DD265224A1

DD265224A1 - Verfahren und anordnung fuer die lichtrastermikroskopie

Info

Publication number: DD265224A1
Application number: DD30673587A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Schuett; Fritz Kuhlmann; Gerald Gruemmer; Fred Reinholz; Stine-Kathrein Kraeft; Otto Fiedler
Original assignee: Univ Rostock
Priority date: 1987-09-07
Filing date: 1987-09-07
Publication date: 1989-02-22
Also published as: DE3830061A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Lichtrastermikroskopie und einer Anordnung dazu, die der Untersuchung von biologischen und Festkoerperpraeparaten dienen, wobei eine erhoehte Information ueber Objektstrukturen und Objektparameter gewonnen werden kann. Geloest wird dies dadurch, dass punktweise das vom Objekt ausgehende Licht hinsichtlich seiner Intensitaetsverteilung in der Bildebene gemessen wird und zur Bilddarstellung Groessen der Intensitaetsverteilung wie Gesamtintensitaet, die Lage, Groesse von Extrema derselben und/oder die Breite von Peaks nach Rechnerverarbeitung genutzt werden, um Lichtrastermikroskope des Typ I, Typ II, Typ III in einem Geraet zu realisieren. Die Anordnung zur Ermittlung der Streulichtverteilung enthaelt zwischen dem abbildenden optischen System und der Blende eines optoelektronischen Wandlers ein elektronisch steuerbares optisches Ablenksystem (z. B. akustooptische, elektrooptische Zelle; Polygonprisma; Drehspiegel). Der Einsatz einer integrierten Empfaengeranordnung aus zeilen- oder matrizenfoermigen Elementen (Photodioden oder CCD-Elemente) oder einer TV-Aufnahmeeinrichtung mit Bildverstaerker ist moeglich. Es wird mit herkoemmlicher Raster- und Bildaufbautechnik gearbeitet.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lichtrastermikroskopie, das die Erkennung von Objektdetails verbessert und günstig zur bildmäßigen Untersuchung biologischer und medizinischer Objekte als auch feinstrukturierter Festkörperoberflächen angewendet werden kann, sowie eine Anordnung zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Lichtrastermikropkope bestehen aus einer Lichtquelle, einer Einrichtung zur Fokussierung des Lichtstrahles auf das zu untersuchende Objekt, einen optoelektronischen Wandler zum Empfang der vom Objekt durchgelassenen oder reflektierten Strahlen und einer Einrichtung zur Rasterung einer Objektfläche durch Bewegung des Objektes oder Ablenkung des Strahles. Als Lichtquelle dient vorzugsweise ein CW-Laser. Wird von jedem beleuchteten Objektpunkt das gesamte ausgehende Licht von dem Abbildungssystem zur Bllddarstellung benutzt, so handelt es sich um das einfache Lichtrastermikroskop, dessen Auflösungsvermögen aem des Lichtmikroskopes entspricht (als Typ I bezeichnet). Es ist ausführlich bei Sheppard, CJ. R.; Wilson, TJ. Microscopy 114 (1978) S. 179 beschrieben. Werden zusätzlich von der Probe ausgehende Strahlungen wie z.B.

Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Raman-Strahlung oder auch Photoelektronen mit Hilfe eines zweiten Detektors zur Bilodarstellung benutzt, so entsteht ein kombiniertes optoelektronisches Maßsystem, das eine Identifizierung probenspezifischer Parameter hoher Empfindlichkeit erlaubt. (lEurop. Patentanmeldung Veröff. Nr. 0056426 [1981] Verf. u. Vorr. zur lichtiduzierten rastermikrorkopischen Darstellung von Probenparametern in ihrer räumlichen Verteilung).

Eine Verbesserung der Auflösung räumlicher Strukturen bringt das von Sheppard, C J. H. Offenlegungeschrift DE 2818651 (1987), beschriebene konfokale Lichtrastermikroskop (als Typ Il bezeichnet).

Es besitzt in der Bildebene eine Lochblende, deren Durchmesser kleiner ist als der des Bildes des Fokus auf dem Objekt, so daß das gesamte aus dem Strahlbündel herausgestreute oder gebeugte Licht ausgeblendet bleibt und nur das zentrale Maximum zur Bilddarstellung genutzt wird. Insbesondere verbessert sich die Tiefenschärfe.

