CN101324527A - 全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明为全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置及方法，属于生物芯片检测技术领域。本发明采用一个微小的全反射镜引入激光光源，全部激光能量可以照射到生物芯片上，提高了入射光的效率；并且在收集荧光时，第三透镜的数值孔径较大，而全反射镜反射掉的荧光较少，相对于经典的半反半透镜的分光方式，提高荧光采集效率，同时由于微小全反射镜便宜而降低成本。本发明利用计算机控制，使光源的针孔和探测器的针孔保持近似共聚焦关系，只需要扫描前调焦一次，调焦控制简单方便。

Description

全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置及方法

技术领域

全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置及方法，属于生物芯片检测技术领域。

背景技术

生物芯片作为一种新兴高科技产品正在被广泛应用于生命科学、医学研究和应用，生物芯片的概念源自于计算机芯片。狭义的生物芯片是指包被在固相载体如硅片、玻璃、塑料和尼龙膜等上的高密度DNA、蛋白质、细胞等生物活性物质的微阵列，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。这些微阵列是由生物活性物质以点阵的形式有序地固定在固相载体上形成的。在一定的条件下进行生化反应，反应结果用化学荧光法、酶标法、同位素法显示，再用扫描仪等光学仪器进行数据采集，最后通过专门的计算机软件进行数据分析。对于广义生物芯片而言，除了上述被动式微阵列芯片之外，还包括利用光刻技术和微加工技术在固体基片表面构建微流体分析单元和系统以实现对生物分子进行快速、大信息量并行处理和分析的微型固体薄型器件。包括核酸扩增芯片、阵列毛细管电泳芯片、主动式电磁生物芯片等。

生物芯片检测方面主要的技术手段有共聚焦扫描法和基于CCD(Charge-coupled device)的检测法。由于共聚焦扫描法具有灵敏度高的特点，大多数的微阵列生物芯片扫描仪采用的都是共聚焦扫描原理的。

经典的基于激光共聚焦扫描的生物芯片检测装置一般利用半反半透镜对入射的激光和诱导出来的荧光进行分光，如图1所示。激光器1发出的激光经过第一透镜2和第一针孔3后成为点光源，经过第二透镜4准直，准直光经过一个半反半透镜6后，再经过第三透镜8汇聚到其后焦面生物芯片10上激发出荧光，荧光经过第三透镜8收集准直后，投射到半反半透镜6上被反射到第四透镜12上，第四透镜12将反射其上的荧光汇聚到第四透镜12的后焦点，该焦点上放置一个针孔13，紧临针孔放置一个光电探测器14，光电探测器将接收的荧光信号转化为数字化电信号后送入计算机15。为了得到信噪比高的荧光信号，必须调焦，经典的调焦是利用成像目镜观察光斑的是否清晰成像，手动调焦。

上述装置中利用半反半透镜将激光和激光诱导出来的荧光进行分光，入射的激光和诱导出的荧光利用效率不高，入射的激光在分光时有50％的能量损失，同时透镜收集到的荧光经过半反半透镜是有50％的能量损失。如果是多路不同波长的激光，诱导不同波长的荧光，荧光收集和利用效率将更低；同时光源的针孔和探测器的针孔严格保持共聚焦关系，扫描过程中的调焦控制非常困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物芯片检测装置，目的之一就是改进光学系统，利用一个微小的全反射镜将光源引入，提高入射激光的利用效率；并且同时由于该微小的全反射镜在收集荧光光路中反射掉的荧光与经典半反半透镜反射掉的荧光50％相比较少，提高了荧光采集效率。目的之二为共聚焦而提出的改变，控制扫描时生物芯片在焦平面及其上下焦深范围，通过扫描生物芯片之前沿着生物芯片的矩形两个对角线预扫描，调节镜头的位置使整个生物芯片的有效部分在预扫描过程中落在镜头的焦平面及其上下焦深范围内。

本发明采取了如下技术方案。全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置，依次包括激光器、第一透镜、第一针孔、第二透镜、第三透镜、生物芯片、第四透镜、第二针孔、光电探测器、计算机和设置在第三透镜和第四透镜之间的全反射镜。全反射镜的直径L小于0.5D，其中D为第三透镜的直径。

在生物芯片的一侧依次放置反射镜和基于四象限光电探测器的探测系统，该基于四象限光电探测器的探测系统包括透镜、柱面镜、四象限光电探测器，四象限光电探测器与计算机相连；

