JP2013225118A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】標本の複数の刺激箇所を簡便に設定して、各刺激箇所を同時に刺激する。
【解決手段】レーザ光源部１０からのレーザ光を標本Ｓに照射する対物レンズ５と、対物レンズ５の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されてレーザ光源部１０により発せられたレーザ光の位相を変調するＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５を有する刺激光学系２０と、レーザ光源部１０により発せられたレーザ光を標本Ｓ上で観察用照明光として走査させるガルバノミラー３３と対物レンズ５により集光された標本Ｓからの観察光を検出するＰＭＴ４０とを有する観察光学系３０と、標本Ｓの３次元的な画像を構築し、その画像上において、刺激光学系２０によりレーザ光を刺激光として照射する標本Ｓの刺激箇所を光軸方向に異なる複数個所に設定する制御部５３とを備え、設定された各刺激箇所にレーザ光が照射されるようにＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５がレーザ光の変調動作を行うレーザ顕微鏡１００を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、空間光変調器（Ｓｐａｔｉａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：ＳＬＭ）を利用し、コヒーレント光源の位相を制御することで、レーザ光の波面を自由に変化させてレーザ光の空間的分布および強度を任意に制御し、所望の空間的分布および強度のレーザ光を標本に照射する顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照）。

特許文献１に記載の顕微鏡システムは、顕微鏡にＳＬＭを組込み、レーザ光が対物レンズや顕微鏡光学系から受ける収差をキャンセルするように波面を制御することで、標本の任意の位置でレーザ光がスポットを結ぶように制御することとしている。

特開２０１１−１３３５８０号公報

しかしながら、特許文献１には、ＳＬＭにより同時に刺激する標本の複数の刺激箇所をどのように設定するかについては記載されておらず、特許文献１を参照してＳＬＭにより所望の複数の刺激箇所を同時に光刺激しようとしても困難である。

本発明は、標本の複数の刺激箇所を簡便に設定して、各刺激箇所を同時に光刺激することができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置されて前記レーザ光源により発せられたレーザ光の位相を変調する位相変調型空間光変調器を有する刺激光学系と、前記レーザ光源により発せられたレーザ光を前記標本上で観察用照明光として走査させる走査部と前記対物レンズにより集光された前記標本からの観察光を検出する検出部とを有する観察光学系と、該観察光学系が光軸方向に異なる観察面の観察画像を取得することにより前記標本の３次元的な画像を構築する画像構築部と、該画像構築部により構築された３次元的な画像上において、前記刺激光学系により前記レーザ光を刺激光として照射する前記標本の刺激箇所を光軸方向に異なる複数個所に設定する位置設定部とを備え、前記位置設定部により設定された各刺激箇所に前記レーザ光が照射されるように前記空間光変調器が前記レーザ光の変調動作を行うレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、刺激光学系により、レーザ光源から発せられたレーザ光を空間光変調器によってその位相を調節して対物レンズを介して標本に照射することで、標本におけるレーザ光の照射位置を刺激することができる。また、観察光学系により、レーザ光源から発せられたレーザ光を走査部によって走査させて対物レンズを介して標本に照射し、レーザ光が照射された標本からの観察光を検出部により検出して、画像構築部により標本の３次元的な画像を構築することで、画像上で標本を３次元的に観察することができる。

この場合において、空間光変調器によりレーザ光の位相を変調することで、標本上でのレーザ光の強度分布のパターンを変化させることができる。そして、観察光学系によって標本上でレーザ光を走査させた範囲の３次元的な画像上において、刺激光学系によって刺激する標本の刺激箇所を位置設定部により光軸方向に異なる複数個所に設定することで、その画像上の刺激箇所に応じて空間光変調器によりレーザ光の位相を調節するだけで、所望の複数の刺激箇所に同時にレーザ光を照射することができる。

したがって、標本の複数の刺激箇所を簡便に設定し、その各刺激箇所にレーザ光を同時に照射することができる。画像構築部により構築する３次元的な画像には、３次元的に立体的に表示した画像だけでなく、３次元的な画像情報を有する２次元的な画像の集合をコマ送り表示や並べて表示したものも含まれる。

上記発明においては、前記刺激光学系により照射される前記レーザ光の前記標本における照射パターンを前記位置設定部に設定される所期の照射パターンに略一致させるように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する相関補正部を備えることとしてもよい。

このように構成することで、刺激光学系により、位置設定部に設定される所期の照射パターン、例えば、ユーザが入力設定する所望のパターンに略一致する照射パターンで標本にレーザ光を照射させることができる。

また、上記発明においては、前記観察光学系またはこれと別に設けられた標本画像取得部が、前記空間光変調器により生成される規定の照射パターンで前記レーザ光が照射された前記標本の観察画像を取得し、前記相関補正部が、前記標本へ照射した規定の照射パターンと前記取得された観察画像における前記照射パターンとの差分を相殺するように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御することとしてもよい。

このように構成することで、刺激光学系によって規定の照射パターンでレーザ光を照射された標本の画像が取得される。相関補正部は、取得された画像上でのレーザ光の強度分布のパターンと規定の照射パターンとの比較に基づいて空間光変調器による位相の変調量を補正するので、刺激光学系により標本に照射するレーザ光を規定の強度分布のパターンに略一致させることができる。

また、上記発明においては、前記対物レンズ、該対物レンズと前記空間光変調器との間に配置される光学系の収差、および／または、前記標本の屈折率ミスマッチによる影響を補正するように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する収差補正部を備えることとしてもよい。

対物レンズや他の光学系の収差および標本の屈折率ミスマッチの影響を受けると、レーザ光のスポットの形状が乱れたり、レーザ光のスポット径が回折限界から計算される値よりも大きくなったりする。このように構成することで、そのような対物レンズや他の光学系の収差および／または標本の屈折率ミスマッチの影響による不都合を回避し、標本における複数の刺激箇所を同時に刺激することができる。

また、上記発明においては、前記空間光変調器が配置される前記刺激光学系の刺激光路と前記走査部が配置される前記観察光学系の観察光路とが別個に設けられ、これらの刺激光路と観察光路とを合成して、前記刺激光学系のレーザ光と前記観察光学系のレーザ光とを共通の前記対物レンズに入射させる光路合成部を備えることとしてもよい。

このように構成することで、異なるレーザ光源から発生させて刺激光学系の刺激光路を通過させるレーザ光と観察光学系の観察光路を通過させるレーザ光とを光路合成部により合成して標本に同時に照射することができる。したがって、刺激光学系による標本の光刺激と観察光学系による標本の観察とを同時に行うことができる。

また、上記発明においては、前記対物レンズにより集光された前記標本からの観察光を撮影して該標本の２次元画像を取得する標本画像取得部を備えることとしてもよい。

このように構成することで、刺激光学系によりレーザ光を照射した標本の画像を標本画像取得部により簡易に取得することができる。

また、上記発明においては、前記相関補正部が、前記刺激光学系により照射するレーザ光の前記標本における深さ位置と前記観察光学系によりレーザ光が照射されて取得された前記標本の前記３次元的な画像上の深さ位置とを対応付けることとしてもよい。

