CN102202561A

CN102202561A - 提供光刺激和结构成像的装置、设备和方法

Info

Publication number: CN102202561A
Application number: CN2009801434467A
Authority: CN
Inventors: 沃洛季米尔·尼科连科; 拉斐尔·尤斯特; 布朗东·O·沃森; 达尔西·彼得卡
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2008-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2011-09-28
Also published as: US20180173004A1; US20110233046A1; US9846313B2; JP2017207767A; JP2014240977A; CN107329280A; WO2010036972A1; JP2022130398A; JP2020058356A; AU2009296405A1; US11531207B2; EP2337489A4; JP2012503798A; EP2337489A1; CA2738652A1

Abstract

根据本公开的示例性实施方案，可以提供方法、系统、装置、计算机可访问介质和装置，以利用光敏化合物例如MNI-谷氨酸和/或RuBi-谷氨酸采取波束复用以任何任意的时间-空间模式刺激脑切片中的个体神经元。这种示例性方法和设备可具有单细胞和三维精确度。例如，通过顺序刺激多达1000个潜在的突触前神经元，可以产生细胞输入的详细功能标测图。此外，可以利用所有光学方法将该示例性方法与双光子钙成像组合以对回路活性进行成像和操控。本公开的其它示例性实施方案可包括提供用于广泛类型应用的轻量化紧凑型便携式设备。

Description

提供光刺激和结构成像的装置、设备和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年9月25日提交的美国专利申请序列号No.61/194,145、2009年4月17日提交的美国专利申请序列号No.61/212,924和2009年5月11日提交的美国专利申请序列号No.61/177,239的优先权，以上申请的全部公开内容通过引用并入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本公开是在美国国家健康研究所(NIH)的国家眼科研究所(NEI)和国家神经病和脑卒中研究所(NINDS)的资金号NIH RO1 EY11787的政府资助下完成的。因此，美国政府对本发明具有一定的权利。

技术领域

本公开的示例性实施方案涉及用于提供光刺激和结构成像的装置、设备和方法，更具体涉及神经元回路的光刺激和成像。

背景技术

神经元回路由多样性的细胞类型构成并且很可能每种细胞类型执行特定功能(参见P.Sterling，“The Synaptic Organization of the Brain，”edited by G.M.Shepherd，Oxford University Press，Oxford，1990)。因此，作为理解回路功能的先决条件，似乎有必要标测出不同类型神经元之间的突触连接，或者如Crick发表论文中所提出的，标测给定细胞上产生的所有连接(参见FH.Crick，ScL Am.241(3)，219(1979))。

根据描述使用荧光膜探针的知识(参见I.C.Farber和A.Grinvald，Science 222，1025(1983))，使用笼锁谷氨酸进行神经元光刺激(参见E.M.Callaway and L.C.Katz，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，7661(1993))已使该研究项目获得了很大进展，生成了脑切片中神经元的高分辨率输入标测图(参见M.B.Dalva和L.C.Katz，Science 265(5169)255(1994)；G.M.Shepherd，T.A.Pologruto和K.Svoboda，Neuron 38(2)，277(2003)；C.Boucsein，M.Nawrot，S.Rotter et al.，Journal of neurophysiology 94(4)，2948(2005)；R.Kotter，D.Schubert，J.Dyhrfjeld-Johnsen et al.，J Biomed Opt 10(1)，11003(2005)；H.U.Dodt，A.Schierloh，M.Eder et al.，Neuroreport 14(4)，623(2003)；S.Shoham，D.H.O′Connor，D.V.Sarkisov et al.，Nature methods 2(11)，837(2005))。在该方法中，通过将紫外光聚焦在切片中的特定位置处实现谷氨酸解笼锁，同时记录来自不同位置的神经元的细胞内反应。通过使解笼锁光束系统地移动穿过切片，可以标测出在所记录的细胞内产生兴奋性或抑制性反应的区域。虽然有用，但是该方法可能存在以下问题：由于在活组织中不可避免的光散射和单光子激发产生大的解笼锁区域，使得刺激区域包含多于一个神经元。因此，单光子光刺激尚未揭示细胞间的突触连接，而只是特定区域和所记录的神经元之间的连接。

因此，需要解决本文所述缺点中的至少一部分。

发明内容

为了克服至少以上限制，可以提供双光子光刺激方法、系统和设备的示例性实施方案。

根据本公开的一个示例性实施方案，可以提供用于产生至少一个辐射的设备和方法。例如，可以提供至少一个特定装置，其构造或设置为产生一种或更多种辐射以触发至少一个样品的至少一部分的光活化、光失活和/或光化学效应。所述辐射可包括至少一个光束，并且所述特定装置可进一步构造或设置为将所述至少一个光束分成多个子束，使得至少一些所述子束碰撞所述样品。所述样品可以是生物样品、化学组合物、半导体器件和/或药物递送装置。

根据一个示例性实施方案，所述特定装置可包括至少一个光学衍射装置。所述特定装置和/或所述光学衍射装置可包括至少一个空间光调制(SLM)装置。此外，所述特定装置可通过以非线性方式激发至少一个辐射来产生所述至少一个辐射。所述至少一个辐射的信噪比可为来自单辐射系统的信号的约1.94倍。

根据本公开的另一示例性实施方案，可以提供至少一个附加装置，其可构造为接收与所述至少一种所实施辐射相关的数据并且产生作为该数据函数的样品的一部分的至少一个图像，所述图像可在小于约100ms的成像周期期间产生。而且，所述特定装置可设置或构造成对生物样品提供所述至少一种所产生的辐射以对其提供光动力效应。所产生的辐射对所述至少一个样品的平均净功率可高于100毫瓦。例如，所述特定装置的至少一部分可提供在内窥镜装置中。

在本公开的又一示例性实施方案中，所述特定装置可进一步设置或构造为利用所述辐射照射样品内的微观结构和/或调节辐射相位来撞击样品并获得其至少一个深度信息。所述SLM装置可设置或构造为利用所述辐射照射样品内的微观结构和/或撞击样品并获得其至少一个深度信息。所述特定装置可容纳在至少一个基于非扫描空间光调制(SLM)的显微镜装置内。所述基于非扫描SLM的显微镜装置可产生所述辐射的相干光，并且所述相干光可包括激光。

根据本公开的再一示例性实施方案，所述SLM装置可设置或构造为校正与用于所述至少一个图像的至少一个样品相关的至少一个偏差。所述辐射可包括至少一种光辐射，并且所述SLM装置可设置或构造为对样品的深度大于约1mm的部分提供强度特别有效的光辐射。所述光辐射可提供在所述部分内基于所述光辐射的至少一个波长的深度处。所述附加装置可基于至少一个多模式过程产生图像。所述SLM装置可进一步构造或设置为产生来自所述辐射的一组成角度交叉的子束。所述SLM装置构造或设置为产生所述辐射以实现(i)在至少一个样品内的双光子或三光子吸收，(ii)与所述辐射相关的二次谐波产生(SHG)，(iii)相干反斯托克斯拉曼光谱成像(CARS)过程以使所述附加装置可产生图像和/或(iv)四波混合成像(FWM)过程以使所述附加装置可产生图像。

根据本公开的又一示例性实施方案，所述SLM装置可构造或设置为改变所述辐射的光束的形状、尺寸或流向中的至少其一以实现在至少一个样品内的双光子或三光子吸收。此外，所述SLM装置可包括纯相位SLM装置，例如其可防止所述辐射的强度显著下降。例如，所述SLM装置可包括单光学组件，所述单光学组件可单独地设置或构造为(i)透射或反射并进一步改变所述辐射，(ii)降低所述辐射的强度，和(iii)至少部分阻断所述至少一个辐射。

在本公开的再一示例性实施方案中，所述附加装置可设置为产生样品的一部分的至少一个三维图像并且将与所述三维图像相关的其它数据储存为三维数据。此外，所述SLM装置可设置或构造为以靶向方式控制所述辐射的递送，例如通过控制对于样品上或样品内的特定部位的辐射强度。而且，所述特定装置可设置或构造为在多个特定部位处同时触发该部分的光活化。所述SLM装置可提供对于样品成像面的所述辐射的特定空间轮廓。

根据本公开的又一示例性实施方案，可以提供用于产生至少一个辐射的设备和方法。例如，至少一个空间光调制(SLM)装置可构造或设置为利用所述辐射照射至少一个样品内的微观结构和/或调节所述辐射的相位以撞击所述样品和获得其至少一个深度信息。此外，所述SLM装置可容纳在至少一个基于非扫描空间光调制(SLM)的显微镜装置内。

根据本公开的再一示例性实施方案，可将时空复用束双光子激光在神经元间移动以解笼锁谷氨酸并顺序地使每个神经元触发，同时记录特定细胞内的所得突触电位。该示例性设置可有利于单突触连接细胞的检测以及待利用单细胞分辨率产生的输入标测图。该示例性方法/过程还与双光子钙成像组合以处理并同时记录回路活性。

结合所附编号段落，阅读本公开的示例性实施方案的以下详述之后，将会理解本公开的示例性实施方案的这些或其它目的、特征和优点。

附图说明

结合示出本公开的示例性实施方案的附图，根据以下详述将会理解本发明的其它目的、特征和优点。

图1(a)为根据本公开的一个示例性实施方案的显微镜的光学系统和显微系统/装置的图；

图1(b)为根据本公开的一个示例性实施方案的包括可使用衍射光学元件的光束分裂配置的装置图；

图1(c)为根据本公开的显微镜的光学系统和显微系统/装置的另一示例性实施方案的图；

图1(d)为根据本公开的光学系统和显微系统/装置的另一示例性实施方案的图，其示出可如何移动激发束以使焦点移动至样品上；

图1(e)为利用SLM的根据本公开的显微镜的光学系统和显微系统/装置的另一示例性实施方案的图；

图1(f)为利用SLM的小型轻量便携显微镜的根据本公开的光学系统和显微系统/装置的另一示例性实施方案的图；

图2(a)为与示例性的波束复用MNI-谷氨酸双光子光刺激相关的时间波束复用解笼锁的示例性图示和结果；

图2(b)为与示例性的波束复用MNI-谷氨酸双光子光刺激相关的解笼锁空间分辨率的示例性图示和结果；

图2(c)-(e)为衍射光学元件(DOE)空间波束复用解笼锁的示例性结果，而图2(c)的图与波束复用MNI-谷氨酸双光子光刺激相关；

图2(f)为波束复用双光子解笼锁的深度分辨率的示例性结果；

图2(g)和(h)为根据本公开的某些示例性实施方案的利用衍射光学元件(DOE)以水平DOE模式增强双光子成像的示意图；

图2(i)和(j)为根据本公开的某些示例性实施方案的利用DOE以垂直DOE模式增强双光子成像的示意图；

图2(k)-(o)为根据本公开的某些示例性实施方案的利用水平DOE模式进行线扫描的示例性结果；

图2(p)和(q)为根据本公开的某些示例性实施方案的利用DOE进行增强框扫描的示例性结果；

图2(r)-(t)为根据本公开的某些示例性实施方案的利用垂直DOE模式进行线扫描的示例性结果；

图2(u)和(v)为根据本公开的某些示例性实施方案的利用DOE的亚微米颗粒成像的示例性结果；

图2(w)和(x)为根据本公开的某些示例性实施方案的利用速度爆增式垂直DOE扫描模式进行扫描的示例性结果；

图3(a)为对于5个锥体神经元及其树突树的重叠形态重构的层的单细胞分辨率的示例性双光子输入标测图；

图3(b)为图3(a)相同神经元的假阳性信号的单细胞分辨率的示例性双光子输入标测图；

图3(c)为提供真阳性信号为单突触连接的示例性图形结果；

图3(d)为说明单突触连接的来自两个示例性神经元的示例性双记录；

图3(e)和(f)为来自两个其它实验的示例性单突触连接的真阳性细胞的图；

图3(g)为示出根据本公开的示例性实施方案的示例性的真假阳性反应分析的示例性表；

图4(a)为在切片的表面焦平面处(标记为0μm)检测的所有mag-Indo-1AM负载细胞(n＝635)的示例性的同时获取图形输入标测图；

图4(b)为在图4(a)的示例性标测图下方45μm处负载细胞(n＝546)的示例性的同时获取图形输入标测图；

图4(c)为通过将图4(a)和4(b)的示例性标测图重叠而得到的在两个示例性焦平面的细胞位置之间的差异的图示；

图4(d)为示例性同时获取的输入标测图的图示，其中示出在图4(a)的示例性标测图的焦平面处刺激时在补充细胞中产生真阳性反应的位置(n＝20)；

图4(e)为利用与图4(d)中所用相同的300个坐标的示例性同时获取的输入标测图，其中示出在图4(b)的示例性标测图的焦平面处产生真阳性反应的位置(n＝17)；

图4(f)为利用输入标测图重叠得到的示例性同时获取的输入标测图的图示，其中仅在两个位置处重叠，其说明在两个相邻焦平面处的选择性标测输入的能力；

图4(g)-(l)为示出例如来自四个神经元的同时获取的输入标测图的示例图；

图5(a)-(g)为经约1小时顺序获得的来自同一神经元的连续示例性输入标测图；

图5(h)为在每个标测图中产生真阳性反应的示例性位置的图示；

图6(a)为利用全光学刺激和网络活性成像的解笼锁反应的光学检测的示例性实施方案的图示；

图6(b)为利用同时成像的顺序刺激的示例性实施方案的图示；

图6(c)为另一同时刺激和成像的示例性实施方案的图示；

图7(a)为用于神经元群落的示例性靶向成像的细胞检测过程和扫描路径优化的示例性结果的图示；

图7(b)为用于神经元群落的示例性靶向成像的靶向神经元钙成像的示例性结果的图示；

图7(c)为用于神经元群落的示例性靶向成像的钙成像的单动作电位灵敏度的示例性示意图和示例性图形结果；

图8为负载的具有mag-Indo-1AM的脊索切片的示例性图像；

图9(a)-9(d)为mag-Indo-1-AM负载的大部分神经元的示例性图像，其中切片同时负载有mag-Indo-1-AM和Sulforhodamine 101(例如，SR101，20μM)并且在其对应的示例性波长处成像；

