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TECHNISCHES GEBIET
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Diese
Erfindung betrifft im Allgemeinen ein Verfahren zum Fokussieren
von Licht für
optische Messungen in Volumenräume
und insbesondere ein automatisches Fokussierungssystem zur Verwendung
bei Messungen in Vertiefungen innerhalb Mikroplatten.
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STAND DER TECHNIK
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Zahlreiche
Forschungsanalysen verwenden Fluoreszenz, um ein interessierendes
Ziel zu identifizieren oder zu spezifizieren. Die Fluoreszenzerfassung
besitzt viele Anwendungen in der Serologie, Zytologie, Mikrobiologie
und Histopathologie. Ein Hauptvorteil der Verwendung der Fluoreszenz
sind die niedrigen Pegel, bei denen die Fluoreszenz erfasst werden
kann, was sehr empfindliche Tests ermöglicht. Ein zweiter Vorteil
bei der Verwendung von Fluoreszenz besteht darin, dass verschiedene
fluoreszierende Verbindungen verschiedene unterschiedliche Anregungs-
und Emissionswellenlängen aufweisen.
Dies ermöglicht
die Entwicklung eines Tests von mehreren Zielen in einer einzelnen
Probe, wobei der Test für
jedes interessierende Ziel einer anderen Wellenlänge als Marker zugeordnet ist.
Ein zusätzlicher
Vorteil besteht darin, dass die Fluoreszenz nicht die Verwendung
von Radioisotopen erfordert, was zu Reagenzien führt, die sowohl sicher zu verwenden
sind als auch leichter entsorgt werden können.
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Eine
Anwendung der Verwendung von Tests auf Fluoreszenzbasis besteht
im Aussondern von Verbindungen, um potentielle Pharmazeutika zu identifizieren.
Der Prozess der Arzneimittelentdeckung umfasst das Aussondern einer
riesigen Anzahl von Arzneimittelkandidaten, die durch kombinatorische
Chemie hergestellt werden, was eine äußerst große Anzahl von Tests erfordert.
Um diesen Prozess zu vereinfachen, werden die Testprozeduren häufig automatisiert.
Die Automatisierung erhöht
den Aussonderungsdurchsatz erheblich, was eine kosteneffizientere
Isolation von möglichen
neuen Arzneimitteln ermöglicht.
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Ein
Verfahren zum Automatisieren des Aussonderungsprozesses beinhaltet
die Einführung
von Proben in eine Mikroplattenvertiefung. Diese Vertiefungen sind
häufig
kleine, zylindrische Behälter,
die in Reihen in einer rechteckigen Matrix an einer Kunststoffprobenplatte
angeordnet sind. Üblicherweise verwendete
Mikroplatten weisen 96, 384 oder mehr Vertiefungen pro Platte auf.
Die automatisierte Handhabung dieser Platten ermöglicht einen höheren Durchsatz
beim Aussondern von Proben in Mikroplatten.
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Derzeit
erfassen Tests unter Verwendung von Mikroplatten und Fluoreszenz
die Emission bei einem zweidimensionalen Lesen von Mikroplattenvertiefungen.
Das
US-Pat. Nr. 5 589 351 lehrt beispielsweise
ein Fluoreszenzanalysesystem, das Licht erfasst, das von Vertiefungen
in einer Mikroplatte übertragen
wird. Das Licht von einer Vertiefung wird gesammelt und zu einem
Reflektor übertragen, der
nacheinander Licht auf einen einzelnen Detektor richtet. Dieses
System ermöglicht
das fortlaufende Lesen von Reihen von Vertiefungen. Das Lesen von Vertiefungen
wird zweidimensional durchgeführt,
wobei jede Vertiefung als einheitliche Quelle von emittiertem Licht
gelesen wird. Dies beseitigt die Fähigkeit, dass der Test eine
Information über
lokalisierte Ereignisse innerhalb der Vertiefung sammelt. Das
US-Pat. Nr. 5 784 152 lehrt
einen weiteren Mikroplattenleser, der eine Fluoreszenzemission erfasst.
In diesem Leser sind optische Elemente enthalten, um eine abstimmbare
Erfassung auf spezifische Wellenlängen zu ermöglichen. Die Erfassung wird
wieder auf eine zweidimensionale Weise durchgeführt.
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Das
dreidimensionale Lesen von Mikroplattenvertiefungen würde ermöglichen,
dass mehr Informationen gesammelt werden, während Mikroplatten verwendet
werden. Die anvisierte Fluoreszenz ist häufig am Boden der Mikroplattenvertiefungen
lokalisiert. Die Flüssigkeit
in den Mikroplattenvertiefungen enthält häufig zusätzliche ungebundene fluoreszierende
Reagenzien. In zweidimensionalen Standard- Mikroplatten-Fluoreszenztests ist die
Erfassung von Fluoreszenz am Boden einer Mikroplattenvertiefung
in einer homogenen Flüssigkeit
nicht möglich. Die
Fluoreszenzemission am Boden der Vertiefung würde durch die Hintergrundfluoreszenz,
die von den ungebundenen fluoreszierenden Verbindungen im Rest der
Tiefe der Vertiefung emittiert wird, verdeckt werden. Vereinfachte
Raster mit hohem Durchsatz würden
idealerweise die Erfassung der Bodenschicht in einer Vertiefung
ohne Entfernung der nicht zur Reaktion gebrachten fluoreszierenden
Reagenzien ermöglichen.
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Die
Fluoreszenz von der Bodenschicht einer Mikroplattenvertiefung erfassen
zu können,
erfordert die Fähigkeit,
automatisch auf eine dünne
Schicht am Boden der Vertiefung zu fokussieren, um die Fluoreszenzemission
anzuregen. Dies erfordert, dass die Lichtquelle auf eine Tiefe von
30 bis 150 Mikrometer am Boden der Mikroplattenvertiefung fokussieren kann.
Diese Tiefenschärfe
würde eine
virtuelle Kapillare am Boden der Vertiefung, eine Brennpunktschicht
mit der Fläche
des Vertiefungsbodens, aber eine Tiefe von nur 30 bis 150 Mikrometer
erzeugen.
