KR101939956B1 - 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법 및 상기 방법에 이용되는 장치에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 반사분광법을 통해 말이집이 형성된 신경축삭의 광학 구조를 광학적으로 분석하는 방법으로 공초점 광학계를 통해 초점에서의 광반사 신호를 추출하여, 광학소자를 통해 반사된 광신호의 스펙트럼을 분석하는 방법에 관한 것이다. 이에, 본 발명에 따른 분석방법은 신경축삭 세포소구조의 생리학적, 병리학적 상태를 추적 관찰이 가능하다.
Description
본 발명은 말이집이 형성된 신경축삭의 반사 분광 분석 방법에 관한 것이다.
축삭(axon)은 뉴런의 세포체에서 뻗어나온 긴 돌기를 의미하는 것으로, 축삭말단은 분지되어 뉴런이나 효과기에 시냅스결합하여 신경세포의 흥분을 전달한다. 실험적으로는 양측성 전도를 나타내지만 생체에서는 대개 축삭의 기부에서 말단의 정방향으로 전도한다. 축삭은 또 측지를 내기도 한다. 축삭 내부에는 뉴로필라멘트와 미소관이 있어 세포체로부터 신경말단으로 또 그 반대의 물질수송(축삭수송)에 관여하고 있다. 이들은 두께 5~10nm의 세포막으로 뒤덮여 있는데 이 막은 막전위, 즉 충격 발생장소로 중요한 기능을 한다.
한편 말이집은 축삭을 둘러싼 중층성 치밀 막구조이다. 상기 말이집의 구성성분은 지질이 매우 많은 것이 특징으로, 생리학적으로는 신경세포의 축삭을 전기적으로 절연하여 도약전도를 가능하게 하고 신경충격의 전도속도를 증가시켜 신경계의 고차기능의 형성에 중요한 역할을 한다.
중추신경계에서는 희소돌기신경교, 말초신경계에서는 시반세포가 말이집을 형성한다. 말이집은 말이집형성세포의 형질막의 안쪽끼리 접착한 주기선과 바깥쪽끼리 접착한 주기간선의 구성단위가 단기적으로 반복되는 구조이다.
이와 같이, 신경축삭과 이를 둘러싸고 있는 신경수초는 다발성경화증, 신경손상 등에 중요한 역할을 하기에 의학적 중요성이 높다. 특히 신경수초는 척추동물의 효율적인 신경 전달뿐 아니라 신경가소성, 신경발달 등의 다양한 신경생리 및 병리학적 과정에 중요한 역할을 하기에, 신경축삭과 함께 신경수초의 상태와 변화를 추적 관찰하는 것은 의생물학적 유용성이 높다.
신경축삭은 0.1 - 10 μm 직경의 섬유형태이고 이를 둘러싸는 신경수초는 수 나노미터(4 - 20 nm) 두께의 말이집이 다층으로 감겨있는 구조로 이러한 구조를 관찰하기 위해서는 적어도 수 나노(1 nm = 10-9 m) 수준의 공간분해능을 가지는 기술이 필요하다.
이와 관련하여 종래 말이집이 형성된 신경 수초를 포함하는 조직을 관찰하기 위해서는, 주로 조직을 적출한 후, 형광 염색을 처리한 후 관찰하는 것이 대부분이었다. 그러나 임상적용을 고려한다면, 비침습적으로 생화학적, 유전학적 표지 없이 신경축삭의 나노구조를 관찰할 수 있는 방법의 필요성이 있다.