Dichte- u: rd Dickeninhomogenitäten des Objektes !essen sich günstig mit einem Scanning-Mikroskop sichtbar machen, das nach dem Differential-Phasenkontrast-Prinzip arbeitet (Dekkers, N. H., de Leng, Optik VoI 41 (1974) S.462). Es besitzt einen geteilten Sensor (split sensor), auf dem die h'okusfläche symmetrisch abgebildet wird. Die beiden Sensorhälften bilden die Differenz der auffallenden Intensität, so daß Dichte- oder Dickengradienten im Fokuebereich des Objektes sichtbar werden. Eine weitere Verbesserung dieser Methode bringt der Vorschlag von S¹ eppard, CJ. R. und Wilson, T. (Europ. Patentarmeid. Veröff.

Nr.0168983A1 [1985] Scanning microscope), das Zentrum des geteilten Sensors abzudecken und nur Randzonen des abgebildeten Lichtstrahles zur Detektion zu benutzen. Das Ausblenden der starken Mittenintensität hat den Vorteil, daß bei der Differenzbildung der Randintensitäten auch Bereiche mit kleinerem Phasenkontrast sichtbar werden.

Nachteilig l·.!, daß die bisher vorgeschlagenen Verfahren und Einrichtungen der Lichtrastermikroskopie mit Detektoren arbeiten, die das Licht über mehr oder wenigor großen Flächen integrieren. Das gilt auch für das konfokale Lichtrastermikroskop, wo die Integration in der Ausblendung des gesamten Streulichtes zu sehen ist (Integraler Fehlbetrag).

Die Integration ist ein Faktor, der wesentlich zur Begrenzung der örtlichen Strukturerkonnung beiträgt.

Relativ hoher Aufwand (optisch und mechanisch) entsteht beim konfokalen Lichtrastermikroskop durch die genaue Mitführung der Empfängerblende beim Abrastem des Objektes.

7. »\ der Erfindung

D is Ziel der Erfindung besteht darin, für die Lichtrastermikroskopie ein Verfahren und eine Einrichtung zu entwickeln, mit deren Hllto mehr Informationen über Objektstrukturen und Objektparameter gewonnen werden können. '

Aufgabe der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfuhren und eine Einrichtung für die Lichtrastermikroskopie zu entwickeln, womit eine genauere Abtastung des Bildes eines ObjektDunktes und damit mehr Informationen von extrem kleinen Objektstrukturen bei hoher Abtastgeschwindigkeit erreicht werden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, df.ß das von einem punktförmig bestrahlten Objektbereich ausgehende Licht hinsichtlich seiner Intensitätsverteilung in der Bildebene (senkrecht zur Strahlachse) in einer oder in mehreren Richtungen kontinuierlich oder in kleinen Schritten gemessen wird. Aus der Intensitätsvorteilung werden charakteristische Größen wie die Gesamtintensität, die Lage und Größe von Extremwerten und/oder die Breite von Peaks der Abtar'.kurve bestimmt und von einem Rechner verarbeitet. Der Meßvorgang wird bei rechnergsteuerter Flächenrasterung (x- und y-Richtung) des Objektes von Punkt zu Punkt wiederholt. Die jeweils erhaltenen charakteristischen Größen der Intensitätsvorteilung werden zur Bilddarstellung genutzt, sie verbessern die Erkennung von Objektdetails.

Die charakteristischen Größen und/oder ihre mathematischen Verknüpfungen (Verhältnisbildungen von Größen und Lagen der Extremwerte, Integration über den Abtastweg) dienen der Grauwertstufung in der Bilddarstellung des Objektbereiches. Die bloße Bildung des Integrals der Intensitätsverteilung eines jeden Objektbereiches liefert Rasterbilder des Rastermikroskopes vom Typ I. Die bloße Messung und Verarbeitung der Höhe des Intensitätsmaximums der Intensitätskurve liefert Rasterbilder des Rastermikroskopes vom Typ II. Dabei spielt es keine Rolle, an welcher Stelle im Abtastbereich die Kurve erscheint, so daß der Meßvorgang auf eine Impulshöhenanalyse reduziert werden kann. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, ohne mechanisches Nachführen der Blende ein Stahlscanning in dieser Richtung vorzunehmen.