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Die
Geometrie von Mikroplatten macht die Versuche, auf den Boden von
Mikroplattenvertiefungen zu fokussieren, kompliziert. Eine Standardbrennweite
wäre möglich, wenn
die Platten für
die optische Toleranz gleichmäßig wären. Der
Ort der Bodenfläche
einer Mikroplattenvertiefung ist jedoch bis auf Toleranzen von 30
bis 150 Mikrometer nicht gleichmäßig. Dieses
Problem zu beseitigen, erfordert die Entwicklung eines Verfahrens
zum genauen Auffinden des Bodens einer Mikroplattenvertiefung und
das Fokussieren auf diesen Ort. Bei einem System mit hohem Durchsatz
muss dieses Verfahren schnell und genau sein.
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Ein
bekanntes Verfahren zum Erfassen einer Bodenschicht in einer Mikroplatte
verwendet die Fluoreszenzerfassung, um optisch automatisch auf eine Zielschicht
innerhalb einer Mikroplattenvertiefung zu fokussieren. Wenn der
Brennpunkt von Laserlicht unter der Vertiefungsbasisoberseite liegt,
wird eine minimale Fluoreszenz erfasst. Wenn die Mikroplatte entlang
der z-Achse einer Mikroplattenvertiefung (die z-Achse ist die Längsachse der Mikroplattenvertiefung)
bewegt wird, beginnt der Brennpunkt an einem gewissen Punkt die
Vertiefungsbasisoberseite zu kreuzen. Das Licht vom Brennpunkt beginnt,
die Fluoreszenzemission von einigen der fluoreszierenden Verbindungen
in der Vertiefung anzuregen, wenn der Brennpunkt in die Vertiefung
eintritt. Wenn der ganze Brennpunkt über der Vertiefungsbasisoberseite
liegt, wird eine maximale Fluoreszenzintensität erreicht. 2 ist
ein Graph der Fluoreszenzintensität, wenn der Brennpunkt in die
Vertiefung bewegt wird. Der Beginn des maximalen Plateaus der Fluoreszenzintensität ist ein
Punkt am Ort der Platte, wenn sich der Brennpunkt vollständig über der
Vertiefungsbasisoberseite befindet. Dies wurde verwendet, um den Strahl
innerhalb der Mikroplattenvertiefung neu zu fokussieren. In der
Praxis hat sich jedoch dieses Verfahren als schwierig durchführbar erwiesen.
Die Zeit, die erforderlich ist, um eine graphische Fluoreszenzdarstellung
zu verwenden, um die Brennpunktanordnung innerhalb einer Vertiefung
zu ermitteln, ist für Anwendungen
mit hohem Durchsatz nicht schnell genug.
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Daher
ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung
bereitzustellen, die in der Lage sind, automatisch auf eine dünne Schicht am
Boden einer Mikroplattenvertiefung zu fokussieren. Die Fokussierungsprozedur
sollte schnell, genau und an die Fluoreszenzmessung in heterogenen Tests,
die ungebundene fluoreszierende Reagenzien enthalten, anpassbar
sein. Eine zusätzliche
Aufgabe der Erfindung besteht darin, das Fokussierverfahren verwenden
zu können,
um das Volumen der Flüssigkeit
innerhalb der Mikroplattenvertiefung zu ermitteln.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
obigen Aufgaben werden durch ein Verfahren und eine Vorrichtung
gelöst,
die einen fokussierten Lichtstrahl verwenden, um einen Bezugspunkt
an einer Mikroplatte wie z. B. den Ort der oberen Oberfläche der
Mikroplattenvertiefungsbasis, d. h. die Oberfläche, die den Boden der Vertiefung
definiert, optisch abzutasten und diesen Bezugsort zu verwenden,
um den Lichtstrahl erneut auf ein Ziel innerhalb der Mikroplattenvertiefung
zu fokussieren, das in einer definierten Beziehung zum Bezugsort angeordnet
ist. Eine Abtastung der Zielschicht ermöglicht einen Test einer dünnen Schicht
innerhalb einer Mikroplattenvertiefung ohne optische Störung von
Nicht-Ziel-Stellen innerhalb der Mikroplattenvertiefung, insbesondere
wenn Fluoreszenz verwendet wird, um Zielsubstanzen zu identifizieren.
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Bei
einem ersten Ausführungsbeispiel
wird dieses Verfahren durch Fokussieren eines Lichtstrahls in Richtung
der Materialgrenzfläche,
die an einer optisch erfassbaren Bezugsoberfläche an der Unterseite einer
Mikroplatte vorkommt, erreicht. Die Bezugsoberfläche wird dann relativ zum Brennpunkt des
Lichtstrahls bewegt. Wenn diese Bewegung stattfindet, wird eine
Spiegelreflexion von der Bezugsoberfläche aufgefangen und durch eine
Brennpunktblendenöffnung
auf einen Lichtdetektor gerichtet, wo die Intensität der Spiegelreflexion
gemessen wird. Eine Spitzenintensität wird gemessen, wenn sich
der Brennpunkt des Lichtstrahls auf der Bezugsoberfläche befindet,
was ermöglicht,
dass eine maximale Menge an Licht durch eine Brennpunktblendenöffnung und
auf einen Detektor gerichtet wird. Sobald der Ort der Bezugsoberfläche bekannt
ist, kann dieser Ort verwendet werden, um den Lichtstrahl auf eine
Zielschicht in der Mikroplattenvertiefung zu verschieben, wenn sich
die Zielschicht in einer bekannten Beziehung zur Bezugsoberfläche befindet.
Sobald der Brennpunkt auf die Zielschicht verschoben ist, wird die
Fluoreszenz angeregt und unter Verwendung einer Abtastung der Zielschicht
erfasst.
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Bei
einem alternativen Ausführungsbeispiel des
automatischen Fokussierverfahrens werden die Brennpunktblendenöffnung und
der Detektor gegen einen positionsempfindlichen Detektor ausgetauscht. Wieder
wird ein Brennpunkt eines Lichtstrahls auf eine Bezugsoberfläche an der
Unterseite einer Mikroplattenvertiefung gerichtet. Die Bezugsoberfläche wird
relativ zum Brennpunkt des Lichtstrahls bewegt, aber der Detektor
wird stationär
gehalten. Wenn diese Bewegung stattfindet, wird die Spiegelreflexion vom
Bezugsstandard auf den positionsempfindlichen Detektor mit einer
empfindlichen Fläche
gerichtet, die groß genug
ist, um den reflektierten Brennpunkt während seiner Bewegung abzubilden.
Der positionsempfindliche Detektor misst sowohl die Intensität des reflektierten
Lichts als auch die Position des reflektierten Lichts am Detektor.
