CN114295593B - 基于dmd的荧光光谱探测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光光谱探测的技术领域，公开了基于DMD的荧光光谱探测方法，包括以下步骤：S1：搭建荧光光谱探测的光学系统，光学系统包括DMD、色散单元和探测器；S2：获取光学系统的光谱矫正系数R，包括以下步骤：S21：测量标准光源的光谱数据L；S22：将标准光源导入光学系统，在DMD上加载多幅光谱图案，测得光谱数据S；则光谱矫正系数R＝(S‑B)/L，B为噪声；S3：重建荧光光谱，将标准光源换成待测样品，多幅光谱图案，测得光谱数据I；则待测样品的荧光光谱f＝(I*L)/(S‑B)。采用了DMD对色散光进行选择性的输出，充分利用DMD像素级调控的优势对光谱进行拆分、编码和重建，本探测方法的光谱的采样点比多通道探测器多，光谱检测的精度和方式要优于多通道探测器。
Description
技术领域
本发明专利涉及荧光光谱探测的技术领域，具体而言，涉及基于DMD的荧光光谱探测方法。
背景技术
与光谱仪不同，成像光谱仪的优势在于成像。但成像光谱仪也可以通过预先的光谱标定加特定的实验操作从而得到染料的光谱曲线。目前，成像光谱仪有多滤光片、可移动式狭缝、多通道探测等几类。多滤光片由许多滤光片组成，方法简单，但成本较高，且十分受限于滤光片，因此不适合探测光谱。可移动式狭缝利用移动的狭缝从而输出特定带宽的光，但由于该方法速度慢、结构复杂、精度低，因此也不适合光谱探测。
多通道探测是指利用多个探测器覆盖整个光谱探测波段，即每个探测器负责响应特定波长范围的荧光。与前两种方法相比，多通道探测速度快、精度高，因此该方法也可用于探测光谱。
如图1所示，Nikon C1si系统的多光谱模块的光路示意图。其中，Emission light是入射荧光，Grating 1是光栅，Multi-channel PMT是多通道光电倍增管。
该模块工作原理如下：样品产生的荧光(Emission light)经过某些光学元件后照射在光栅(Grating 1)上。由于衍射效应，入射荧光在空间上色散展开。最终，色散光全部打在多通道光电倍增管(Multi-channel PMT)上，保证探测器能接受所有的色散光。由于色散荧光完全被探测器接受，所以每一个通道都对应一个固定的光谱带宽。在测量光谱时，各个通道接受信号并计数，再将这些信号值除以系统的光谱透过率系数既能得到入射荧光的光谱。
这种多通道光谱探测凭借着性能稳定、结构简单得到了广泛的应用，除了此产品，许多其它的产品也使用了该结构，例如Becker&Hick1 GmbH的16通道探测器(NW-FLIM-DEFGASP-NDD-NOS)。
如上述所提到的多通道探测器，虽然性能优越、应用广泛，但是也存在一些问题。具体问题如下：
(1)由于结构的限制，探测器的通道数量不会无限制的增加。目前通道数量最多只能达到16个，因此也只有16个光谱探测点，往往会遇到光谱采样点不足的问题。因为很多荧光的光谱范围很宽(以荧光素钠举例，该染料的发射光谱涵盖400nm～700nm)，所以光谱探测点越多，光谱探测精度越准。
(2)由于通道数量受限，所以每个通道的带宽不会很窄，即光谱分辨率不会很高。在光谱仪中，光谱分辨率越差，可分辨的两个波长之间的波长差越大，探测效果越差。
(3)对于光谱仪而言，光栅的能量利用率会比棱镜低很多，尤其是光栅的工作波长范围小且还有较多的杂散光和反射光，对于探测系统有较大的影响。
(4)多通道探测器价格昂贵。由于是几个或十几个探测器的叠加，所以这种类型的探测器成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DMD的荧光光谱探测方法，旨在解决现有技术中，光谱探测的采样点不足的问题。
本发明是这样实现的，基于DMD的荧光光谱探测方法，包括以下步骤：
S1：搭建荧光光谱探测的光学系统，所述光学系统包括DMD(数字微镜器件)、色散单元和探测器，经由所述色散单元的光入射至所述DMD，后被所述探测器接收；
S2：获取所述光学系统的光谱矫正系数R，包括以下步骤：
S21：用光谱仪测量标准光源，得到其光谱数据L；
S22：将所述标准光源导入所述光学系统，在所述DMD上加载多幅光谱图案，每加载一幅所述光谱图案，所述探测器采集一次信号，此数据记为S；
则所述光谱矫正系数R由以下公式计算：
S3：重建荧光光谱，将所述标准光源换成待测样品，激发待测样品产生荧光并将其导入所述光学系统；在所述DMD上加载多幅所述光谱图案，每加载一幅所述光谱图案，所述探测器采集一次信号，此数据记为I；
则待测样品的荧光光谱f由以下公式计算：
可选的，在步骤S22中，在加载所述光谱图案前，用光谱仪标定所述光谱图案的中心波长和光谱带宽。