第三透镜与调焦装置相连，调焦装置包括驱动电机和与驱动电机相连的机械传动装置，调焦装置与计算机相连。

上述基于全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置的扫描生物芯片的方法，包括以下步骤：

1)打开激光器预热；

2)激光器发出的激光经过由第一透镜、第一针孔、第二透镜组成的扩束系统扩束成直径为L的光束，光束照射到直径L的全反射镜上，经过反射镜的反射到第三透镜上，第三透镜将激光汇聚到后焦面处的生物芯片上，汇聚到生物芯片上的部分激光透过生物芯片，经过反射镜的反射，被基于四象限光电探测器的探测系统得到，进入计算机进行调焦，保证扫描过程中生物芯片始终在第三透镜焦点以及焦深范围内，因此必须利用调焦装置对生物芯片调焦，调焦过程为：部分垂直入射的激光从生物芯片透射，经过调焦光学系统，即透镜和柱面镜后，成像于四象限光电探测器，适当选择透镜和柱面镜的参数，可以得到一定的调焦范围和一定的调焦精度。四象限光电探测器接受的光信号转化为电信号，经过滤波与放大处理，传输到计算机里，经过计算产生差动信号与预先设定值比较，产生驱动信号驱动电机由电机带动与驱动电机相连的机械传动装置运动，第三透镜与机械传动装置一起沿着光轴线方向上下平动，直到物镜到达要求的目标焦平面位置。对生物芯片对角线扫描，逐点调焦，使得整个生物芯片在第三透镜的焦深范围。

3)聚焦到生物芯片上的另一部分激光诱导生物芯片上的生物样品上某一斑点发出荧光，发出的荧光的一部分经过第三透镜，变成准直光(其中部分投射到全反射镜上被反射损失了)，传播到的第四透镜上，会聚到第四透镜的后焦平面的第二针孔上(第一针孔与第二针孔成或者近似成共聚焦关系)，光电探测器接收荧光，将该点的荧光信号转化电信号，数字化进入计算机；

4)移动生物芯片，使第三透镜汇聚的激光斑点逐点二维扫描整个生物芯片。

本实用新型的优点在于：

1.采用一个微小的全反射镜引入激光光源，全部激光能量可以照射到生物芯片上，提高了入射光的效率；并且在收集荧光时，第三透镜的数值孔径较大，而全反射镜反射掉的荧光较少，相对于经典的半反半透镜的分光方式，提高荧光采集效率，同时由于微小全反射镜便宜而降低成本。具体计算如下假设第三透镜直径为D、焦距为f，其数值孔径为nsinθ较大；全反射镜反射掉的荧光换算到数值孔径为nsinω较小，其中

$n\sin \mathrm{\θ}=n\frac{D}{\sqrt{D^2+4f^2}}=\frac{D}{\sqrt{D^2+4f^2}}$ 在空气中n＝1

$n\sin \mathrm{\ω}=n\frac{L}{\sqrt{D^2+4f^2}}=\frac{L}{\sqrt{D^2+4f^2}}$ 在空气中n＝1

第三透镜数值孔径一般较大，大于0.7，在经典应用中半反半透镜损失50％第三透镜数收集到的荧光；本发明微小全反射镜的直径L小于0.5D，全反射镜反射损失小于50％第三透镜数收集到的荧光，因此提高了荧光的利用效率。

2.利用计算机控制，使光源的针孔和探测器的针孔保持近似共聚焦关系，只需要扫描前调焦一次，调焦控制简单方便。

附图说明

图1经典的单路入射光的共聚焦扫描生物芯片检测装置的结构示意图

图2为本实用新型的共聚焦扫描生物芯片检测装置的示意图

图3为本实用新型的实施例中的生物芯片示意图

图4本实用新型的实施例扫描方式

具体实施方式

下面结合附图，详细对本实用新型进行说明。

激光器1发出的激光经过由第一透镜2、第一针孔3、第二透镜4组成的扩束系统扩束成直径为L的光束5，光束5照射到直径为L的全反射镜7上，经过全反射镜7的反射到第三透镜8上，第三透镜8将激光汇聚到后焦面处的生物芯片10上。全反射镜7的直径L小于0.5D，其中D为第三透镜8的直径。