このように構成することで、標本の深さ方向の異なる各位置においても、観察光学系により取得した標本の画像上の座標と刺激光学系により標本に照射するレーザ光の照射位置との位置関係を相関補正部により対応付けることができる。

また、上記発明においては、前記相関補正部が、前記レーザ光の波長ごとに、前記刺激光学系により照射される前記標本における深さ位置と前記観察光学系によりレーザ光が照射されて得られる前記標本の前記３次元的な画像上の深さ位置とを対応付ける相関テーブルを有し、該相関テーブルに基づいて前記レーザ光の波長ごとに前記空間光変調器による位相の変調を制御することとしてもよい。

このように構成することで、レーザ光の波長を変えても、刺激光学系により照射するレーザ光の標本における深さ位置と観察光学系によりレーザ光が照射されて得られる標本の３次元的な画像上の深さ位置とを対応付けて、標本の３次元的な画像上に設定される深さ位置が異なる複数の刺激箇所に同じ強度でレーザ光を照射することができる。

また、上記発明においては、前記刺激光学系により照射する前記レーザ光の強度を、前記位置設定部により設定された複数の刺激箇所のそれぞれに対して設定可能な強度設定部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、強度設定部により、標本の刺激する刺激箇所ごとにレーザ光の強度を設定することができる。したがって、刺激光強度と標本の反応とを関連付けて観察することができる。

また、上記発明においては、前記強度設定部が、前記レーザ光が照射される照射位置の深さに関わらず一定の強度で前記標本を刺激するように、前記レーザ光の強度を調節することとしてもよい。
このように構成することで、強度設定部により、標本における深さが異なる複数箇所を同じ強度のレーザ光により刺激することができる。

また、上記発明においては、前記強度設定部が、前記標本において照射された前記レーザ光が減光する減光関数を記憶する記憶部と、該記憶部に記憶されている前記減光関数に基づいて前記レーザ光源の出力を調節する出力調節部とを備えることとしてもよい。

このように構成することで、標本の状態や種類によって減光関数の係数を修正するだけで、レーザ光の照射位置の深さに関わらず一定の強度で標本を刺激するように、レーザ光の強度を容易に調節することができる。

また、上記発明においては、前記強度設定部が、前記標本の深さに対する前記レーザ光の散乱率および吸収率に関するテーブルを記憶する記憶部と、該記憶部に記憶されている前記テーブルに基づいて前記レーザ光源の出力を調節する出力調節部とを備えることとしてもよい。

このように構成することで、同じ標本を観察し続けるような場合において、正確かつ容易にテーブルを作成することができる。また、関数化するのが困難な場合に有効である。
また、上記発明においては、前記レーザ光源が赤外パルスレーザであることとしてもよい。

上記発明においては、レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置されて前記レーザ光源により発せられたレーザ光の位相を変調する位相変調型空間光変調器が配置された刺激光路を有する刺激光学系と、前記レーザ光源により発せられたレーザ光を前記標本上で観察用照明光として走査させる走査部が配置された観察光路と前記対物レンズにより集光された前記標本からの観察光を検出する検出部とを有する観察光学系と、前記刺激光路と前記観察光路とを合成して、前記刺激光学系のレーザ光と前記観察光学系のレーザ光とを共通の前記対物レンズに入射させる光路合成部と、該観察光学系が光軸方向に異なる観察面の観察画像を取得することにより前記標本の３次元的な画像を構築する画像構築部と、該画像構築部により構築された３次元的な画像上において、前記刺激光学系により前記レーザ光を刺激光として照射する前記標本の刺激箇所を光軸方向に異なる複数個所に設定する位置設定部と、前記刺激光学系により照射される前記レーザ光の前記標本における照射パターンを前記位置設定部に設定される所期の照射パターンに略一致させるように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する相関補正部とを備え、前記位置設定部により設定された各刺激箇所に前記レーザ光が照射されるように前記空間光変調器が前記レーザ光の変調動作を行うこととしてもよい。

上記発明においては、前記刺激光学系が、前記レーザ光を前記標本上で刺激光として走査させる刺激光走査部を前記刺激光路上に備えることとしてもよい。

上記発明においては、前記空間光変調器により生成される規定の照射パターンで前記レーザ光が照射された前記標本からの光を、前記観察光学系が前記走査部を作動させて検出することにより、前記規定の照射パターンが照射された標本の観察画像を取得し、前記相関補正部が、前記標本へ照射した規定の照射パターンと前記取得された観察画像における前記照射パターンとの差分を相殺するように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御することとしてもよい。

本発明によれば、標本の複数の刺激箇所を簡便に設定して、各刺激箇所を同時に光刺激することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第２実施形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第２実施形態の変形例に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第２実施形態の他の変形例に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第３実施形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係るレーザ顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１００は、図１に示すように、標本Ｓが載置されるステージ１と、レーザ光を発するレーザ光源部（レーザ光源）１０と、標本Ｓを光刺激する刺激光学系２０と、標本Ｓを観察する観察光学系３０と、刺激光学系２０の光路（刺激光路）と観察光学系３０の光路（観察光路）とを合成するダイクロイックミラー等の光路合成部３と、標本Ｓにレーザ光を照射する一方、標本Ｓからの戻り光を集光する対物レンズ５と、制御装置５０と、モニタ５７と、キーボード等の入力装置５９とを備えている。同図において、符合７は結像レンズを示し、符合９はミラーを示している。

ステージ１は、対物レンズ５の光軸方向に移動可能に設けられており、制御装置５０に接続されている。このステージ１は制御装置５０により制御されるようになっている。また、ステージ１の光軸方向における位置情報が制御装置５０に送られるようになっている。

レーザ光源部１０は、標本Ｓを刺激するためのレーザ光（以下、刺激光という。）を発するレーザ光源１１と、標本Ｓを励起して蛍光を発生させるためのレーザ光（以下、励起光という。）を発するレーザ光源１３とを備えている。レーザ光源１１は刺激光学系２０に配置され、レーザ光源１３は観察光学系３０に配置されている。

刺激光学系２０は、レーザ光源１１から発せられた刺激光の光束径を調節可能なビームエキスパンダ２１と、刺激光を反射する直角プリズム２３と、刺激光の位相を変調可能な空間光位相変調器（位相変調型の空間光変調器。Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ−Ｓｐａｔｉａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ。以下、「ＬＣＯＳ−ＳＬＭ」という。）２５と、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５により位相を調節された刺激光を反射するミラー２７と、ミラー２７により反射された刺激光を光路合成部３に入射させて、結像レンズ７の手前で像を結ばせるリレーレンズである瞳投影レンズ２９とを備えている。

レーザ光源１１としては、例えば、赤外線領域の超短パルスレーザ光（刺激光）を射出する赤外パルスレーザを採用することができる。
直角プリズム２３は、レーザ光源１１から発せられビームエキスパンダ２１を介して入射される刺激光をＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５に向けて反射する一方、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５から戻る刺激光をミラー２７に向けて反射することができるようになっている。

ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５は、対物レンズ５の瞳位置と共役な位置に配置されており、制御装置５０に接続されている。このＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５は、制御装置５０により制御され、入射した刺激光の波面形状を位相変調により変化させて反射するようになっている。これにより、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５は、標本Ｓ上での刺激光の強度分布を３次元的に変化させて、標本Ｓに所望の３次元的なパターンの刺激光を照射することができるようになっている。

３次元的なパターンは、刺激光の光軸方向の位置が異なる２箇所以上のスポットを含むこととする。これにより、例えば、標本Ｓ上の一点に刺激光を照射したり、標本Ｓ上のＸＹＺ軸方向にわたる３次元的な多点に刺激光を同時に照射したりすることができるようになっている。

観察光学系３０は、レーザ光源１３から発せられた励起光を透過する一方、標本Ｓにおいて発生した蛍光を反射する特性を有するダイクロイックミラー３１と、標本Ｓ上で励起光を走査させるガルバノミラー（走査部）３３と、ガルバノミラー３３により走査された励起光を光路合成部３に入射させて、結像レンズ７の手前で像を結ばせるリレーレンズである瞳投影レンズ３５と、標本Ｓにおいて発生した蛍光を検出する検出光学系４０とを備えている。

レーザ光源１３は、例えば、レーザ光源１１とは異なる波長の可視レーザ光を励起光として射出するようになっている。
ガルバノミラー３３は、制御装置５０に接続されている。また、ガルバノミラー３３は、光軸に対して互いに垂直な揺動軸回りに揺動可能な一対のミラー対（図示略）を備えている。このガルバノミラー３３は、制御装置５０により制御されて、ミラー対を揺動させながら励起光を反射することにより、標本Ｓ上で励起光をＸＹ方向に走査させることができるようになっている。

また、ガルバノミラー３３は、ミラー対の揺動角度信号を制御装置５０へ出力するようになっている。また、ガルバノミラー３３は、対物レンズ５の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていることが望ましい。

検出光学系４０は、ダイクロイックミラー３１により反射された蛍光を集光する共焦点レンズ４１と、共焦点レンズ４１により集光された蛍光の光束を制限する共焦点ピンホール４３と、共焦点ピンホール４３を通過した蛍光を平行光にするコリメートレンズ４５と、平行光になった蛍光の強度を検出するＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ、検出部。)４７とを備えている。

共焦点ピンホール４３は、標本の観察面と共役な位置に配置されており、観察面から発生した蛍光のみを通過させ、それ以外の層から発生した蛍光を除去することができるようになっている。
ＰＭＴ４７は、検出した蛍光の検出信号を制御装置５０に出力するようになっている。このＰＭＴ４７は、対物レンズ５の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていることが望ましい。

制御装置５０は、観察光学系３０による励起光の照射位置と刺激光学系２０による刺激光の照射位置とを対応付ける相関補正部５１と、刺激光学系２０および観察光学系３０の制御および標本Ｓの画像処理等を行う制御部（画像構築部、位置設定部）５３と、対物レンズ５の収差を補正する収差補正部５５とを備えている。

相関補正部５１は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５により位相が調節された刺激光学系２０の刺激光が照射される標本Ｓの画像のパターンとガルバノミラー３３により走査された観察光学系３０の励起光が照射される標本Ｓの画像のパターンとが略一致するように、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による刺激光の位相変調を制御するようになっている。

制御部５３は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５のリフレッシュタイミングとガルバノミラー３３およびＰＭＴ４７の制御とを同期させて、観察光学系３０により励起光を照射する標本Ｓの画像の取得と刺激光学系２０により刺激光を照射する標本Ｓの光刺激のタイミングとを制御するようになっている。

また、制御部５３は、ステージ１から送られてくるステージの光軸方向における位置情報と、ガルバノミラー３３から送られてくるミラー対の揺動角度信号と、ＰＭＴ４７から送られてくる蛍光の検出信号とに基づいて、ガルバノミラー３３による励起光の走査とＰＭＴ４７による蛍光の検出とを同期させて、標本Ｓの３次元的な画像を構築することができるようになっている。

さらに、制御部５３は、構築した標本Ｓの画像をモニタ５７に表示させることができるようになっている。そして、制御部５３は、モニタ５７に表示した標本Ｓの３次元的な画像上において、ユーザにより入力装置５９を介して入力される刺激光学系２０によって光刺激する標本Ｓの刺激箇所、すなわち、刺激光の照射位置を光軸方向に異なる複数個所に設定することができるようになっている。

収差補正部５５には、設計上や製造上の誤差に起因する対物レンズ５の収差に関する収差データを対物レンズ５と対応づけて記憶させることができるようになっている。この収差補正部５５は、対物レンズ５の収差データに基づき、その対物レンズ５の収差による影響を補正するように、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５に入力する位相変調信号を生成するようになっている。

このように構成されたレーザ顕微鏡１００の作用について説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１００により標本Ｓを光刺激する場合について説明する。
刺激光学系２０により標本Ｓを刺激するには、まず、レーザ光源１１から刺激光を発生させ、ビームエキスパンダ２１によりその光束径をＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５のサイズに合わせて調整する。ビームエキスパンダ２１により光束径が調整された刺激光は、直角プリズム２３により反射されて、平行光としてＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５に入射される。

ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５に入射された刺激光は、位相が変調されて波面形状が変化して直角プリズム２３に戻される。直角プリズム２３に戻された刺激光は、ミラー２７に向けて反射され、瞳投影レンズ２９を介して光路合成部３に入射される。光路合成部３に入射された刺激光は、反射されて観察光学系３０との共通の光路を進み、結像レンズ７およびミラー９を介して対物レンズ５に入射される。

対物レンズ５に入射された刺激光は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調によって形成された所望のパターンで標本Ｓに照射される。これにより、刺激光の照射パターンに従い標本Ｓが刺激される。

次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１００により標本Ｓを観察する場合について説明する。
観察光学系３０により標本Ｓを観察するには、まず、レーザ光源１３から励起光を発生させ、ダイクロイックミラー３１を透過させてガルバノミラー３３に入射させる。ガルバノミラー３３に入射された励起光は、ミラー対により標本Ｓ上の走査位置に応じた方向に偏向され、瞳投影レンズ３５を介して光路合成部３に入射される。

光路合成部３に入射した励起光は、透過して刺激光学系２０との共通の光路を通り、結像レンズ７およびミラー９を介して対物レンズ５により標本に照射される。これにより、ガルバノミラー３３のミラー対の揺動角度に応じて、標本Ｓ上で励起光が走査される。

励起光が照射されることにより標本Ｓ上の走査位置において蛍光が発生すると、蛍光は対物レンズ５により集光され、ミラー９、結像レンズ７、光路合成部３、瞳投影レンズ３５、および、ガルバノミラー３３を介して励起光の光路を戻り、ダイクロイックミラー３１により反射されて検出光学系４０に入射される。

検出光学系４０に入射した蛍光は、共焦点レンズ４１により集光されて共焦点ピンホール４３によりその光束径が制限された後、コリメートレンズ４５により平行光にされてＰＭＴ４７によりその強度が検出される。ＰＭＴ４７により蛍光の強度が検出されると、その蛍光の検出信号がガルバノミラー３３のミラー対の揺動角度信号と共に制御装置５０に送られる。さらに、ステージ１から送られてくるステージ１の光軸方向における位置情報が制御装置５０に送られる。制御部５３において、これらの蛍光の検出信号、ミラー対の揺動角度信号およびステージ１の光軸方向における位置情報に基づいて、標本Ｓの３次元的な画像が構築される。