Wie beim ersten Ausführungsbeispiel
korreliert die Messung der maximalen erfassten Lichtintensität damit,
wo sich der Brennpunkt auf der Bezugsoberfläche befindet. Wenn das Licht
die maximale Intensität
der gemessenen Spiegelreflexion erreicht, wird das Licht auch in
einer Position am positionsempfindlichen Detektor erfasst. Diese
Position am positionsempfindlichen Detektor ist der Ort, an dem
der Brennpunkt auf die Bezugsoberflächen gezielt wird. Sobald diese
Position am positionsempfindlichen Detektor bekannt ist, kann sie als
deterministischer Indikator zum Auffinden der Position der Bezugsoberfläche an anderen
Orten an der Mikroplatte verwendet werden. Sobald die Bezugsoberfläche aufgefunden
ist, wird sie wie beim ersten Ausführungsbeispiel verwendet, um
den Brennpunkt auf eine Zielschicht umzupositionieren, die anschließend optisch
abgetastet wird.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die optischen Elemente eines Fluoreszenzspektrometers mit automatischer
Fokussierfähigkeit
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2 zeigt
ein graphisches Ergebnis eines Fokussierverfahrens des Standes der
Technik.
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3a zeigt
die zum automatischen Fokussieren vorgesehenen optischen Elemente
von 1, die verwendet werden, um den Vertiefungsbasisboden
zu erfassen.
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3b zeigt
das optische System von 3a unter
Verwendung eines alternativen Detektors.
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3c zeigt
die zum automatischen Fokussieren vorgesehenen optischen Elemente
von 1, die verwendet werden, um die Vertiefungsbasisoberseite
zu erfassen.
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3d zeigt
die zum automatischen Fokussieren vorgesehenen optischen Elemente
von 1, die verwendet werden, um die Oberfläche der
Flüssigkeit
innerhalb einer Mikroplattenvertiefung zu erfassen.
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4 zeigt
einen Graphen der Spiegelreflexion von Licht, wenn der Boden einer
Mikroplattenvertiefung entlang der Längsachse der Vertiefung relativ
zu einem Brennpunkt eines Lichtstrahls bewegt wird.
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5 zeigt
einen zweiten Graphen der Intensität von reflektiertem Licht,
wenn die Basis einer Mikroplattenvertiefung entlang der Längsachse
der Vertiefung in Bezug auf einen Brennpunkt eines Lichtstrahls
bewegt wird.
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6 zeigt
einen Abschnitt einer Mikroplatte mit optisch erfassbaren Registrierungsmarkierungen.
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7 zeigt
optisch erfassbare Registrierungsmarkierungen eines Mikroplattenvertiefungsbodens,
die bei der Mikroplatte von 6 verwendet werden.
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8 stellt
einen Schaltplan der Schaltung dar, die bei dem positionsempfindlichen
Detektor von 3b verwendet wird.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Mit
Bezug auf 1 erzeugt ein Laser 10 einen
Laserstrahl 11. Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel wird ein Helium-Neon-Laser
verwendet. Dieser Laser kann kohärentes
Licht mit einer Wellenlänge
von 633 nm erzeugen. Die Verwendung von Licht mit dieser Wellenlänge ermöglicht eine
optimale Erfassung von fluoreszierenden Zielverbindungen in biologischen
Proben, da das Lichtabsorptionsvermögen von typischen biologischen
Proben unter dieser Wellenlänge
liegt, daher wird die Eigenfluoreszenz von den Proben minimiert.
Das Laserlicht 11 wird durch einen ersten Lenkspiegel 12 durch
eine erste Verschlussblende 22 gerichtet. Das Licht wird
als nächstes
durch einen zweiten Lenkspiegel 14 durch eine zweite Verschlussblende 24 gerichtet.
Die Verschlussblenden 22 und 24 sind enthalten,
um Lasersicherheitsanforderungen zu genügen. Nach dem Durchtritt durch
die zweite Verschlussblende 24 tritt das Laserlicht als
nächstes
durch ein Laserlinienfilter 26 hindurch. Das Laserlinienfilter
ist enthalten, um das Plasmaröhrenlicht
zu unterdrücken,
aber zu ermöglichen,
dass das Laserlicht durchgelassen wird. Dies ist erforderlich, da
das Plasmalicht das zu sammelnde Fluoreszenzlicht stört. Das
Laserlicht tritt durch das Laserlinienfilter 26 auf den
Strahlteiler 28. Der Strahlteiler 28 reflektiert
einiges des Lichts in den Laserleistungssensor 16. Der
Leistungssensor 16 überwacht
kontinuierlich die Leistung des Lasers und kann erfassen, wenn die
Lichtleistungsausgabe unter den Spezifikationsanforderungen liegt.
Außerdem würde die Überwachung
der Lichtleistung die Normierung der Lichtausgabe ermöglichen.
Das Laserlicht, das nicht durch den Strahlteiler 28 abgelenkt wird,
wird durch den Strahlteiler und durch die positive Kontraktionslinse 30 und
die negative Kontraktionslinse 32 durchgelassen. Diese
Linsen werden verwendet, um die Größe des Laserlichtstrahls zu formen,
um die erforderliche Brennpunktgröße auf der Zielmikroplattenvertiefung
zu erzeugen. Das Laserlicht wird dann durch den dichroitischen Laserteiler 34 auf
einen oszillierenden Galvanometerspiegel 36 gelenkt. Die
Bewegung des oszillierenden Galvanometerspiegels 36 erzeugt
eine Bewegung des Laserlichts entlang einer Achse. Das Licht wird
durch den oszillierenden Galvanometerspiegel 36 durch eine
Galvanometer-Übertragungslinse 38 gerichtet und
wird durch einen Übertragungsknickspiegel 56 durch
eine Objektivübertragungslinse 54 gelenkt,
die das Licht fokussiert. Der Zweck der Galvanometer-Übertragungslinse 38 und
der Objektivübertragungslinse 54 besteht
darin, das mit dem Laser beleuchtete Zentrum des Galvanometers auf
die Eintrittspupille der Objektivlinse abzubilden. Beim bevorzugten
Ausführungsbeispiel
lenkt der Übertragungsknickspiegel 56 das
Laserlicht 11 in einer Richtung derart, dass das Licht zu
der Ebene senkrecht ist, in der das Licht vorher gelenkt worden
war. Das Licht tritt als nächstes
durch das Objektiv 51 hindurch und trifft auf den Zielmikroplatten-Vertiefungsbasisboden 53.
