JP3099063B2 - 多光子顕微鏡 - Google Patents
多光子顕微鏡Info
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- JP3099063B2 JP3099063B2 JP10373723A JP37372398A JP3099063B2 JP 3099063 B2 JP3099063 B2 JP 3099063B2 JP 10373723 A JP10373723 A JP 10373723A JP 37372398 A JP37372398 A JP 37372398A JP 3099063 B2 JP3099063 B2 JP 3099063B2
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- Japan
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- photon excitation
- laser
- excitation fluorescence
- incident
- photon
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、多焦点走査方式を
採用することにより単一焦点走査方式の多光子顕微鏡に
比べて格段に高い走査速度を実現して、動きのある試料
等のリアルタイム観察を可能にした、多光子顕微鏡に関
するものである。
採用することにより単一焦点走査方式の多光子顕微鏡に
比べて格段に高い走査速度を実現して、動きのある試料
等のリアルタイム観察を可能にした、多光子顕微鏡に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞工学等の医学的分野では、２
光子励起蛍光顕微鏡の試料観察への応用が注目されてい
る。２光子励起蛍光顕微鏡は、例えば、レーザ装置から
発せられたレーザ光を対物レンズにより試料観察面に結
像したときに発生する２光子励起蛍光を、対物レンズ、
ダイクロイックミラーおよび集光レンズを介してＣＣＤ
カメラ等の撮像手段に入射して２光子励起蛍光画像を撮
像し、得られた２光子励起蛍光画像をモニタ等に表示す
るように構成されている。この２光子励起蛍光顕微鏡
は、（１）試料観察面以外の蛍光色素の退色を防止する
ことができ、（２）散乱体内部の観察に有利である、と
いう長所を有している。
光子励起蛍光顕微鏡の試料観察への応用が注目されてい
る。２光子励起蛍光顕微鏡は、例えば、レーザ装置から
発せられたレーザ光を対物レンズにより試料観察面に結
像したときに発生する２光子励起蛍光を、対物レンズ、
ダイクロイックミラーおよび集光レンズを介してＣＣＤ
カメラ等の撮像手段に入射して２光子励起蛍光画像を撮
像し、得られた２光子励起蛍光画像をモニタ等に表示す
るように構成されている。この２光子励起蛍光顕微鏡
は、（１）試料観察面以外の蛍光色素の退色を防止する
ことができ、（２）散乱体内部の観察に有利である、と
いう長所を有している。
【０００３】このような従来の２光子励起蛍光顕微鏡に
おいては、試料全体の２光子励起蛍光画像を得るために
は、レーザ光を固定して試料を走査するステージ走査型
とするか、あるいは試料を固定してレーザ光を走査する
光束走査型とするかの何れかにする必要がある。ステー
ジ走査型の場合、試料を載置したステージ等をＸＹ方向
に移動する必要があるため、走査速度が光束走査型に比
べて遅くなり、この走査速度の遅さは試料の検索や焦点
合わせ等に支障をきたすこととが多い。そのため、近年
においては光束走査型が主流となってきている。
おいては、試料全体の２光子励起蛍光画像を得るために
は、レーザ光を固定して試料を走査するステージ走査型
とするか、あるいは試料を固定してレーザ光を走査する
光束走査型とするかの何れかにする必要がある。ステー
ジ走査型の場合、試料を載置したステージ等をＸＹ方向
に移動する必要があるため、走査速度が光束走査型に比
べて遅くなり、この走査速度の遅さは試料の検索や焦点
合わせ等に支障をきたすこととが多い。そのため、近年
においては光束走査型が主流となってきている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
た従来の光束走査型の２光子励起蛍光顕微鏡は、単一焦
点走査方式を採用していることから、レーザ走査法等に
より対物レンズの焦点を試料上でＸＹ方向に走査するこ
とによって２光子励起蛍光画像を得なければならないた
め、ビデオレート（１／３０秒）が限界フレームレート
となる（「先端レーザーテクノロジー」1992年11月30日
発行、日経技術図書株式会社、P224を参照のこと）。し
たがって、動きのある試料等のリアルタイム観察には適
しておらず、細胞内カルシウム波伝搬等の観察には適用
することができない。
た従来の光束走査型の２光子励起蛍光顕微鏡は、単一焦
点走査方式を採用していることから、レーザ走査法等に
より対物レンズの焦点を試料上でＸＹ方向に走査するこ
とによって２光子励起蛍光画像を得なければならないた
め、ビデオレート（１／３０秒）が限界フレームレート
となる（「先端レーザーテクノロジー」1992年11月30日