可选的，所述光谱图案的中心波长为400～700nm；所述光谱带宽在6nm～20nm之间。
可选的，所述探测器为单光子探测器或面阵探测器。
可选的，所述光谱图案满足最小光谱分辨率的要求。
可选的，所述光谱图案的位深设置成1比特。
可选的，所述光谱图案为19幅以上。
可选的，在步骤S3中，检测重建荧光光谱时的噪声B1，则待测样品的荧光光谱f由以下公式计算：
可选的，所述光学系统还包括第一透镜、光纤、第二透镜、滤光片和第三透镜；荧光依次经过所述第一透镜、所述光纤、所述第二透镜、所述滤光片、所述色散单元、所述DMD、所述第三透镜后，被所述探测器接收。
可选的，所述光学系统还包括光束终止器，从所述DMD出射的光中，有用的信号被所述探测器接收，无用的信号走向所述光束终止器。
与现有技术相比，本发明提供的基于DMD的荧光光谱探测方法，采用了DMD对色散光进行选择性的输出，充分利用DMD像素级调控的优势对光谱进行拆分、编码和重建，由于DMD具有像素级控制的特性，所以能加载各种各样的图案，即可使用不同中心波长、不同带宽的光谱图案来重建光谱。因此，本探测方法的光谱的采样点比多通道探测器多，光谱检测的精度和方式要优于多通道探测器。
附图说明
图1是现有技术中Nikon C1si系统的多光谱模块光路示意图；
图2是本发明提供的基于DMD的荧光光谱探测方法的光路示意图；
图3是本发明提供的基于DMD的荧光光谱探测方法中在DMD上加载的光谱图案示意图；
图4是本发明提供的基于DMD的荧光光谱探测方法对EOSINY染料进行检测的实验结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
参照图2-4所示，为本发明提供的较佳实施例。
基于DMD的荧光光谱探测方法，包括以下步骤：
S1：搭建荧光光谱探测的光学系统，光学系统包括DMD、色散单元和探测器，经由色散单元的光入射至DMD，后被探测器接收；
S2：获取光学系统的光谱矫正系数R，包括以下步骤：
S21：用光谱仪测量标准光源，得到其光谱数据L；
S22：将标准光源导入光学系统，在DMD上加载多幅光谱图案，每加载一幅光谱图案，探测器采集一次信号，此数据记为S；
则光谱矫正系数R由以下公式计算：
S3：重建荧光光谱，将标准光源换成待测样品，激发待测样品产生荧光并将其导入光学系统；在DMD上加载多幅光谱图案，每加载一幅光谱图案，探测器采集一次信号，此数据记为I；
则待测样品的荧光光谱f由以下公式计算：
本实施例提供的基于DMD的荧光光谱探测方法，采用了DMD对色散光进行选择性的输出，充分利用DMD像素级调控的优势对光谱进行拆分、编码和重建，由于DMD具有像素级控制的特性，所以能加载各种各样的图案，即可使用不同中心波长、不同带宽的光谱图案来重建光谱。因此，本探测方法的光谱的采样点比多通道探测器多，光谱检测的精度和方式要优于多通道探测器。
该基于DMD的荧光光谱探测方法利用DMD的可调谐性对荧光光谱编码和重建从而得到荧光的发射光谱。该光谱探测方法不仅步骤简单、光谱探测精度高，且适合点扫描成像的系统。
对于噪声B，主要是探测器的暗噪声，其测量方法如下：
S221：关闭所有光源，即不往系统中输入任何光信号；
S222：探测器连续采集三次信号，所得信号的平均值即为探测器的暗噪声。
在以上噪声B的测量过程中，探测器的任何参数设置(包括曝光时间、增益等)都需要与重建光谱时的参数一致。
DMD(数字微镜器件)是一种由多个高速数字式光反射开光组成的阵列。DMD是由许多微型反射镜面构成的，镜片的多少由显示分辨率决定，一个小镜片对应一个像素。DMD器件具有像素级可控特性及高速的翻转频率。
在搭建的荧光光谱探测的光学系统中，由于透镜、滤光片、光纤等一系列的光学元件的存在，任何荧光经过此光学系统后，其光谱一定会发生变化。因此，计算系统的光谱矫正系数是重建光谱的重要一步。
具体的，色散单元采用色散棱镜，能产生较好的色散效果，且能量损耗小。
具体的，标准光源可采用钨灯、LED等。
具体的，在步骤S22中，在加载光谱图案前，用光谱仪标定光谱图案的中心波长和光谱带宽。
优选的，光谱图案的中心波长为400～700nm；光谱带宽在6nm～20nm之间。
例如，可依次加载19幅光谱图案，其中心波长分别为505nm、515nm、525nm、535nm、545nm、555nm、565nm、575nm、585nm、595nm、605nm、615nm、625nm、635nm、645nm、665nm、665nm、675nm、685nm，光谱带宽在6nm～20nm之间。
探测器为单光子探测器或面阵探测器，没有较大的限制。理论上只要是探测器，本方法都可以使用。相比现有技术多通道探测器中需要多个探测器，本基于DMD的荧光光谱探测方法只需一个探测器即可。