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Dieses
optische System ermöglicht
die zweidimensionale Abtastung des Vertiefungsbasisbodens 53.
Der Galvanometerspiegel 36 ermöglicht die Bewegung des fokussierten
Lichts entlang einer Achse. Der Tisch (nicht dargestellt) zum Halten
der Mikroplatte 53 ermöglicht
eine Bewegung des fokussierten Lichts entlang einer anderen Achse.
Eine inkrementale Bewegung des Tischs erzeugt eine Rasterlinienabtastung
des Bodens der Mikrotiterplatte. Eine Rasterlinienabtastung der
Ebene einer dünnen
Zielschicht, die in einer Mikroplattenvertiefung enthalten ist,
ermöglicht
die Erfassung von Fluoreszenz über einen
großen
Oberflächenbereich
mit einer begrenzten Tiefenschärfe.
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Sobald
das Licht durch den Vertiefungsbasisboden 53 und in die
Mikroplattenvertiefung 55 gerichtet ist, kann das Licht
von zwei Quellen in Abhängigkeit
davon gesammelt werden, worauf der Brennpunkt des Lichts zielt.
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Zuerst
kann einiges des Laserlichts von der Spiegelreflexion von einer
gewissen Oberfläche
gesammelt werden, wo sich ein Materialübergang befindet, wie z. B.
der Übergang
von Luft zu Glas/Kunststoff am Vertiefungsbasisboden 53.
Dieses Licht wird durch das Objektiv 51 und die Objektivübertragungslinse 54 zurück reflektiert
und wird durch den Übertragungsknickspiegel 56 durch
eine Galvanometer-Übertragungslinse 38 gerichtet.
Das reflektierte Licht wird dann durch den Galvanometerspiegel 36 auf
den dichroitischen Laserteiler 34 gerichtet. Da dieses
Licht reflektiertes Licht ist, besitzt es dieselbe Wellenlänge wie
das ursprüngliche
Laserlicht 11 und tritt nicht durch den dichroitischen
Laserteiler 34 hindurch, sondern wird statt dessen durch
die negative Kontraktionslinse 32 und die positive Kontraktionslinse 30 auf
den Strahlteiler 28 gerichtet. Der Strahlteiler 28 lenkt
das spiegelreflektierte Laserlicht durch die Brennpunktsensorlinse 58 und
in Richtung der Blendenöffnung 50.
Das reflektierte Licht, das fokussiert wird, wird durch die Blendenöffnung 50 nicht
gestoppt und wird vom Sensor 52 erfasst. Dies wird mit Bezug
auf 3a, 3b, 3c und 3d weiter
erläutert.
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Zweitens
kann das Laserlicht in das Innere einer Vertiefung 55 an
der Mikroplatte 53 fokussiert werden. Innerhalb der Vertiefung
sind fluoreszierende Verbindungen enthalten, die durch Licht der
Wellenlänge
des Laserlichts 11 angeregt werden. Wenn das Laserlicht
auf die fluoreszierenden Verbindungen im Inneren der Mikroplattenvertiefung 55 gerichtet wird,
wird Fluoreszenzlicht mit einer bekannten Wellenlänge erzeugt.
Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel
sind die fluoreszierenden Verbindungen Cy5TM und
Cy5.5TM, Fluorophore, die von Amersham Life
Sciences, Inc., in Arlington Heights, Illinois, erhältlich sind
und die Fluoreszenzlicht maximal mit 670 nm bzw. 698 nm emittieren.
Dieses Licht wird emittiert und einiges tritt in das Objektiv 51 ein
und tritt durch die Objektivübertragungslinse 56 auf
den Übertragungsknickspiegel 56.
Das emittierte Fluoreszenzlicht wird durch die Galvanometer-Übertragungslinse 38 und
auf den Galvanometerspiegel 36 gerichtet, der das Fluoreszenzlicht
auf den dichroitischen Laserspiegel 34 richtet. Der dichroitische
Laserteiler 34 wird so ausgewählt, dass er Licht mit der Wellenlänge des
Laserlichts reflektiert, aber Licht mit der Wellenlänge der
Fluoreszenzemission durchlässt.
Das Fluoreszenzlicht, das durch den dichroitischen Laserteiler 34 hindurch
tritt, tritt dann in ein Langpassfilter 40 ein. Das Langpassfilter
unterdrückt jegliches
Laserlicht, das durch den dichroitischen Laserteiler 34 hindurchgetreten
ist. Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel
lässt das
Langpassfilter 40 Licht hindurch, das eine Wellenlänge über 645
nm aufweist, und unterdrückt
niedrigere Lichtwellenlängen. Das
Fluoreszenzlicht wird dann durch den Knickspiegel 42 durch
die Raumfilterlinse 44 gerichtet, die das Fluoreszenzlicht
durch die Blendenöffnung 46 fokussiert.
Die Blendenöffnung
blockiert Strahlen der Fluoreszenzemission, die außerhalb
des interessierenden Sammelvolumens entstehen. Das Fluoreszenzlicht,
das durch die Blendenöffnung 46 hindurch
tritt, wird dann durch das dichroitische Fluoreszenzfilter 48 gelenkt,
das das Licht in zwei Kanäle
spaltet. Licht unterhalb 680 nm wird durch das dichroitische Fluoreszenzfilter 48 auf
eine Photovervielfacherröhre 62 reflektiert,
die Fluoreszenzlicht erfasst. Licht über der Grenze von 680 nm tritt
durch das dichroitische Fluoreszenzfilter 48 hindurch und
wird durch die Photovervielfacherröhre 64 erfasst.
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Homogene
Tests erfordern die Begrenzung der Tiefenschärfe der Abtastung einer Mikroplattenvertiefung
auf eine dünne
Zielschicht, die innerhalb der Mikroplattenvertiefung vorgesehen
ist. Zielzellen oder Fluoreszenzkügelchen befinden sich häufig am Boden
einer Mikroplattenvertiefung. Dies ist ein Ergebnis entweder der
Bindung des Ziels an irgendeine Verbindung, die mit dem Vertiefungsboden
verbunden ist, oder ist das Ergebnis von Schwerkraftabsetzung. Nicht
zur Reaktion gebrachte fluoreszierende Verbindungen, die in Lösung bleiben,
würden
gewöhnlich
die lokalisierte Erfassung von Fluoreszenz von einer spezifischen
Zielschicht innerhalb einer Mikroplattenvertiefung verhindern. Die
Hintergrundfluoreszenz von nicht zur Reaktion gebrachten fluoreszierenden
Verbindungen würde
die Fluoreszenz von einer Zielschicht in einer Mikroplattenvertiefung
effektiv unerfassbar machen. Es ist erforderlich, die Zielschicht
in der Mikroplattenvertiefung aufzufinden und einen Lichtstrahl
auf diesen Ort zu fokussieren. Dies verhindert die Beleuchtung und
Fluoreszenzemission von dem Bereich der Vertiefung, der nicht das
Ziel ist. Die erforderliche Tiefenschärfe liegt im Bereich von 30
bis 150 Mikrometer von der Bodenoberfläche einer Mikroplattenvertiefung.