発行、日経技術図書株式会社、P224を参照のこと）。し
たがって、動きのある試料等のリアルタイム観察には適
しておらず、細胞内カルシウム波伝搬等の観察には適用
することができない。
【０００５】本発明は、上述した問題に着目してなされ
たものであり、従来の単一焦点走査方式の多光子顕微鏡
に比べて格段に高い走査速度を実現し得る、多焦点走査
方式の多光子顕微鏡を提供することを目的とする。
たものであり、従来の単一焦点走査方式の多光子顕微鏡
に比べて格段に高い走査速度を実現し得る、多焦点走査
方式の多光子顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この目的のため、請求項
１に記載の第１発明は、チタンサファイアレーザおよび
該チタンサファイアレーザから発せられたレーザ光のパ
ルスピークパワーを高増幅度で増幅する再生増幅器を具
備して成るレーザ装置と、入射側から順次配列される凹
レンズおよび凸レンズを具備して成り前記レーザ装置か
ら発せられたレーザ光のビーム幅を拡張するビーム拡張
器と、該ビーム拡張器を出射したレーザ光を多数のマイ
クロレンズが配置された入射面に垂直に入射されるマイ
クロレンズアレイと、該マイクロレンズアレイを経たレ
ーザ光を前記マイクロレンズと対応して配置されたピン
ホールにそれぞれ入射されるニポウディスクと、該ニポ
ウディスクを出射した後にリレーレンズを経て入射され
るレーザ光を試料観察面に結像して２光子励起蛍光を発
生させる対物レンズと、前記リレーレンズおよび対物レ
ンズ間に配置され前記試料観察面から前記対物レンズを
経て入射された２光子励起蛍光を反射させるダイクロイ
ックミラーと、該ダイクロイックミラーで反射された２
光子励起蛍光を集光レンズを介して入射されて２光子励
起蛍光画像を撮像する撮像手段と、該撮像手段により撮
像された２光子励起蛍光画像を表示する表示手段とを具
える多光子顕微鏡であって、前記マイクロレンズアレイ
およびニポウディスクを所定回転速度で同期回転駆動し
て前記試料観察面に形成される多数の焦点を走査するこ
とにより、ビデオレートよりも十分小さいフレームレー
トで２光子励起蛍光画像を得るようにしたことを特徴と
する。
１に記載の第１発明は、チタンサファイアレーザおよび
該チタンサファイアレーザから発せられたレーザ光のパ
ルスピークパワーを高増幅度で増幅する再生増幅器を具
備して成るレーザ装置と、入射側から順次配列される凹
レンズおよび凸レンズを具備して成り前記レーザ装置か
ら発せられたレーザ光のビーム幅を拡張するビーム拡張
器と、該ビーム拡張器を出射したレーザ光を多数のマイ
クロレンズが配置された入射面に垂直に入射されるマイ
クロレンズアレイと、該マイクロレンズアレイを経たレ
ーザ光を前記マイクロレンズと対応して配置されたピン
ホールにそれぞれ入射されるニポウディスクと、該ニポ
ウディスクを出射した後にリレーレンズを経て入射され
るレーザ光を試料観察面に結像して２光子励起蛍光を発
生させる対物レンズと、前記リレーレンズおよび対物レ
ンズ間に配置され前記試料観察面から前記対物レンズを
経て入射された２光子励起蛍光を反射させるダイクロイ
ックミラーと、該ダイクロイックミラーで反射された２
光子励起蛍光を集光レンズを介して入射されて２光子励
起蛍光画像を撮像する撮像手段と、該撮像手段により撮
像された２光子励起蛍光画像を表示する表示手段とを具
える多光子顕微鏡であって、前記マイクロレンズアレイ
およびニポウディスクを所定回転速度で同期回転駆動し
て前記試料観察面に形成される多数の焦点を走査するこ
とにより、ビデオレートよりも十分小さいフレームレー
トで２光子励起蛍光画像を得るようにしたことを特徴と
する。
【０００７】請求項２に記載の第２発明は、第１発明に
おける多数のマイクロレンズは、１回転当たり１２枚の
２光子励起蛍光画像を取得し得るように前記マイクロレ
ンズアレイの入射面に配置されていることを特徴とす
る。
おける多数のマイクロレンズは、１回転当たり１２枚の
２光子励起蛍光画像を取得し得るように前記マイクロレ
ンズアレイの入射面に配置されていることを特徴とす
る。
【０００８】請求項３に記載の第３発明は、第１または
第２発明における撮像手段は、入射された２光子励起蛍
光を増倍するイメージ増倍管と、該イメージ増倍管によ
り増倍された２光子励起蛍光を撮像して２光子励起蛍光
画像とするＣＣＤカメラとを具備して成ることを特徴と
する。
第２発明における撮像手段は、入射された２光子励起蛍
光を増倍するイメージ増倍管と、該イメージ増倍管によ
り増倍された２光子励起蛍光を撮像して２光子励起蛍光
画像とするＣＣＤカメラとを具備して成ることを特徴と
する。
【０００９】第１発明によれば、チタンサファイアレー
ザおよび再生増幅器を具備して成るレーザ装置におい
て、前記チタンサファイアレーザから発せられたレーザ
光は、前記再生増幅器によってそのパルスピークパワー
を高増幅度で増幅されて、高いパルスピークパワーを有
するレーザ光となる。この高いパルスピークパワーを有
するレーザ光は、入射側から順次配列される凹レンズお
よび凸レンズを具備して成るビーム拡張器に入射して、
ビーム幅が拡張されたレーザ光となる。
ザおよび再生増幅器を具備して成るレーザ装置におい