Die Abrasterung des Objektes in x- und y-Richtung erfolgt durch Bewegung des Objektes oder des Strahles oder beider in Stufen oder bei höheren Abtaotgesnhwindigkeiten kontinuierlich.

Zur Ermittlung bestimmter Probenparameter wird die Intensitätsverteilung von Streustrahlungan gemessen, deren Wellenlangen infolge von inelastischen Wechselwirkungen der Strahlen mit dem Objekt verändert sind, z. B. Fluoreszenz- oder Ramanstrahlung.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß weiterhin dadurch gelöst, daß zur Durchführung des Verfahrens eine restermikroskopische Anordnung erstellt ist, in der sich zwischen dem abbildenden optischen System und der Blende des optoelektronischen Wandlers ein elektronisch steuerbares optisches Ablenksystem befindet, eine akustooptische oder elrAtrooptische Zelle.

Bei nur eindimensionaler Ablenkung ist das Ablenksystem vorzugsweise ein rotierendes Polygonprisrna. Die Blende, die sich vor dem optoelektronischen Wandler in der Bildebene befindet, hat eine Öffnungsweite, die kleiner ist als de; Durchmesser des Bildes des Laserfokus auf dem Objekt. Das Bild des beleuchteten Objektbereiches wird über die Blende gelenkt und vom dahinter befindlichen Wandler als zeitabhängige Intensität registriert.

Anstelle des Polygonprismas können schwingende Ablenkelemente, wie z. B. lichtbrechende planparallele Körper oder Schwingspiegel oder auch gleichmaßig bewegte Drehspiegel angeordnet sein.

Für eine 2 D-Darstellung der Intensitätsverteilung des vom beleuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes ist das Polygonpnsma mit geringfügig in Richtung der Drehachse angeschrägten Prismenflächen versehen.

Der optoelektronische Wandler, die Blende und das Ablenksystem können durch eine integrierte Empfängeranordnung, durch zeilen- oder matrizenförmig angeordnete Elemente (Photodioden oder CCD-Elemente) oder auch durch eine TV-Aufnahmeeinrichtung, vorzugsweise mit Bildvorverstärker (Ebiscon) ersetzt sein. Die Zeile, die Matrix oder das Empfängertarget sind jeweils in der Bildebene des Objektbereiches senkrecht zur Strahlachse angeordnet.

Für Messungen von Streustrahlungen, deren Wellenlängen vom Objekt durch inelastische Wechselwirkungen verändert oind, ist ein Filter im Strahlengang oberhalb des halbdurchlässigen Spiegels angeordnet.

Für wahlweises Arbeiten im Auflicht oder im Durchlicht kann das Lichtrestermikroskop einen Strahlteiler im Strahlengang des Lasers enthalten. Die beiden Teilstrahlen sind über optische Unterbrecher- und Umlenkvorrichtungen an das Objekt geführt, ein Strahl tür Durchlichtmessungen und ein Strahl für Auflichmessungen.

Für e!ne dreidimensionale Bilddarstellung sind das Objekt oder der Strahlfokus oder beide in Richtung der Strahlachse (Achse des Abbildungssystems = z-Achse) schrittweise verschiebbar angeordnet.

Zum Zwecke herkömmlicher lichtmikroskopisccher Beobachtung des Objektes sind außer einer an sich bekannten Vorrichtung zur gleichmäßigen Ausleuchtung des gesamten Objektes im Strahlengang des abbildenden Systems ein halbdurchlässiger Spiegel und ein Okular angeordnet.

Ausführungsbeispiel

Anhand eines Ausführungsbeispiels wird die Erfindung näher erläutert. In Fig. 1 ist eine mögliche Ausführungsform einer Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Lichtrastermikroskopie schematisch dargestellt.