Da Mikroplatten nicht so ausgelegt sind, dass sie auf diese Toleranzen
optisch flach sind, muss es ein gewisses Verfahren zur automatischen
Erfassung eines Bezugspunkts geben, der eine bekannte Beziehung
zur Zielschicht aufweist.
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Ein
Hauptausführungsbeispiel
der optischen automatischen Fokussierung ist in den 3a, 3c und 3d gezeigt. 3a zeigt
die zur automatischen Fokussierung vorgesehenen Elemente von 1,
die verwendet werden, um den Vertiefungsbasisboden 114 einer
Mikroplattenvertiefungsbasis zu erfassen. Eine Mikroplattenvertiefung
ist durch Wände
gebildet, die sich von der Oberseite der Mikroplatte nach unten
erstrecken. Die Basis der Vertiefung ist durch eine Schicht aus
transparentem Glas- oder Kunststoffmaterial gebildet. Eine obere Vertiefungsbasisoberfläche der
Vertiefungsbasis ist dem offenen oberen Ende der Vertiefungen zugewandt.
Eine Bodenoberfläche
der Vertiefungsbasis dieser Vertiefungsbasis ist von der offenen
Unterseite der Mikroplatte nach unten gewandt. Die Zielzellen 120 haben
sich durch Schwerkraft am Boden der Flüssigkeit in einer Mikroplattenvertiefung
abgesetzt. Die Schicht aus Kunststoff oder Glas, die die Vertiefungsbasis
bildet, besitzt eine Vertiefungsbasisoberseite 116, wo
sich die Zielzellen abgesetzt haben, und einen Vertiefungsbasisboden 114.
Ein Strahl von Laserlicht 110 wird durch den Strahlteiler 124 gerichtet
und wird durch die Linse 112 in einen Brennpunkt fokussiert.
Dieser Brennpunkt wird in Richtung des Vertiefungsbasisbodens 114 gerichtet.
Einiges des Lichts, das in Richtung des Vertiefungsbasisbodens 114 gerichtet
wird, wird durch Spiegelreflexion in Richtung der Linse 112 zurück reflektiert.
Dieses Licht wird durch den Strahlteiler 124 durch die
Brennpunktsensorlinse 128 und in Richtung der Brennpunktsensorblendenöffnung 132 gerichtet.
Die Brennpunktsensorblendenöffnung
wirkt als Blende für
Licht, das nicht fokussiert wird. Durch Ändern der Größe dieser
Blendenöffnung
kann die Größe des Brennpunkts
angepasst werden. Das Licht, das durch die Brennpunktsensorblendenöffnung 132 hindurch
tritt, wird vom Brennpunktsensor 136 erfasst. Dieser Brennpunktsensor
könnte
eine Photodiode oder eine andere Vorrichtung sein, die die Intensität des reflektierten
Lichts misst. Um den Ort des Vertiefungsbasisbodens 114 zu
ermitteln, wird die Mikrotiterplatte entlang der Längsachse
einer Mikroplattenvertiefung bewegt. Dies führt zur Bewegung des Brennpunkts
entlang dieser Achse. Wenn sich der Brennpunkt des Strahls nicht
am Vertiefungsbasisboden 114 befindet, wird die Spiegelreflexion
vom Vertiefungsbasisboden 114 breiter gestreut. Dieses
gestreute Licht wird durch die Brennpunktsensorblendenöffnung 132 gestoppt,
was dazu führt,
dass weniger Licht vom Detektor 136 erfasst wird. Wenn
dagegen die Einschnürung
des fokussierten Strahls am Vertiefungsbasisboden 114 liegt,
wird die Spiegelreflexion vom Vertiefungsbasisboden 114 weniger
gestreut. Dies führt
dazu, dass mehr Licht durch die Brennpunktsensorblendenöffnung 132 hindurch
tritt, wo das Licht vom Detektor 136 erfasst wird. 4 stellt
die Intensität
des erfassten Lichts, wenn der Vertiefungsbasisboden 114 entlang
der Z-Achse bewegt wird, relativ zur Einschnürung des fokussierten Lichtstrahls
graphisch dar. In der Position 5 auf der z-Achse liegt
der Brennpunkt des Strahls unter dem Vertiefungsbasisboden der Platte
und wenig Licht wird durch die Brennpunktsensorblendenöffnung fokussiert.
Wenn die Mikroplatte entlang der z-Achse bewegt wird und der Brennpunkt
des Strahls näher an
den Vertiefungsbasisboden kommt, wird mehr Spiegelreflexion vom
Vertiefungsbasisboden erfasst. Nahe der Position 5,4 auf der z-Achse
wird die maximale Intensität
der Spiegelreflexion erreicht. Dies geschieht, wenn der Brennpunkt
des Lichtstrahls auf den Vertiefungsbasisboden 114 fokussiert
wird. Wenn die Mikroplatte entlang der z-Achse bewegt wird, nimmt
die Intensität
der Spiegelreflexion ab, wenn sich der Brennpunkt des Strahls in
das Innere der Vertiefungsbasis bewegt. Unter Verwendung dieses
Verfahrens kann der Ort entlang der z-Achse, auf den der Brennpunkt
des Strahls am Vertiefungsbasisboden 114 fokussiert wird,
ermittelt werden. Dieser Ort wird dann als Bezugspunkt für das Verschieben
des Brennpunkts des Lichtstrahls zu einer Zielschicht in der Mikroplattenvertiefung
verwendet. Der Abstand zwischen dem Vertiefungsbasisboden 114 und
der Vertiefungsbasisoberseite 116 ist die Dicke des Kunststoff-
oder Glasmaterials, das die Vertiefungsbasis bildet. Die Abmessung
dieser Dicke ist vom Hersteller der Mikroplatte erhältlich.