图10为可通过处理装置执行的根据本公开某些实施方案的示例性光刺激过程的流程图；

图11为根据本公开的用于SLM相位掩模形成的方法的示例性实施方案的流程图；

图12(a)-12(d)为根据本公开的示例性实施方案的示例性SLM光图案化和深度聚焦图像以及用于从示例性实验获得其结果的序列；和

图13为根据本公开的某些示例性实施方案设置的系统或装置的方块图。

除非另有说明，否则在所有附图中，相同的附图标记表示所示实施方案的相同的特征、要素、组件或部分。此外，以下将参照附图并联系所示实施方案来详细说明本公开。在不偏离如所附权利要求书所限定的本公开的真实范围和实质的情况下，可对所描述的示例性实施方案进行修改和变化。

具体实施方式

可以提供有利于利用根据本公开的一些示例性实施方案的单双光子激光进行大神经元群的光刺激和成像的根据本发明示例性实施方案实施的系统、装置和方法。

双光子显微镜的示例性光学设计和实施方案

通过根据本公开的一个示例性实施方案的处理装置(例如处理器)执行的示例性软件可促进激光束在视场中任意位点的定位和在例如对单个神经元的Indo-1AM双光子钙成像和双光子MNI-笼锁谷氨酸解笼锁(参见M.Canepari，同前；G.C.R.Ellis-Davies，同前)之间的快速切换，使它们产生动作电位。光电调制器可用于在两个激光光强度水平之间切换：低强度的用于成像，高强度的用于光刺激/解笼锁。因此，可利用激光束(例如，约725nm)来三维精确地触发并监控回路活性。

例如，根据本公开的系统和装置的示例性实施方案可改进双光子荧光(2PF)和二次谐波产生(SHG)显微镜(参见V.Nikolenko，同前；A.Majewska，G.Yiu，and R.Yuste，Pflügers Archiv-Eur.J.Physiol.441(2-3)，398(2000))。

图1(a)示出根据本公开的显微镜的光学系统和显微系统的一个示例性实施方案的图。

例如，根据某些的示例性实施方案，如图1(a)所示的示例性显微镜可包括(但不限于)以下示例性组件：Ti：蓝宝石激光器101、光电调制器(普克尔盒)102、波束成形光学器件(望远镜/空间滤光器)103、包括DOE104和DOE望远镜105的衍射光学元件(DOE)光学器件、潜望镜106、扫描器107、直立式显微镜108和基于光放大器(PMT)的2PF/SHG检测系统，其包括2PF PMT 109、PMT信号放大器110、数据获取模块111和亮场照明灯或用于2PF/SHG的第二PMT 112。示例性的波束成形光学器件103可包括聚焦透镜103a、针孔103b和透镜103c。示例性的DOE望远镜105可包括透镜105a、波束选择光圈105b和另一透镜105c。示例性的扫描器107可包括红外反射镜107a、镜式电流计107b和光瞳转移透镜107c。示例性的直立式显微镜108可包括低通分色器108a、管式透镜108b、物镜108c和聚光器108d。示例性的2PF PMT 109可包括IR阻隔宽通或带通滤光器109a、PMT透镜109b和快速快门109c。

根据某些的示例性实施方案，可以使用一个或更多个以下组件：可调Ti：蓝宝石(例如，Chameleon；Coherent，Santa Clara，CA)、型号275线性放大器驱动的型号350-160普克尔盒(Conoptics，Inc Danbury，CT)、中间介电镜(例如，Thorlabs，Newton，NJ的BB1-E02)、衍射光学元件(例如，熔融二氧化硅，来自SLH-505Xa-(0.23)-(780)Stocker Yale Canada Inc.，Dollard-Des-Ormeaux，Quebec，Canada)。光路的其它元件可由标准组件(例如，Thorlabs)组装。直立式显微镜(例如，Olympus BX50WI)配备有水浸没物镜(例如，Olympus镜头)。

例如，LUMPlanFI/IR 40x 0.8NA透镜(例如IR2涂层)可用于使DIC中细胞靶向膜片钳制和少量神经元的高分辨率双光子成像和光刺激，而低放大率物镜(例如，UMPlanFI 20x 0.5NA，XLUMPlanFI 20x0.95NA和UMPlanFI 10x 0.3NA)可用于神经元群的成像/光刺激。低通分色镜(例如，650DCSP；来自Chroma Technology，Rockingham，VT)可置于示例性显微镜的标准三目管内。红外阻断滤光器(例如，Chroma Technology的BG39)可置于PMT之前以滤除从激发路径散射的红外光。作为检测器，可以使用具有附加放大器(例如，PE 5113，来自Signal Recovery AMETEK Advanced Measurement Technology，Wokingham，UK)的冷GaAs PMT(例如，H7422P-40，来自Hamamtsu Corp.，Japan)。快速机械快门(例如，VCM-D1驱动的LS6T2，来自Vincent Associates，Rochester，NY)可用于保护PMT以在同时成像/解笼锁的实例中防止过载。

PMT信号可通过例如光栅模式的Fluoview板或通过矢量模式的外部A/D板(例如，NI PCI-6052E，来自National Instruments，Austin，TX)来数字化。该板也可按照根据本公开的一些示例性实施方案的客户软件的模拟输出来调制穿过普克尔盒的激光强度。相同的示例性软件可通过直接调用原始文件夹中的函数(例如，gbx.dll；FV200 Olympus Fluoview Basic)(参见V.Nikolenko，同前)来控制扫描镜的位置。根据本公开的示例性软件可由处理装置(例如，处理器、计算机等)执行。其可提供在例如LabView编程环境(National Instruments)中并与计算密集过程例如细胞轮廓检测或旅行销售员路径计算的集成软件程序(例如，MATLAB，来自The Mathworks，Natick，MA)通信。

图1(b)示出说明根据本公开的示例性装置之实施的图120，该装置有利于利用根据本公开的示例性实施方案的DOE 121的波束分裂。DOE121可以是例如图1(a)所描述和显示的DOE 104。波束122可一起聚集在镜式电流计123上，其可扫描和传送波束124用以激发样品。示例性的望远镜125可改变输出子束126的尺寸，因而可在DOE望远镜复合体128之前使用预定尺寸的望远镜127。可以利用例如光放大器管(PMT)129和/或CCD照相机130来进行图像采集。

图1(c)示出根据本公开的显微镜的光学系统和显微系统的另一示例性实施方案。例如，该示例性光学系统和显微系统可包括例如：源(超快激光器)131、普克尔盒132、波束尺寸调节望远镜133、半波板134、潜望镜135、慢机械安全快门136、DOE 137、DOE成像望远镜138、任选的0级波束屏障139、扫描反射镜140、扫描(或“光瞳转移”)透镜141、直立式显微镜142、检测系统143、用于PMT检测的电流-电压转换器/信号放大器、数据获取单元145、任选的二级检测器(照相机或PMT)146和用于数据获取和设备控制的PC 147。

根据本公开的某些示例性实施方案，普克尔盒132可通过电压输入和调节激发激光强度来控制并且可实质上作为快速“快门”工作。波束尺寸调节望远镜133与DOE 108组合可在显微镜的输入端口提供常规尺寸的波束以适当填满显微镜物镜的后出光口。根据所用DOE的类型，半波板134可用于改变衍射效率和使0衍射级的子束的强度等于其它子束的强度。潜望镜135可包括将激光束传输至直立式显微镜的输入端口的反射镜。DOE成像望远镜138可将DOE 137表面的图像传递至接近扫描镜140的平面。不使用例如任选的0级波束屏障139或除此之外，可以使用薄金属棒用于该示例性目的，其可与设计或构造为产生在中心部位没有子束的图案的DOE一起使用，该DOE产生不期望的0级子束。

示例性的直立式显微镜142可包括用于双光子荧光检测的标准分色器142a、管式透镜142b、显微镜物镜142c和显微镜亮场照明聚光器142d。检测系统143可检测较短波长的光并且包括例如仅包括发射波长光的带通滤光器143a；在成像端口(一个端口可用于常规全场PMT检测，而另一个端口用于利用照相机快速成像)之间转换的标准显微镜三目管143b；冷CCD照相机143c和任选的用于常规慢扫描成像的PMT143d。任选的第二检测器(例如，照相机或PMT)146可用于将光学信号(例如，双光子激发荧光或二次谐波产生(SHG)信号)集中在前向上。

使用衍射空间光调制器的前体可以是许多复合光学系统(例如，激光扫描显微镜的激发光路，其可用于生物成像)可被视为通过例如透镜、扫描系统等的组合进行的波前调制器，用于多种不同的成像模态。例如，对于基于非线性现象的复合光学系统(例如，双光子荧光或二次谐波产生成像等)而言，激发路径可以是采用常规扫描方法时限定样品的受激点的路径。显微镜物镜可如调制器类型一样操作并且将来自激光源的准直波束(例如，平面电磁波)转换成球面电磁波，其会聚在焦点处从而产生来自该点的光学信号。

图1(d)示出根据本公开的显微镜151的示例性实施方案，其包括例如扫描系统151(a)(包括例如镜式电流计)，其可激起激发波束152、153(例如，改变平面波152的传播方向)并因而将焦点154移动到样品平面上以聚集来自样品不同位点的光学信号。根据所用的成像模态，光学信号也可是可被成像光学器件例如光放大器或照相机检测到的电磁波。

除了本文所述的基本光学转换(例如，通过物镜151(b)的平面波152到球面波153的转换)之外，透镜还可起到光学傅里叶控制器的更一般功能，用于进行将位于远离透镜平面的源所产生的电磁波(例如，近似平面波)的空间频率转换成位于焦平面上并对应于透镜后波阵面(例如，球面波)的虚拟点源的位置。关于光学傅里叶变换的附加信息和实例可见例如Lehar，Steven，“An Intuitive Explanation of Fourier Theory，”可见http://sharp.bu.edu/～slehar/fourier/fourier.html，最近访问日期为2009年9月23日。

因此，显微镜可以是复合的光学调制器，其可以不同方式将来自光源的光的波阵面改变成样品中的波阵面以进行成像。因此，在根据本公开的显微镜装置的某些示例性实施方案中，整个激发光路(或至少可激起波束的其动力部分)可被单元件衍射光学调制器替代，以实施新的复合成像策略，例如同时激发数个点。这种能够例如几乎通用转换光波阵面的示例性调制器可称为衍射空间光调制器(SLM)。

可根据本公开的某些示例性实施方案使用的SLM的实例可以是基于向列式液晶的二维基体的，其中每个像素可用于局部延迟波阵面。示例性SLM的一个示例性特征可以是其可不包括移动部件。因此，波束扫描例如可以通过仅向调制器发送不同图案来进行。一个示例性SLM还可适用于非线性成像，这是因为超快脉冲的分散可认为是可忽略的。

图1(e)示出根据本公开的使用SLM的光学系统和显微镜系统/装置的另一示例性实施方案和设计的图。例如，该示例性光学系统和显微镜系统可包括例如激光源161、光纤162、准直透镜164、SLM 165、计算机166、照相机167、滤光器168、透镜169、分色器170和其下方可放置样品160的物镜171。

如本文所述，通过将复杂度从硬件(例如，光学方案)转移至软件(例如，计算相位掩模)，可以得到根据本公开的示例性SLM基显微镜，其可具有最小数量的常规光学元件(例如，透镜)并因此在光学结构上得到简化。

图1(f)示出根据本公开的某些示例性实施方案的基于SLM的显微镜的图。例如，如图1(f)所示，该示例性光学系统和显微镜系统/装置可包括例如：准直透镜184、SLM 185、照相机187、滤光器188、透镜189、分色器190和其下方可放置样品180的物镜191。图1(f)所示的示例性显微镜可以与图1(e)所示的示例性装置相同或不同。