次に、これらの刺激光学系２０による標本Ｓの光刺激と観察光学系３０による標本Ｓの観察とを光照射位置のズレが少なくなるように対応付けて行う場合について説明する。
刺激光学系２０による標本Ｓの光刺激と観察光学系３０による標本Ｓの観察とを対応付けて行うには、まず、ステージ１上の標本位置上にミラー（図示略。以下、「ミラー標本」という。）を載置し、刺激光学系２０により、レーザ光源１１から刺激光を発生させてＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５によって位相変調し、規定パターンからなるグリッドをミラー標本上に照射する。

この状態で、観察光学系３０により、励起光を発生させずに、標本Ｓ上を走査するのと同様にミラー対を揺動させてミラー標本を空スキャンし、制御部５３により、刺激光が照射された標本Ｓの画像を取得する。そして、制御部５３によって構築される標本Ｓの画像のパターンが規定パターンに一致するように、すなわち、標本Ｓの画像における照射パターンと規定の照射パターンとの差分が相殺されるように、相関補正部５１によりＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５の位相変調が制御される。また、規定パターンに一致したときの位相変調設定が相関補正部５１に記憶される。

これにより、観察光学系３０による励起光のＸＹ軸方向の照射位置と刺激光学系２０による刺激光のＸＹ軸方向の照射位置とが対応付けられる。
観察光学系３０による励起光のＺ軸方向の照射位置と刺激光学系２０による刺激光のＺ軸方向の照射位置との関連付けはオープンループ制御とする。ここでいうオープンループ制御とは、実際の画像との差分を補正に利用するのではなく、設計的に求められる波面変調の値を用いた制御である。

次に、ステージ１に標本Ｓを載置し、観察光学系３０により、レーザ光源１３から励起光を発生させてガルバノミラー３３により標本Ｓ上で走査させる。そして、２次元平面上を走査し終える毎にステージ１を光軸方向へ移動させ、ＰＭＴ４７および制御部５３により標本ＳのＸＹＺスタック画像を構築する。そして、制御部５３により、３次元画像化ソフトを用いて、ＸＹＺスタック画像から３次元的な画像（以下、３次元画像という。）に変換する。

次いで、モニタ５７に標本Ｓの３次元画像を表示し、画像操作手段（図示略）により、３次元画像を拡大、縮小、回転、移動等の操作をして、標本Ｓの刺激箇所を２箇所以上探す。この際、３次元画像を半透明で表示して内部構造を視認可能にしたり、３次元画像を任意の位置でスライスして表示して注目部位を探しやすくしたりしてもよい。

このような操作により探した標本Ｓの刺激箇所は、ユーザにより入力装置５９を介して入力され、制御部５３により標本Ｓの３次元画像上において設定される。続いて、制御部５３により、設定した刺激箇所から標本Ｓの３次元的な座標が算出され、算出された座標データが収差補正部５５へ出力される。そして、収差補正部５５により、制御部５３から送られてきた座標データに基づいてその座標位置に刺激光を照射するための位相変調信号が生成されて、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５に送られる。これにより、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による刺激光の位相変調が制御される。

この場合において、収差補正部５５に対物レンズ５とその収差データを対応づけて記憶させておくことで、収差補正部５５により、刺激光が対物レンズ５から受ける収差をキャンセルする波面となるような位相変調信号が生成される。これにより、対物レンズ５により受ける収差の影響を補正することができる。

したがって、刺激光学系２０において、レーザ光源１１から刺激光を発生させると、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５により、観察光学系３０によって取得された標本Ｓの３次元画像上で設定された所望の複数の刺激箇所に応じたパターンが形成され、各刺激箇所に同時に刺激光が照射される。これにより、標本Ｓの複数の刺激箇所を同時に刺激しながら、観察光学系３０によって取得される標本Ｓの３次元画像でその反応を観察することができる。

以上説明したように本実施形態に係るレーザ顕微鏡１００によれば、観察光学系３０により取得される標本Ｓの３次元画像上において、刺激光学系２０により刺激する標本Ｓの刺激箇所を設定することで、刺激箇所の設定を容易にすることができる。また、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による刺激光の位相変調によって観察光学系３０による励起光の照射位置と刺激光学系２０による刺激光の照射位置とを対応付けることで、観察光学系３０により取得される標本Ｓの３次元画像上において設定される所望の複数の刺激箇所に対して、刺激光学系２０により同時に刺激光を照射することができる。

特に、ステージ１を光軸方向に移動させて、刺激光学系２０により照射する刺激光の標本Ｓにおける深さ位置と観察光学系３０により励起光が照射された標本Ｓの３次元的な画像上の深さ位置とを対応付けることで、標本Ｓの同一箇所を刺激しながら、観察光学系３０による観察位置の深さを変えた観察を同時に行うことができる。したがって、標本Ｓの複数の刺激箇所を簡便に設定して、各刺激箇所を同時に光刺激することができる。

また、収差補正部５５により、対物レンズ５の収差の影響を補正することで、複数の刺激箇所に精度よく刺激光を照射することができる。さらに、観察光学系３０の光路と刺激光学系２０の光路とを別々に設けることで、観察光学系３０による励起光の照射と刺激光学系２０による刺激光の照射とを同時に行い、標本Ｓの刺激とその反応の観察とをタイムラグ無く行うことができる。

本実施形態においては、３次元画像化ソフトを用いて、ＸＹＺスタック画像から３次元画像に変換してから刺激箇所を設定することとしたが、例えば、観察光学系３０により取得されるＸＹ２次元画像をモニタ（図示略）に表示し、Ｚ軸方向の位置を変えながら刺激したい部分を探して、制御部５３により２次元画像上において刺激箇所を設定することとしてもよい。

また、本実施形態においては、収差補正部５５により対物レンズ５の収差を補正することとしたが、対物レンズ５の収差のみならず、直角プリズム２３、ミラー２７、瞳投影レンズ２９、光路合成部３、結像レンズ７、ミラー９等の顕微鏡光学系の収差や標本Ｓの屈折率ミスマッチも補正することとしてもよい。

また、本実施形態においては、３次元画像を取得する際に、２次元平面上を走査し終える毎にステージ１を光軸方向へ移動させることとしたが、ステージ１を固定するものとし、その代わりに制御装置５０により対物レンズ５を制御して、２次元平面上を走査し終える毎に対物レンズ５を光軸方向へ移動させることとしてもよい。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係るレーザ顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡２００は、図２に示すように、レーザ光源部１０がレーザ光源１１に代えてレーザ光源装置１１０を備え、刺激光学系２０により照射する刺激光の強度を設定する強度設定部１５７と、ＣＣＤカメラ（標本画像取得部）１６１と、ＣＣＤカメラ１６１の前段に配置される結像レンズ１６３と、ミラー９に代えて配置されるハーフミラー１０９とを備える点で、第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るレーザ顕微鏡１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