て、前記チタンサファイアレーザから発せられたレーザ
光は、前記再生増幅器によってそのパルスピークパワー
を高増幅度で増幅されて、高いパルスピークパワーを有
するレーザ光となる。この高いパルスピークパワーを有
するレーザ光は、入射側から順次配列される凹レンズお
よび凸レンズを具備して成るビーム拡張器に入射して、
ビーム幅が拡張されたレーザ光となる。
【００１０】上記のようにしてビーム幅が拡張された高
いパルスピークパワーを有するレーザ光は、前記ビーム
拡張器を出射してマイクロレンズアレイの入射面に配置
された多数のマイクロレンズに垂直に入射し、その後、
ニポウディスクの前記マイクロレンズと対応して配置さ
れたピンホールをそれぞれ透過して出射する。このニポ
ウディスクを出射したレーザ光は、リレーレンズを経て
対物レンズに入射し、該対物レンズにより試料観察面に
結像される。この結像により試料観察面から発せられる
２光子励起蛍光は、前記対物レンズを経て、前記リレー
レンズおよび対物レンズ間に配置されるダイクロイック
ミラーに入射されて反射した後、集光レンズを介して撮
像手段に入射され、撮像手段により撮像されて２光子励
起蛍光画像となって表示手段に表示される。
いパルスピークパワーを有するレーザ光は、前記ビーム
拡張器を出射してマイクロレンズアレイの入射面に配置
された多数のマイクロレンズに垂直に入射し、その後、
ニポウディスクの前記マイクロレンズと対応して配置さ
れたピンホールをそれぞれ透過して出射する。このニポ
ウディスクを出射したレーザ光は、リレーレンズを経て
対物レンズに入射し、該対物レンズにより試料観察面に
結像される。この結像により試料観察面から発せられる
２光子励起蛍光は、前記対物レンズを経て、前記リレー
レンズおよび対物レンズ間に配置されるダイクロイック
ミラーに入射されて反射した後、集光レンズを介して撮
像手段に入射され、撮像手段により撮像されて２光子励
起蛍光画像となって表示手段に表示される。
【００１１】その際、前記マイクロレンズアレイおよび
ニポウディスクを所定回転速度で同期回転駆動して前記
試料観察面に形成される多数の焦点を走査することによ
り、ビデオレートよりも十分小さいフレームレートで２
光子励起蛍光画像を得るようにしたから、単一焦点走査
方式の多光子顕微鏡における限界フレームレートである
ビデオレートよりも遙に小さいフレームレートを実現す
ることができ、細胞内カルシウム波伝搬等の動きのある
試料のリアルタイム観察が可能になる。
ニポウディスクを所定回転速度で同期回転駆動して前記
試料観察面に形成される多数の焦点を走査することによ
り、ビデオレートよりも十分小さいフレームレートで２
光子励起蛍光画像を得るようにしたから、単一焦点走査
方式の多光子顕微鏡における限界フレームレートである
ビデオレートよりも遙に小さいフレームレートを実現す
ることができ、細胞内カルシウム波伝搬等の動きのある
試料のリアルタイム観察が可能になる。
【００１２】また、第１発明によれば、多焦点走査にお
ける焦点数に応じて増加する対物レンズ入射レーザ光の
パワー増大要求を、単一焦点走査型の２光子励起蛍光顕
微鏡と同一の平均強度のチタンサファイアレーザに、高
増幅度の増幅が可能な再生増幅器を追加するだけで満足
させ、それにより多焦点における２光子励起を可能にし
ているため、コストアップを抑制することができる。ま
た、その際、ピークパワーを高増幅度で増幅されたパル
スレーザ光を用いることにより、同一平均強度を有する
チタンサファイアレーザのみを用いる場合の蛍光励起効
率に前記高増幅度を掛算した高い蛍光励起効率を実現す
ることができ、より明るい蛍光を発生させることができ
る。
ける焦点数に応じて増加する対物レンズ入射レーザ光の
パワー増大要求を、単一焦点走査型の２光子励起蛍光顕
微鏡と同一の平均強度のチタンサファイアレーザに、高
増幅度の増幅が可能な再生増幅器を追加するだけで満足
させ、それにより多焦点における２光子励起を可能にし
ているため、コストアップを抑制することができる。ま
た、その際、ピークパワーを高増幅度で増幅されたパル
スレーザ光を用いることにより、同一平均強度を有する
チタンサファイアレーザのみを用いる場合の蛍光励起効
率に前記高増幅度を掛算した高い蛍光励起効率を実現す
ることができ、より明るい蛍光を発生させることができ
る。
【００１３】第２発明によれば、前記マイクロレンズア
レイの入射面には、１回転当たり１２枚の２光子励起蛍
光画像を取得し得るように多数のマイクロレンズが配置
されているから、前記マイクロレンズアレイおよびニポ
ウディスクを所定回転速度で同期回転駆動することによ
り、前記試料観察面の多焦点走査を実現することがで
き、走査速度の高速化が可能になる。
レイの入射面には、１回転当たり１２枚の２光子励起蛍
光画像を取得し得るように多数のマイクロレンズが配置
されているから、前記マイクロレンズアレイおよびニポ
ウディスクを所定回転速度で同期回転駆動することによ
り、前記試料観察面の多焦点走査を実現することがで
き、走査速度の高速化が可能になる。
【００１４】第３発明によれば、前記撮像手段は、入射
された２光子励起蛍光を増倍するイメージ増倍管と、該
イメージ増倍管により増倍された２光子励起蛍光を撮像