한편, 국내 공개특허 제2013-0118845호에서는, 세포 도식을 위한 TEM 이미징 방법을 제공하고 있으나, 비침습적으로 생화학적, 유전학적 표지 없이 신경축삭의 변화 등을 분석하는 방법은 제시하지 못하고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 백색광 레이저를 광원으로 사용하여, 검체로부터 발생한 반사광의 스펙트럼을 분석하여, 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조를 관찰하는 방법을 발명하였다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
광원으로부터 발생한 빛을 단색화하는 단계(S1);
상기 S1 단계에서 단색화된 빛을 검체에 입사시키는 단계(S2); 및
상기 S2 단계에서 검체로부터 발생한 반사광을 광검출기에서 검출하는 단계(S3)를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 백색 광원으로부터 발생한 빛을 검체에 입사시키는 단계(S1'); 및
상기 검체로부터 발생한 반사광을 분광검출기에서 검출하는 단계(S2')를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현에에 있어서, 상기 S1 단계에서 단색화된 빛은 스캐너(40)와 대물렌즈(50)를 통과하여 검체에 입사되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 S1' 단계에서 광원으로부터 발생한 빛은 스캐너(40)와 대물렌즈(50)를 통과하여 검체에 입사되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 S3 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 광검출기로 입사되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 S2' 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 분광검출기로 입사되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 광원으로부터 발생한 빛의 파장은 400 nm 내지 2 μm 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 스캐너는 갈바노 미러(galvano-mirror) 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 분광은 광음향변조 단색화 필터((Acousto-optical tunable filter, AOTF)를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 검체로 조사되는 백색 광(11)을 발생시키는 광원(10);
상기 광원으로부터 발생한 빛을 단색화하는 단색화 필터(20);
상기 검체로부터 발생한 반사광을 통과시켜 분광검출기로 입사시키는 빔 분할기(Beam splitter)(30); 및
상기 빔 분할기(Beam splitter)(30)로부터 입사된 반사광을 측정하는 광검출기(90)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공한다.
아울러, 본 발명은 검체로 조사되는 백색 광(11)을 발생시키는 광원(10);
상기 검체로부터 발생한 반사광을 통과시켜 분광검출기로 입사시키는 빔 분할기(Beam splitter)(30); 및
상기 빔 분할기(Beam splitter)(30)로부터 입사된 반사광을 측정하는 분광검출기(91)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단색화 필터는 광음향변조 단색화필터(Acousto-optical tunable filter, AOTF)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 장치는 상기 단색화된 빛 또는 반사광을 스캐닝(scanning)하는 스캐너(40);
검체를 확대하는 대물렌즈(50);
상기 반사광을 통과시키는 공초점 관찰용 렌즈(70); 및
상기 렌즈(70)를 통과한 반사광이 통과하는 핀홀(80);을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 분석 방법은, 별도의 생화학적 표지 없이 신경 축삭의 나노 구조를 관찰함으로써, 살아있는 실험동물 및 인체에 바로 적용할 수 있는 장점이 있다. 즉 신경수초와 관련되어 있는 다양한 유전병과 병리학적 증세를 관찰 할 수 있고, 신경 수초 발달과정을 관찰함으로써 신경 가소성(neuro plasticity)의 지표로 이용할 수 있으며, 살아있는 온전한 개체에서 신경 가소성 관찰을 할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 방법을 적용하면 실험 동물로부터 신경 축삭의 나노 구조의 변화 등을 용이하게 추적 및 관찰하는 것이 가능하므로 뇌과학 및 신경병리학 분야에서 유용하게 사용될 수 있으며, 배양된 세포(예, neuron-oligodendrocyte coculture), 추출된 신경조직, 혹은 실험동물을 이용한 신경축삭 및 신경수초와 관련된 약물 스크리닝에 활용하는 것이 가능하고, 신경축삭 및 신경수초의 나노구조 변화를 수반하는 질병(e.g. 다발성 경화증, 뇌진탕, 수초용해증, 탈수초증, 수초형성부전증)의 임상적 진단 및 치료효과 추적에 활용 가능할 것으로 기대된다.
도 1 및 2는 본 발명의 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 통해 얻은 신경수초의 반사광 측정을 통해 얻은 영상과, 종래 형광 현미경 측정을 통해 얻은 영상을 병합한 영상을 나타낸 도면으로, 붉은색 신호는 형광 염색 후 형광 현미경을 통한 신경 수초 영상을 나타낸 것이고, 하늘색 신호는 반사광 분석을 통한 신경 수초 영상을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 신경수초의 반사 스펙트럼 분석을 통한 신경축삭 직경 분석결과 및 추세선을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 반사 스펙트럼 분석을 통한 신경축삭 직경과 형광 현미경을 통해 측정한 신경축삭의 직경을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 6은 물리적 손상을 받은 실험용 생쥐를 대상으로, 반사광 측정 영상을 통해 신경축삭이 손상 입은 부분을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 물리적 손상을 입은 부위의 신경축삭의 반사광 영상과 형광 현미경 영상을 병합하여 나타낸 도면이다.