这些示例性显微镜可例如改善功率效率并可以小型化和轻量化至可以手持的程度。其也可相对廉价，从而在比常规显微镜的可能应用更广泛的应用中提供更大的用途以及提供根据本公开的某些示例性实施方案的更大的示例性显微镜。例如，用途和应用可包括例如SLM双光子(2P)光刺激和/或成像(具有例如更低的功率限制)、单光子(1P)光刺激，例如用于体内和/或其它医学应用、药物发现和/或递送以及体内2P显微术。其还可以吸引可能因为现有技术中所预见的技术复杂性而通常不使用2P和成像的用户。

激发问题和检测问题可以分开，这是因为光学性能的目标(例如，终端用户的目标)可不同。例如，激发路径可为了例如光刺激(通过例如光可活化化合物、基因修饰神经元等)而提供功率递送或用于多点成像。光可活化化合物可包括例如大部分可被电磁波活化的化合物。除了活化之外，光刺激(或光活化)可包括例如抑制、失活和改变细胞内的生物代谢过程等。

根据本公开的某些示例性实施方案，SLM自身可构造或设置为实施复合光学器件的功能，如上所述。例如，可通过具有例如约0.1NA的数值孔径的示例性SLM(例如，对于具有HDTV分辨率的给定孔径/尺寸的示例性SLM而言)来提供示例性的虚拟透镜。根据SLM的另一特定示例性实施方案，数值孔径可更大。无论是否可被2P应用所接受，数值孔径的尺寸对于1P应用的重要性较低。例如，对某些应用而言，数值孔径越大可能越有利(例如1P体内光刺激，其中可优选大的工作距离)。

因此，对于1P应用(例如，使用Ru化合物)而言或者当2P-发色团不可用(ChR-2)时，显微镜可简化为只有光源161(例如蓝色激光器或常规可见光光纤)和示例性SLM 165。对于光学组件，例如激发路径可包括示例性透射SLM 165和单模式光纤162。在某些实例中，可优选SLM 165保持偏振。因此，有可能不需要0级阻断，这是因为从光纤传播的非衍射光可能离焦(例如，可认为是类似于偏离中心但在轴向上的构造)，所以。对于2P应用，例如，可在SLM 165后使用常规显微镜物镜以得到更好的聚焦。

为了将根据本公开的示例性显微镜简化、轻量化以及尺寸紧凑，可以使用可传输超快脉冲的光子晶体能带隙光纤，其可有助于提供真正便携的双光子显微镜。为了使根据本公开的示例性显微镜甚至更便携，可用更小的东西例如紧凑型超快光纤激光器替代Chameleon。例如，来自IMRA的激光器可适合本公开的某些实施方案，这是因为其可被认为非常小并且目前可得到780nm和800nm的型号。在选择紧凑型超快光纤激光器时考虑的其它因素可以是例如功率、成本等。

发射路径(用于成像)的实例：甚至对于纯粹的光刺激应用，首先靶向光刺激区域(例如，定位细胞体)可以是有用的。虽然此类靶向可通过完全分离的系统(例如，紧凑型LED基宽场照明器和小型照相机)来实施，但是根据本公开的某些示例性实施方案可使用SLM进行此类型的靶向，例如SLM也可用来执行如本文所述的所有其它功能。如果目的只是获取校准图像，则速度可能不那么重要，因为这通常可能仅一次就完成了。例如，使用光检测器(例如，光放大器(PMT)或微型雪崩式光电二极管)，可以使用根据本公开的某些示例性实施方案的SLM来扫描视场。虽然获得高分辨率2D图像所需的时间长于其它方式可能需要的时间，但是本实例可被认为便于实施(例如，可使用软件来计算相位模式，而不是直接依赖于复杂的算术)。在本公开的某些示例性实施方案中，2D检测器可用于更快地成像。例如，也可使用与微通道板图像增强器耦联的微型照相机。

用于实施根据本公开的某些示例性实施方案的2D检测器的示例性阶段可包括例如：

1.获得透射SLM，建立手持式的仅SLM的1P显微镜，测试1P刺激应用，不进行综合成像；

2.利用仅SLM+点光检测器来测试成像

3.增加物镜透镜-测试2P功率传送；

4.利用光检测器测试2P成像；

5.增加2D检测器，开发快速成像方案；

6.引入超快光纤以使2P模型便携；和

7.用紧凑型光纤激光器替换Chameleon。

可用于根据本公开的某些示例性实施方案的2D检测器中的示例性组件可包括例如：

1.透射SLM；

2.将所有器件结合在一起的小型模拟板；

3.固定器/转接器/透镜(例如，得自Thorlabs)；

4.检测器：雪崩式光电二极管/微通道2D检测器(科学等级或得自夜间护目镜)；

5.光纤，例如：

约472nm的1P蓝色激光器，和

用于780nm或800nm 2P的约1-1.5m的超快光纤(例如，得自Crystal fibers)；

6.光纤排列装置(例如，得自Thorlabs)；和

7.IMRA激光器。

附加的示例性益处和/或优点可包括例如：建立外接模块的能力，所述外接模块能够将1P成像设置升级至1P解笼锁(例如，使用新开发的Rubi-笼蔽化合物类，例如Rubi-谷氨酸和Rubi-GABA)和/或利用基因修饰细胞的光刺激和2P解笼锁/空间选择成像，以提供可用于广泛类型的应用的便携式解笼锁器(例如，Rubi-笼锁可用于例如光动力疗法)。可考虑的其它因素可包括例如：液晶SLM的时间分辨率(可认为对于光刺激和/或结构照明成像不重要)、功率传输(尽管功率高效率激光器可抵消对于功率的关注)以及使用单计算机运行快速成像和计算相位模式。

示例性复用激光解笼锁

可以提供根据本发明示例性实施方案的光学方法和系统以利于利用笼锁谷氨酸可靠地激发神经元。双光子激发的点散布功能可能过小而不能释放足够的游离谷氨酸来使神经元有效去极化至动作电位阈值。为了使神经元可靠地激发动作电位，可以在靶细胞胞体上方设置数个解笼锁位置以同时进行光刺激和钙成像。

例如，图2(a)-(c)示出与利用波束复用的示例性MNI-谷氨酸双光子光刺激相关的图。

具体而言，图2(a)示出可利用时间波束复用解笼锁的示例性结果的图。具体地，图像210提供形成圆圈的三组12个解笼锁靶211的位置和示例性膜片细胞，它们可以顺序进行刺激(2.5ms/点)。图2(b)中提供的点212代表成像靶。比例尺可以是约10μm。

图2(b)示出解笼锁的空间分辨率的示例性结果图。例如，上部迹线221表示在图2(a)所示位置处解笼锁期间神经元的示例性电生理学记录。如该示例性附图所示，位置1中的解笼锁可触发动作电位爆发。保持电位可以是例如约65mV。下部迹线222表示示例性激光脉冲。如在图2(b)的示例性位置2和3中所示，可以不总是达到动作电位阈值。

此外，图2(c)-(e)示出利用衍射光学元件(DOE)空间波束复用进行解笼锁的示例性结果的图。具体而言，图2(c)示出可通过利用线性DOE图案刺激示例性神经元得到的示例性结果的图。点231表示解笼锁靶，点232表示成像靶。比例尺可以是约10μm。

图2(d)示出其中DOE 240在空间上分裂激光束241产生可同时照射5点的图案242从而缩短达到动作电位阈值所需的解笼锁时间的实例的图。例如，DOE 240和顺序复用可组合，如图2(c)的实例所示，因而总共照射20个点，每次5个点。图2(e)示出DOE光刺激的实例的图，说明更快的解笼锁时间，如线251所示，以产生尖峰，如尖峰252所示。与图2(e)的实例相关的示例性图可类似于与图2(b)相关的图。

图2(f)示出波束复用双光子解笼锁的深度分辨率的示例性结果的图。例如，曲线254表示在不同深度处通过解笼锁脉冲诱发的动作电位数目，相对于可诱发的动作电位的最大数目进行归一化。曲线255表示每个焦平面的双光子荧光，相对于对应胞体的最大荧光进行归一化。如图所示，在曲线254、255之间可存在封闭对应关系。因此，双光子光刺激的轴向分辨率可紧密追踪双光子荧光成像的3D分层性质。可利用例如具有20x 0.5NA物镜的示例性4x3ms、5子束DOE方案进行示例性解笼锁。误差柱256可以是平均值的标准误差(SEM)。

回到图2(a)的示例性图示，示例性的“复合”刺激靶(参见S.Shoham，同前)211可具有类似于示例性受刺激神经元210的直径，并且其解笼锁反应的空间分辨率也可与细胞体的平均直径相当。为了同时成像和解笼锁，可以将单个成像靶定位在刺激靶中心，如在示例性刺激靶211中心的示例性成像靶212所示。

为了改善解笼锁的时间分辨率(例如，减少达到动作电位激发阈值所必需的时间)和更有效地利用可得的激光功率，可以将激光束241光学分裂成几个紧密间隔的子束243，用于围绕细胞胞体的几个不同空间位置的同时解笼锁。如图2(d)的示例性图所示，这可通过利用示例性DOE来进行(参见Froner E Sacconi L，Antolini R，Taghizadeh MR，Choudhury A，Pavone FS.，Opt Lett.28(20)，1918(2003))240)，其可以是例如应用于非线性显微镜的高效单元件分束器。该示例性DOE 240可在远场中产生示例性对称线性5-点图案242(例如，第一衍射级)。例如，示例性DOE 240可置于与扫描镜平面光学共轭的平面上的光学台上，如本文以下参照图7(a)-7(c)所述。中间望远镜的放大倍数可根据显微镜的物镜透镜进行调节，以产生覆盖例如大约神经元胞体244尺寸的例如5个子束243的图案。

与复合靶231组合使用示例性DOE 240可有利于较短解笼锁脉冲的使用。大部分神经元可被10-13ms的解笼锁脉冲刺激产生约3-7个动作电位的短爆发，并且可以利用短至5ms的解笼锁脉冲诱发单个动作电位，如图2(e)中的示例性脉冲253所示。示例性DOE 240很可能不仅提高解笼锁的效率，而且改善用于矢量模式成像的点测量的信噪比，这是因为PMT可例如对被独立子束243同时照射的5个空间上不同的胞体位置210进行采样。

可以通过在系统地改变解笼锁激光的焦平面的同时，监测神经元的动作电位反应和双光子荧光二者来测量这些示例性波束复用解笼锁方法的轴向分辨率。例如，约30μm的轴向位移可有效地防止神经元对解笼锁脉冲作出反应，如图2(f)的示例性图的示例性迹线254所示。双光子荧光曲线图也可取决于焦平面，由图2(f)示出的示例性迹线255表示。这些示例性结果表明根据本公开的示例性解笼锁方法的光学分层能力，例如双光子激发的内在性质。

利用衍射光学元件的双光子成像

图2(g)和(h)示出示例性实施衍射光学元件(DOE)以增强根据本公开的某些示例性实施方案的水平DOE模式双光子成像的示意图。

例如，图2(g)示出常规光栅扫描成像可能需要的反射镜系统扫描激发波束穿过视场的的时间并且可对于在可能发生光损伤前的可激发量具有一定的最高限度。图2(h)示出使用衍射光学元件(DOE)260可以将波束261分裂成大量子束262。利用子束262水平散布，可以利用可允许将每个像素处样品的激发信号汇集得到更大的信号并提高信号的信噪比的方式进行成像。水平DOE模式或“兴奋性爆发”的根据本公开的示例性实施方案可用于例如线扫描或全场帧扫描，这例如可能会损失一些空间分辨率。

图2(i)和2(j)示出根据本公开的某些示例性实施方案的利用衍射光学元件(DOE)增强垂直DOE模式的双光子成像的示意图。

垂直DOE模式或“兴奋性爆发”的根据本公开的示例性实施方案可实现比常规光栅扫描更高的扫描速度。通过在视场的垂直区域使DOE产生的子束的间隔变宽和同时使每个子束水平穿过视场窄条进行扫描，可以在单波束所需大致相同时间量的1/(子束数)内激发整个视场。例如，如分别指向每个视场图265和266左侧的箭头263和264所示，在标准光栅扫描模式中，单波束必须沿视场的整个高度进行水平线扫描(例如，箭头263)。相反，在示例性的速度爆增模式中，每个子束可同时扫描视场的垂直区域的一部分(例如，箭头264)。由于多于一个区域可同时被激发，所以其分辨率至少等于子束数目的照相机或其它类似的广视场光(或电磁波)收集装置(例如，光电二极管阵列或多阴极光放大器管)可与该示例性方法一起使用。

