorteilhafte Lösung ergibt sich, wenn das Gitter bzw. Hologramm selbst veränderbar ist. Technische Realisierungsmöglichkeiten dafür sind z.B. mikroelektronisch-mikromechanische Bauelemente (MEMS) wie DMDs (Digital Mirror Devices - Fa. Texas Instruments) oder schaltbare Lichtventile (Gräting Light Valves - Fa. Silicon Light Machines). Eine weitere Möglichkeit ist die Nutzung eines veränderbaren Gitters auf Flüssigkristail-Basis. Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ergibt sich, wenn Anregungsfilter und Strahlteiler in einem wechselbaren Modul zusammengefasst werden. Diese wechselbaren Module können mit verschiedenen Anregungsfilter/Strahlteiler-Kombinationen bestückt sein. Ebenfalls von Vorteil ist die Nutzung eines Multi-Bandpass-Filters als Anregungsfilter. Ein vorteilhaftes Verfahren zum Messen von Objekteigenschaften mit einem solchen bildgebenden Spektrorneter besteht darin, sequenziell mehrere Bilder aufzunehmen und zwischen den Bildern das Anregungsfilter oder das Anregungsfilter/Strahlteiler- Modul zu wechseln. Damit werden die beschriebenen Beschränkungen durch die Bedingung λ Anregung < λ Langpass λ Detektion aufgehoben und es können nahezu beliebige Fluoreszenzmarker-Kombinationen benutzt werden. Diese Anregungswellenlängen sind dabei an unterschiedliche Farbstoffe (mit Stokes- Verschiebung λj) angepasst. Obige Bedingung für die Wellenlängen ist dann für jede Einzelaufnahme erfüllt, das Verfahren bietet aber nun eine erhöhte spektrale Bandbreite, die maximal der Summe ∑λ, der einzelnen Stokes-Verschiebungen entspricht.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ergibt sich, wenn die zur Bildaufnahme dienende Kamera eine variable Auflösung aufweist. Dadurch lässt sich je nach Anwendungszweck die spektrale bzw. räumliche Auflösung des Messergebnisses anpassen.
Ein besonders einfaches Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden Spektrometers besteht in der Beleuchtung einer Probe, welche bekannte räumliche und spektrale Eigenschaften aufweist, mit Licht bekannter spektraler Zusammensetzung, dem Vergleich der so ermittelten Messwerte mit Sollwerten und der Ableitung von Korrekturwerten aus den Ergebnissen dieses Vergleichs. Dabei kann die bekannte spektrale Zusammensetzung des Lichtes durch eine Lichtquelle mit bekannten Spektrallinien, durch einen Farbfilter oder durch den Hauptfarbteiler - erzeugt werden.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der schematischen Darstellungen in den Figuren 3 bis 5 näher erläutert.
In Fig. 3 ist eine bevorzugte Lösung dargestellt, bei der Farbfilter für ein erfindungsgemäßes nicht-scannendes bildgebendes Spektrorneter in einer kompakten Form zusammengefasst sind. Bestandteil ist ein Anregungsfilter 11 , der einen Teil 16 des Anregungslichts zurückhält und einen anderen Teil 17 passieren lässt. Dieser Teil fällt dann auf einen Strahlteiler 12, der einen Teil 18 der Strahlung zur Probe reflektiert. Die von der Probe kommende Strahlung passiert diesen Strahlteiler wiederum teilweise und passiert noch teilweise einen Emissionsfilter 13 und eine Feldlinse 14. Die Komponenten Anregungsfilter 11 , Strahlteiler 12,
Emissionsfilter 13 und Feldlinse 14 sind in einer gemeinsamen Einheit 15 montiert. Diese erfindungsgemäße Ausführung erlaubt die einfache Integration in kommerzielle Mikroskope, da diese den Einsatz verschiedener Filter in Strahlteilerwürfeln vorsehen. Bei Integration der Feldlinse 14 in die kompakte Einheit 15 entfällt die im Schema dargestellte Feldlinse 7.
In Fig. 4 sind verschiedene Varianten dargestellt, wie das Gitter bzw. Hologramm an wechselbar gestaltet sein können, um so eine einfache Anpassung an verschiedene Anforderungen realisieren zu können. Z. B. ist es notwendig für verschiedene Auflösungen oder Vergrößerungen auch jeweils angepasste computergenerierte Hologramme zu benutzen. In Fig. 4a sind die verschiedenen Gitter bzw. Hologramme auf einem Schieber 20 angebracht, das wechselweise Einbringen in den Strahlengang 4 erfolgt durch eine transversale Verschiebung des Schiebers 20. In Fig. 4b sind die verschiedenen Gitter bzw. Hologramme auf einem drehbaren Halter 21 (Revolver) angebracht und werden durch eine Drehbewegung wechselweise im Strahlengang 4 positioniert.