して２光子励起蛍光画像とするＣＣＤカメラとを具備す
るから、入射された２光子励起蛍光をイメージ増倍管に
より増倍した後に撮像することにより所望の感度を実現
することが可能になる。
された２光子励起蛍光を増倍するイメージ増倍管と、該
イメージ増倍管により増倍された２光子励起蛍光を撮像
して２光子励起蛍光画像とするＣＣＤカメラとを具備す
るから、入射された２光子励起蛍光をイメージ増倍管に
より増倍した後に撮像することにより所望の感度を実現
することが可能になる。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図面
に基づき詳細に説明する。図１は本発明の多光子顕微鏡
の第１実施形態の構成を示すシステム図である。本実施
形態の多光子顕微鏡１は多焦点走査方式の２光子励起蛍
光顕微鏡として構成されており、その光学系は、図１に
示すように、レーザ装置２、ミラー３、ミラー４、ビー
ム拡張器５、マイクロレンズアレイ６、ニポウディスク
７、リレーレンズ８、対物レンズ９、ダイクロイックミ
ラー１０、集光レンズ１１，撮像手段１２および表示手
段としてのモニタ１３を具備して成る。なお、本実施形
態の多光子顕微鏡１の詳細については、本願発明者が先
に「1998年秋季 第59回応用物理学会学術講演会講演会
予稿集(JSAP Catalog Number:AP981129-03) 」に題名
「実時間観察可能なレーザー走査２光子励起蛍光顕微
鏡」として発表した論文を参照のこと。
に基づき詳細に説明する。図１は本発明の多光子顕微鏡
の第１実施形態の構成を示すシステム図である。本実施
形態の多光子顕微鏡１は多焦点走査方式の２光子励起蛍
光顕微鏡として構成されており、その光学系は、図１に
示すように、レーザ装置２、ミラー３、ミラー４、ビー
ム拡張器５、マイクロレンズアレイ６、ニポウディスク
７、リレーレンズ８、対物レンズ９、ダイクロイックミ
ラー１０、集光レンズ１１，撮像手段１２および表示手
段としてのモニタ１３を具備して成る。なお、本実施形
態の多光子顕微鏡１の詳細については、本願発明者が先
に「1998年秋季 第59回応用物理学会学術講演会講演会
予稿集(JSAP Catalog Number:AP981129-03) 」に題名
「実時間観察可能なレーザー走査２光子励起蛍光顕微
鏡」として発表した論文を参照のこと。
【００１６】上記レーザ装置２は、レーザ光源であるモ
ードロック型チタンサファイアレーザ（以下、チタンサ
ファイアレーザという）１４と、チタンサファイアレー
ザ１４から発せられたパルス状のレーザ光１５のパルス
ピークパワーを約８万倍の高増幅度で増幅する再生増幅
器１６とを具備して成り、増幅後のレーザ光１７を出射
する。このレーザ光源２では、後述する多焦点走査にお
ける焦点数に応じて増加する対物レンズ入射レーザ光の
パワー増大要求を満たすには従来の単一焦点走査型の２
光子励起蛍光顕微鏡で使用しているチタンサファイアレ
ーザの少なくとも１０００倍程度のレーザパワーが必要
であることを考慮して、チタンサファイアレーザ１４の
出射レーザ光１５を再生増幅器１６で約８万倍に増幅す
るようにしている。なお、上記チタンサファイアレーザ
１４は、１ＫＨｚ程度のレーザ出力周波数を有するもの
であれば、後述する２光子励起蛍光画像を取得すること
ができるが、１ＭＨｚ以上のレーザ出力周波数を有する
ものを用いるのが画質を向上させる上で好ましい。な
お、本実施形態では、チタンサファイアレーザ１４とし
て出力周波数＝８２ＭＨｚ、平均強度９００ｍＷ、ピー
ク強度６５ＫＷのものを用い、再生増幅器１６において
出力周波数＝１ｋＨｚ、平均強度９００ｍＷ、ピーク強
度５．２ＧＷを実現している。
ードロック型チタンサファイアレーザ（以下、チタンサ
ファイアレーザという）１４と、チタンサファイアレー
ザ１４から発せられたパルス状のレーザ光１５のパルス
ピークパワーを約８万倍の高増幅度で増幅する再生増幅
器１６とを具備して成り、増幅後のレーザ光１７を出射
する。このレーザ光源２では、後述する多焦点走査にお
ける焦点数に応じて増加する対物レンズ入射レーザ光の
パワー増大要求を満たすには従来の単一焦点走査型の２
光子励起蛍光顕微鏡で使用しているチタンサファイアレ
ーザの少なくとも１０００倍程度のレーザパワーが必要
であることを考慮して、チタンサファイアレーザ１４の
出射レーザ光１５を再生増幅器１６で約８万倍に増幅す
るようにしている。なお、上記チタンサファイアレーザ
１４は、１ＫＨｚ程度のレーザ出力周波数を有するもの
であれば、後述する２光子励起蛍光画像を取得すること
ができるが、１ＭＨｚ以上のレーザ出力周波数を有する
ものを用いるのが画質を向上させる上で好ましい。な
お、本実施形態では、チタンサファイアレーザ１４とし
て出力周波数＝８２ＭＨｚ、平均強度９００ｍＷ、ピー
ク強度６５ＫＷのものを用い、再生増幅器１６において
出力周波数＝１ｋＨｚ、平均強度９００ｍＷ、ピーク強
度５．２ＧＷを実現している。
【００１７】上記レーザ装置２から発せられたレーザ光
１７は、ミラー３およびミラー４により方向を１８０度
変えられてビーム拡張器５に入射する。ビーム拡張器５
は入射側から順次配列される凹レンズ１８および凸レン
ズ１９を具備して成り、入射されたレーザ光１７のビー