レーザ光源装置１１０は、異なる波長の可視レーザ光（刺激光）を発生する複数のレーザ光源１１１Ａ，１１１Ｂ，１１１Ｃと、これらのレーザ光源１１１Ａ，１１１Ｂ，１１１Ｃから発せられた各刺激光を同一光路に統合するミラー１１３Ａ，１１３Ｂおよびダイクロイックミラー１１４Ａ，１１４Ｂと、同一光路に統合された各刺激光のパワーを調整可能なＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔ Ｏｐｔｉｃ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ：音響光学可変フィルター）１１５と、各波長の刺激光を集光するカップリングレンズ１１７とを備えている。

また、レーザ光源装置１１０には、カップリングレンズ１１７により集光された刺激光を刺激光学系２０に導光するシングルモードファイバ１１８と、シングルモードファイバ１１８により導光された刺激光を平行光にしてビームエキスパンダ２１に入射させるコリメートレンズ１１９とが備えられている。

レーザ光源１１１Ａから発せられた刺激光は、ダイクロイックミラー１１４Ａにより反射されてミラー１１３Ａを介してＡＯＴＦ１１５に入射されるようになっている。また、レーザ光源１１１Ｂから発せられた刺激光は、ダイクロイックミラー１１４Ｂにより反射された後、ダイクロイックミラー１１４Ａを透過してミラー１１３Ａを介してＡＯＴＦ１１５に入射されるようになっている。さらに、レーザ光源１１１Ｃから発せられた刺激光は、ミラー１１３Ｂにより反射された後、ダイクロイックミラー１１４Ｂ，１１４Ａを透過してミラー１１３Ａを介してＡＯＴＦ１１５に入射されるようになっている。
ＡＯＴＦ１１５は、強度設定部１５７により、透過させる刺激光の光量および波長を選択することができるようになっている。

入力装置５９は、ユーザにより操作され、モニタ５７に表示される標本Ｓの３次元画像上において制御部５３により設定される刺激箇所に対して、所望の刺激強度および刺激時間を入力することができるようになっている。また、入力装置５９には、刺激光学系２０により標本Ｓを刺激する刺激箇所と、観察光学系３０による標本Ｓを観察する観察範囲を設定することができるようになっている。

強度設定部１５７は、入力装置５９により入力された刺激箇所ごとの刺激強度および刺激時間に従い、レーザ光源装置１１０を制御するようになっている。これにより、標本Ｓの各刺激箇所に対して、刺激時間を異ならせつつ、相対的な強度比率で刺激光を照射したり同一の刺激強度で刺激光を照射したりすることができるようになっている。

ハーフミラー１０９は、励起光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生し対物レンズ５により集光されて励起光の光路を戻る蛍光を結像レンズ７に向けて反射する一方、刺激光が照射されることにより標本Ｓにおいて反射されてその刺激光の光路を戻る反射光を透過させるようになっている。

ＣＣＤカメラ１６１と結像レンズ１６３は、対物レンズ５と光路合成部３との間に配置されており、ハーフミラー１０９を透過した反射光が結像レンズ１６３により集光されてＣＣＤカメラ１６１により撮影されるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡２００の作用について説明する。
本実施形態は、相関補正部５１によりＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５の位相変調を行う相関補正用の画像をＣＣＤカメラ１６１により取得する点で、観察光学系３０のガルバノミラー３３を空スキャンさせて画像を取得する第１実施形態と異なる。具体的には、本実施形態に係るレーザ顕微鏡２００により刺激光学系２０による標本Ｓの光刺激と観察光学系３０による標本Ｓの観察とを対応付けて行うには、予め、ＣＣＤカメラ１６１の各画素と観察光学系３０の走査側の各画素とを対応付けておく。

そして、第１実施形態と同様に、ステージ１にミラー標本を載置し、レーザ光源装置１１０から刺激光を発生させて、規定パターンからなるグリッドをミラー標本上に照射する。ミラー標本に照射された刺激光は反射されて光路を逆方向に戻り、対物レンズ５により集光されてハーフミラー１０９を透過し、結像レンズ７を介してＣＣＤカメラ１６１に入射される。これにより、ＣＣＤ１６１の受光面において規定パターンのグリッドが投影され、ＣＣＤカメラ１６１によって刺激光のグリッドの画像が取得される。

次いで、相関補正部５１により、ＣＣＤカメラ１６１によって取得される標本Ｓの画像のパターンが規定パターンに一致するように、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調が制御される。また、規定パターンに一致したときの位相変調設定が相関補正部５１に記憶される。

これにより、観察光学系３０による励起光のＸＹ軸方向の照射位置と刺激光学系２０による刺激光のＸＹ軸方向の照射位置とが対応付けられる。したがって、制御部５３により、観察光学系３０によって取得される標本Ｓの３次元画像において刺激箇所を設定することで、刺激光学系２０によりその刺激箇所に刺激光を同時に照射することができる。

ここで、観察光学系３０により観察する範囲の深さを変えるには、標本Ｓが載置されたステージ１または対物レンズ５を光軸方向に動かすことになる。そうすると、刺激光学系２０により標本Ｓに照射される刺激光の照射位置がステージ１または対物レンズ５の移動量に応じて変動してしまう。したがって、刺激位置を標本Ｓ内の当初設定した位置に保ったまま３次元画像を取得するには、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５により、ステージ１または対物レンズ５の移動量に応じた量だけ刺激光に位相変調を加えることで刺激位置を戻せばよい。

本実施形態においては、入力装置５９により、刺激光学系２０による標本Ｓの刺激位置と観察光学系３０による標本Ｓの観察範囲（ＸＹＺ範囲とスライス幅）を設定しておくことで、相関補正部５１により、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調が制御されて、刺激光の照射位置が一定に保たれる。

具体的には、刺激光学系２０により標本Ｓに刺激光を照射するとともに観察光学系３０により標本ＳのＸＹ軸方向の画像を取得しつつ、スライス幅の分だけＺ軸方向の位置を変更すると、入力装置５９により入力された刺激光学系２０による標本Ｓの刺激位置と観察光学系３０による標本Ｓの観察範囲とに基づいて、相関補正部５１によりＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５が制御され、位相変調により刺激光の照射位置の深さがスライス幅の分だけ元の深さに戻される。これにより、刺激位置が一定に保たれる。続いて、観察光学系３０により２枚目のＸＹ画像が取得され、最初に設定されたＺ位置まで同様の手順が繰り返される。

このようにすることで、観察光学系３０により観察する深さを変えても、刺激光学系２０により標本Ｓに照射される刺激光の照射位置が変動してしまうのを防ぎ、常に標本Ｓの同一箇所を刺激することができる。

次に、強度設定部１５７により、刺激光学系２０によって光刺激する標本Ｓの刺激箇所ごとに異なる刺激強度または異なる照射時間で刺激光を照射する場合について説明する。なお、設定できる刺激強度は刺激箇所の数で決まり、１０箇所であれば１つの刺激箇所に対する刺激強度は最大でレーザ光源装置１１０の最大出力の１０％であり、３箇所であれば１つの刺激箇所に対する刺激強度は最大でレーザ光源装置１１０の最大出力の３３％である。