도 8은 손상된 부위의 신경 수초 반사 스펙트럼 분석한 결과(좌)와, 반사광 분석을 통한 신경축삭의 직경과 형광 현미경 영상의 신경축삭 직경 비교한 결과(우)를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 통해 얻은 신경수초의 반사광 측정을 통해 얻은 영상과, 종래 형광 현미경 측정을 통해 얻은 영상을 병합한 영상을 나타낸 도면으로, 붉은색 신호는 형광 염색 후 형광 현미경을 통한 신경 수초 영상을 나타낸 것이고, 하늘색 신호는 반사광 분석을 통한 신경 수초 영상을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 신경수초의 반사 스펙트럼 분석을 통한 신경축삭 직경 분석결과 및 추세선을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 반사 스펙트럼 분석을 통한 신경축삭 직경과 형광 현미경을 통해 측정한 신경축삭의 직경을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 6은 물리적 손상을 받은 실험용 생쥐를 대상으로, 반사광 측정 영상을 통해 신경축삭이 손상 입은 부분을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 물리적 손상을 입은 부위의 신경축삭의 반사광 영상과 형광 현미경 영상을 병합하여 나타낸 도면이다.
도 8은 손상된 부위의 신경 수초 반사 스펙트럼 분석한 결과(좌)와, 반사광 분석을 통한 신경축삭의 직경과 형광 현미경 영상의 신경축삭 직경 비교한 결과(우)를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.
덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 '연결' 되어 있다고 할 때, 이는 '직접적으로 연결'되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 '간접적으로 연결'되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은 신경축삭의 특이적인 구조에서 기인하는 광반사를 분광학적으로 분석함으로서 나노구조를 외부 표지 없이 관찰할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 통해 기존의 광학영상법의 회절한계를 넘어 신경축삭의 직경 및 신경수초의 구조적 정보를 제공할 수 있다.
즉 본 발명은 광원으로부터 발생한 빛을 단색화하는 단계(S1);
상기 S1 단계에서 단색화된 빛을 검체에 입사시키는 단계(S2); 및
상기 S2 단계에서 검체로부터 발생한 반사광을 광검출기에서 검출하는 단계(S3)를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공한다.
상기 단색화는 바람직하게는 광음향변조 단색화필터(Acousto-optical tunable filter, AOTF)를 사용하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 S1 단계에서 단색화된 빛은 스캐너와 대물렌즈를 통과하여 검체에 입사된다.
상기 S3 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 광검출기로 입사되는 것이다.
또한, 본 발명은 광원으로부터 발생한 빛을 검체에 입사시키는 단계(S1'); 및
상기 검체로부터 발생한 반사광을 분광검출기에서 검출하는 단계(S2')를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공할 수 있다.
상기 S1' 단계에서 광원으로부터 발생한 빛은 스캐너(30)와 대물렌즈(40)를 통과하여 검체에 입사되는 것이고, 상기 S2' 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 분광검출기로 입사된다.
즉, 본 발명의 나노 구조 분석 방법은 광원으로부터 발생한 빛을 단색화한 후 검체에 입사 시키고, 반사광을 광검출기에서 검출할 수도 있고, 단색화 단계 없이 반사광 자체를 분광검출기에서 검출하는 방법을 사용할 수 있는 것이다.
상기 스캐너는 갈바노 미러(galvano-mirror) 인 것을 사용한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치의 사시도를 도시한 것으로, 상기 도 1은 단색화 필터(AOFT) 및 빔 분할기(Beam Splitter)가 구비된 장치에 관한 것이다. 도시된 것과 같이, 발생한 빛을 단색화 필터에서 단색화한 후, 빔 분할기를 지나, 스캐너와 대물렌즈를 통과하여 검체에 입사하게 된다. 검체에 입사된 후 발생하는 반사광은 다시 스캐너를 지나, 빔 분할기에서 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 광검출기로 입사되는 것이다.
즉 본 발명은 검체로 조사되는 백색 광(11)을 발생시키는 광원(10);
상기 광원으로부터 발생한 빛을 단색화하는 단색화 필터(20);
상기 검체로부터 발생한 반사광을 통과시켜 분광검출기로 입사시키는 빔 분할기(Beam splitter)(30); 및
상기 검체로부터 발생한 반사광을 측정하는 광검출기(90)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공할 수 있다.
상기 단색화 필터는 빛을 '단색화'하는 역할을 하는 것으로, 상술한 바와 같이, 광음향변조 단색화필터가 이용되는 것이 바람직하다.
