CN101339129A - 基于固定光路系统的变视场扫描显微的方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于固定光路系统的变视场扫描显微方法及其装置。首先使用扩束系统对激光器输出的激光束进行均匀扩束，形成均匀激光束；再使用两维空间离散系统对均匀激光束作两维空间离散化处理，形成M×N束子光束；使M×N子光束依次经过准直透镜、扫描振镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜后聚焦到样品平台的样品上，在样品上形成激发荧光；荧光显微镜收集激发的荧光，经过双色镜反射和聚焦透镜聚焦到图像成像系统。利用振镜扫描和样品台跨越移动相结合，即通过改变振镜的扫描步长和扫描步数、以单元视场区域为步长移动样品台来改变被扫描的视场，实现大视场、低分辨率与小视场、高分辨率的灵活转换，满足不同的生物医学应用要求。

Description

基于固定光路系统的变视场扫描显微的方法及其装置

技术领域

本发明涉及荧光显微技术，尤其是涉及基于固定光路系统的变视场扫描显微的方法及其装置。

背景技术

荧光显微技术已经成为生命科学，尤其是细胞生物学研究的重要工具。近年来，随着生命科学的发展，对荧光显微技术也提出了越来越高的要求，激光技术、荧光探针标记技术、新型荧光探测技术和成像手段的不断发展，成为推动生命科学发展的重要动力。激光扫描共焦显微和多光子激发荧光显微技术可用于实现生物样品的高空间分辨三维成像。但它们共有的缺点是要对样品进行逐点扫描，因此成像速度低，不利于活体测量。目前有多种方法研究如何提高采集速度，例如增加荧光团浓度或激发光强度等，但这些受到所研究生物样品的限制，过高的荧光团浓度会干扰生物样品的正常功能，同时会对样品产生毒性，因此不利于生物学研究。

近年来发展起来的多焦点多光子显微技术(multifocal multiphotonmicroscopy，简称MMM)采用微透镜阵列、Nipkow盘、分光镜或衍射光学元件(diffractive optical element，简称DOE)等方法产生多个激发光点，对样品进行多焦点并行激发，并对荧光信号同时探测，使成像速度得到显著提高，不但可以实现生物样品的实时多光子激发显微成像，还可以用眼睛通过目镜直接观察。MMM技术是多光子激发荧光显微向高速三维成像发展的一个必然，这是因为它在提高成像速度的同时，也提高了多光子激发荧光显微对光源光能的利用率。多光子激发荧光显微技术所用光源一般是超短脉冲锁模激光器，如钛宝石锁模飞秒激光器，其所输出激光脉冲的宽度一般为100fs左右，重复频率大约80MHz，平均功率1-2W。而实际上，受样品非线性损伤的限制，传统的单点扫描多光子激发荧光显微为了达到足够的光子数密度所需的光功率大约为3-10mW。因此，对光能的利用率不足5％。而MMM技术将钛宝石锁模飞秒激光器发出的光脉冲分为空间上分离的多个子光束，提高了光能的利用率，而且，这种并行的测量过程并没有显著影响空间分辨率。目前，MMM技术已经用于生物样品的荧光寿命三维成像以及活体细胞的动态成像。

一般的激光扫描共焦显微镜，一旦物镜确定，其中间像面大小固定。如果取样像素数量不变，只需通过改变振镜扫描角度来控制扫描样品的区域，就可以按照不同的取样精度和放大倍率对样品进行观察，这是一种电子放大。但是，在MMM技术中采用阵列点并行扫描实现多焦点显微成像，由于产生阵列点的光学元件如微透镜阵列或DOE的光学特性参数是固定的，同时中间光学系统一般也是不变的，因此，如果采用传统的光栅型扫描方式和图像重构方法，就使扫描系统只能在特定的系统参数下工作，如特定的扫描区域、特定的分辨率、特定的物镜等。迄今所发展的MMM系统，都是针对固定的物镜配置而设计的，为了避免相邻光束之间产生串扰，相邻焦点间的距离一般在6-9μm。由于是阵列点扫描，MMM系统不可能实现单点扫描系统中的电子放大，因此其视场范围和分辨本领单一，限制了它在生命科学研究中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是弥补上述缺陷，提出一种基于固定光路系统的变视场扫描显微的方法以及一种基于固定光路系统的变视场扫描显微的装置。