图2(k)-2(o)示出利用根据本公开的某些示例性实施方案的水平衍射光学元件(DOE)模式进行线扫描的示例性结果。

图2(k)示出利用常规单波束激发(图像271)和示例性5子束激发(图像272)获取的充有Fura 2五钾盐的神经元270的示例性全帧光栅扫描图像271和272。如图所示，利用多子束，神经元图像可能会轻微模糊，但是窄间距可使这种模糊最小化至细胞清晰可辨的程度。这些图像可用于选择线扫描的水平(例如，在每张图像中的白色水平线273和274)。

图2(l)示出利用单波束(图像275)和多波束(图像276)激发的80次扫描/秒获取的线扫描结果。如图所示，时间可表示为水平轴，每个垂直柱表示一次扫描。出于显示目的示出包括细胞胞体的示例性线扫描空间限制程度。在光学记录期间，神经元被膜片钳制并被驱动激发动作电位。

图2(m)示出图2(l)所示的示例性线扫描的强度-时间曲线图的示例性图。如图所示，每个图中的不同亮度单位的原始亮度强度可调节成基本相同。可观察到钙瞬变现象对应于在整个细胞膜片钳电流钳迹线中所指示的动作电位激发的次数，例如如图2(o)所示。在该实验中，诱发细胞产生数量逐渐增加的动作电位，从1开始到5结束。在两个成像区域中，钙瞬变现象对应于动作电位数量而单调上升，但是在5子束的示例性实施方案中可以更清楚地观察到。图2(n)所示的结果来自于图2(m)实验相同的数据，但是重新绘图使得在迹线277和278两种情况下偏离基线的百分比(DF/F)相同。如图所示，给定数目的峰诱发的钙瞬变现象在两种条件下具有大致相同的幅度，但是在5子束实验中噪声下降，表明使用DOE成型可能具有更高的信噪比。在该实验中，在所示的示例性兴奋性爆发DOE成像结果中，相对于该实验中的单波束成像，信噪比提高约1.91±0.24倍(n＝5个信号)。

图2(p)和(q)示出利用根据本公开的某些示例性实施方案的衍射光学元件(DOE)的增强帧扫描的示例性结果。

图2(p)示出利用常规单波束激发(图像279)和5子束激发(图像280)获取的大量充有Fura 2-AM钙指示剂染料的神经元群的全帧光栅扫描图像。该实验显示水平DOE模式会略微降低空间分辨率，但是不会降低到单个细胞的分辨率通常被认为有问题的程度。图像279和280是影像的平均单像素投影的结果。图2(q)示出图2(p)中箭头282所示的细胞281的所示视场的延时影像的强度-时间曲线图。图像283和284中的比例尺相同，其中纵轴以亮度单位为单位，横轴以秒为单位。在光学记录期间，所关注的神经元281被膜片钳制并被驱动激发成组的三个动作电位。可观察到钙瞬变现象对应于动作电位激发的次数(如箭头285和垂直线286所示)。在该实验中，兴奋性爆发多波束的兴奋性爆发帧扫描模式相对于单波束成像的信噪比平均提高1.95±0.72倍。

图2(r)-2(t)示出根据本公开的某些示例性实施方案的垂直衍射光学元件(DOE)模式进行扫描的示例性结果。

图2(r)示出利用在视场上垂直散布的多个波束对纸样品进行渐进式全视场扫描并用CCD照相机拍摄的结果。图像287a是“线扫描”，其产生数目等于子束数目的多个兴奋性线。从图像287a向右移动至图像287b-d，可以看到该系统所进行的扫描图示的结果。对于每个图像287a-d，允许子束扫描更长的时间，最终利用照相机拍摄的每一帧覆盖全部视场。

图2(s)示出利用具有PMT检测的常规单波束对膜片钳制的神经元进行全帧扫描的结果。以1帧/秒获取实验影像。该图示出箭头288a所指示细胞288的强度-时间曲线图和膜片钳记录，该细胞被驱动爆发数目逐渐增加的动作电位(例如，每次爆发的动作电位的数目由迹线289下方指示，并且以具有垂直虚线289a的成像迹线指示时序)。强度迹线的纵轴以强度单位为单位，横轴以秒为单位。

图2(t)示出利用11个子束激发并用CCD照相机成像的神经元群的垂直DOE扫描的示例性结果。以10帧/秒采集实验影像。如迹线290中的峰290a所示，例如利用基于DOE的成像所产生的钙指示剂示踪比利用单波束光栅扫描更容易观察到对应于2或3个动作电位的爆发次数的钙瞬变。此外，虽然在两种情况下9-11个动作电位/次爆发所产生的钙瞬变可易于区分(例如，通过峰290b)，但是发现在该示例性速度爆增成像实验中它们具有约2.15倍的更大信噪比。

图2(u)和(v)示出利用根据本公开的某些示例性实施方案的衍射光学元件(DOE)的亚微米颗粒成像的示例性结果。在该实验中，利用单波束292(图像291和图2(u))和帧扫描模式的5子束294DOE(图像293，图2(v))对0.5μm荧光颗粒进行成像。利用约800nm的约30mW总功率对样品上的颗粒进行成像。在成像软件中使用约5-7mW/波束与10x缩放倍率的20x 0.95NA物镜。在该实验中，存在具有1.5μm的子束间距和7.5μm的5子束总散布的0.2μm/像素。

图2(w)和2(x)示出利用根据本公开的某些示例性实施方案的速度爆增垂直衍射光学元件(DOE)扫描模式和速度爆增模式设备同步进行扫描的示例性结果。

在该实验中，针对扫描的时序和协同，在速度爆增模式垂直DOE扫描模式期间的照相机曝光和激光强度，将CCD照相机曝光与基于镜式电流计的扫描时间获取进行同步。如图2(w)所示，当只要示例性扫描软件发送输出指示主动扫描就将CCD芯片简单曝光时，出现对角线的假像296(斜箭头296a指示)。当特别控制全强度激光脉冲持续时间和将激光功率下调至0时，可以消除该假像，如在图像295b中所可见。

该效应可能是由于“回扫”(参见例如图2(x)中的回扫296)或在准备其下一次扫描时镜式电流计从其最终位置到初始位置的移动所致。在该实验中，发现在给定该实验中使用的某些成像和扫描系统的各个反应时间的情况下，允许电流计系统独立运行和使照相机帧定时和激光强度服从该系统的定时比反过来工作得更好。控制激光功率的电压脉冲经由普克尔盒设定，以根据扫描细节持续特定的毫秒数。此外，示例性的照相机曝光控制通过结束帧扫描输出而停止并且立刻重新开始而不错过下一次扫描的开始。

对于利用衍射光学元件的双光子成像的其它实例和实验，参见Watson，Brendon O.，Nikolenko，Volodymyr，and Yuste，Rafael，Two-photon imaging with diffractive optical elements，Frontiers in Neural Circuits，3，1(2009)。

示例性的具有单细胞分辨率的突触输入的双光子标测

图3(a)-(f)示出根据本公开的示例性实施方案的具有单细胞分辨率的双光子输入标测的根据本公开的示例性结果的图。

具体而言，图3(a)示出5个锥体神经元的层和其树突树311的重叠形态重构的示例性输入标测图，在该实例中，如图3(a)的上图310所示，区域312可勾画出受刺激神经元的轮廓。其它区域可以是所有“真阳性”细胞的轮廓，这可以例如根据峰值EPSP幅度进行编码。比例尺可以是约100μm。虚轮廓线314表示示例性的膜片吸管。下图315示出在解笼锁期间来自膜片钳制细胞的示例性电压记录316(上迹线)，在利用箭头318标示的位置中的示例性对应激光脉冲317(下迹线)。保持电位可以为例如约-65mV。

图3(b)示出对于同一神经元的假阳性信号321的示例性标测图320。如该实例中所示，可以追踪示例性树突树311的形态。下图325示出分别在箭头328和329标示的对应位置中的解笼锁期间的假阳性信号326和327的记录。如在该示例性图示中所示，可以提供在真假阳性信号之间的动力学和幅值差异。

图3(c)示出假定真阳性信号可以是单突触连接的示例性结果的图。可将箭头332所指示的示例性突触后神经元331膜片钳制并且可以顺序刺激由点333所标示的所有神经元。如该实例所示，由点334所表示的神经元可产生真阳性信号并随后被膜片钳制。如图所示，在神经元331和334二者之间可存在显著的距离。比例尺可为约50μm。

图3(d)示出来自两个神经元331和334的示例性双记录的图，其可揭示单突触连接。如图3(d)所示，可通过在推定的突触前神经元334中进行电流注射来诱发动作电位，这可由迹线341表示，并且可导致在突触后神经元331中的锁时EPSP，如迹线342所示。如在图3(d)的放大图343中所示，可以提供在动作电位触发和EPSP之间的对应性。二个神经元均可保持在例如-63mV。

图3(e)和(f)示出两个其它实例的单突触连接的真阳性细胞的根据本公开示例性实施方案的图。

例如，对不同神经元的突触输入的标测可以通过利用来自选定神经元的电流钳的电生理学记录和对来自小鼠的躯体感觉皮质和视皮质的切片中的周围区域中的大部分或全部标记神经元(例如，图3(a)，n＝169标测图)进行光刺激来进行，亦如本文所述。可以使用AM-染料负载来标记皮质神经元，这不同于鉴定神经元/层/皮质区域的其它方法，这些方法过去可能已用于单光子解笼锁标测，例如红外导引显微术(参见，H.U.Dodt，同前)。在一个典型的示例性实施方案中，使用10x物镜和1.5x扫描缩放，示例性方法可以检测例如在单个焦平面上的约700-1000个负载的细胞，下文参照附图8进行更详细的描述。这些参数可便于例如使单视场中的所有皮质层可视化。虽然可以刺激每个单个细胞以在合理的时间内完成方案，但是可以采取任意特定或伪随机方式将所刺激的神经元数目限制在例如500个靶向神经元。作为对照，例如，可通过在光刺激方案结束时进行解笼锁来刺激膜片钳制的细胞。

在本文所述的示例性标测方法和结果中，可遇到两种不同类型的突触后反应，例如对解笼锁脉冲317、327的锁时，分别如图3(a)、(b)的实例所示(还参见，例如图3(g)的表361)。这些示例性事件可非常类似于在单光子谷氨酸解笼锁期间所描述的两类事件(参见，R.Kotter，同前)：可通过突触前光刺激细胞中动作电位的短爆发诱发复合单突触EPSP(例如，“true positives”313，如图3(a)的示例性图示所示)，以及更短等待时间的更大更慢的去极化，这可通过对膜片钳制细胞的远端树突进行直接解笼锁而引起(例如，如图3(b)所示的“假阳性”321)。虽然在示例性的负载条件下树突可能不可见，而且只有细胞体可被刺激方案所靶向，但是树突在刺激区域附近通过并由此被直接刺激仍然是可能的。可以基于其对解笼锁脉冲的不同触发动力学和等待时间来区别真假阳性，并且在这些测量得到的变量中可存在统计学显著的差异(参见，表361)。此外，将膜片钳制神经元的树突的形态重构与输入标测图重叠可示出假阳性信号可追踪突触后细胞的树突树311，如图3(b)所示，而真阳性信号313则很可能不会这样，如图3(a)所示。

可通过施用钠通道阻断剂TTX(1μM)阻断切片中动作电位的产生从而防止所有诱发突触释放来确认对真假阳性反应的分类。通过实施采用TTX的标测实例，因此可以得到假阳性信号的标测图并将其与不使用TTX的假阳性手工分类进行对比。这些示例性的对照实例可表明，错误地将假阳性信号计数为真阳性的可能性将可能非常低(例如，平均0.45％，n＝17标测图。相反，采用手工分类标准，可能比假阳性的TTX限定更严格。例如，尽管99.3％的TTX假阳性也可被手工分类所确定，但是仅有84％的手工标记的假阳性可随后被TTX标测所确认。

此外，利用双重全细胞记录，可以确认被解笼锁刺激后产生真阳性信号的神经元实际上是单突触连接至膜片钳制的突触后神经元的(参见，例如图3(c))，这是因为动作电位后可产生的EPSP在推定的突触前神经元中被触发，这可具有短突触延迟(例如，0.79±0.04ms；峰值EPSP幅值：1.68±0.11mV；3/3对记录)。

突触性质的示例性功能标测图

根据本公开的方法和装置的示例性实施方案不仅可促进推定的突触前神经元的识别，而且可促进其突触性质的测量，例如单一突触EPSP的幅值或发生/抵消动力学，并且可根据突触前和突触后神经元的胞体位置产生其分布的示例性标测图(对于示例性的幅值标测图，参见例如图3(a)和9(a)-9(d))。因为解笼锁在受刺激的细胞中产生几个短爆发的动作电位，因此也可以例如对每个输入细胞测量更复杂的突触性质，例如促进/抑制速率、复合EPSP的总幅值、几个光刺激脉冲后的适应等。

三维的示例性输入标测图

为了证明解笼锁的光学分层能力和示例性输入标测图的精确性，可以在分离45μm的两个不同焦平面上进行示例性标测，如在例如图4(a)-4(f)的图示中所示，其示出三维的示例性标测输入。