Die Einschnürung
des Lichtstrahls kann bis direkt über die Vertiefungsbasisoberseite 116 bewegt
werden, um zelluläre
Ziele 120 aufzufinden. Das optische System kann dann eine
Abtastung der Zielschichten durchführen.
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Das
in Bezug auf 3a beschriebene Verfahren zur
automatischen Fokussierung erfordert, dass die Längsachse des fokussierten Lichtstrahls zum
Vertiefungsbasisboden 114 des Mikroplattenvertiefungsbodens
im Wesentlichen senkrecht ist. Dies wird bewirkt, indem der Galvanometer-Übertragungsspiegel 36 zentriert
und der Spiegel stationär gehalten
wird. Das Licht wird dann durch die Linse 112 senkrecht
zum Vertiefungsbasisboden 114 fokussiert.
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Bei
einem alternativen Ausführungsbeispiel, das
in 3b zu sehen ist, ermöglicht der Austausch des Detektors
zusätzliche
Merkmale im System zum automatischen Fokussieren. Bei diesem Ausführungsbeispiel
tritt Laserlicht 110 durch den Strahlteiler 124 und
auf den Galvanometer-Übertragungsspiegel 142.
Bei diesem Ausführungsbeispiel
ist der Galvanometer-Übertragungsspiegel 142 nicht
zentriert, sondern wird in eine feste Position bewegt, so dass der
Laserstrahl 110 in einem nicht-senkrechten Winkel in Bezug auf den
Vertiefungsbasisboden 114 gerichtet wird, und wird wieder
stationär
gehalten. Folglich wird das Laserlicht 110 durch die Linse 112 und
auf den Vertiefungsbasisboden 114 gerichtet, so dass die
Längsachse
des Laserlichts zum Vertiefungsbasisboden 114 nicht senkrecht
ist, sondern statt dessen in einem nicht-rechten Winkel in Bezug auf
den Vertiefungsbasisboden 114 gerichtet wird. Das Laserlicht 110 wird
durch den Vertiefungsbasisboden 114 durch Spiegelreflexion
reflektiert, die reflektiertes Licht 126 erzeugt. Dieses
Licht tritt durch die Linse 112 hindurch und wird durch
den Galvanometer-Übertragungsspiegel 142 auf
den Strahlteiler 124 gerichtet. Da das reflektierte Licht 126 dieselbe Wellenlänge wie
das ursprüngliche
Laserlicht 110 aufweist, tritt das Licht nicht durch den
Strahlteiler 124 hindurch, sondern wird statt dessen durch
die Brennpunktsensorlinse 128 auf den positionsempfindlichen
Detektor 140 gerichtet.
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Ein
Beispiel eines positionsempfindlichen Detektors (PSD) ist eine Siliziumphotodiode,
die ein analoges Ausgangssignal erzeugt, das zur Position eines
Lichtflecks auf dem optisch empfindlichen Streifen des Detektors
direkt proportional ist. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung
der Lichtintensität
und der Lichtposition am Detektor. Wenn das Licht auf die Photodiode
auftrifft, wird ein photoelektrischer Strom erzeugt. Der durch das
einfallende Licht erzeugte photoelektrische Strom ist ein Eingangsstrom,
der in zwei Ausgangsströme
aufgeteilt wird. Die Verteilung der Ausgangsströme auf dem optisch empfindlichen
Streifen gibt die Lichtposition am Detektor an. Die Summe des Ausgangstroms
gibt die Lichtintensität
an.
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Die
Messung der Lichtintensität
wird in der gleichen Weise verwendet, wie in 3a zu
sehen. Um den Ort einer Oberfläche
an der Unterseite einer Mikroplatte zu ermitteln, wird der Vertiefungsbasisboden 114 relativ
zum Brennpunkt des Strahls bewegt. Dies bewirkt, dass sich der Brennpunkt
von unter dem Vertiefungsbasisboden 114 auf den Vertiefungsbasisboden 114 bewegt.
Wenn die geschieht, nimmt die Intensität von Licht, die durch den
PSD erfasst wird, zu, da der immer kleinere Lichtfleck ermöglicht, dass
mehr Licht innerhalb der Breite des lichtempfindlichen Elements
am PSD auftrifft. An der Lichtintensitätsspitze ist die Einschnürung des
Strahls auf den Vertiefungsbasisboden 114 fokussiert. Dies
kann wieder als Bezugsstelle für
die Verschiebung der Einschnürung
des Strahls auf eine Zielschicht innerhalb der Mikroplattenvertiefung
verwendet werden. Wenn sich der Brennpunkt von unter dem Vertiefungsbasisboden 114 auf
diese Oberfläche
und dann in die Vertiefungsbasis bewegt, bildet die Intensität des reflektierten
Lichts wieder eine Gauß-Kurve
mit einer ähnlichen
Form zu der in 4 gezeigten Kurve. Bei der Spitze
der Kurve liegt die Intensität
des reflektierten Lichts auf einem Maximum, das darauf hinweist,
dass sich der Brennpunkt am Vertiefungsbasisboden 114 befindet.
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Die
Breite des lichtempfindlichen Streifens am PSD 140 legt
fest, welche optische Konfiguration bei dem PSD 140 verwendet
wird. Wenn die Breite des Streifens sehr schmal ist, kann eine Blendenöffnung zwischen
der Brennpunktsensorlinse 128 und dem PSD 140 angeordnet
werden. Die Blendenöffnung
fungiert als Blende für
unfokussiertes Licht, was eine Gauß-Kurve erzeugt, wenn sich
der Brennpunkt auf den Vertiefungsbasisboden 114 und von
diesem weg bewegt. Wenn dagegen die Breite des lichtempfindlichen
Streifens am PSD breit ist, könnte
der PSD 140 ohne Brennpunktsensorlinse 128 verwendet werden.
Die Intensität
des Lichts wird gemessen, wenn die Spiegelreflexion kollimiert wird,
wenn es auf den Vertiefungsbasisboden 114 fokussiert wird.