可以用CCD替代光电倍增管(PMT)、单光子计数器(APD)等高灵敏探测器，这样可以节约成本，而且可以充分发挥单个探测器的利用率。
光谱图案满足最小光谱分辨率的要求，即加载该光谱图案时光谱带宽最小。
光谱图案的位深设置成1比特，这样才能充分发挥DMD高刷新率的优势，提高光谱的获取速度。
光谱图案为19幅以上，保证了光谱采样点有覆盖较宽的光谱范围。
在步骤S3中，检测重建荧光光谱时的噪声B1，则待测样品的荧光光谱f由以下公式计算：
其中，噪声B1也是探测器的暗噪声，其检测方法与噪声B的检测方法相同。
具体的，基于DMD光谱探测方法的光学系统包括第一透镜、光纤、第二透镜、滤光片、色散单元、DMD和第三透镜；荧光依次经过第一透镜、光纤、第二透镜、滤光片、色散单元、DMD、第三透镜后，被探测器接收。
荧光经由第一透镜耦合入光纤，在光纤中传输；而后从光纤的出射端出射。光纤的出射端位于第二透镜的前焦点处，使得从光纤出射的光经由第二透镜后，变为平行光，入射至滤光片上。透过滤光片的平行光入射至色散单元上，色散单元可以是三棱镜；不同波长的光经由三棱镜后偏折不同的角度，即为色散展开；色散展开的光投射在DMD上；调节数字微镜器件DMD上加载的光谱图案，使得有用信号经由第三透镜后被探测器所接收。
光学系统还包括光束终止器，从DMD出射的光中，有用的信号被探测器接收，无用的信号走向光束终止器。避免无用的信号对有用信号对探测结果造成干扰。
在以下具体实施例中：
首先搭建了荧光光谱探测的光学系统，如图2所示，基于DMD光谱探测方法的光学系统主要包括透镜、光纤、滤光片、色散棱镜、数字微镜器件(DMD)、探测器和光束终止器。
从样品中产生的荧光经过物镜或透镜201后耦合进光纤202里面；荧光从光纤202的另一端出射，然后依次经过透镜203、滤光片204后入射至棱镜205。多波长的荧光经过棱镜205后会产生角度差，即不同波长的光拥有不同的出射角，从而使得荧光色散展开，色散展开的荧光最后落在数字微镜器件DMD206上。调节数字微镜器件DMD上的图案，使得荧光落在光束终止器209上，或经过透镜207聚焦后被探测器208接收。其中ON是滤出光的光路，即有用信号沿着此光路传播；而OFF代表被滤除光的光路，即无用信号通过此光路走向光束终止器209。
下面开始介绍光谱重建的方法：
(1)计算系统的光谱矫正系数。由于透镜、滤光片、光纤等一系列的光学元件的存在，任何荧光经过此光学系统后，其光谱一定会发生变化。因此，计算系统的光谱矫正系数是重建光谱的重要一步。计算方法如下：
用光谱仪测量标准光源(钨灯、LED等)，并得到其光谱数据L。然后将该标准光源导入系统，往DMD上加载图3所示图案。在加载前需要用光谱仪标定这些图案的中心波长和光谱带宽。DMD每加载一幅图案，探测器采集一次信号，此数据记为S。其中，探测器208既可以是单光子探测器也可以是面阵探测器，为了节约成本，可以用CCD替代光电倍增管(PMT)、单光子计数器(APD)等高灵敏探测器。然后将探测器得到的信号S减去测量时产生的噪声B后除以标准光源的光谱数据L后即可得到光谱矫正系数R，即
在图3中是DMD上加载的图案，每一个图案对应一个光谱通道。图3(a)～图3(s)的中心波长分别为：505nm、515nm、525nm、535nm、545nm、555nm、565nm、575nm、585nm、595nm、605nm、615nm、625nm、635nm、645nm、665nm、665nm、675nm、685nm，光谱带宽在6nm～20nm之间。其中，图案的白色部分代表这部分光沿着探测器方向传播，反之亦然。
(2)重建荧光光谱。与上一步步骤类似，首先将标准光源换成待测样品，激发光激发样品产生荧光并将其导入系统。往DMD上依次加载图3所示图案。如(1)中操作相同，DMD加载一幅图案，探测器采集一次信号，此数据记为I。将该值除以光谱矫正系数R后即可得到样品的荧光的光谱f，即
重建光谱时，为了得到更佳的探测效果，DMD加载的图案需要满足以下要求：
①图3所示图案数量19是能重建光谱的基础，如果测量图案较少，则光谱重建精度较低。当然也可以适当的增加图案的数量(比如探测范围增大)，但是要注意光谱串扰的影像。
②图案要满足最小光谱分辨率的要求，即加载该图案时光谱带宽最小。系统设计不同，满足该条件的图案也会不同。一般图案中的狭缝宽度越小，分辨率越低，但也会有一个极限值。
③图案位深必须设置成1比特，这样才能充分发挥DMD高刷新率的优势，提高光谱的获取速度。
为了检验准确性，可以用光谱仪测量该荧光的真实光谱F，并与本基于DMD的荧光光谱探测方法得到的光谱f进行对比。
本发明提供的基于DMD的荧光光谱探测方法经过理论验证和实验验证，图4为实验结果。