또한, 빔 분할기는 빛을 원하는 방향으로 분사할 수 있는 역할을 하는 것으로, 상기 빔 분할기로는 광음향변조 빔 분할기(Acousto-optical beam splitter, AOBS)가 이용되는 것이 바람직하다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치의 사시도를 도시한 것으로, 상기 도 2는 단색화 장비를 따로 구비하지 않는다. 이에 광검출기 대신, 분광검출기를 사용하는 구성을 가짐으로써, 분광 단계 없이 바로 검출이 가능하다.
즉 본 발명은, 상기 검체로부터 발생한 반사광을 통과시켜 분광검출기로 입사시키는 빔 분할기(Beam splitter)(30); 및
상기 빔 분할기(Beam splitter)(30)로부터 입사된 반사광을 측정하는 분광검출기(81)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공할 수 있다.
상기 장치들은 상기 분광된 빛 또는 반사광을 스캐닝(scanning)하는 스캐너(40);
검체를 확대하는 대물렌즈(50);
상기 장치는 상기 단색화된 빛 또는 반사광을 스캐닝(scanning)하는 스캐너(40);
검체를 확대하는 대물렌즈(50);
상기 반사광을 통과시키는 공초점 관찰용 렌즈(70); 및
상기 렌즈(70)를 통과한 반사광이 통과하는 핀홀(80);을 더 포함할 수 있다.
이와 같은 구성을 채택함으로써, 신경축삭의 특이적인 구조에서 기인하는 광반사를 분광학적으로 분석할 수 있고, 이를 통해 신경축삭의 직경 및 신경 수초의 구조적 정보를 제공할 수 있는 것이다.
이하에서는, 본 발명의 일실시예에 따른 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법 및 장치에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
[S1 단계]
본 발명에서 S1 단계는 광원(10)으로부터 발생한 빛을 단색화 필터에 통과시켜 단색화시키는 단계이다.
상기 광원(10)은 백색광을 조사하는 것으로, 다양한 파장의 빛을 조사할 수 있다. 광원(10)으로부터 발생하는 빛의 파장은 400 nm 내지 2 μm 인 것일 수 있으나, 관찰하려는 목표에 따라서 변경이 가능하다. 단색화 필터에서 단색화 된 빛은 빔 분할기로 입사된다.
상기 단색화 필터는 소망하는 파장의 빛을 원하는 경로로 보낼 수 있는 빔 단색화 필터로 NKT photonics의 nlR1가 사용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
[S2 단계]
본 발명에서 S2 단계는 상기 S1 단계에서 단색화된 빛을 검체에 입사시키는 단계이다.
상기 광원으로부터 발생하는 빛을 단색화하여 원하는 파장의 빛만 빔 분할기를 거쳐 검체로 투과시킬 수 있고, 평면 영상화를 위해서, 상기 단색화된 빛을 스캐너(40) 및 대물렌즈(50)를 통해 광원으로부터 발생하는 빛을 입사시킨다. 상기 스캐너(40)는 갈바노 미러를 사용하는 것이 바람직하나, 관찰하고자 하는 대상에 따라 변경이 가능하다.
노이즈를 최소화하기 위한 목적으로, 검체를 고정하기 위해서 샘플 고정장치가 추가로 포함될 수 있으며, 상기 고정 장치 및 대물렌즈는 xyz 방향으로 독립적으로 움직일 수 있도록 한다.
[S3 단계]
S3 단계는 상기 S2 단계에서 검체로부터 발생한 반사광을 광검출기에서 검출하는 단계이다. 상기 검체에 빛이 입사되면서 발생하는 반사광은 다시 대물렌즈(50) 및 스캐너(40)를 통과한 후, 렌즈(70) 및 핀홀(80)을 통과한 후 광 검출기(90)에 입사될 수 있다.
상기 검출기는 광반사 스펙트럼을 분석하는 기기라면 제한없이 사용이 가능하며, 광반사 스펙트럼으로부터 신경축삭 나노구조를 분석하는 모듈, 실시간으로 나노구조를 디스플레이하는 모듈, 삼차원 나노구조를 분석하는 모듈. 분광영상을 통해 관측할 수 있는 생체 활동 또는 인위적인 조절에 의해 발생하는 변화를 포함하는 생체시료의 나노구조를 분석하는 모듈 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 핀홀(80)의 직경은 다양하게 조절이 가능하며, 이를 통해 다양한 직경의 핀홀이 구비된 회전 디스크(Spinning disk)를 사용할 수 있다.