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Zusätzlich zur
Intensität
von Licht misst der PSD auch den Ort des Lichts entlang der lichtempfindlichen
Länge des
PSD. Da das Licht in einem nicht-rechten Winkel in Bezug auf den
Vertiefungsbasisboden 114 gerichtet wird, ändert die
Bewegung des Vertiefungsbasisbodens 114 relativ zur Einschnürung des
Lichtstrahls, wo das Zentrum des fokussierten Strahls unter der
Oberfläche 114 auftrifft. Dies ändert wiederum,
wo das reflektierte Licht entlang der Länge der lichtempfindlichen
Länge des PSD
auftrifft. Folglich bewegt sich das Licht entlang der Länge des
PSD, wenn der Vertiefungsbasisboden 114 relativ zum Brennpunkt
bewegt wird. Der Punkt, an dem sich der Brennpunkt am Vertiefungsbasisboden 114 befindet,
entspricht Licht, das auf einen Ort am PSD auftrifft. Das Licht
bewegt sich von diesem Ort in einer Richtung entlang des PSD weg, wenn
der Brennpunkt unter den Vertiefungsbasisboden 114 bewegt
wird, und das Licht bewegt sich in der anderen Richtung von diesem
Ort weg, wenn der Brennpunkt über
den Vertiefungsbasisboden 114 bewegt wird.
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Die
Verwendung des PSD für
das Fokussieren auf eine Zielschicht innerhalb einer Mikroplattenvertiefung
erfordert zuerst die Messung sowohl der Intensität von reflektiertem Licht als
auch der Position des reflektierten Lichts am PSD, wenn die Mikroplatte entlang
der z-Achse bewegt wird. Die Spitzenintensität entspricht dem Ort, an dem
sich der Brennpunkt am Vertiefungsbasisboden befindet. Dies erfordert einen
Bewegungsbereich entlang der z-Achse für eine Mikroplattenvertiefung.
Sobald diese Messungen für
eine Mikroplattenvertiefung durchgeführt sind, ist der Ort entlang
der Länge
des PSD, der der Messung für
die Spitzenlichtintensität
entspricht, bekannt. Sobald dieser Ort bekannt wird, wird er zu
einer Bezugsmessung, die eine deterministische automatische Fokussierung
für andere
Vertiefungen an der Mikroplatte ermöglicht. Für jede andere Vertiefung an
der Platte entspricht eine einzelne Messung der Spiegelreflexion
entlang der z-Achse einem Ort entlang der lichtempfindlichen Länge des
PSD. Dieser Ort entlang des PSD kann mit der Position entlang des
PSD verglichen werden, die als Intensitätsspitze bekannt ist. Dies
gibt sowohl die Richtung als auch das Ausmaß an, in die bzw. um das der
Boden bewegt werden muss, um die Einschnürung des Strahls auf den Vertiefungsbasisboden
zu fokussieren.
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Eine
Schaltung wird bei dem PSD verwendet, um die relevanten Messungen
durchzuführen. Mit
Bezug auf die optische Positionsabtast-Erfassungsschaltung von 8 trifft
Licht auf eine Siliziumphotodiode 160 auf, die ein analoges
Ausgangssignal liefert, das zur Position eines Lichtflecks auf der optisch
aktiven Fläche
des Detektors direkt proportional ist. Ausgangssignale werden an
den Elektroden 161 und 162 entnommen. Das Ausgangssignal
aus der Elektrode 161 wird dem Operationsverstärker 170 zugeführt, während das
Ausgangssignal aus der Elektrode 162 dem Operationsverstärker 172 in
einem zum Operationsverstärker 170 parallelen
Weg zugeführt
wird. Die zwei Operationsverstärker
liegen in parallelen symmetrischen Wegen, die kreuzgekoppelt sind.
Der Operationsverstärker 170 ist
mit einem Eingang des Operationsverstärkers 192 kreuzgekoppelt,
der auch ein Eingangssignal vom Operationsverstärker 172 empfängt. Der
Operationsverstärker 190 ist
mit dem Operationsverstärker 172 kreuzgekoppelt,
der auch ein Eingangssignal vom Operationsverstärker 170 empfängt. Auf
diese Weise werden die Signale sowohl addiert als auch subtrahiert, so
dass im oberen Kanal durch geeignete Eingangssignale des Operationsverstärkers 190 das
Ausgangssignal des Operationsverstärkers 190 ein subtraktives
Signal X1 – X2
ist, während
im unteren Kanal das Ausgangssignal des Operationsverstärkers 192 ein
additives Signal X1 + X2 ist. Diese zwei kombinierten Signale werden
einem analogen Dividierer 196 zugeführt, der das Verhältnis der
zwei Signale als X1 – X2/X1
+ X2 nimmt. Das Ausgangssignal des Operationsverstärkers 192,
X1 + X2, gibt die Intensitätsmessung
an. Das Ausgangssignal des analogen Dividierers 196 gibt
die Position von einfallendem Licht am Detektor an, die hinsichtlich
der Lichtintensität
normiert ist.
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3c stellt
ein alternatives optisches Verfahren zum automatischen Fokussieren
dar, das dem Auffinden einer Zielschicht in einer Mikroplattenvertiefung
dient. Bei diesem Verfahren wird der Brennpunkt in Richtung der
Vertiefungsbasisoberseite 116 gerichtet. Wie in 3a wird
die Spiegelreflexion von dieser Oberfläche aufgefangen und durch die
Brennpunktsensorblendenöffnung 132 fokussiert
und vom Brennpunktsensor 136 erfasst. Wie in 3a wird der
Brennpunkt entlang der z-Achse bewegt. Auch wie in 3a tritt
die maximale Intensität
der Spiegelreflexion auf, wenn sich der Brennpunkt des Strahls an
der Vertiefungsbasisoberseite 116 befindet. Diese Oberfläche kann
wieder als Bezugspunkt für
das Auffinden der Schicht, die das interessierende Ziel enthält, verwendet
werden. 5 stellt die Intensitätsprofile
dar, die vom Vertiefungsbasisboden und von der Vertiefungsbasisoberseite
erfasst werden, wenn eine Vertiefungsbasis relativ zu einem Brennpunkt
eines Lichtstrahls bewegt wird. Die größere Intensitätsspitze
bei etwa 20,5 ist die Spiegelreflexion vom Vertiefungsbasisboden.
Die kleinere zweite Spitze bei etwa 21,4 ist die Reflexion von der
Vertiefungsbasisoberseite. Diese zweite Spitze ist viel kleiner
als die erste Spitze, was auf eine viel geringere Spiegelreflexion
von der Vertiefungsbasisoberseite hindeutet. Dies ist ein Ergebnis
des niedrigeren Reflexionsindex.
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Der
niedrigere Reflexionsindex ist ein Ergebnis der verschiedenen Übergänge von
einem Material zum anderen. Die Menge an Licht, das durch Spiegelreflexion
erzeugt wird, ist durch die Formel festgelegt: =
(N – N')2/(N
+ N')2
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N
ist der Reflexionsindex des ersten Materials, das das Licht durchläuft.