在图4中是EOSINY染料的实验结果，带原点的线是基于DMD的荧光光谱探测方法得到的结果，另一条曲线是用商业光谱仪测量得到的结果。从图4可以看到，本基于DMD的荧光光谱探测方法的重建精度较高。由于该染料在640nm以上的信号很弱，噪声较多，重建结果不理想，所以删除了640nm后面的数据。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的基于DMD的荧光光谱探测方法有以下几个优点：
(1)光谱的采样点比多通道探测器多。由于DMD具有像素级控制的特性，所以能加载各种各样的图案，即可使用不同中心波长、不同带宽的图案来重建光谱。因此，光谱检测的精度和方式要优于多通道探测器。
(2)光谱分辨率高。多通道探测器的光谱分辨率主要取决于探测器的数量，探测器数量越多，分辨率越高。但目前探测器数量最多也只能达到16个，在保证光谱探测范围的情况下，光谱分辨率不会很高。而在此方法中，可以通过光学设计使得系统在相同光谱探测范围的情况下获得更高的光谱分辨率。
(3)能量利用率高。本方法光路中的色散单元是棱镜，与光栅相比，棱镜的能量利用率、工作波长、杂散光等方面都要优于光栅。由于荧光信号很弱，因此降低光损耗是非常重要的一步。
(4)单探测器探测。与多通道探测器相比，本发明所述方法只需要一个探测器，这种构造不仅能节约成本，还可以充分发挥单个探测器的利用率。由于空间大小的限制，多通道探测器的每一个探测器性能肯定不如单个探测器，例如信噪比、探测器接收面积，而且每个探测器之间也会存在性能差异，因此单探测器可以充分发挥单个探测器的性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：搭建荧光光谱探测的光学系统，所述光学系统包括DMD、色散单元和探测器，经由所述色散单元的光入射至所述DMD，后被所述探测器接收；
S2：获取所述光学系统的光谱矫正系数R，包括以下步骤：
S21：用光谱仪测量标准光源，得到其光谱数据L；
S22：将所述标准光源导入所述光学系统，在所述DMD上加载多幅光谱图案，每加载一幅所述光谱图案，所述探测器采集一次信号，此数据记为S；
则所述光谱矫正系数R由以下公式计算：
S3：重建荧光光谱，将所述标准光源换成待测样品，激发待测样品产生荧光并将其导入所述光学系统；在所述DMD上加载多幅所述光谱图案，每加载一幅所述光谱图案，所述探测器采集一次信号，此数据记为I；
则待测样品的荧光光谱f由以下公式计算：
2.如权利要求1所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，在步骤S22中，在加载所述光谱图案前，用光谱仪标定所述光谱图案的中心波长和光谱带宽。
3.如权利要求2所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，所述光谱图案的中心波长为400～700nm；所述光谱带宽在6nm～20nm之间。
4.如权利要求3所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，所述探测器为单光子探测器或面阵探测器。
5.如权利要求4所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，所述光谱图案满足最小光谱分辨率的要求。
6.如权利要求4所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，所述光谱图案的位深设置成1比特。
7.如权利要求4所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，所述光谱图案为19幅以上。
8.如权利要求1-7任一项所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，在步骤S3中，检测重建荧光光谱时的噪声B1，则待测样品的荧光光谱f由以下公式计算：
9.如权利要求1-7任一项所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，所述光学系统还包括第一透镜、光纤、第二透镜、滤光片和第三透镜；荧光依次经过所述第一透镜、所述光纤、所述第二透镜、所述滤光片、所述色散单元、所述DMD、所述第三透镜后，被所述探测器接收。
10.如权利要求9所述的基于DMD的荧光光谱探测方法，其特征在于，所述光学系统还包括光束终止器，从所述DMD出射的光中，有用的信号被所述探测器接收，无用的信号走向所述光束终止器。
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