ム幅を拡張する。ビーム拡張器５により拡張されたレー
ザ光２０は、マイクロレンズアレイ６の入射面６ａに垂
直に入射する。
１７は、ミラー３およびミラー４により方向を１８０度
変えられてビーム拡張器５に入射する。ビーム拡張器５
は入射側から順次配列される凹レンズ１８および凸レン
ズ１９を具備して成り、入射されたレーザ光１７のビー
ム幅を拡張する。ビーム拡張器５により拡張されたレー
ザ光２０は、マイクロレンズアレイ６の入射面６ａに垂
直に入射する。
【００１８】上記マイクロレンズアレイ６の入射面６ａ
には、約２００００個のマイクロレンズ（図示せず）が
配置されている。これらマイクロレンズとしては、本実
施形態では、直径＝２５０μｍ、焦点距離＝１０ｍｍ、
開口数（ＮＡ）＝０．０１２５のものを用いている。な
お、これらマイクロレンズは、マイクロレンズアレイ６
の１回転の間に１２枚の顕微鏡像（２光子励起蛍光画
像）を取得し得るように配置されている（マイクロレン
ズの配置については、田名網健雄、小杉泰仁、杉山由美
子、磯崎克己、御厨健太、杉浦 端、根岸秀臣、柏原伸
也、市原 昭、「共焦点スキャナユニットＣＳＵ１０と
ピンホール配置法」、レーザー顕微鏡研究会第１７回講
演会論文集ｐ．４２（１９９６）を参照のこと）。
には、約２００００個のマイクロレンズ（図示せず）が
配置されている。これらマイクロレンズとしては、本実
施形態では、直径＝２５０μｍ、焦点距離＝１０ｍｍ、
開口数（ＮＡ）＝０．０１２５のものを用いている。な
お、これらマイクロレンズは、マイクロレンズアレイ６
の１回転の間に１２枚の顕微鏡像（２光子励起蛍光画
像）を取得し得るように配置されている（マイクロレン
ズの配置については、田名網健雄、小杉泰仁、杉山由美
子、磯崎克己、御厨健太、杉浦 端、根岸秀臣、柏原伸
也、市原 昭、「共焦点スキャナユニットＣＳＵ１０と
ピンホール配置法」、レーザー顕微鏡研究会第１７回講
演会論文集ｐ．４２（１９９６）を参照のこと）。
【００１９】上記マイクロレンズアレイ６の各マイクロ
レンズを出射したレーザ光２１はニポウディスク７に入
射する。ニポウディスク７には、上記マイクロレンズア
レイ６のマイクロレンズと同数のピンホール（図示せ
ず）が対応して配置されており、各ピンホール上に上記
マイクロレンズアレイ６を経たレーザ光２１が集光され
る。このニポウディスク７および上記マイクロレンズア
レイ６は、回転駆動機構２２によって所定回転速度（本
実施形態では１８００ｒｐｍ）で同期回転駆動されるよ
うになっている。
レンズを出射したレーザ光２１はニポウディスク７に入
射する。ニポウディスク７には、上記マイクロレンズア
レイ６のマイクロレンズと同数のピンホール（図示せ
ず）が対応して配置されており、各ピンホール上に上記
マイクロレンズアレイ６を経たレーザ光２１が集光され
る。このニポウディスク７および上記マイクロレンズア
レイ６は、回転駆動機構２２によって所定回転速度（本
実施形態では１８００ｒｐｍ）で同期回転駆動されるよ
うになっている。
【００２０】上記ニポウディスク７を出射したレーザ光
２３は、リレーレンズ８を経て対物レンズ９に入射した
後、試料２４の観察面２４ａに結像され、それにより観
察面２４ａから２光子励起蛍光２５が発生する。このと
き、結像される焦点は約１０００点である。このように
して発生した光子励起蛍光２５は、対物レンズ９を経て
ダイクロイックミラー１０に入射して、そこで反射して
方向を９０度変えられた後、集光レンズ１１を介して撮
像手段１２に入射する。
２３は、リレーレンズ８を経て対物レンズ９に入射した
後、試料２４の観察面２４ａに結像され、それにより観
察面２４ａから２光子励起蛍光２５が発生する。このと
き、結像される焦点は約１０００点である。このように
して発生した光子励起蛍光２５は、対物レンズ９を経て
ダイクロイックミラー１０に入射して、そこで反射して
方向を９０度変えられた後、集光レンズ１１を介して撮
像手段１２に入射する。
【００２１】上記撮像手段１２は、入射された２光子励
起蛍光２５を増倍するイメージ増倍管２６と、イメージ
増倍管２６により増倍された２光子励起蛍光２５を撮像
して２光子励起蛍光画像２７とするＣＣＤカメラ２８と
から成り、撮像手段１２により撮像された２光子励起蛍
光画像２７はモニタ１３に表示されることになる。
起蛍光２５を増倍するイメージ増倍管２６と、イメージ
増倍管２６により増倍された２光子励起蛍光２５を撮像
して２光子励起蛍光画像２７とするＣＣＤカメラ２８と
から成り、撮像手段１２により撮像された２光子励起蛍
光画像２７はモニタ１３に表示されることになる。
【００２２】ところで、本実施形態の多光子顕微鏡は、
以下のようにして多焦点走査を実現している。すなわ
ち、マイクロレンズアレイ６とその後段に配置したニポ
ウディスク７とを通過した後のレーザ光２３を対物レン
ズ９に入射させることにより、試料観察面２４ａを約１
０００点もの多焦点で照明して該多焦点で２光子励起を
行わせるとともに、１回転の間に１２枚の２光子励起蛍
光画像２７を取得し得るように約２００００個のマイク
ロレンズを配置したマイクロレンズアレイ６およびニポ
ウディスク７を回転機構２２によって１８００ｒｐｍで