具体而言，图4(a)示出全mag-Indo-lAM负载细胞411的示例性标测图410的图示(n＝635)，其可在示例性切片412的表面焦平面上检测到(标记为0μm)。可刺激这些635中的300个位置以测试潜在的连接性。在该图的略图中示出了示例性膜片吸管413。示例性的比例尺可为约100μm。图4(b)示出负载细胞421(n＝546)的示例性标测图420，其可在图4(a)所示的示例性标测图下方45μm。这两个示例性焦平面处的细胞位置之间的示例性差异可通过图4(c)的示例性标测图430的重叠而显示出。图4(d)示出其中在图4(a)的示例性标测图410的焦平面处受到刺激时位置441(n＝20)可在膜片钳制细胞中产生真阳性反应的示例性标测图。图4(e)示出示例性标测图450的图示。如图4(e)中所示，在图4(b)的示例性标测图420的焦平面处，示例性位置451(n＝17)可产生真阳性反应。可进行测试的300个坐标可与图4(d)中所用的相同。图4(f)示出利用输入标测图重叠的示例性标测图460。如图4(c)中的实例所示，仅在两个位置461处重叠是可能的，表明在两个相邻焦平面处选择性标测输入的能力。

可实施这种示例性的分离以利于相邻焦平面上的神经元不被刺激。如图所示，可得到在两个不同焦平面上的连通性标测图之间的可忽略的重叠。例如，在300个靶坐标中只有2个可在一个焦平面上被选出以同时在两个焦平面上产生真阳性反应。这可能是因为根据本公开的该示例性双光子解笼锁方案的光学分层能力。因此，可以建立深度分辨率与例如神经元细胞体平均尺寸相当的独立输入标测图。

来自相邻细胞的实验性输入标测图

图4(g)-(l)提供从例如4个神经元A 476、B 477、C 478和D 479同时获取的输入标测图471-476的图示。如图所示，可通过来自几个神经元的同时记录来进行示例性标测以改善根据本公开的部分示例性方案或方法的效率。如在该实例中所示，这样的效率改善可因为可在该示例性方案的单次运行期间得到几个输入标测图而完成。

例如，根据一个实验，对于总共169个标测图，可以记录26个单细胞标测图、16个成对神经元的同时标测图、25个三细胞标测和9个四细胞标测图。感兴趣的结果可能是，甚至位置非常接近的同一类(例如，大层5锥体)神经元也可具有非常不同的输入标测图，如图4(g)-4(l)中所提供的示例性图示所示，其指示例如在同一皮质区域中可叠加皮质神经元的功能独立网络(参见，Y.Yoshimura，J.L.Dantzker，and E.M.Callaway，Nature 433(7028)，868(2005))。

输入标测图的示例性可重复性

还可以检验示例性输入标测图的稳定性和根据本公开的示例性刺激方案和分析的可重复性，例如这可利用其缩短版本例如所得的每个输入标测图的间隔时间为约5-8分钟来进行。

图5(a)-(h)是实施本公开的示例性实施方案得到的示例性输入标测图的可重复性的示例性图像，其中n＝7个突触后神经元。

例如，图5(a)-(g)示出来自同一神经元500的连续示例性输入标测图的图示(由示例性的吸管轮廓509的尖端标示)，这可经约1小时依次获得。亮区显示所有被刺激的细胞510，暗区显示产生真阳性的那些细胞511。图5(a)-5(g)的下方图512-518分别示出示例性EPSP，由上部迹线519-525指示。示例性EPSP可通过箭头535所指示的具有约-65mV的示例性保持电位的黑细胞534的解笼锁(下部迹线526-532；激光脉冲533)而产生。图5(h)示出说明在每个示例性标测图中可产生真阳性反应的示例性位置的示例性图像。比例尺可为例如100μm。

图5(a)-5(h)的这些示例性标测图501-508表明例如来自选定细胞的EPSP的可重复性和形状可在每次试验中均类似。例如，在每个标测图中所有真阳性细胞511中的77.1±12％可被评价为真阳性(平均数±SD；n＝7个细胞，＞7个标测图每次)。这个实例表明根据本公开的示例性方案可产生可靠的标测图。此外，该实例表明这种示例性解笼锁方法和/或程序不会损害所刺激神经元的健康。

此外，可以获得在输入标测图中的低程度的可变性，如示例性标测图501-507的对比所示。该低程度的可变性可因例如解笼锁脉冲所产生的动作电位数目的不一致所导致(参见，例如图2(b)和6(a)中的图示)。该低程度的可变性也可反映突触权重或突触重构的自发性波动(参见，JV.Le Be and H.Markram，Proc Natl Acad Sci U S A.103，13214(2006))。因此，可以利用根据本公开的某些示例性实施方案的示例性方法和装置来例如确定在长期实例的实施方案中的皮质可塑性。

示例性的同时双光子刺激和成像

此外，可实施光刺激方法和装置的示例性实施方案与回路之钙成像的组合(参见，Rafael Yuste and Lawrence C.Katz，Neuron 6，333(1991))。如图1(c)所示和上文所述，例如，当动作电位是通过对示例性的膜片钳制神经元注入电流脉冲来诱发时，可利用矢量模式的钙成像检测单峰。当动作电位是通过MNI-谷氨酸的双光子解笼锁来触发时可测得类似的灵敏度。通过对比由负载Indo-1AM但未被膜片钳制的光刺激细胞所表现出的钙瞬变的幅值，可以估计解笼锁事件在未被膜片钳制的神经元中诱发类似数目的动作电位。

例如，当在一些神经元中进行解笼锁时，除了钙瞬变与光刺激细胞中的动作电位所产生的钙瞬变类似之外，也可在未被光刺激的细胞中检测到类似的光学信号。

图6(a)-(c)示出网络活性的所有光学刺激和成像的某些示例性结果的示例性图示。

具体而言，图6(a)示出根据本公开的解笼锁反应的光学检测的示例性实施方案的图示和图表。图6(a)的上方图601示出示例性的较暗神经元602可依次被光刺激并同时以矢量模式成像。下方图603示出示例性神经元1605的电生理学记录604(图6(a)的上部迹线)和在对其细胞体进行解笼锁期间(下部迹线611示出激光脉冲612)的来自神经元1 605、神经元2 606和神经元3 607的荧光钙测量608-610(中部迹线，ΔF/F)。插图613示出在神经元1 605(通过膜片吸管负载Indo-l-K 50μM)中解笼锁如何触发动作电位，产生容易检测到的钙信号。对神经元2 606和3 607(未进行膜片钳制和负载Indo-1AM)的解笼锁可产生幅值类似于神经元1 605中的幅值的钙信号，这例如可由于动作电位活性所致。可利用示例性的复合DOE靶实施成像和解笼锁(例如，成像：5ms/神经元；解笼锁：4x2.5ms/神经元)。比例尺可为例如约50μm。

图6(b)示出顺序刺激且同时成像的示例性实施方案的图示和图表。如上方图621所示，例如50个示例性神经元622(由其暗影所指示)可在顺序光刺激的同时连续成像。中间图623显示示例性过程的示例性方案，其中每个神经元均可成像(水平线624)，同时垂直柱625所标记的神经元可被刺激。下方图626所示为一个神经元通过刺激另一神经元而活化的实例。上部迹线627是示例性荧光测量，下部迹线628表示示例性激光脉冲。如该实例所示，针对神经元1 605的解笼锁脉冲629可产生钙信号630，其可归因于在神经元1 605中的动作电位；而针对神经元2 606的解笼锁不仅在示例性神经元606中(例如，峰632)，而且在示例性神经元1 606(例如，峰631)中可产生钙信号。根据该实例，可以采用示例性的mag-Indo-1AM和Indo-1AM的联合负载。比例尺可为例如约50μm。

图6(c)示出同时刺激和成像的示例性实施方案的图示和图表。上方图641反映与图6(b)的实例类似的实例。然而，在图6(c)中，例如，可以同时刺激不同组别的5个神经元642(箭头643所指示)，同时对所有50个神经元622成像。中间图642示出该实例的示例性方案如何能够显示出如垂直线645所示的示例性组的5个神经元642在如不与垂直线645对应交叉的水平线646所示的所有其他细胞的成像期间的顺序活化。下方图647表示该实例的示例性分析。对于y轴上显示的每个示例性细胞，较暗的记号648表示示例性检测到的钙瞬变，点649表示示例性的被刺激神经元。如图所示，同步刺激能够可靠地触发在示例性被刺激细胞中的钙瞬变，但是感兴趣的是，也能够产生网络活性(例如，黑线650的垂直阵列)，在一些情况下，导致大部分成像细胞的同步活化，如星号651所示。该实例的示例性标测图可以以更高分辨率重新打印并如参照图5(a)-(h)所示和如上所述那样使用。根据该实例，可以使用根据本公开的示例性联合负载mag-Indo-1AM和Indo-1AM。比例尺可为例如约100μm。

钙瞬变可以是对图6(b)所示的解笼锁脉冲629锁时的。例如，表现出钙瞬变的神经元可远离被刺激的细胞，意味着触发光学信号的动作电位可以不是突触后神经元的树突的非特定直接刺激的结果。因此，在远端细胞中的这种功能信号可归因于来自光刺激神经元的强兴奋性连接所诱发的动作电位。事实上，例如在锥体兴奋性细胞和低阈值形成峰的中间神经元之间已经示出了可激发突触后细胞的强促进单突触连接(参见Y.Kawaguchi，J Neurosci 15(4)，2638(1995)；J.Kozloski，F.Hamzei-Sichani，and R.Yuste，Science 293(5531)，868(2001)；Y.Wang，M.Toledo-Rodriguez，A.Gupta et al.，J Physiol 561(Pt 1)，65(2004))。

此外，可以利用本公开的某些示例性实施方案半同时刺激几个细胞(例如，5个神经元，60-90ms的总解笼锁时间)，同时监测网络反应(参见例如图6(c)的上部图和图6(c)的中间图)。在其它实例中，可以通过刺激神经元的特定组合而在多个神经元中触发对解笼锁脉冲锁时的同时钙瞬变(参见图6(c)的下方图)。这种全局活化可类似于在某些类型的癫痫样事件下所观察到的活化(参见T.Badea，J.Goldberg，B.Q.Mao et al.，J.Neurobiol.48，215(2001)；A.J.Trevelyan，D.Sussillo，B.O.Watson et al.，The Journal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience 26(48)，12447(2006))。因此，通过同时电生理记录可观察到突发性去极化位移。类似的癫痫样事件可自发地出现在灌注MNI-谷氨酸的示例性切片中，这是因为该事件可以是对示例性神经元的特定组的光刺激锁时的。因此，在根据本公开的一些示例性实施方案中，刺激极少的神经元可足以在切片中触发癫痫样事件。

示例性实施方案的进一步讨论

如本文所述，根据本公开的某些示例性实施方案，神经元回路的双光子光刺激可与钙成像组合提供。利用双光子解笼锁的灵敏空间分辨率的优点和利用波束复用光学器件，该示例性技术和装置可克服单光子光刺激的一些前述问题，例如在突触输入的标测中缺少单细胞分辨率。通过对数百个神经元的胞体系统地进行谷氨酸解笼锁，同时记录所关注细胞的细胞间活性，可以获得切片中的兴奋性连接的单细胞分辨率标测图。

例如，可利用计算机控制的示例性标测程序并系统地检测神经元，因此可以对大量神经元(例如，多达1000个)进行相对快速的采样(例如，约30分钟)并测试它们是否与所记录细胞连接。事实上，利用双全细胞记录，推定的输入细胞可单突触连接所记录的神经元。可以将真阳性输入的标测图转译为所记录细胞的突触前神经元的标测图。此外，该示例性标测图可以三维形式得到，因此在原理上可以对组织中的所有细胞进行采样并测试其是否在任意给定细胞的突触前，从而更加接近Crick的揭示对于给定细胞的所有连接的理想(参见FH.Crick，同前)²。

除了其用于解剖标测的用途之外，根据本公开的方法、系统、装置、计算机可访问介质和装置的一些示例性实施方案可用于标测功能性突触性质。可根据突触反应的幅值来估计或确定突触接触的数目，并且可通过进一步分析得到其他性质，例如失效或突触动力学。此外，对于本文所示的神经元的类似的示例性标测图可采取电压钳模式获得，从而能够例如对来自不同的突触前神经元的突触连接进行生物物理分析。此外，由于几个神经元可同时膜片钳制，因此可以得到同时功能性标测图并进行比较(参见，例如图4(g)-(l))此外，因为这些输入标测图可快速和可重复地得到，如图4所示和本说明书相应部分所述，因此该示例性技术和装置可用于例如监测突触连通性的改变(参见JV.Le Be，同前)。而且，可以检测抑制性反应，因而根据本公开的技术和装置的示例性实施方案可延伸至标测抑制性连接并且可例如揭示神经元的突触权重的矩阵(参见J.J.

Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，2554(1982))。

因为可以经由例如互联网、局域网、外联网、虚拟专用网络、直接连接等来在线分析和可视化示例性输入标测图，因此可以促进示例性的方法、系统、装置、计算机可访问介质和装置的一些示例性实施方案在其他应用中的用途。例如，在检测到真阳性之后，可以对突触前神经元进行靶向和电生理记录以对其进行解剖学和生理学表征。来自给定突触前细胞的输入标测图可随后顺序获得，使得该方法可顺序地用于例如光学追踪回路，特别是在利用根据本公开的某些示例性实施方案的更快速扫描对示例性方法和装置的速度进行优化的情况下。

根据本公开的波束复用方法和装置的示例性实施方案也可用于例如具有单细胞精度的其他神经活性化合物的光释放。而且，可以将一些示例性实施方案与光敏感通道方法(参见E.S.Boyden，F.Zhang，E.Bamberg et al.，Nature neuroscience 8(9)，1263(2005)；F.Zhang，L.P.Wang，M.Brauner et al.，Nature 446(7136)，633(2007))组合，以将该方法扩展至体内应用，同时仍然保持例如单个细胞分辨率。

此外，如图6(a)-6(c)所示和上文所述，根据本公开的技术和装置的一些示例性实施方案可与双光子钙成像组合。因此，根据本公开的技术和装置的一些示例性实施方案可用作全光学刺激和记录的方法和装置，以快速检验回路的连通性和其中例如不同群组的神经元可活化的功能区域。这种示例性方法可以用于例如确定单个神经元在生物回路、逆向工程和译解其转移功能等中的作用。

示例性的利用钙成像的细胞检测、快速扫描和动作电位检测以及神经元标记

图7(a)示出示例性细胞检测程序和扫描路径优化的示例性结果的示例性图示。可在线分析原始双光子图像710(图7(a)的左侧图)，如图像710所示，其示出细胞711。例如，可自动检测细胞轮廓713，如图像712所示(图7(a)的中间图)。示例性旅行推销员问题凸包算法可计算例如在所有细胞711之间的最短扫描路径715，如图像714所示(图7(a)的右侧图)。示例性P13新皮质切片可负载Indo-1AM并用730nm激发光和40x 0.8NA物镜进行成像。比例尺可以为约50μm。

图7(b)示出所靶向神经元的钙成像的示例性结果的图示。如在该图示中所示，示例性P14新皮质切片可负载Indo-1AM并且可选择一组神经元721进行矢量模式成像。箭头723所指示的膜片钳制细胞722可灌注有50μM的Indo-l-K。在负载细胞中的荧光水平可类似于膜片钳制细胞722的荧光。如该实例所示，可在735nm激发，利用40x 0.8NA物镜拍摄示例性图像。比例尺可以为约50μm。

图7(c)示出钙成像的单动作电位灵敏度的示例性示意图和示例性图表结果。如该图所示，参考图7(c)中的示例性图表730，可通过从膜片钳制神经元注入电流脉冲734诱发动作电位732以及相应的电压记录733和-65mV的保持电位，如图7(c)中插图731的迹线735和下方光学迹线737(ΔF/F)所指示的相应的钙信号736所示，所示的膜片钳制神经元清晰地报名对一个或更多个峰738作出响应。动作电位732的数目739在光学迹线737下方示出。

当切片被负载并获取图像时，可以自动检测例如500-4000个神经元的位置。可以利用方法(参见R.Cossart，D.Aronov，and R.Yuste，Nature 423，283(2003))来检测来自双光子荧光成像的所有可视神经元的质量坐标中心，例如如图7(a)，图像712所示。然后，利用示例性软件(参见V.Nikolenko，B.Nemet，and R.Yuste，Methods 30，3(2003))，可以实施预定的扫描方案，例如“矢量模式”方案来进行同时成像和光活化。与光栅扫描不同的是，在矢量模式中，激光顺序访问用户选定的目标点的组(“靶”，在这种情况下是神经元细胞体)以在预定的持续时间和激光强度下执行荧光和/或光活化光敏化合物的点测量。为了优化扫描模式，减少扫描点之间的延迟和使电流计扫描镜的磨损最小化，可利用可发现对旅行销售员问题的近似最优解的快速算法(例如，“凸包”方法)对靶序列进行重排。

利用示例性矢量模式，可以测量通过电流注入诱发的动作电位所产生的钙信号。例如，可以用50μM Indo-l-K盐经由膜片钳吸管注入神经元。这种细胞间浓度近似对应于AM-染料负载所得指示剂的细胞间浓度(参见Z.A.Peterlin，J.Kozloski，B.Mao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(7)，3619(2000))，如图7(b)的实例所示。在这些示例性条件下，可以检测到例如由单个动作电位引起的具有可接受的信噪比的钙信号(例如5ms激光曝光/细胞)，如图7(c)所示。

为了使神经元细胞体可视化并检测到其坐标，可以负载具有膜渗透性AM-酯钙指示剂的尖锐新皮质切片。因为MNI-笼锁L-谷氨酸的双光子解笼锁可需要700-735nm的光，因此可使用Indo-1AM作为钙指示剂。Indo-1AM已经表现出对于神经元负载的良好性能(参见R.Yuste and J.MacLean，in Imaging Neurons：a laboratory manual，edited by R.Yuste，F.Lanni，and A Konnerth(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，2005))，并且可具有响应于动作电位的合适的钙灵敏度，如在图7(a)-7(c)的实例中所示。此外，低亲和性钙指示剂mag-Indo-1AM可比Indo-1AM更有效地负载新皮质切片，即使mag-Indo-1AM可能不适用于光学监测动作电位(因为其对钙的低亲和性)，荧光标记神经元胞体也可能是非常有用的。Mag-Indo-1AM负载可用于识别不需钙成像的示例性实施方案(例如，示例性输入标测)的神经元。对于组合的示例性成像和/或解笼锁，可以利用两种Indo-1指示剂联合标记以得到mag-Indo-1AM对神经元的稳定标记，同时仍然受益于Indo-1AM的功能性钙灵敏度。

Indo-1AM和mag-Indo-1AM可提供例如大多数神经元并且可以不对神经胶质显著染色，如利用磺酰罗丹明(Sulforhodamine)701的双标记所测定的(参见A.Nimmerjahn，F.Kirchhoff，J.N.Kerr et al.，Nat Methods 1(1)，31(2004))。例如，5.7±1.56％(145/2555；n＝4切片)的mag-Indo-1AM负载的细胞也可灌注磺酰罗丹明，并且仅有8.1±2.59％(145/1786，n＝4切片)的磺酰罗丹明负载细胞也可负载mag-Indo-1AM。

示例性的切片制备和负载

可以利用振动切片机(例如，VT1000S；Leica，Nussloch，Germany)，由例如P 12-15 C57/BL6小鼠或生长抑素-GFP小鼠来制备头部新皮质切片(参见A.A.Oliva，Jr.，M.Jiang，T.Lam et al.，J Neurosci 20(9)，3354(2000))(例如Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。可在冰冻氧化改性的ACSF中切割300μm厚的切片，所述ACSF可包含1mM CaCl₂和3mMMgSO₄，其中NaCl可被等摩尔浓度的蔗糖(mM)替代：27NaHCO₃、1.5NaH₂PO₄、222蔗糖、2.6KCl。然后可将切片置于37℃的氧化标准ACSF中30分钟。对于AM-负载，可将切片沉淀在装有2mlACSF的小皮氏培养皿(35x 10mm)的底部，将其用95％O₂/5％CO₂吹风并置于在37℃下保温的载玻片上(Fisher Scientific，Waltham MA)。可制备在10μl DMSO和2μl Pluronic F-127(Molecular Probes)中的50μg Indo-1AM或mag-Indo-1AM(Molecular Probes，Eugene，OR)的等分试样。对于组合负载，可以使用50μg Indo-1AM和2μg mag-Indo-1AM。然后，可将染料的等分试样置于皮氏培养皿中并可将切片在黑暗中孵育并保持约35-37℃持续至多例如约60分钟。对于利用例如mag-Indo-1AM和SR101进行的双标记，可使用SR101(20μM)用于最后约15分钟等。然后，在将切片转移至纪录室之前，将其在室温下保持至少约例如30分钟。用95％O₂、5％CO₂连续通气、含有(mM)：123NaCl、3KCl、26NaHCO₂、1NaH₂PO₂、10蔗糖、1CaCl₂和3MgSO₂的标准ACSF可用于标测实例或负载，或者例如含有3CaCl₂和1MgSO₂。

示例性谷氨酸双光子解笼锁

例如，MNI笼锁谷氨酸(2.5mM；Tocris Cookson，UK)可用于浸浴施用并且可使用λ(Bioptechs，Butler，PA)或Dynamax RP-1型(Rainin Instrument，Oakland，CA)蠕动微型泵控制浴灌注和最小化总浴体积。可利用以Matlab编写的常规软件(例如The Mathworks，Natick，MA)来分析电生理记录(检测例如对解笼锁激光脉冲锁时的EPSP样事件)。为了利用较短激光脉冲有效解笼锁，可以使用例如多达25个分离的子束。根据本公开的某些示例性实施方案，也可以提供更大的波束复用。

根据本公开的某些示例性实施方案可使用RuBi-谷氨酸(基于钌光化学的笼锁谷氨酸化合物)。RuBi-谷氨酸可用可见光波长激发并在单光子或双光子激发后释放谷氨酸。其可被认为具有高量子效率并可在低浓度下使用，部分避免了例如可与其他笼锁化合物共存的GABA能发射的阻断。RuBi-谷氨酸的双光子解笼可具有高空间分辨率并在单个树突脊索中以生理动力学产生兴奋性反应。利用激光波束复用，双光子RuBi-谷氨酸解笼锁也可用于例如以单细胞分辨率去极化和激发锥体神经元。因此，RuBi-谷氨酸使得能够利用可见光或双光子光源来光活化神经元树突和回路，实现单细胞或甚至单脊索的精度。关于RuBi-谷氨酸的更多信息和相关实例用途，参见Fino，Elodie，Araya，Roberto，Peterka，Darcy S.，Salierno，Marcelo，Etchenique，Roberto and Yuste，Rafael，RuBi-谷氨酸：two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines，Frontiers in Neural Circuits，3，1(2009)。也参见Rial Verde EM，Zayat L，Etchenique R，Yuste R.Photorelease of GABA with Visible Light Using an Inorganic Caging Group.Front Neural Circuits.2008；2：2.Epub 2008 Aug 13，作为以类似方式使用基于钌笼锁化学的另一化合物(Rubi-GABA)的实例，其中其选择性地光抑制神经元。

示例性复合靶向解笼锁技术/方法

在复合靶触发动作电位中的谷氨酸解笼锁

在前述针对树突脊索的解笼锁实验中，双光子激发所触发的谷氨酸光释放的有效半径非常小(在所有维度上为约2-3μm)(参见Matsuzaki，M.，et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CAl pyramidal neur

激光强度还可受限于笼锁神经递质的浓度，而其可受限于该化合物在水中的溶解度(例如，局部施用(“喷”)时为10-50mM的MNI-谷氨酸)以及受限于化学物纯度。笼锁谷氨酸通常具有痕量的游离谷氨酸，并且在浸浴施用时通常不实际使用大于5mM的MNI-谷氨酸。因此，通过MNI-谷氨酸扩散进入照射区域而使光释放的游离谷氨酸朝向谷氨酸受体扩散可有效控制去极化的速率和幅值，这是因为解笼锁本身的化学反应可以非常快(参见Canepari，M.，Nelson，L.，Papageorgiou，G.，Corrie，J.E.& Ogden，D.Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel，fast caged neurotransmitters.J Neurosci Methods 112，29-42(2001))。

通过靶向神经元胞体而不是脊索，可以利用MNI-笼锁谷氨酸的双光子解笼锁来触发皮质神经元中的动作电位(参见Nikolenko，V.，Ellis-Davies，G.C.R.&Yuste，R.Simultaneous optical stimulation and two-photon imaging of neocortical circuits，in Society for Neuroscience Annual Meeting(Society for Neuroscience，New Orleans，2003)。利用在接近细胞胞体的位置处的长激光脉冲(例如，约10-50ms)，细胞可以去极化约5-10mV，并且达到动作电位阈值可能并不简单。此外，长解笼锁持续时间可能够诱发光损伤并且还可例如由于在这些持续时间期间产生溢出效应而损害空间分辨率。

为了使神经元更可靠地激发，可以例如利用几个解笼锁位置并在较大区域上光释放大量谷氨酸。因此，可对同时光刺激和钙成像提供“复合靶”(参见例如图2(a)的图示)。复合靶可包括几个解笼锁的“刺激子靶”和一个中心位于所检测的神经元质量中心的“成像子靶”。可将高激光强度的波束顺序置于每个刺激位置。然后，为了成像，可将激光强度降低至较低水平并将激光束定位在成像靶上。为了利用高NA物镜有效解笼锁，可以对样品使用例如约30mW的激光功率水平。例如对样品约5mW可足以点测量荧光信号，具有良好的信噪比而没有任何可检测的解笼锁。