まず、各刺激箇所に対して相対的な強度比率で刺激光を照射する場合は、例えば、３箇所を刺激することとすると、刺激強度がトータルで１００％になるように、例えば、入力装置５９により各刺激箇所についてそれぞれレーザ光源装置１１０の最大出力の２０％、３０％、５０％に設定する。また、刺激時間は、例えば、各刺激箇所についてそれぞれ１秒、３秒、５秒に設定する。

このように設定した場合は、相関補正部５１により、設定した各刺激位置に対して相対的な強度比率でスポットが結ばれるようにＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による刺激光の位相変調が制御され、強度設定部１５７により、レーザ光源装置１１０が以下のように制御される。

まず、刺激開始から１秒後に、２０％に設定した刺激箇所への照射が終了される。そして、ＡＯＴＦ１１５の透過率が初期の透過率に対して２０％低減される。次いで、刺激開始から３秒後に、３０％に設定した刺激箇所への照射が終了される。そして、ＡＯＴＦ１１５の透過率が初期の透過率に対して５０％低減される。次いで、刺激開始から５秒後に、５０％に設定した刺激箇所への照射も終了される。

これにより、刺激箇所ごとに異なる強度で刺激光を照射するともに、刺激箇所ごとに刺激を加える時間を変えることができる。
なお、ＡＯＴＦ１１５の透過率を予め所望の値まで下げてから実行するようにしてもよい。このようにすることで、標本Ｓへのダメージを低減することが可能になる。

一方、標本Ｓの各刺激箇所に対して同じ強度で刺激光を照射する場合は、例えば、刺激箇所を３箇所とすると、例えば、入力装置５９により各刺激箇所に対してレーザ光源装置１１０の最大出力の３３％に設定する。この場合も、刺激箇所ごとに刺激時間を設定することとしてもよい。例えば、刺激箇所ごとに刺激時間をそれぞれ１秒、３秒、５秒に設定する。

このように設定した場合は、相関補正部５１により、設定した各刺激位置に対して同じ刺激強度でスポットが結ばれるようにＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による刺激光の位相変調が制御され、強度設定部１５７により、レーザ光源装置１１０が以下のように制御される。

まず、刺激開始から１秒後に１つ目の刺激箇所への照射が終了される。そして、ＡＯＴＦ１１５の透過率が初期の透過率に対して６６％に低減される。次いで、刺激開始から３秒後に２つ目の刺激箇所への照射が終了される。そして、ＡＯＴＦ１１５の透過率が初期の透過率に対して３３％に低減される。次いで、刺激開始から５秒後に３つ目の刺激箇所への照射も終了される。これにより、刺激箇所ごとに同じ強度で刺激光を照射するともに、刺激箇所ごとに刺激を加える時間を変えることができる。

以上説明したように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡２００によれば、ＣＣＤ１６１により、刺激光学系２０によって刺激光を照射した標本Ｓの画像を簡易に取得することができる。したがって、ＣＣＤ１６１により取得される刺激光を照射した標本Ｓの画像上での刺激光の強度分布のパターンに基づいて、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による刺激光の位相の変調を行うことで、刺激光学系２０により標本Ｓに照射する刺激光を規定の強度分布のパターンに簡易かつ迅速に設定することができる。また、強度設定部１５７により、標本Ｓの刺激する刺激箇所ごとに刺激光の強度を設定し、刺激光強度と標本Ｓの反応とを関連付けて観察することができる。

また、刺激光学系２０により照射する刺激光の標本Ｓにおける深さ位置と観察光学系３０により励起光が照射された標本Ｓの３次元的な画像上の深さ位置とを対応付けることで、標本Ｓの同一箇所を刺激しながら、観察光学系３０による観察位置の深さを変えた観察を同時に行うことができる。

本実施形態においては、観察光学系３０により励起光を照射した標本ＳをＣＣＤ１６１により観察することとしてもよい。このようにすることで、ＰＭＴ４７および制御部５３により画像を構築する場合と比較して、標本Ｓにおける刺激後の動態を高速に画像化することができる。

ここで、標本Ｓの深さが異なる複数の刺激箇所を同一強度で刺激しようとすると、標本Ｓでの散乱や吸収により、深い位置の刺激強度は浅い位置よりも弱くなる傾向がある。そこで、例えば、標本Ｓ上での散乱や減光の影響を考慮して、深さが異なる複数の刺激箇所を同一強度で刺激することとしてもよい。

この場合、例えば、強度設定部１５７が、標本Ｓにおいて照射された刺激光が減光する減光関数を記憶する記憶部（図示略）と、記憶部に記憶されている減光関数に基づいてレーザ光源装置１１０の出力を調節する出力調節部（図示略）とを備えることとしてもよい。

そして、記憶部には、減光関数として、例えば、標本Ｓの散乱係数と吸収係数が記憶されることとしてもよい。
また、出力調節部は、各刺激箇所の３次元座標と、記憶部に記憶されている標本Ｓの散乱係数および吸収係数とから、刺激強度の基準にする刺激箇所（以下、基準刺激箇所という。）と同じ強度で刺激光が照射されるような刺激強度を刺激箇所ごとに算出することとしてもよい。さらに、出力調節部により算出された刺激箇所ごとの刺激強度が収差補正部５５に送られることとしてもよい。なお、出力調節部は、必要に応じて、ＡＯＴＦ１１５の透過率を上げることとしてもよい。

本変形例に係るレーザ顕微鏡２００により、深さが異なる複数の刺激箇所を同一強度で刺激するには、まず、標本Ｓの散乱係数と吸収係数を予め記憶部に記憶させておき、入力装置５９により、各刺激箇所の刺激強度をパーセンテージで設定する。例えば、全ての刺激箇所に対してレーザ光源装置１１０の最大出力の１０％の刺激強度で刺激光を照射するように設定すればよい。また、基準刺激箇所を選択する。

出力調節部により、各刺激箇所の３次元座標と、記憶部に記憶されている標本Ｓの散乱係数および吸収係数とから、刺激箇所ごとに基準刺激箇所と同じ強度で刺激光を照射可能な刺激強度が算出されて収差補正部５５に送られる。そして、収差補正部５５により、入力された刺激箇所ごとの刺激強度に応じた位相変調信号が生成され、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５に送られて位相変調が制御される。また、出力調節部により、必要に応じて、ＡＯＴＦ１１５の透過率が上げられる。これにより、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５により刺激光の位相が変調されて、標本Ｓの複数の刺激箇所に深さに応じた強度で刺激光が照射される。

このようにすることで、標本Ｓの状態や種類によって減光関数の係数を修正するだけで、刺激光の照射位置の深さに関わらず一定の強度で標本Ｓを刺激するように、刺激光の強度を容易に調節することができる。また、ユーザは散乱による刺激光の減光を意識せずに、各刺激箇所に対して同じ強度で刺激を行うことができる。