同期回転駆動させて試料観察面２４ａの全域を走査する
ことにより、多数の２光子励起蛍光画像を得るようにし
ている。
以下のようにして多焦点走査を実現している。すなわ
ち、マイクロレンズアレイ６とその後段に配置したニポ
ウディスク７とを通過した後のレーザ光２３を対物レン
ズ９に入射させることにより、試料観察面２４ａを約１
０００点もの多焦点で照明して該多焦点で２光子励起を
行わせるとともに、１回転の間に１２枚の２光子励起蛍
光画像２７を取得し得るように約２００００個のマイク
ロレンズを配置したマイクロレンズアレイ６およびニポ
ウディスク７を回転機構２２によって１８００ｒｐｍで
同期回転駆動させて試料観察面２４ａの全域を走査する
ことにより、多数の２光子励起蛍光画像を得るようにし
ている。
【００２３】この場合、マイクロレンズアレイ６は１秒
間に３０回転し、マイクロレンズアレイ６の１回転の間
に１２枚の２光子励起蛍光画像２７が得られるから、１
秒間当たり３６０枚の２光子励起蛍光画像２７が得られ
ることになり、この場合のフレームレートは１／３６０
秒となる。
間に３０回転し、マイクロレンズアレイ６の１回転の間
に１２枚の２光子励起蛍光画像２７が得られるから、１
秒間当たり３６０枚の２光子励起蛍光画像２７が得られ
ることになり、この場合のフレームレートは１／３６０
秒となる。
【００２４】本実施形態によれば、上記多焦点走査によ
り単一焦点走査方式の多光子顕微鏡における限界フレー
ムレートであるビデオレート（１／３０秒）よりも十分
小さいフレームレートを実現したため、単一焦点走査方
式の多光子顕微鏡に比べて格段に走査速度を高速化する
ことができる。したがって、実現不可能と考えられてい
た細胞内カルシウム波伝搬等の動きのある試料のリアル
タイム観察が可能になる。
り単一焦点走査方式の多光子顕微鏡における限界フレー
ムレートであるビデオレート（１／３０秒）よりも十分
小さいフレームレートを実現したため、単一焦点走査方
式の多光子顕微鏡に比べて格段に走査速度を高速化する
ことができる。したがって、実現不可能と考えられてい
た細胞内カルシウム波伝搬等の動きのある試料のリアル
タイム観察が可能になる。
【００２５】また、本実施形態によれば、多焦点走査に
おける焦点数（約１０００点）に応じて増加する対物レ
ンズ入射レーザ光のパワー増大要求を、単一焦点走査型
の２光子励起蛍光顕微鏡と同一の平均強度のチタンサフ
ァイアレーザに、約８万倍に増幅が可能な再生増幅器１
６を追加するだけで満足させ、それにより多焦点におけ
る２光子励起を可能にしているため、コストアップを抑
制することができる。また、その際、ピークパワーを約
８万倍に増幅されたパルスレーザ光１７を用いることに
より、同一平均強度を有するチタンサファイアレーザの
みを用いる場合に比べて約８万倍の蛍光励起効率を実現
することができ、より明るい蛍光を発生させることがで
きる。
おける焦点数（約１０００点）に応じて増加する対物レ
ンズ入射レーザ光のパワー増大要求を、単一焦点走査型
の２光子励起蛍光顕微鏡と同一の平均強度のチタンサフ
ァイアレーザに、約８万倍に増幅が可能な再生増幅器１
６を追加するだけで満足させ、それにより多焦点におけ
る２光子励起を可能にしているため、コストアップを抑
制することができる。また、その際、ピークパワーを約
８万倍に増幅されたパルスレーザ光１７を用いることに
より、同一平均強度を有するチタンサファイアレーザの
みを用いる場合に比べて約８万倍の蛍光励起効率を実現
することができ、より明るい蛍光を発生させることがで
きる。
【図１】本発明の多光子顕微鏡の第１実施形態の構成を
示すシステム図である。
示すシステム図である。
１ 多光子顕微鏡（２光子励起蛍光顕微鏡） ２ レーザ装置 ３，４ ミラー ５ ビーム拡張器 ６ マイクロレンズアレイ ７ ニポウディスク ８ リレーレンズ ９ 対物レンズ １０ ダイクロイックミラー １１ 集光レンズ １２ 撮像手段 １３ 表示手段（モニタ） １４ チタンサファイアレーザ １５，１７，２０，２１，２３ レーザ光 １６ 再生増幅器 １８，１９ レンズ ２２ 回転駆動機構 ２４ 試料 ２４ａ 観察面 ２５ ２光子励起蛍光 ２６ イメージ増倍管 ２７ ２光子励起蛍光画像 ２８ ＣＣＤカメラ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平８−54340（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−15746（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−246644（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−94816（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−304411（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−333054（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−503149（ＪＰ，Ａ) 市原昭、外５名，“マイクロレンズ付 ニポウ板型共焦点蛍光顕微鏡の開発”, レーザ顕微鏡研究会第16回講演会論文 集，平成７年11月21日，ｐ．68−74 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G02B 21/00 G02B 21/06 - 21/36 G01N 21/62 - 21/74 H01S 3/00 - 3/02 H01S 3/04 - 3/095 H01S 3/098 - 3/102 H01S 3/105 - 3/131 H01S 3/20 H01S 3/23 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ２光子＊顕微鏡