示例性的复合靶解笼锁的空间分辨率

在刺激靶的环形排列的情况下，如图2(a)所示和上文所述，刺激靶图案的直径可近似对应于典型神经元胞体的尺寸。该示例性排列可利用例如约30-50ms的解笼锁脉冲(所有刺激子靶的总持续时间)在实际上所有被刺激神经元中提供动作电位的可重复触发，并且可提供良好的光刺激空间分辨率(参见例如图2(a)和2(b)以及本文中相应的说明)。根据本公开的一些示例性实施方案，复合靶的实际示例性参数(例如，刺激子靶的数目、环形图案直径、每个子靶的持续时间、解笼锁功率等)可针对例如不同类型的特定用途、应用、物镜透镜放大率、NA等而单独调节。

示例性输入标测方案

在提供可设置为刺激单个神经元的双光子解笼锁技术和装置的示例性实施方案之后，可以利用该示例性方法、过程和/或装置对神经元的输入连接进行标测，如利用单光子谷氨酸解笼锁光刺激所实施的那样(参见I.C.Farber，同前；E.M.Callaway，同前；M.B.Dalva，同前；G.M.Shepherd，同前；C.Boucsein，同前；R.Kotter，同前；H.U.Dodt，同前；S.Shoham，同前；M.Canepari，同前)。单光子解笼锁的一个示例性限制可在于在横向特别是在轴向上缺少空间分辨率。虽然利用高NA物镜透镜可实现一定水平的空间分辨率(参见R.Kotter，同前)，但是可利用解笼锁UV波束的圆柱状轮廓(参见M.B.Dalva，同前；G.M.Shepherd，同前；C.Boucsein，同前)来产生二维标测图。因此，通常，可这样产生的标测图不具有单细胞分辨率，而是反映小区域的活化。

根据本公开的某些示例性实施方案的示例性双光子解笼锁的非线性特性可用于克服至少这些限制和实施具有单细胞精度的标测。

根据本公开的一些示例性实施方案的示例性光刺激方法和/或过程可包括以下步骤：

1.使尖锐切片负载AM-染料(例如，mag-Indo1AM)；

2.识别目标区域和/或范围；

3.将一个或更多个神经元以全细胞模式膜片钳制(例如，使用电流钳)；

4.将物镜透镜转换至低放大率(例如，使所有皮质层在单视场下可视)；

5.获取2D光栅模式图像；

6.分析该图像，检测单个神经元并确定质量坐标中心；

7.载入处理装置，其包括例如用于顺序光刺激的软件程序(所述载入可以例如以伪随机次序进行)；

8.启动光刺激方案，利用例如脉冲间隔约0.5秒的约3-6个激光脉冲刺激每个神经元(示例性方案的总持续时间可为例如约25分钟(当刺激约500个神经元时))；

9.识别电生理记录；

10.分析该电生理记录，识别来自光刺激细胞的相似突触EPSP事件(例如对解笼锁脉冲的锁时)；和

11.基于与识别和分析电生理记录相关的信息产生输入连接的标测图。

示例性的电生理方法和/或过程

根据本公开的某些示例性实施方案，在成像和/或解笼锁期间可将神经元膜片钳制并可同时监测细胞内电位。可利用例如BVC-700(Dagan Corp.，Minneapolis，MN)或Axoclamp 700B(Axon Instruments，Foster City，CA)放大器产生全细胞电流钳记录。6-10MΩ的微吸管可充有(mM)例如：130K-硫酸二甲酯、10KCl、10Na-HEPES、2.5ATP-Mg和0.3GTP-Na以及pH7.4(294-6mOsm)的0.35％生物胞素以及约50μM荧光染料Indo-1-K五钾盐(用于标定实例)或Alexa-594(例如，用于标测以利用PMT前的附加的约600nm高通滤光器使树突树可视化；两种染料均可得自Molecular Probes，OR)。例如，在记录和处理(例如形态识别)过程中，神经元可充有生物胞素。

利用同时光刺激和钙成像的示例性方法和/或过程可在生理温度下进行，以在尽可能接近生理状态的系统中研究网络活性。为了改善全细胞记录的持续时间，可以例如在室温下进行示例性标测。

示例性组织学方法

可利用例如在0.12M磷酸缓冲液(PB)中的4％多聚甲醛溶液来固定切片。在成像/解笼锁实例之后，可将切片在室温下浸没于固定剂中并允许在约4℃下固定过夜。然后，可用例如0.12M PB冲洗切片3次，在0.12MPB中的约20％蔗糖溶液中进行约12-168小时的防冻并用组织冷冻介质(H-TFM，Triangle Biomedical Sciences，Durham，NC)干冰冷冻。例如，在解冻后，可将切片用0.12M PB冲洗3次并在室温搅拌下用0.12M PB中的1％过氧化氢进行预处理约30分钟。然后，可用0.02M磷酸钾盐水(KPBS)冲洗组织并在室温搅拌下在亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(目录编号PK-6100，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)中孵育过夜(10μl溶液A和10μl溶液B/1ml 0.02M KPBS和0.3％Triton-X)。然后，用0.02MKPBS冲洗切片约3次并在0.02M KPBS中的约0.7mg/ml 3，3′-二氨基联苯胺、0.2mg/ml过氧化氢脲、0.06M Tris缓冲液(D-4293，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中孵育约5-15分钟。在完成3，3′-二氨基联苯胺反应后，可用0.02M KPBS冲洗切片并将其安装在Vectashield安装介质(H-1000，Vector Laboratories，Inc.)中。可利用采用Olympus直立式显微镜(BX51)的DIC光学装置使染色细胞可视化并且可利用例如Neurolucida工作站(例如MicroBrightField Inc.，Williston，VT)3维重构71个神经元。所有的重构可在例如100x、1.40NA物镜下进行。

再参考图7(a)-(c)，其示出根据本公开的系统的示例性实施方案，如前文所述，可对前述示例性常规双光子荧光(2PF)和二次谐波产生(SHG)显微镜进行各种改进(参见Shoham，S.，O′Connor，D.H.，Sarkisov，D.V，&Wang，S.S.Rapid neurotransmitter uncaging in spatially defined patterns.Nature methods 2，837-843(2005)；and Majewska，A.，Yiu，G.& Yuste，R.Acustom-made two-photon microscope and deconvolution system.

Archiv-Eur.J.Physiol.441，398-409(2000))。例如，来自NIR脉冲模式锁定Ti：蓝宝石激光器701的波束强度可通过普克尔盒702控制。然后，可通过平凸透镜703a将准直波束聚焦在可用作空间滤光器的针孔703b上，并且通过第二透镜703c使之重新准直。DOE 4可将激光束分裂成多个例如5个独立子束(如在图2(b)的图示中所示)，所述子束可以约0.23°的子束间角散布。

参见图7(a)，可通过第二望远镜(两个平凸透镜705a和705c)减小该角度，所述第二望远镜也可使DOE在扫描镜707b的光学平面上成像，同时保持各个子束准直。光圈705b可置于透镜705a和705c之间以在单束光栅模式成像(其闭合时可利于中心子束通过)和5子束DOE矢量模式成像/光刺激(当光圈705b全开时)之间切换。例如，约700nm高通滤光器706a可从激光中移除残余的可见光辐射，并且潜望镜706可将波束从光学台平面传输至扫描单元707，所述扫描单元707可包括用于IR反射镜或分色器707a的支架和电流计扫描镜707b。

图7(a)所示的扫描透镜(或“光瞳转移”透镜)707c可与直立式显微镜708的扫描单元707机械耦合并形成具有显微镜管透镜708b的望远镜以将准直波束递送至物镜708c的背孔。也可将扫描镜和物镜光学联合。双光子荧光(2PF)信号可通过同一物镜汇集并且通过低通分色器708a与激发光分离，以及可在经附加滤光器709a滤光后通过PMT709检测并通过附加透镜709b聚焦到PMT 709的小活性区上。快速快门709c可保护PMT709在解笼锁脉冲期间不过载。或者，2PF或二次谐波产生(SHG)信号可经由显微镜聚光器708d汇集并通过第二PMT组合件712检测。来自PMT709、712的电信号可通过放大器710放大并通过数据采集板711数字化。

再参照图8，示出双光子荧光图像801的实例，其由P13躯体感觉(Sl)新皮质切片802提供，负载有mag-Indo-1AM。该图像可利用10x 0.3NA物镜以光栅模式(725nm激发)采集，并且示出轴向(z)的单光学分层，不使用附加的扫描缩放。该实例中的比例尺为200μm。软膜表面803显示为在顶部并且所有皮质层是可视的。

图9(a)和9(b)示出图8的同一示例性切片802在10x(0.3NA)mag-Indo1-AM(例如，725nm激发，480/540nm滤光器)和SR101(例如图9(b)所示-850nm激发，595/615nm滤光器)的条件下横穿全部皮质层的示例性图像。该实例中的示例性比例尺为约100μm。

图9(c)和9(d)分别示出示例性图像903和904，其示出更高放大率(60x，0.9NA)下的示例性切片802的示例性细胞905。在图9(c)中提供比图9(d)中的SR101-阳性细胞更高密度的mag-Indo1-AM-阳性细胞906，并且全部低程度重叠。图9(d)中的箭头907指示SR101标记细胞908(例如星形细胞)也负载有mag-Indo1-AM。该示例性图中的比例尺为约10μm。

再参照上文所述的图4(g)-4(l)中所示图像，这些示例性图像470-475是利用来自相邻神经元的四重记录的标测突触输入的实例的示例性图示。例如，与图9(a)所示类似，可膜片钳制四层5锥体细胞(白色箭头480指向对应的细胞体的位置476-479)，并且可在单次运行示例性刺激方案期间获取四个对应的输入标测图。神经元A 476、B 477和D 479的树突树的形态重构可以叠加。该实例中的示例性比例尺为约100μm。具体而言，如图4(g)-4(j)所示，可以为例如所有四个神经元提供输入编码标测图。示例性编码方案可以是例如与EPSP幅值成比例的颜色编码方案，但相对于图9(a)相反，以增强在暗背景上的可视性，使得例如更亮的阴影对应于更大的峰值幅值。图4(k)和4(l)分别示出神经元A 476和B 477以及神经元A 476、B 477和C 478之间的2次和3次重叠的示例性代表标测图的图示。

图10示出根据本公开的某些示例性实施方案的光刺激过程或方法的示例性流程图，所述过程或方法可通过处理装置(例如计算机处理器或处理器集合)来执行。如图10所示，可采取和/或利用处理装置1000(例如一个或更多个微处理器或其集合)来执行示例性过程。在1001处开始，示例性过程可将尖锐切片负载AM-染料(例如，mag-Indo1AM)。在1002处，示例性过程可识别目标区域和/或范围。在1003处，示例性过程可以全细胞模式膜片钳制一个或更多个神经元(例如，采用电流钳)。在1004处，示例性过程可将物镜切换成较低放大率(例如，使所有皮质层在单视场中可见)。在1005处，示例性过程可采集2D光栅模式图像；分析该图像，然后检测单个神经元并确定重量坐标的中心-1006。

在1007中，示例性过程可载入处理装置，其包括例如用于顺序光刺激的软件程序(例如所述载入可采取伪随机模式进行)；然后启动光刺激方案，例如通过脉冲间隔为约0.5秒的约3-6个激光脉冲刺激每个神经元(示例性方案的总持续时间可以为例如约25分钟(当刺激约500个神经元时))-1008。在1009中，示例性过程可识别电生理记录；然后在1010中，分析该电生理记录，识别来自光刺激细胞的类似于突触EPSP的事件(例如，对解笼锁脉冲锁时)。在1011中，示例性过程可基于与识别和分析电生理学记录相关的信息产生输入连接的标测图。

利用SLM的激光复用示例性方法和结果

图11示出根据本公开的用于SLM相位掩模形成的方法或过程的示例性实施方案的流程图。

示例性SLM过程能够因光学器件的基本性质(光学傅里叶变换)而产生任意图案。对于置于薄透镜前恰好一个焦距的透明物体而言，对该物体的傅里叶变换可在透镜后一个焦距长度上形成。因此，如果在焦点_前的输入场由复合幅值E_k表示，则在焦点_后处的场为F_k，其中E_k和F_k傅里叶变换对，在一个示例性显微镜中，虽然延迟透镜系统使光路更加复杂，但是SLM可位于焦点_前处并且样品平面位于焦点_后处。纯相位SLM可仅作用于场相位，而不是幅值。当受到SLM作用时，电场为E_k＝A₀exp(i·Φ_k)，其中exp(i·Φ_k)为原始幅值，Φ_k为SLM逐渐改变的相位。计算相位Φ_k使得在远场(样品平面)上产生所需的强度图案。可利用例如来自Holoeye的软件以及根据基于标准迭代自适应的定制开发软件来计算或确定相位掩模。