Bei dieser Anordnuno ist das aus einer Lichtquelle, vorzugsweise einem Laser 9, austretende Licht und einem optischen System 8, bestehend aus einnr Vorrichtung iur Strahlaufweitung, Fokussierung und Strahlablenkung in der zur Drehachse des Polygonprismas 1 senkrechten Richtung, auf die Unterseite des Objektes 7 oder mit einer weiteren Lichtquelle, vorzugsweise einem Laser 10 über nine Optik 11, bestehend aus einer Vorrichtung zur Strahlaufweitung, Fokussierung und Strahlablenkung in der zur Drehachse des Polygonprismas 1 senkrechten Richtung, Ober einen halbdurchlässigen Spiegel 12 und Optik 4 auf die Oberseite des Objektes 7 fokussiert. Das Objekt 7 wird durch eine Vorrichtung zur mechanischen Verschiebung 16 durch den Rechner 14 in drei TranslationsfreiSoi'.sgraden reproduzierbar bewegt. Das vom beleuchteten Punkt des Objektes 7 ausgehende Licht wird sowohl bei der Transmissions- als auch der Reflexionsvariante des Beispiels durch die Optik 4 und den halbdurchlässigen Spiegel 12 durch das Polygonp ismes 1 hindurch auf die Blende 2 abgebildet. Bei Bewegung (drehende) des Polygonprisma 1 wird das vom jeweiligen Objektpunkt ausgehende Licht an der Lochblende 2 vorbeigeführt und vom Fotodetektor 3 erfaßt. Der A/D-Wandler 13 und der Rechner 14 erfassen die Intensitätoverteilung des vom jeweiligen beleuchteten Objektpunkt ausgehenden Lichtes. Dabei kontrolliert ein mit dem Rechner 14 verbundenes optoelektronisci * System 17 die Stellung des Polygonprismas. Es gestattet, zur Aufnahme der Intenslttttsverteilung stets dieselben Flächonpuare

des Polygonprismas 1 zu benutzen, um gerätebedingte Intensitätsschwankungen zu vermeiden. Über die Optik 4, einen weiterenhalbdurchläsbigen Spiegel 6 und das Okular 18 kann der zu untersuchende Objektbereich visuell in herkömmlicher

Durchlichtmikroskopie betrachtet werden, wenn das Objekt 7 mittels des Kondensors 20 und der Leuchte 21 über den

halbdurchlässigen Spiegel 19 gleichmäßig beleuchtet wird.

Das Filter 5 dient zur Abtrennung des Fluoreszbnzüchtes der Probe vom .beleuchtenden Primärstrahl. Flg. 2 stellt schematisch die Intensitätsverteilung des von einem beleuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes in der Bildebene in einer Richtung χ dar zwecks Erklärung der Lichtrastermikroskope der Typen I, Il und III. Zur Bilddarstellung auf einer Bildausgabeeinheit 15 werden charakteristische Merkmale der Intensitätsverteilung des vom

beleuchteten Objektbereiches ausgehenden Lichtos wie z. B. Lage, Höhe und Breite der Maxima und Minima und/oder derenmathematische Verknüpfung (Typ III; Fig. 2 c) oder das Integral der Intensitätsverteilung zur Aufnahme des Rasterbildes nach Typ

I (Fig. 2 a) oder die Höhe des Maximums zur Aufnahme von Rasterbildern des Types Il (Fig. 2 b) herangezogen.

Claims

1. Verfahren zur Lichtrastermikroskopie hoher Informationsgewinnung von Objektstrukturen, bei dem das Objekt nacheinander punktförmig vorzugsweise von einem Laser kurzer Wellenlänge beleuchtet wird und das von jedem beleuchteten Objektbereich ausgehende Licht von einem optoelektronischen Wandler mit vorgeschaltetei Blende aufgenommen und zur Bilddarstellung genutzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das von dem einzelnen beleuchteten Objektbereich ausgehende Licht hinsichtlich seiner Intensitätsverteilung in der Bildebene in einer oder mehreren Richtungen kontinuierlich oder in kleinen diskreten Schritten gemessen wird, aus der Intensitätsverteilung charakteristische Größen wie die Gesamtintensität, die Lage, Größe von Extreme und/oder die Breite von Peaks bestimmt und von einem Rechner verarbeitet werden, daß der Meßvorgang bei rechnergesteuerter Rasterung des Objektes von Punkt zu Punkt wiederholt wird und die jeweils erhaltenen charakteristischen Größen der Intensitätsverteilung zur Bilddarstellung genutzt werden.