本发明的技术问题通过以下技术方案予以解决。

这种基于固定光路系统的变视场扫描显微方法的特点在于包括以下步骤：

(1)使用扩束系统对激光器输出的高重复频率超短脉冲激光束进行均匀扩束，形成均匀激光束；

(2)使用两维空间离散系统对均匀激光束作两维空间离散化处理，形成M×N束子光束；

(3)使M×N子光束依次经过准直透镜、扫描振镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜后聚焦到放置在样品平台上的样品上，在样品的预定区域上形成荧光材料的两维分布的多光子激发荧光；

(4)荧光显微镜收集激发的荧光，依次经过双色镜反射和聚焦透镜聚焦到图像成像系统。

步骤(3)中通过样品平台在x-y平面的移动实现成像视场的移动，通过样品平台在z方向的移动，选择不同的测量深度并实现对样品的聚焦。

所述样品平台在x-y平面的移动是以单元视场区域为步长的移动。

步骤(3)中通过改变扫描振镜扫描步长，获得不同的空间分辨率。

所述M×N束子光束中，M＞1，N＞1。

所述激光器输出的高重复频率超短脉冲激光束的波长在700nm-1000nm范围内、重复频率在50MHz-500MHz范围内可调。

这种基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，包括激光器、扩束系统、两维空间离散系统、准直透镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜、样品平台、聚焦透镜和图像成像系统，激光器发出的激光依次经扩束系统、两维空间离散系统、准直透镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜聚焦在设置在样品平台上的样品上，样品上的荧光材料发出的荧光经双色镜反射、聚焦透镜聚焦到图像成像系统。

这种基于固定光路系统的变视场扫描显微装置的特点在于：还包括设置在准直透镜和反射镜间的扫描振镜；所述两维空间离散系统对激光器发出的激光束作两维空间离散化处理，形成M×N束子光束并穿过准直透镜后形成M×N束平行子光束；所述的扫描振镜对M×N束平行子光束进行步进扫描。

所述样品平台为微位移样品平台，所述微位移样品平台可以实现在x-y平面的移动和在z方向的移动，所述扫描振镜对M×N束平行子光束进行步长可变的步进扫描。

所述激光器为高重复频率超短脉冲激光器。

所述高重复频率超短脉冲激光器为钛宝石锁模飞秒激光器。

所述两维空间离散系统为微透镜阵列、Nipkow盘、分光镜、衍射光学元件的一种。

所述经过两维空间离散系统形成的M×N束子光束的M×N个焦点在两维空间离散系统的焦平面上等距排列。

所述荧光显微镜为多光子激发共焦显微镜。

所述图像成像系统为像增强型CCD相机，所述像增强型CCD相机包括CCD相机和像增强器，CCD相机和像增强器之间通过光学透镜或者光锥实现光耦合。

所述图像成像系统为像增强型CMOS相机，所述像增强型CMOS相机包括CMOS相机和像增强器，CMOS相机和像增强器之间通过光学透镜或者光锥实现光耦合。

还包括设置在分色镜和聚焦透镜之间的光路中的反射滤光片。

本实用新型与现有技术对比的有益效果是：

利用振镜扫描和样品台跨越移动相结合，通过改变振镜的扫描步长和扫描步数、通过样品台以单元视场区域为步长移动被扫描的视场，实现大视场、低分辨率与小视场、高分辨率的灵活转换，满足不同的生物医学应用要求。

附图说明

附图是本发明具体实施方式的测量装置系统图。

具体实施方式

本发明的一种基于固定光路系统的变视场扫描显微方法，包括以下步骤：

(1)使用钛宝石锁模飞秒激光器产生超短脉冲激光束，激光束的波长允许变化范围700-1000nm，重复频率变化范围50MHz-500MHz，但是每一次工作时的工作频率保持稳定。