Claims (3)
- 【請求項１】 チタンサファイアレーザおよび該チタン
サファイアレーザから発せられたレーザ光のパルスピー
クパワーを高増幅度で増幅する再生増幅器を具備して成
るレーザ装置と、入射側から順次配列される凹レンズお
よび凸レンズを具備して成り前記レーザ装置から発せら
れたレーザ光のビーム幅を拡張するビーム拡張器と、該
ビーム拡張器を出射したレーザ光を多数のマイクロレン
ズが配置された入射面に垂直に入射されるマイクロレン
ズアレイと、該マイクロレンズアレイを経たレーザ光を
前記マイクロレンズと対応して配置されたピンホールに
それぞれ入射されるニポウディスクと、該ニポウディス
クを出射した後にリレーレンズを経て入射されるレーザ
光を試料観察面に結像して２光子励起蛍光を発生させる
対物レンズと、前記リレーレンズおよび対物レンズ間に
配置され前記試料観察面から前記対物レンズを経て入射
された２光子励起蛍光を反射させるダイクロイックミラ
ーと、該ダイクロイックミラーで反射された２光子励起
蛍光を集光レンズを介して入射されて２光子励起蛍光画
像を撮像する撮像手段と、該撮像手段により撮像された
２光子励起蛍光画像を表示する表示手段とを具える多光
子顕微鏡であって、 前記マイクロレンズアレイおよびニポウディスクを所定
回転速度で同期回転駆動して前記試料観察面に形成され
る多数の焦点を走査することにより、ビデオレートより
も十分小さいフレームレートで２光子励起蛍光画像を得
るようにしたことを特徴とする多光子顕微鏡。 - 【請求項２】 前記多数のマイクロレンズは、１回転当
たり１２枚の２光子励起蛍光画像を取得し得るように前
記マイクロレンズアレイの入射面に配置されていること
を特徴とする請求項１記載の多光子顕微鏡。 - 【請求項３】 前記撮像手段は、入射された２光子励起
蛍光を増倍するイメージ増倍管と、該イメージ増倍管に
より増倍された２光子励起蛍光を撮像して２光子励起蛍
光画像とするＣＣＤカメラとを具備して成ることを特徴
とする請求項１または２記載の多光子顕微鏡。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10373723A JP3099063B2 (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | 多光子顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10373723A JP3099063B2 (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | 多光子顕微鏡 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000193889A JP2000193889A (ja) | 2000-07-14 |
| JP3099063B2 true JP3099063B2 (ja) | 2000-10-16 |
Family
ID=18502652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10373723A Expired - Lifetime JP3099063B2 (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | 多光子顕微鏡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3099063B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109724954A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-05-07 | 北京超维景生物科技有限公司 | 荧光收集装置、微型双光子显微镜及双光子成像方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10044308A1 (de) * | 2000-09-07 | 2002-03-21 | Leica Microsystems | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Fluoreszenzlicht bei der konfokalen Rastermikroskopie |