本変形例においては、記憶部が標本Ｓの深さに対する刺激光の散乱率および吸収率に関するテーブルを記憶し、出力調節部が記憶部に記憶されているテーブルに基づいてレーザ光源装置１１０の出力を調節することとしてもよい。
この場合、標本Ｓの深さごとの散乱率と吸収率のテーブルを予め記憶部に記憶させておくこととすればよい。

そして、出力調節部により、各刺激箇所の３次元座標と記憶部に記憶されているテーブルとから、刺激箇所ごとに基準刺激箇所と同じ強度で刺激光を照射可能な刺激強度を算出するとともに、必要に応じてＡＯＴＦ１１５の透過率を上げることとすればよい。そして、収差補正部５５により、その刺激箇所ごとの刺激強度に応じた位相変調信号を生成して、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調を制御することとすればよい。

このようにすることで、同じ標本Ｓを観察し続けるような場合において、正確かつ容易にテーブルを作成することができる。また、関数化するのが困難な場合に有効である。

また、本実施形態においては、相関補正部５１が、刺激光の波長ごとに、観察光学系３０による励起光の照射位置と刺激光学系２０による刺激光の照射位置とを対応付けた相関テーブルを有することとしてもよい。この場合、入力装置５９により標本Ｓに照射する刺激光の波長を選択した段階で、相関補正部５１により相関テーブルから刺激光の波長に対応した位相変調値を算出して、収差補正部５５に送ることとすればよい。

このようにすることで、標本Ｓを刺激する刺激光の波長に応じた最適な変調を行うことができる。したがって、刺激光の波長が変わっても、観察光学系３０により取得される標本Ｓの３次画像上において、狙った位置へ刺激光を照射することができる。

本実施形態は、観察光学系３０の光路と刺激光学系２０の光路とを別個に設けることとしたが、これに代えて、例えば、図３および図４に示すように、観察光学系３０の光路と刺激光学系２０の光路とを共通にすることとしてもよい。

具体的には、図３に示すように、レーザ顕微鏡２００が、レーザ光源部１０に代えて、レーザ光を発振するレーザ光源１１２を備えることとしてもよい。そして、観察光学系および刺激光学系を、ビームエキスパンダ２１と、直角プリズム２３と、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５と、直角プリズム２３により再度反射されたレーザ光をリレーするリレー光学系１２６と、ダイクロイックミラー３１と、ガルバノミラー３３と、瞳投影レンズ３５と、検出光学系４０とにより構成することとしてもよい。この場合、標本Ｓを観察する場合は、レーザ光の光路プリズム２３を脱離するか、または、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調を行わないように制御することとすればよい。

また、図４に示すように、レーザ顕微鏡２００が、レーザ光源部１０に代えて、標本Ｓに多光子励起を生じさせるＩＲパルスレーザを発振するレーザ光源１１４を備えることとしてもよい。そして、観察光学系および刺激光学系を、ビームエキスパンダ２１と、直角プリズム２３と、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５と、直角プリズム２３により再度反射されたレーザ光をリレーするリレー光学系１２６と、ガルバノミラー３３と、瞳投影レンズ３５とにより構成することとしてもよい。さらに、レーザ顕微鏡２００が、標本Ｓからの蛍光を反射するダイクロイックミラー１７１と、ダイクロイックミラー１７１により反射された蛍光を集光する集光レンズ１７２と、集光レンズ１７２により集光された蛍光を検出するＰＭＴ１７５とを備えることとしてもよい。この場合も同様に、標本Ｓを観察する場合は、レーザ光の光路プリズム２３を脱離するか、または、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調を行わないように制御することとすればよい。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係るレーザ顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡３００は、図５に示すように、レーザ光源部１０に代えて、レーザ光を発するレーザ光源２１１，２１３を有するレーザ光源部２１０を備え、さらに、レーザ光源２１１，２１３から発せられるレーザ光の透過率を制御するＡＯＭ（Ａｃｏｒｓｔｉｃ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｏｄｕｒａｔｏｒ）２１５，２１７と、ミラー２７に入射される刺激光を標本Ｓ上で走査させるガルバノミラー（刺激光走査部）２２６と、標本Ｓからの蛍光を反射するダイクロイックミラー１７１と、ダイクロイックミラー１７１により反射された蛍光から励起波長の光を除去するカットフィルタ１７３と、カットフィルタ１７３を通過した蛍光を検出するＰＭＴ１７５とを備える点で、第１実施形態および第２実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るレーザ顕微鏡１００または第２実施形態に係るレーザ顕微鏡２００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

レーザ光源２１１，２１３は、それぞれ標本Ｓに多光子励起を生じさせるＩＲパルスレーザ（レーザ光）を発振するようになっている。
透過率を制御するためのＡＯＭ２１５、２１７は制御装置５０と接続されている。
ＰＭＴ４７は制御部５３に接続されている。

本実施形態においては、制御部５３は、ガルバノミラー２２６の揺動角度とステージ１の位置とレーザ光の強度とに基づいて画像を構築することができるようになっている。
刺激光学系２０によりＸＹＺ軸方向に走査する深さの範囲は、予め厚さが正確に分かっている標本Ｓの底面から上面までとする。

また、本実施形態においては、相関補正部５１は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調によって刺激光学系２０によるレーザ光の深さ方向の位置の目標値が標本Ｓの厚さと一致する制御値を算出して設定および記憶することができるようになっている。これにより、相関補正部５１は、刺激光学系２０によるレーザ光の深さ方向の位置と観察光学系３０による観察範囲のＺ軸方向の制御との相関をとることができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡３００の作用について説明する。
レーザ光源２１１から発せられたレーザ光は、ＡＯＭ２１５により透過率が制御された後、刺激光学系２０のガルバノミラー２２６を介して光路合成部３により観察光学系３０との共通の光路に入射される。また、レーザ光源２１３から発せられたレーザ光も、ＡＯＭ２１７により透過率が制御された後、観察光学系３０のガルバノミラー３３を介して光路合成部３により刺激光学系２０との共通の光路に入射される。

共通の光路に入射されたレーザ光は、それぞれハーフミラー１０９により反射された後、ダイクロイックミラー１７１を透過して対物レンズ５により標本Ｓに照射される。レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて２光子の蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ５により集光されて光路を逆方向に戻り、ダイクロイックミラー１７１により反射された後、カットフィルタ１７３を透過してＰＭＴ１７５により検出される。

本実施形態においては、刺激光学系２０によりレーザ光源２１１から発せられるレーザ光を標本Ｓに照射し、それにより標本Ｓにおいて発生する蛍光をＰＭＴ１７５により検出して、制御部５３により標本のＸＹＺ画像を構築する。ここで、ＸＹ軸方向はガルバノミラー２２６により走査し、Ｚ軸方向のみＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調によって動かす。このとき、多点照明はしない。つまり、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５は、レーザ光の照射位置を光軸方向へ動かすことにのみ用いる。

この場合において、相関補正部５１により、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５の位相変調によるレーザ光の深さ方向の位置の目標値が標本Ｓの厚さと一致する制御値が設定されて、観察光学系３０によるＺ軸方向の制御との相関がとられる。これにより、観察光学系３０による観察範囲の深さ方向の移動とＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５の位相変調による刺激箇所の深さ方向の移動との対応を取ることができる。さらに、ＸＹ方向にガルバノミラー２２６を振りながらＺ位置を動かすことによってＸＹ方向の位置によらず正確にＺ位置を補正することができる。