Eine weitere erfindungsgemäße Variante die Bedingung λ Anregung "^ λ Langpass ** λ Detektion zu umgehen ist, einen Farbteiler zu verwenden, der einige schmale
Reflektionsbänder und im übrigen Spektralbereich hohe Transmission aufweist (Multi-Bandpass-Filter). Das bedeutet, dass in Auflicht-Fluoreszenz (der Aufbau ist schematisch in Fig. 3 dargestellt) von der Lichtquelle einige wenige Anregungslinien über den Teiler zur Probe reflektiert werden. Das von der Probe emittierte Licht, passiert den Teiler und wird anschließend delektiert Dabei werden gerade die Anregungswellenlängen unterdrückt (Fig. 5). Das Multi-Bandpass-Filter kann dabei vorteilhafterweise auch als durchstimmbares Filter ausgelegt sein (Lyot-Filter). In einer erfindungsgemäßen Form kann dieser Strahlteiler als beschichtetes Substrat ausgeführt sein, also z. B. dielektrische Vielfachschichten benutzen (z. B. Multibandfilter von Carl Zeiss oder Omega Optical Inc.). In einer weiteren Ausführungsform ist das Gitter / Hologramm 10 selbst variabel ausgeführt, der Grundaufbau ist in Fig. 3 dargestellt.
Für die Realisierung eines variablen Gitters bzw. Hologramms sind eine Reihe technischer Möglichkeiten prinzipiell bekannt. a) Ein variables Gitter bzw. Hologramm auf Flüssigkristall-Basis:
Solche Flüssigkristallelemente bestehen aus einer Anordnung von einem oder mehreren Paaren von Elektroden, zwischen denen sich eine Flüssigkristallsubstanz befindet, die die Eigenschaft besitzt, ihren Brechungsindex als Funktion der zwischen den Elektroden angelegten Spannung zu verändern. Verschiedene Varianten solcher variablen Flüssigkristall-basierten Gitter wurden z. B. bei C. Slinger et al. SPIE Proc. 3015, S. 72-83 (1997) oder der Science Applications International Corporation (Patent US 5 942 157) vorgeschlagen bzw. realisiert. b) Ein variables Gitter bzw. Hologramm mit Hilfe mikroelektronisch-mechanischer Bauelemente (MEMS):
Ein solches Bauelement besteht aus einer Mehrzahl miniaturisierter beweglicher Elemente (z. B. Mikrospiegel, Membranen oder Metallstreifen), die einzeln elektromagnetisch oder meist elektrostatisch angesteuert werden. Beispiele für solche Elemente sind so genannte Digital Mirror Devices (Texas Instruments, Patent US 5 661 591), wie sie in Videoprojektoren eingesetzt werden oder das Gräting Light Valve (Silicon Light Machines, Patent US 5 311 360), das ein elektronisch schaltbares Beugungsgitter realisiert. c) Ein variables Gitter bzw. Hologramm mit Hilfe eines akustooptischen Modulators: Akusto-optische Modulatoren erlauben die Beugung optischer Strahlung an laufenden oder stehenden akustischen Wellen in einem Kristall. Da die akustische Frequenz in Bereichen verstellbar ist, kann damit die Periode des Beugungsgitters verändert und dem gewünschten Beugungswinkel angepasst werden. Durch die Wahl unterschiedlicher Pulsformen abweichend von der Sinuswelle können gewünschte Beugungsordnungen hervorgehoben werden. Durch Überlagerung mehrerer akustischer Wellen sind auch Stehwellen und zweidimensionale Gitterstrukturen machbar.
Eine weitere erfmdungsgemäße Variante zur Veränderung der Auflösung des Systems ist die Verwendung eines Detektors, der eine variable Auflösung besitzt. Eine vorteilhafte Ausführungsform benutzt eine Kamera, deren Detektor-Chip sich mittels (Piezo-) Aktuatoren verschieben lässt (z. B. Axiocam von Carl Zeiss). Diese verwendet einen Sensor, der 1300 x 1030 matrix-artig angeordnete Elemente aufweist, deren Abstand jeweils 6,7 μm in Zeilen- und Spaltenrichtung beträgt. Verschiebt man nun den Sensor um jeweils einen halben Elementabstand, so lassen sich auf diese Weise vier verschiedene Sensorpositionen realisieren. Nimmt man in jeder dieser vier Positionen ein separates Bild auf, lassen sich diese zu einem Gesamtbild kombinieren, das eine effektive Auflösung von 2600 x 2060 Elementen besitzt. Es lassen sich auch andere Auflösungen durch Sensorverschiebungen um andere Längen erreichen. Durch Veränderung der effektiven Auflösung der Kamera kann die Orts- und Spektralauflösung des gesamten nicht-scannenden bildgebenden Spektrometers modifiziert werden.