| JP2005233802A (ja) * | 2004-02-20 | 2005-09-02 | Yokogawa Electric Corp | 物理量計測装置およびその装置を用いて行う物理量校正方法 |
| EP1889111A2 (en) | 2005-05-25 | 2008-02-20 | Massachusetts Institute of Technology | Multifocal imaging systems and methods |
| JP5618533B2 (ja) | 2008-12-26 | 2014-11-05 | キヤノン株式会社 | 光干渉断層情報取得装置、撮像装置及び撮像方法 |
| JP5623028B2 (ja) | 2009-01-23 | 2014-11-12 | キヤノン株式会社 | 光干渉断層画像を撮る撮像方法及びその装置 |
| DE102009060793A1 (de) * | 2009-12-22 | 2011-07-28 | Carl Zeiss Microlmaging GmbH, 07745 | Hochauflösendes Mikroskop und Verfahren zur zwei- oder dreidimensionalen Positionsbestimmung von Objekten |
| CN103616330A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-05 | 中国科学院化学研究所 | 基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨sted显微成像系统 |
| EP3087423A1 (en) * | 2013-12-24 | 2016-11-02 | Tissuevision, Inc. | Multi-foci multiphoton imaging systems and methods |
| US10788403B2 (en) | 2015-03-11 | 2020-09-29 | Tissuevision, Inc. | Systems and methods for serial staining and imaging |
| CN108982455B (zh) * | 2018-07-31 | 2020-08-18 | 浙江大学 | 一种多焦点光切片荧光显微成像方法和装置 |
| DE102018127281A1 (de) * | 2018-10-31 | 2020-04-30 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Mikroskop und Verfahren zur Mikroskopie |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0315746A (ja) * | 1988-05-13 | 1991-01-24 | Hitachi Ltd | 光検出型ｄｎａ検出方式 |
| US5034613A (en) * | 1989-11-14 | 1991-07-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Two-photon laser microscopy |
| JPH04304411A (ja) * | 1991-04-01 | 1992-10-27 | Nikon Corp | 高感度顕微鏡 |
| JPH0794816A (ja) * | 1993-09-22 | 1995-04-07 | Nippon Steel Corp | 再生増幅器 |
| JP3244100B2 (ja) * | 1994-08-17 | 2002-01-07 | 横河電機株式会社 | ２光子励起顕微鏡 |
| JPH09246644A (ja) * | 1996-03-13 | 1997-09-19 | Rikagaku Kenkyusho | 赤外光発生装置 |
| JPH10333054A (ja) * | 1997-05-30 | 1998-12-18 | Yokogawa Electric Corp | 共焦点顕微鏡 |
-
1998
- 1998-12-28 JP JP10373723A patent/JP3099063B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 市原昭、外５名，"マイクロレンズ付ニポウ板型共焦点蛍光顕微鏡の開発"，レーザ顕微鏡研究会第１６回講演会論文集，平成７年１１月２１日，ｐ．６８−７４ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109724954A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-05-07 | 北京超维景生物科技有限公司 | 荧光收集装置、微型双光子显微镜及双光子成像方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000193889A (ja) | 2000-07-14 |
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