[S1' 단계]
본 발명의 S1' 단계는, 상기 S1 단계와 다르게, 광원으로부터 발생한 빛을 단색화하지 않고, 검체에 입사시키는 것이다. 상기 빛은 빔 분할기를 통과하여 스캐너로 입사된다.
광원에서 발생하는 빛의 파장은 상술한 바와 같고, 상기 광원으로부터 발생한 빛은 스캐너(40) 및 대물렌즈(50)를 통해 검체에 입사된다.
[S2' 단계]
본 발명에서 S2' 단계는 상기 S1' 단계에서 입사된 빛이 검체로부터 반사되어 발생한 반사광을 분광검출기에서 검출해내는 단계이다.
상기 검체에 빛이 입사되면서 발생하는 반사광은 다시 대물렌즈(50) 및 스캐너(40)를 통과한 후, 렌즈(70) 및 핀홀(80)을 통과한 후 분광검출기에 입사될 수 있다.
상기 분광검출기는 광학소자 및 검출기를 구비한 장치(Andor, SR-303i-A) 가 사용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
한편, 본 발명에서, 부품간의 체결은 독립적으로 움직일 수 있도록 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
[
실시예
1] 반사광 분광법을 통해
신경축삭
영상화 및
직경
측정
척추동물의 신경세포의 신경 전달 통로인 신경축삭은 신경수초에 의한 말이집이 형성되어 있다. 본원의 실시예의 준비 과정으로, 말이집이 형성된 신경축삭을 포함하는 조직을 적출하였다. 상기 조직에 대한 실험을 위해 실험용 생쥐를 이용하였으며, 신경 세포가 밀집되어있는 뇌조직과 척수 조직을 주로 관찰하였다.
본 발명의 반사분광법의 경우 레이저 광원에서 470nm 내지 670nm의 파장을 발생시켜, 단색화 필터에서 단색화시킨 후, 갈바노 미러 및 대물렌즈에 통과시킨 후, 실험용 생쥐의 대뇌 피질 및 척수 부분에 투과시켰다.
상기 실험용 생쥐의 대뇌 피질 및 척수 부분에서 반사된 반사광은 다시 갈바노 미러 및 스캐너를 통과하여 빔 분할기로 입사되었고, 상기 빔 분할기에서 반사광은 영상검출을 위한 공초점 관찰용 렌즈를 투과하여 조리개를 통과한 후, 광검출기에 입사되었다.
도 3에서 나타낸 것과 같이, 적출한 생쥐의 뇌조직(50)을 공초점 현미경으로 관측한 말이집이 형성된 신경수초를 영상화하였다.
말이집이 형성된 신경 수초를 포함한 조직(50)을 관찰하기 위한 기존 방법으로는 목표한 조직 및 세포에 형광 염색을 처리 후 관찰이 있다. 본 실시예에서 반사분광법을 검증하기 위한 형광 현미경 관찰의 경우 (Leica, SP8)를 사용하여 수행된 것으로, 형광 염색을 처리한 후 형광 현미경을 사용하여 측정한 결과와, 본 발명의 반사광 측정법을 통해서 분석한 결과를 병합하여 도 3에 나타내었다.
반사광 분석법을 통해 관찰한 결과, 형광 현미경 보다 높은 해상도의 구조적 정보를 얻을 수 있었고, 말이집이 형성된 신경수초의 경우 다층으로 형성된 구조에 의해 반사광이 강하게 발생하며, 별도의 생화학적 표지자 없이 말이집이 형성된 신경수초를 관찰할 수 있었다.
말이집이 형성된 신경 수초는 다층구조에 의해, 파장에 따라 다양한 반사광 스펙트럼을 갖는다. 검출기(70)에서 획득한 반사 신호들에서 구조적 정보를 얻기 위해 반사광 스펙트럼에 대한 분석을 수행하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이, 신경축삭의 직경을 측정 할 수 있었다.
또한 본 발명에서 제시한 기술의 유의성을 확인하기 위해서, 형광 현미경으로도 관측이 가능하여 비교가 가능한 부분을 선별하여, 구조적 정보를 비교한 결과를 도 5에 나타내었다.