(2)使用一对扩束透镜对激光器输出的高重复频率超短脉冲激光束进行均匀扩束，形成均匀激光束。

(3)使用微透镜阵列组成的两维空间离散系统对均匀激光束作两维空间离散化处理，形成M×N束子光束，该M×N束子光束为二维空间离散分布，其中M＞1，N＞1。

(4)使M×N束子光束依次经过准直透镜、扫描振镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜后聚焦到放置在样品平台上的样品上，在样品的预定区域上形成荧光材料的两维分布的多光子激发荧光。其中，通过准直透镜将M×N束子光束形成为M×N束平行子光束；通过扫描振镜对M×N束平行子光束进行步进扫描，并通过改变扫描振镜扫描步长，获得不同的扫描空间分辨率；通过样品平台在x-y平面以单元视场区域为步长的移动来实现对样品成像视场的移动；通过样品平台在z方向的移动，选择不同的测量深度并实现对样品的聚焦。

(5)荧光显微镜收集激发的荧光，依次经过双色镜反射、反射滤光片滤光和聚焦透镜聚焦到与计算机连接的像增强型CCD相机。

在上述方法中，可以首先以较低的分辨率，即扫描振镜使用较大的扫描步长，较少的图像采集帧数，并进行快速扫描，获得样品低放大倍数或低空间分辨率的图像；并结合样品台的成像视场区域移动，对样品大范围低分辨率快速扫描，得到由各个单元扫描区域重构图像；再对所感兴趣的具体区域，移动样品台至该区域，扫描振镜使用较小的扫描步长，以高分辨率对该区域进行精细扫描。以上可以实现大视场、低分辨率与小视场、高分辨率的灵活转换，满足不同的生物医学应用要求。

如附图所示的一种基于固定光路系统的变视场扫描显微的装置，包括钛宝石锁模飞秒激光器101、由扩束透镜102和103组成的扩束系统、微透镜阵列104、准直透镜106、扫描振镜107、反射镜108、双色镜109、荧光显微镜110、发射滤光片114、管镜115、像增强型CCD相机116、计算机117和微位移样品平台113。其中，钛宝石锁模飞秒激光器101可产生波长在700nm-1000nm范围内、重复频率在50MHz-500MHz范围内可调的激光束；微透镜阵列104组成两维空间离散系统，当然该两维空间离散系统也可以由Nipkow盘、分光镜或衍射光学元件组成；荧光显微镜110为多光子激发共焦显微镜，在700-1000nm光谱范围内都具有精密的空间分辨率；像增强型CCD相机116和计算机117组成图像成像系统，像增强型CCD相机116包括CCD相机和像增强器，CCD相机和像增强器之间通过光学透镜或者光锥实现光耦合。

钛宝石锁模飞秒激光器101为高重复频率超短光脉冲激光器，输出重复频率为76MHz，脉冲宽度为120fs的超短脉冲。该激光脉冲经一对扩束透镜102和103对激光束进行均匀扩束，形成均匀激光束。微透镜阵列104将均匀激光束作两维空间离散化处理，形成M×N个子光束并在其焦平面105上聚焦，M×N个子光束的M×N个焦点在焦平面105上等距排列，M×N个子光束穿过准直透镜106后形成M×N个平行子光束。

M×N个平行子光束经一对扫描振镜107后由反射镜108反射，再通过双色镜109进入倒置荧光显微镜110聚焦到样品111上。包含有荧光材料的样品111被M×N个平行子光束照明，被照射的两维分布的M×N个子离散点同时发出荧光，在112处产生两维空间离散的荧光点阵列图像。样品所发出的点阵列荧光被荧光显微镜110收集，经过双色镜109反射，再经过发射滤光片114后被聚焦透镜115成像到像增强型CCD相机116上；通过像增强型CCD相机116和与其连接的计算机117，并经过图像的软件重构和拼接，可以实时监测和记录样品111的荧光发射信息。