本実施形態においては、Ｚ軸方向を補正することとしたが、これに代えて、例えば、各頂点に蛍光ビーズが付いた微細立方体の集合体など、形状および形態が３次元的に既知な標本（以下、３次元グリッド標本という。）を用いることとしてもよい。そして、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調よってレーザ光をＸＹＺ軸方向に走査して多光子励起した３次元グリッド標本の３次元画像を取得することしてもよい。このようにすることで、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ２５による位相変調の制御によってＸＹＺ軸の３方向について補正ができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

３ 光路合成部
５ 対物レンズ
１０，１１２，１１４，２１０ レーザ光源部（レーザ光源）
２０ 刺激光学系
２５ ＬＣＯＳ−ＳＬＭ（空間光変調器）
３０ 観察光学系
３３ ガルバノミラー（走査部）
４０ ＰＭＴ（検出部）
５１ 相関補正部
５３ 制御部（画像構築部，位置設定部）
５５ 収差補正部
１００，２００，３００ レーザ顕微鏡
１５７ 強度設定部
１６１ ＣＣＤカメラ（標本画像取得部）
２２６ ガルバノミラー（刺激光走査部）

Claims (16)

1. レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
   該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置されて前記レーザ光源により発せられたレーザ光の位相を変調する位相変調型空間光変調器を有する刺激光学系と、
   前記レーザ光源により発せられたレーザ光を前記標本上で観察用照明光として走査させる走査部と前記対物レンズにより集光された前記標本からの観察光を検出する検出部とを有する観察光学系と、
   該観察光学系が光軸方向に異なる観察面の観察画像を取得することにより前記標本の３次元的な画像を構築する画像構築部と、
   該画像構築部により構築された３次元的な画像上において、前記刺激光学系により前記レーザ光を刺激光として照射する前記標本の刺激箇所を光軸方向に異なる複数個所に設定する位置設定部とを備え、
   前記位置設定部により設定された各刺激箇所に前記レーザ光が照射されるように前記空間光変調器が前記レーザ光の変調動作を行うレーザ顕微鏡。
2. 前記刺激光学系により照射される前記レーザ光の前記標本における照射パターンを前記位置設定部に設定される所期の照射パターンに略一致させるように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する相関補正部を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
3. 前記観察光学系またはこれと別に設けられた標本画像取得部が、前記空間光変調器により生成される規定の照射パターンで前記レーザ光が照射された前記標本の観察画像を取得し、
   前記相関補正部が、前記標本へ照射した規定の照射パターンと前記取得された観察画像における前記照射パターンとの差分を相殺するように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
4. 前記対物レンズ、該対物レンズと前記空間光変調器との間に配置される光学系の収差、および／または、前記標本の屈折率ミスマッチによる影響を補正するように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する収差補正部を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
5. 前記空間光変調器が配置される前記刺激光学系の刺激光路と前記走査部が配置される前記観察光学系の観察光路とが別個に設けられ、
   これらの刺激光路と観察光路とを合成して、前記刺激光学系のレーザ光と前記観察光学系のレーザ光とを共通の前記対物レンズに入射させる光路合成部を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
6. 前記対物レンズにより集光された前記標本からの観察光を撮影して該標本の２次元画像を取得する標本画像取得部を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
7. 前記相関補正部が、前記刺激光学系により照射するレーザ光の前記標本における深さ位置と前記観察光学系によりレーザ光が照射されて取得された前記標本の前記３次元的な画像上の深さ位置とを対応付ける請求項２から請求項６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
8. 前記相関補正部が、前記レーザ光の波長ごとに、前記刺激光学系により照射される前記標本における深さ位置と前記観察光学系によりレーザ光が照射されて得られる前記標本の前記３次元的な画像上の深さ位置とを対応付ける相関テーブルを有し、該相関テーブルに基づいて前記レーザ光の波長ごとに前記空間光変調器による位相の変調を制御する請求項２から請求項７のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
9. 前記刺激光学系により照射する前記レーザ光の強度を、前記位置設定部により設定された複数の刺激箇所のそれぞれに対して設定可能な強度設定部を備える請求項１から請求項８のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
10. 前記強度設定部が、前記レーザ光が照射される照射位置の深さに関わらず一定の強度で前記標本を刺激するように、前記レーザ光の強度を調節する請求項９に記載のレーザ顕微鏡。
11. 前記強度設定部が、前記標本において照射された前記レーザ光が減光する減光関数を記憶する記憶部と、該記憶部に記憶されている前記減光関数に基づいて前記レーザ光源の出力を調節する出力調節部とを備える請求項１０に記載のレーザ顕微鏡。
12. 前記強度設定部が、前記標本の深さに対する前記レーザ光の散乱率および吸収率に関するテーブルを記憶する記憶部と、該記憶部に記憶されている前記テーブルに基づいて前記レーザ光源の出力を調節する出力調節部とを備える請求項１０に記載のレーザ顕微鏡。
13. 前記レーザ光源が赤外パルスレーザである請求項１から請求項１２のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
14. レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
    該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置されて前記レーザ光源により発せられたレーザ光の位相を変調する位相変調型空間光変調器が配置された刺激光路を有する刺激光学系と、
    前記レーザ光源により発せられたレーザ光を前記標本上で観察用照明光として走査させる走査部が配置された観察光路と前記対物レンズにより集光された前記標本からの観察光を検出する検出部とを有する観察光学系と、
    前記刺激光路と前記観察光路とを合成して、前記刺激光学系のレーザ光と前記観察光学系のレーザ光とを共通の前記対物レンズに入射させる光路合成部と、
    該観察光学系が光軸方向に異なる観察面の観察画像を取得することにより前記標本の３次元的な画像を構築する画像構築部と、
    該画像構築部により構築された３次元的な画像上において、前記刺激光学系により前記レーザ光を刺激光として照射する前記標本の刺激箇所を光軸方向に異なる複数個所に設定する位置設定部と、
    前記刺激光学系により照射される前記レーザ光の前記標本における照射パターンを前記位置設定部に設定される所期の照射パターンに略一致させるように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する相関補正部とを備え、
    前記位置設定部により設定された各刺激箇所に前記レーザ光が照射されるように前記空間光変調器が前記レーザ光の変調動作を行うレーザ顕微鏡。
15. 前記刺激光学系が、前記レーザ光を前記標本上で刺激光として走査させる刺激光走査部を前記刺激光路上に備える請求項１４に記載のレーザ顕微鏡。
16. 前記空間光変調器により生成される規定の照射パターンで前記レーザ光が照射された前記標本からの光を、前記観察光学系が前記走査部を作動させて検出することにより、前記規定の照射パターンが照射された標本の観察画像を取得し、
    前記相関補正部が、前記標本へ照射した規定の照射パターンと前記取得された観察画像における前記照射パターンとの差分を相殺するように、前記空間光変調器による前記レーザ光の位相の変調を制御する請求項１４に記載のレーザ顕微鏡。

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