如图11所示，在1101中利用已知强度分布的激光示例性过程/方法，然后在1102中增加随机相位(速度收敛)，在103中产生E_k＝A₀exp(i·Φ_k)。在1104中，示例性过程/方法接着计算或确定FFT，F_k＝B_kexp(i·Θ_k)并在步骤1105中就计算得到的图像与所需图像进行比较。如果误差超出了阈值，则在1106中改变幅值而不是相位以更好地匹配所需图像。在1107中，进行逆向变换，并且在1108中，应用限制条件，例如相位量子化，在1109中产生新的输入场，并且再次开始循环。如果在步骤1105中误差不超过阈值，则示例性过程进入1110，其中设定相位掩模。

图12(a)-12(d)示出从根据本公开的示例性实验得到其结果的示例性SLM光图案化和深度聚焦图像和顺序。例如，对Alexa 488荧光指示剂饱和的琼脂糖凝胶样品进行成像以测试双光子激发的效率。利用60x 0.9NA物镜获取示例性图像。比例尺为约20μm。图12(a)示出上载至示例性SLM软件中的简单示例性二进制位图图案(例如，文本“COLUMBIA”)，如在第一图1201中所示。所得的相位掩模示于第二图1202中。灰度对应于从0到2π的相位位移。利用显微镜CCD照相机从样品采集得到的双光子荧光图像(记录室)示于右侧图1203中。如图所示，在所计算的图案和所得图像之间存在良好的对应性。该数据也表明基于液晶的衍射SLM可承受高功率脉冲锁模超快激光的照射并有效地用于结构化非线性照射。

图12(b)示出示例性复合灰度图案可用于编程SLM。可以基于组织学照片，使用Santiago Ramon y Cajal的程式化图片。该实验中的示例性图1204-1205类似于图12(a)的图1201-1204。

图12(c)示出利用SLM的示例性聚焦。如图所示，SLM软件的示例性实施方案可利于在相位掩模上应用附加光学功能。在该实例中，可以使用透镜功能以使激发光焦点在轴向尺寸上移动。示例性图1207-1211示出原始图像，示例性图1212-1216示出对应的相位掩模，以及在原始相位掩模上只增加示例性透镜功能。-10、-100、+10和+100是示例性软件所使用的示例性单位，用以指示对应的凹透镜/凸透镜以及相对的光学能力。

图12(d)示出在用CCD照相机采集的测试图案的示例性左侧图1217中的双光子荧光图像。如图1218-1225所示，利用具有相应能力的透镜功能使虚拟焦平面在两个方向上从原始平面移出。使用40x 0.8NA物镜。比例尺为约50μm。该示例性数据说明SLM可用作无需物理移动部件的“通用扫描器”。

图13是根据本公开的某些示例性实施方案设置的系统或装置的方块图，其可编程或设置为执行任意的示例性程序、方法和过程。

如图13所示，可提供(与处理装置1301通信)例如计算机可访问介质1303(例如，如前文所述，存储装置例如硬盘、软盘、记忆棒、CD-ROM、RAM、ROM等或其集合)。计算机可访问介质1303上可包含可执行指令1305。此外或可替代地，存储装置1307可与计算机可访问介质1303分开提供，其可提供处理装置1301的指令以设置处理装置执行某些示例性程序、过程和方法，如前文所述。

本文所述的示例性技术可利用处理器和处理器组实施。此外，本文所述的示例性程序可利用可存储在计算机可访问介质(例如，硬盘、软盘、记忆棒或记忆卡、RAM、ROM或任何其它计算机存储装置中的至少其一)中的计算机软件来实施。

前文只是说明了本公开的示例性实施方案的原理。对所述实施方案进行多种修改和变化是本领域技术人员根据本文的教导所知晓的。因此，应该认识到本领域技术人员能够想到大量的系统、装置和方法，虽然它们没有在本文中明确示出或描述，但是它们体现出本发明的原理并因此在本发明的实质和范围内。此外，对于上文中尚未通过引用明确并入本文的现有技术，在此明确地通过引用全文并入本文。所有本文引用的出版物均适于通过引用全文并入本文。当本公开的教导与并入文件的教导存在矛盾时，以本公开的教导为准。

Claims

1.一种产生至少一个辐射的设备，包括：

至少一个特定装置，其构造或设置为产生所述至少一个辐射以触发至少一个样品的至少一部分的光活化、光失活或光化学效应中的至少其一。

2.根据权利要求1所述的设备，其中所述至少一个辐射包括至少一个波束，并且其中所述至少一个特定装置还构造或设置为将所述至少一个波束分裂成多个子束，使得至少一些所述子束撞击所述至少一个样品。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的设备，其中所述至少一个样品为生物样品。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的设备，其中所述至少一个样品为化学组合物。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的设备，其中所述至少一个样品为半导体装置。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的设备，其中所述至少一个样品为药物递送装置。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置包括至少一个光学衍射装置。

8.根据权利要求7所述的设备，其中所述至少一个光学衍射装置包括至少一个空间光调制(SLM)装置。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置包括至少一个空间光调制(SLM)装置。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置包括衍射光学元件(DOE)。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置通过以非线性方式激发所述至少一个辐射来产生所述至少一个辐射。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的设备，其中所述至少一个辐射的信噪比为来自单辐射系统的信号的信噪比的约1.94倍。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的设备，还包括至少一个附加装置，所述至少一个附加装置设置为接收与所产生的所述至少一个辐射相关的数据并产生作为所述数据之函数的所述至少一个样品的所述至少一部分的至少一个图像，其中所述至少一个图像在小于约100ms的成像周期期间产生。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置设置或构造为向生物样品提供所产生的所述至少一个辐射以为其提供光动力效应，其中所产生的所述至少一个辐射对所述至少一个样品的平均净功率大于100毫瓦。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置的至少一部分提供在内窥镜装置内。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置还设置或构造为利用所述至少一个辐射照射在所述至少一个样品内的显微结构。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置还设置或构造为调节所述至少一个辐射的相位以撞击所述至少一个样品并得到其至少一个深度信息。

18.根据权利要求9所述的设备，其中所述SLM装置设置或构造为利用所述至少一个辐射照射所述至少一个样品内的显微结构。

19.根据权利要求9所述的设备，其中所述SLM装置设置或构造为调节所述至少一个辐射的相位以撞击所述至少一个样品并得到其至少一个深度信息。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置包括在至少一个基于无扫描空间光调制(SLM)的显微镜装置中。

21.根据权利要求20所述的设备，其中所述至少一个基于无扫描SLM的显微镜装置产生所述至少一个辐射的相干光。

22.根据权利要求21所述的设备，其中所述相干光包括激光。

23.根据权利要求9所述的设备，还包括至少一个附加装置，所述至少一个附加装置设置为接收与所产生的所述至少一个辐射相关的数据并产生作为所述数据之函数的所述至少一个样品的所述至少一部分的至少一个图像，其中所述至少一个SLM装置设置或构造为对所述至少一个图像校正与所述至少一个样品相关的至少一个偏差。

24.根据权利要求9或23中任一项所述的设备，其中所述至少一个辐射包括至少一个光辐射，其中所述至少一个SLM装置设置或构造为以特别有效的强度将所述至少一个光辐射提供至所述至少一个样品的所述至少一部分的大于约1mm的深度处。

25.根据权利要求24所述的设备，其中将至少一个光辐射基于所述至少一个光辐射的至少一个波长提供至所述至少一部分内的深度处。

26.根据权利要求24或25中任一项所述的设备，其中以大于由I＝I₀exp(-σ_wl□z)描述的强度对在所述至少一部分内的深度处的特定靶提供所述至少一个光辐射，其中I₀是在所述至少一个样品的表面处的原始强度，z为所述至少一个辐射透入的深度，σ_wl为有效衰减常数，其为取决于波长的平均吸收与本体材料的波长散射系数之和。

27.根据权利要求9、23或24中任一项所述的设备，还包括至少一个附加装置，所述至少一个附加装置设置为接收与所产生的所述至少一个辐射相关的数据并产生作为所述数据的函数并且基于至少一个多模式过程的所述至少一个样品的至少一部分的至少一个图像。

28.根据权利要求27所述的设备，其中所述至少一个SLM装置进一步构造或设置为产生来自所述至少一个辐射的一组成角度交叉的子束。

29.根据权利要求9、23、24或27中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为产生所述至少一个辐射以实现在所述至少一个样品内的双光子吸收。

30.根据权利要求9、23、24、27或29中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为产生所述至少一个辐射以实现在所述至少一个样品内的三光子吸收。

31.根据权利要求9、23、24、27、29或30中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为产生所述至少一个辐射以实现与所述至少一个辐射相关的二次谐波产生(SHG)。

32.根据权利要求9、23、24、27或29-31中任一项所述的设备，还包括至少一个附加装置，所述至少一个附加装置设置为接收与所产生的所述至少一个辐射相关的数据并产生作为所述数据之函数的所述至少一个样品的至少一部分的至少一个图像，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为产生所述至少一个辐射以实现相干反斯托克斯拉曼光谱成像(CARS)过程，使得所述至少一个附加装置产生所述至少一个图像。

33.根据权利要求9、23、24、27或29-32中任一项所述的设备，还包括至少一个附加装置，所述至少一个附加装置设置为接收与所产生的所述至少一个辐射相关的数据并产生作为所述数据之函数的所述至少一个样品的至少一部分的至少一个图像，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为产生所述至少一个辐射以实现四波混合成像(FWM)过程，使得所述至少一个附加装置产生所述至少一个图像。

34.根据权利要求9、23、24、27或29-33中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为改变所述至少一个辐射的波束的形状、尺寸或流向中的至少其一以实现在所述至少一个样品中的双光子吸收。

35.根据权利要求9、23、24、27或29-34中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为改变所述至少一个辐射的波束的形状、尺寸或流向中的至少其一以实现在所述至少一个样品中的三光子吸收。

36.根据权利要求9、23、24、27或29-35中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置为纯相位SLM装置。

37.根据权利要求9、23、24、27或29-36中任一项所述的设备，其中所述纯相位SLM装置防止所述至少一个辐射的强度显著下降。

38.根据权利要求9、23、24、27或29-37中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置包括单光学组件，所述单光学组件单独设置或构造为(i)透射或反射并进一步改变所述至少一个辐射、(ii)降低所述至少一个辐射的强度和(iii)至少部分阻断所述至少一个辐射。

39.根据权利要求9、23、24、27或29-38中任一项所述的设备，还包括至少一个附加装置，所述至少一个附加装置设置为接收与所产生的所述至少一个辐射相关的数据并产生作为所述数据的函数的所述至少一个样品的所述至少一部分的至少一个三维图像，所述至少一个附加装置还设置或构造为将与所述三维图像相关的数据存储为三维数据。

40.根据权利要求9、23、24、27或29-39中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为以靶向方式控制所述至少一个辐射的递送。

41.根据权利要求40所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为通过控制到达所述至少一个样品上或其内的特定位置的所述至少一个辐射的强度来控制所述至少一个辐射的递送。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的设备，其中所述至少一个特定装置构造或设置为在多个特定位置处同时触发所述至少一个部分的光活化。

43.根据权利要求9、23、24、27或29-40中任一项所述的设备，其中所述至少一个SLM装置构造或设置为在所述至少一个样品的像平面上提供所述至少一个辐射的特定空间分布。

44.根据权利要求24所述的设备，其中在所述至少一个部分内的所述深度处对特定靶提供具有调制强度的至少一个辐射，所述调制强度不同于在预定照射条件下的预期结果。

45.一种产生至少一个辐射的设备，包括：

至少一个空间光调制(SLM)装置，其构造或设置为利用所述至少一个辐射照射至少一个样品内的显微结构。

46.一种产生至少一个辐射的设备，包括：

至少一个空间光调制(SLM)装置，其构造或设置为调节所述至少一个辐射的相位以撞击所述至少一个样品并得到其至少一个深度信息。

47.一种产生至少一个辐射的设备，包括：

至少一个空间光调制(SLM)装置，其构造或设置为产生所述至少一个辐射并包括在至少一个基于非扫描空间光调制(SLM)的显微镜装置内。

48.一种产生至少一个辐射的方法，包括：

产生所述至少一个辐射以触发至少一个样品的光活化、光失活或光化学效应中的至少其一。

49.一种产生至少一个辐射的方法，包括：

利用至少一个空间光调制(SLM)装置以使所述至少一个辐射照射至少一个样品内的显微结构。

50.一种产生至少一个辐射的方法，包括：

利用至少一个空间光调制(SLM)装置来调节所述至少一个辐射的相位以撞击所述至少一个样品并得到其至少一个深度信息。

51.一种产生至少一个辐射的方法，包括：

利用至少一个空间光调制(SLM)装置产生所述至少一个辐射，所述至少一个空间光调制(SLM)装置包括在至少一个基于非扫描空间光调制(SLM)的显微镜装置内。