[
실시예
2] 반사광 분광법을 통한 외상성 뇌손상 병변 검출
본 실시예에서는 본 발명의 방법을 이용하여 외상성 뇌손상을 검출하는 것이 가능한 것인지 확인하기 위해서 수행되었다. 외상성 뇌손상은, 신경축삭 및 신경 수초를 포함하는 신경 세포가 파손되면서 발생하며, 다양한 증상을 보인다. 우선 본 발명의 방법을 통한 외상성 뇌손상 검출의 효용성을 검증하기 위해, 실험용 쥐에 외상성 뇌손상을 인위적으로 발생시켰다(도 6 좌측). 뇌 손상을 발생시킨 후, 상기 실험용 쥐의 뇌를 형광 현미경에서 촬영하여 손상 입은 신경축삭 부위를 확인하였다(도 6 우측).
상기 손상 부위를 본 발명의 반사분광법으로도 측정하였으며, 상기 반사분광법으로 측정된 반사광 영상과 도 6의 손상 부위 형광 현미경 영상을 병합하여 도 7에 나타내었다(붉은색 신호: 형광 현미경 측정, 하늘색 신호 : 반사광 분석).
그 결과 형광 현미경 측정결과와, 본 발명의 반사광 영상 분석을 통한 구조적 정보는 유사한 구조적 양상을 보여, 별도의 생화학적 표지자 없이 손상 부위의 검출이 가능함을 확인하였다.
도 8 좌측에는 손상된 부위의 신경 수초 반사 스펙트럼을 분석한 결과를 나타내었다. 점선은 분석을 위해 형성해낸 추세선으로, 반사 스펙트럼의 결과와 유사하게 나타난다는 것이 확인된다.
즉 반사스펙트럼에 의해서도 파장별로 손상된 신경 축삭에서 발생하는 부풀어 오름 현상을 확인할 수 있었다.
도 8 우측에는 반사광 분석을 통한 신경축삭의 직경(x축)과 형광 현미경 영상의 신경 축삭 직경(y축)을 비교하여 나타낸 것으로, 본 발명의 반사광 분석에 신뢰성이 있다는 것이 다시 한 번 확인되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
10 : 광원 20 : 단색화 필터
30 : 빔 분할기 40 : 스캐너
50 : 대물렌즈 60 : 검체
70 : 공초점 관찰용 렌즈
80 : 핀홀 90 : 광검출기
91 : 분광검출기
30 : 빔 분할기 40 : 스캐너
50 : 대물렌즈 60 : 검체
70 : 공초점 관찰용 렌즈
80 : 핀홀 90 : 광검출기
91 : 분광검출기
Claims (5)
- 백색광원으로부터 발생한 빛을 순차적으로 단색화하는 단계(S1);
상기 S1 단계에서 단색화된 빛을 검체에 입사시키는 단계(S2); 및
상기 S2 단계에서 검체로부터 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과하고, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 광검출기에서 검출되는 단계(S3)를 포함하고,
상기 S1 단계에서 단색화된 빛은 스캐너와 대물렌즈를 통과하여 검체에 입사되며,
상기 광검출기에서 측정된 신호(optical intensity)와 상기 순차적으로 단색화한 광원의 파장 정보를 조합해 반사광 스펙트럼을 측정하는 모듈, 반사광 스펙트럼으로부터 신경축삭 나노구조를 분석하는 모듈, 및 신경축삭 나노구조를 디스플레이하는 모듈을 통해 신경의 크기와 다층 말이집 구조를 분석하는 것을 특징으로 하는 신경 축삭의 나노구조의 비침습적 분석 방법.
- 백색광원으로부터 발생한 빛을 검체에 입사시키는 단계(S1'); 및
상기 검체로부터 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 분광검출기에서 검출되는 단계(S2')를 포함하고,
상기 S1' 단계에서 광원으로부터 발생한 빛은 스캐너와 대물렌즈를 통과하여 검체에 입사되며,
상기 분광검출기에서 측정된 반사광 스펙트럼으로부터 신경축삭 나노구조를 분석하는 모듈과 신경축삭 나노구조를 디스플레이하는 모듈을 통해 신경의 크기와 다층 말이집 구조를 분석하는 것을 특징으로 하는 신경 축삭의 나노구조의 비침습적 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 백색광원으로부터 발생한 빛의 파장은 400 nm 내지 2 ㎛ 인 것을 특징으로 하는, 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조의 비침습적 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 스캐너는 갈바노 미러(galvano-mirror)인 것을 특징으로 하는, 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조의 비침습적 분석 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단색화는 광음향변조 단색화필터(Acousto-optical tunablefilter,AOTF)를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조의 비침습적 분석 방법.
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2018
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