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N' ist der Reflexionsindex
des zweiten Materials, das das Licht durchläuft.
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Aus
dieser Formel ist zu sehen, dass die Spiegelreflexion für Übergänge zwischen
Materialien mit Brechungsindizes, die weiter auseinander liegen, größer ist.
Der Vertiefungsbasisboden der Mikroplattenvertiefungsbasis ist ein Übergang
von Luft mit einem Reflexionsindex von 1 zu Kunststoff oder Glas mit
einem Reflexionsindex von 1,47 bis 1,5. Die relativ große Differenz
zwischen diesen zwei Reflexionsindizes erzeugt die Spiegelreflexion,
wie bei der Intensitätsspitze
bei 20,5 zu sehen, die in 5 dargestellt
ist. Dagegen ist die Vertiefungsbasisoberseite der Mikroplattenvertiefungsbasis
ein Übergang
von Kunststoff mit einem Reflexionsindex von 1,47 zu einer Flüssigkeit,
die innerhalb der Vertiefung enthalten ist, mit einem Brechungsindex
von 1,33. Die relativ kleine Differenz zwischen den Reflexionsindizes
erzeugt die viel kleinere Intensitätsspitze bei 21,4, die in 5 zu
sehen ist. Bei einigen Mikroplatten reicht die optische Qualität der verwendeten
Materialien nicht aus, um die Intensitätsspitze von der Spiegelreflexion
von der Vertiefungsbasisoberseite aufzulösen.
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Beschichtungen
können
zu einer Oberfläche hinzugefügt werden,
um den Reflexionsindex zu ändern
und die Erfassung der oberen Oberfläche durch die Spiegelreflexion
durchführbar
zu machen. Der Vertiefungsbasisboden könnte beispielsweise mit einer
Beschichtung überzogen
werden, um die Reflexion zu verringern. Die Antireflexbeschichtung
wird zum Vertiefungsbasisboden durch Vakuumaufdampfungsabscheidung
hinzugefügt.
Beispiele von Verbindungen, die für Antireflexbeschichtungen
verwendet werden, umfassen Magnesiumfluorid und Lanthantrifluorid.
Alternativ könnte
die obere Oberfläche
der Vertiefung mit einer Beschichtung überzogen werden, um die Reflexion
zu erhöhen.
Verbindungen zum Erhöhen
der Reflexion umfassen metallische Beschichtungen mit neutraler
Dichte, die auf der Vertiefungsbasisoberseite mit der gewünschten
Dicke im Vakuum abgeschieden werden können, um das gewünschte Ausmaß an Reflexion
vorzusehen.
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Ein
weiteres Verfahren zum optischen Fokussieren auf eine Zielschicht
in einer Mikroplattenvertiefung verwendet optisch erfassbare Merkmale, die
zur Unterseite einer Mikroplatte hinzugefügt werden und die als Bezugspunkt
für das
Auffinden der dünnen
Schicht in einer Mikroplattenvertiefung fungieren. 6 zeigt
einen Teil des Bodens der Mikroplatte 150 mit diesen Merkmalen.
Die optisch erfassbare Vertiefung 154 weist ein optisch
erfassbares Merkmal auf, das eine genaue Lokalisierung der Vertiefungsbasisoberseite
ermöglicht.
Sobald diese Oberfläche
erfasst wurde, wird sie als Bezugspunkt für die Erfassung der oberen
Oberfläche
der Vertiefung 152 verwendet, die nicht die optischen Merkmale
aufweist.
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Ein
Beispiel der optisch erfassbaren Registrierungsmarkierungen ist
in 7 gezeigt. 7 zeigt
die obere Oberfläche
eines Vertiefungsbodens, die physikalisch geändert wurde, so dass sie optisch erfassbar
ist. Die schattierten Abschnitte geben Bereiche der Oberfläche an,
die aufgeraut wurden, um die Reflexion von der Oberfläche zu verringern.
Die unschattierten Bereiche geben Bereiche an, die nicht aufgeraut
wurden und vergleichsweise höhere
Mengen an Spiegelreflexion aufweisen. Wenn der Brennpunkt auf die
optisch geänderte
Bodenoberfläche
fokussiert und über
die Oberfläche
abgetastet wird, besteht ein scharfer Übergang, wenn der Brennpunkt vom
rauen Bereich des Bodens zum nicht-rauen Bereich des Bodens der
Platte bewegt wird. Wenn der Punkt unfokussiert ist, ist der Übergang
weniger scharf.
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Die
optischen Bezugsmarkierungen können sich
am Vertiefungsbasisboden, an der Vertiefungsbasisoberseite oder
an einer anderen Stelle an der Unterseite einer Mikroplatte befinden,
solange diese Stelle eine definierte Beziehung zur Stelle der Vertiefungsbasis
aufweist. Die optisch erfassbare Referenz können die beschriebenen Ritzmarkierungen
sein oder könnten
alternativ Strichcodeangaben oder eine gemusterte Reflexionsbeschichtung
(wie z. B. die vorher beschriebenen Beschichtungen mit neutraler Dichte)
sein.
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3d zeigt
die zum automatischen Fokussieren vorgesehenen Elemente von 1,
die verwendet werden, um die Flüssigkeitsoberfläche 118 zu
erfassen. Sobald die Vertiefungsbasisoberseite 116 des
Bodens der Vertiefung aufgefunden ist, kann der Brennpunkt des Lichtstrahls
entlang der z-Achse in Richtung der Oberseite der Vertiefung bewegt
werden. Wenn der Brennpunkt nahe der Flüssigkeitsoberfläche liegt,
kann spiegelnd reflektiertes Licht durch den Brennpunktsensor 136 erfasst
werden. Wie bei den anderen Oberflächen nimmt, wenn der Brennpunkt
in Richtung der Oberfläche 118 bewegt wird,
die Intensität
des reflektierten Lichts bis zu einem Maximalpunkt zu, wenn sich
der Brennpunkt an der Flüssigkeitsoberfläche 118 befindet.
Sobald der Ort der Flüssigkeitsoberfläche 118 und
der Mikroplatten-Vertiefungsbasisoberseite 116 bekannt
sind, kann das Volumen der Flüssigkeit
in der Vertiefung berechnet werden, wenn die Geometrie der Vertiefung
bekannt ist.