通过高精度三维微位移样品台113在x-y平面，即垂直于附图的平面，对单元成像区域大幅度跨越移动，可获得大的成像视场。通过微位移样品台113在z方向，即附图中的上下方向的微位移，可以实现对样品111的聚焦，并可选择不同深度进行荧光测量和成像。扫描振镜107实现对样品111的二维离散点同时扫描，对每个单元视场区域，采用步长可变的步进扫描，实现空间分辨率随采用不同的步长而改变的目的。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (18)

1.一种基于固定光路系统的变视场扫描显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)使用扩束系统对激光器输出的高重复频率超短脉冲激光束进行均匀扩束，形成均匀激光束；

(2)使用两维空间离散系统对均匀激光束作两维空间离散化处理，形成M×N束子光束；

(3)使M×N子光束依次经过准直透镜、扫描振镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜后聚焦到放置在样品平台上的样品上，在样品的预定区域上形成荧光材料的两维分布的多光子激发荧光；

(4)荧光显微镜收集激发的荧光，依次经过双色镜反射和聚焦透镜聚焦到图像成像系统。

2.如权利要求1所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微方法，其特征在于：

步骤(3)中通过样品平台在x-y平面的移动实现成像视场的移动，通过样品平台在z方向的移动，选择不同的测量深度并实现对样品的聚焦。

3.如权利要求2所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微方法，其特征在于：

所述样品平台在x-y平面的移动是以单元视场区域为步长的移动。

4.如权利要求3所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微方法，其特征在于：

步骤(3)中通过改变扫描振镜扫描步长和扫描步数，获得不同的空间分辨率。

5.如权利要求1所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微方法，其特征在于：

所述M×N束子光束中，M＞1，N＞1。

6.如权利要求1所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微方法，其特征在于：

所述激光器输出的高重复频率超短脉冲激光束的波长在700nm-1000nm范围内、重复频率在50MHz-500MHz范围内可调。

7.一种基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，包括激光器、扩束系统、两维空间离散系统、准直透镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜、样品平台、聚焦透镜和图像成像系统，激光器发出的激光依次经扩束系统、两维空间离散系统、准直透镜、反射镜、双色镜、荧光显微镜聚焦在设置在样品平台上的样品上，样品上的荧光材料发出的荧光经双色镜反射、聚焦透镜聚焦到图像成像系统，其特征在于：

还包括设置在准直透镜和反射镜间的扫描振镜；所述两维空间离散系统对激光器发出的激光束作两维空间离散化处理，形成M×N束子光束并穿过准直透镜后形成M×N束平行子光束；所述扫描振镜对M×N束平行子光束进行步进扫描。

8.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述样品平台为微位移样品平台，所述微位移样品平台可以实现在x-y平面的移动和在z方向的移动；所述扫描振镜对M×N束平行子光束进行步长可变的步进扫描。

9.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述激光器为高重复频率超短脉冲激光器。

10.如权利要求9所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述高重复频率超短脉冲激光器为钛宝石锁模飞秒激光器。

11.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述两维空间离散系统为微透镜阵列、Nipkow盘、分光镜、衍射光学元件的一种。

12.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述经过两维空间离散系统形成的M×N束子光束的M×N个焦点在两维空间离散系统的焦平面上等距排列。

13.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述荧光显微镜为多光子激发共焦显微镜。

14.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述图像成像系统包括像增强型CCD相机，所述像增强型CCD相机包括CCD相机和像增强器，CCD相机和像增强器之间通过光学透镜或者光锥实现光耦合。

15.如权利要求14所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述图像成像系统还包括与像增强型CCD相机相连接的计算机。

16.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述图像成像系统包括像增强型CMOS相机，所述像增强型CMOS相机包括CMOS相机和像增强器，CMOS相机和像增强器之间通过光学透镜或者光锥实现光耦合。

17.如权利要求16所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

所述图像成像系统还包括与像增强型CMOS相机相连接的计算机。

18.如权利要求7所述的基于固定光路系统的变视场扫描显微装置，其特征在于：

还包括设置在分色镜和聚焦透镜之间的光路中的反射滤光片。

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