Die Kalibrierung von bildgebenden Spektrometern erfolgt für gewöhnlich mit Hilfe von schmalbandiger Beleuchtung und einem zweiten Spektrorneter höherer Genauigkeit, das als Referenz dient Es ist erfindungsgemäß vorgesehen das System zu kalibrieren, ohne dabei ein separates Spektrorneter verwenden zu müssen. Stattdessen soll mit Hilfe der bekannten spektralen Charakteristik des Hauptfarbteilers oder der bekannten spektralen Charakteristik der Lichtquelle kalibriert werden. Mit Hilfe einer solchen Beleuchtung, deren Spektrum bekannt ist, wird nun eine wohl definierte Probe beleuchtet und mit dem bildgebenden Spektrorneter detektiert. Durch den Vergleich des auf diese Weise erhaltenen Resultats mit dem erwarteten Ergebnis kann das System kalibriert werden. Diese Kalibrierung gilt streng genommen nur für die Wellenlängen, die von der definierten Probe emittiert wurden.
Durch eine Interpolation zwischen diesen Wellenlängen lässt sich eine Kalibrierung realisieren, die den gesamten Wellenlängenbereich umfasst, der von diesen einzelnen Messpunkten aufgespannt wird.
Die Realisierung der Erfindung ist nicht an die dargestellten Ausführungsbeispiele gebunden, fachmännische Weiterentwicklungen führen nicht zu einem Verlassen der erfinderischen Lösung.

Claims

Patentansprüche
1. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei
Anregungsfilter und Strahlteiler in einem wechselbaren Modul zusammengefasst sind.
2. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Anregungsfilter, einer
Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, welche einen optischen Strahlengang definieren, wobei mehrere dispersive Elemente vorgesehen sind, welche wahlweise in den Strahlengang einbringbar sind.
3. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei die dispersiven Eigenschaften des dispersiven Elements gezielt veränderbar sind.
4. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 1 , wobei in das wechselbare Modul eine Linse integriert ist.
5. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 2, wobei die dispersiven Elemente auf einem Schieber angebracht sind.
6. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 2, wobei die dispersiven Elemente auf einer drehbaren Einheit angebracht sind.
7. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 3, wobei das dispersive Element aus einem veränderbaren Gitter oder Hologramm besteht.
8. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus einem FIüssigkristall-Array besteht.
9. Biidgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus mikroelektronisch-mechanischen Bauelementen besteht.
10. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 9, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus einem DMD-Array besteht
11. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 9, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus steuerbaren Lichtventilen (Gräting light valve) besteht.
12. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter oder Hologramm aus einem Flüssigkristall-Gitter besteht.
13. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 7, wobei das veränderbare Gitter mittels akusto-optischer Modulatoren (AOM) generiert wird.
14. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 3, wobei das veränderbare dispersive Element ein mittels akusto-optischer Modulatoren veränderbares Gitter ist.
15. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer
Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei die Bildaufnahmeeinrichtung eine variable Auflösung aufweist.
16. Biidgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, wobei das . Anregungsfilter als Multi-Bandpass-Filter ausgeführt ist.
17. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer, bestehend aus mindestens einem Objektiv, mindestens einem Strahlteiler, mindestens einer Beleuchtungsquelle, einem Anregungsfilter, einer Abbildungsoptik, einem dispersiven Element und einer Bildaufnahmeeinrichtung, welche einen optischen Strahlengang definieren, wobei mehrere Anregungsfilter vorgesehen sind, welche wahlweise in den Strahlengang einbringbar sind.
18. Verfahren zum Betrieb eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers nach Anspruch 17, wobei mit der Bildaufnahmeeinrichtung mehrere Bilder sequentiell aufgenommen werden und zwischen den Aufnahme das Anregungsfilter gewechselt wird. Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers, wobei eine Probe, deren räumliche und spektrale Eigenschaften bekannt sind, mit Licht bekannter spektraler Zusammensetzung beleuchtet wird und die so entstehende Messung mit einem Soll-Ergebnis verglichen wird und aus der Abweichung der Messung von dem Soll-Ergebnis
Korrekturwerte bestimmt werden. Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden, nicht-scannenden ■ Spektrometers nach Anspruch 19, wobei das Licht bekannter spektraler Zusammensetzung von einer Lichtquelle mit bekannten Spektrallinien erzeugt wird. Verfahren zum Kalibrieren eines bildgebenden, nicht-scannenden Spektrometers nach Anspruch 19, wobei die bekannte spektrale Zusammensetzung des Lichts durch einen Farbfilter erzeugt wird. Verfahren zum Kalibrieren eines biidgebenden, nicht-scannenden Spektrometers nach Anspruch 19, wobei die bekannte spektrale
Zusammensetzung des Lichts durch einen Hauptfarbteiler erzeugt wird. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 16, wobei das Multi-Bandpass-Filter abstimmbar ist. Bildgebendes, nicht-scannendes Spektrometer nach Anspruch 16, wobei das Multi-Bandpass-Filter aus dielektrischen Schichten aufgebaut ist.
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