2. Verfahren und Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die charakteristischen Größen und/oder deren mathematische Verknüpfung zur Grauwertdifferenzierung des Bildes des Objektbereiches genutzt werden und zum Vergleich mit bekannten Verfahren durch Bildung des Integrals der Intensitätsverteilung zur Gewinnung von Rasterbildern des Rastermikroskopes vom Typ I oder durch Ermittlung der Höhe des Intenshätsmaximums in der Strahlachse zur Gewinnung von Rasterbildern des Rastermikroskopes vom Typ Il herangezogen werden.

3. Verfahren und Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bewegung des Objektes oder des Strahles oder beider bei der Abrasterung des Objektes in Stufen oder bei höheren Geschwindigkeiten kontinuierlich erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Intensitätsverteilungen von Streustrahlungen gemessen werden, deren Wellenlänge infolge von inelastischen Wechselwirkungen der einfallenden Strahlung mit dem Objekt verändert sind, z. B. Fluoreszenzoder Ramanstrahlung.

5. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen dem abbildenden optischen System (4) und der Blende (2) des optoelektronischen Wandlers (3) ein elektronisch steuerbares optisches Ablenksystem (1) befindet, das aus einer akustooptischen oder elektrooptischen Zelle oder bei eindimensionaler Ablenkung vorzugsweise aus einem rotierenden Polygonprisma (1) besteht und daß die Blende (2), die sich in der Bildebene des abtastenden Systems befindet und über die das Bild des jeweils beleuchteten Objektbereiches gelenkt wird, eine Öffnungsweite hat, die kleiner ist als der Durchmesser des Bildes des Laserfokus auf dem Objekt.

6. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Polygonprisma (1) durch schwingende Ablenkelemente, wie z. B. lichtbrechende planparallele Körper oder Schwingspiegel ersetzt ist.

7. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Polygonprisma (1) durch einen gleichmäßig bewegten Drehspiegel ersetzt ist.

8. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polygonprisma zwecks 2 D-Darstellung der Streulichtkurve eines Objektbereiches mit geringfügig in Richtung der Drehachse angeschrägten Prismanflächen versehen ist.

9. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Ablenksystem, bestehend beispielsweise aus dem Polygonprisma (1), der Blende (2) und dem optoelektronischen Wandler (3), durch eine optoelektronische Empfängerzeile oder durch eine optoelektronische Empfängermatrix ersetzt und die lichtempfindliche Empfängerfläche in der Bildebene des Objektbereiches senkrecht zur Strahlachse angeordnet ist.

10. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Ablenksystem, bestehend beispielsweise aus dem Polygonprisma (1), die Blende (2) und der optoelektronische Wandler (3) durch e>ne TV-Aufnahmeeinrichtung, vorzugsweise mit Bildvorverstärker ersetzt und die optoelektronische Wandlerfläche in der Bildebene des Objektbereiches senkrecht zur Stahlachse angeordnet ist.

11. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 4 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß für Messungen von Streustrahlungen, deren Wellenlängen vom Objekt verändert sind, ein optischos Filter (5) oberhalb des halbdurchlässigen Spiegels (12) angeordnet ist.

12. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 7-11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Strahlteiler im Strahlengang des Laser angeordnet ist und die Teilstrahlen über optische Unterbrecher- und Umlenkvorrichtungen geführt sind, derart, daß das Mikroskop wahlweise im Auflicht oder im Durchlicht arbeitet.

13. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5-12, dadurch gekennzeichnet, daß das Objekt oder der Strahlfokus oder beide in Richtung der Achse des A bbildungssystems(z-Richtung) schrittweise zum Zwecke der Tiefonabtastung und rechnergesteuerten dreidimensionalen Bilddarstellung verschiebbar sind.

14. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5-13, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang des abbildenden Systems ein halbdurchlässiger Spiegel (6) und ein Okular (18) für eine herkömmliche lichtmikroskopische Beobachtung des Objektes im Durchlicht angeordnet sind, wenn das Objekt (7) mittels der Leuchte (21), des Kondensors (20), des halbdurchlässigen

- Spiegels (19) für die Abbildung mittels der Optik (4) gleichmäßig beleuchtet wird.