一部分激光汇聚到生物芯片10上并且透过生物芯片，经过反射镜16的反射，被基于四象限光电探测器的探测系统得到，进入计算机15进行调焦，保证扫描过程中生物芯片10始终在透镜8焦点上以及焦深范围内。利用调焦装置9对生物芯片调焦，在图2所示的光学系统中，调焦过程为：部分垂直入射的激光从生物芯片10透射，经过调焦光学系统，即透镜17和柱面镜18后，成像于四象限光电探测器19，适当选择透镜和柱面镜的参数，可以得到一定的调焦范围和一定的调焦精度。四象限光电探测器19接受的光信号转化为电信号，经过滤波与放大处理，传输到计算机15里，经过计算产生差动信号与预先设定值比较，产生驱动信号驱动电机，由电机带动与驱动电机相连的机械传动装置运动，透镜8与机械传动装置一起沿着光轴线方向上下平动，直到物镜到达要求的目标焦平面位置。对生物芯片对角线扫描，逐点调焦，使得整个生物芯片10在透镜8的焦深范围，完成调焦，否则认为不合格放弃该生物芯片。

另一部分激光汇聚到生物芯片10上的诱导生物芯片10上的生物样品，发出荧光，一部分荧光11经过第三透镜8，变成准直光(其中部分投射到反射镜7上被反射)，传播到的第四透镜12上，会聚到第四透镜12的后焦平面的第二针孔13上(第一针孔3与第二针孔13成或者近似成共聚焦关系)，光电探测器14紧邻针孔14接收荧光，将荧光信号转化电信号，数字化进入计算机15。这样就探测得到生物芯片上的一个点的荧光光强，通过控制由直线电机和步进电机及其所带动的二维平台移动生物芯片，这里没有画出来，二维扫描得到整个生物芯片上二维点阵的荧光光强，荧光强度与生物芯片上生化反应物的数量成正比关系，根据荧光强度可以计算生物芯片上生化反应物的数量，生物芯片见图3，在75毫米×25毫米的载玻片上60毫米×20的范围内间隔150纳米点样，点样的直径150纳米左右，二维扫描的方式见图4；图4中沿着短轴方向即25毫米方向运动，同时沿着长轴75毫米运动，循环进行，扫描整个生物芯片。

流程：开始，打开激光器1预热10分钟；检测基于四象限光电探测器系统17的探测值，通过机电装置9调整第三透镜8，使生物芯片10上表面处于透镜8的后焦面，并且在扫描过程中始终处于焦深范围内；同步扫描生物芯片与荧光探测，即数据采集；计算机15数据处理与显示。

Claims (2)

1、全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置，依次包括激光器(1)、第一透镜(2)、第一针孔(3)、第二透镜(4)、第三透镜(8)、生物芯片(10)、第四透镜(12)、第二针孔(13)、光电探测器(14)和计算机(15)；其特征在于：还包括有设置在第三透镜(8)和第四透镜(12)之间的全反射镜(7)；全反射镜(7)的直径L小于0.5D，其中D为第三透镜(8)的直径；

在生物芯片(10)的一侧依次放置反射镜(16)和基于四象限光电探测器的探测系统，该基于四象限光电探测器的探测系统包括透镜(17)、柱面镜(18)、四象限光电探测器(19)，四象限光电探测器(19)与计算机(15)相连；

第三透镜(8)与调焦装置(9)相连，调焦装置(9)包括驱动电机和与驱动电机相连的机械传动装置，调焦装置(9)与计算机(15)相连。

2、如权利要求1所述的全反射式激光诱导荧光共聚焦扫描装置的扫描方法，其特征在于，该方法是按以下步骤实现的：

1)打开激光器(1)预热；

2)激光器(1)发出的激光经过由第一透镜(2)、第一针孔(3)、第二透镜(4)组成的扩束系统扩束成直径为L的光束(5)，光束(5)照射到直径为L的全反射镜(7)上，经过全反射镜(7)反射到第三透镜(8)上，第三透镜(8)将激光汇聚到后焦面处的生物芯片(10)上，汇聚到生物芯片(10)上的部分激光透过生物芯片(10)，经过反射镜(16)的反射，被基于四象限光电探测器的探测系统得到，进入计算机(15)进行调焦；

调焦过程为：部分垂直入射的激光从生物芯片(10)透射，经过调焦光学系统，即透镜(17)和柱面镜(18)后，成像于四象限光电探测器(19)；四象限光电探测器(19)接受的光信号转化为电信号，经过滤波与放大处理，传输给计算机(15)，在计算机(15)内经过计算产生差动信号与预先设定值比较，产生驱动信号驱动电机由电机带动与驱动电机相连的机械传动装置运动，第三透镜(8)与机械传动装置一起沿着光轴线方向上下平动，直到物镜到达要求的目标焦平面位置；对生物芯片对角线扫描，逐点调焦，使得整个生物芯片(10)在第三透镜(8)的焦深范围；

3)汇聚到生物芯片(10)上的另一部分激光诱导生物芯片(10)上的生物样品上某一斑点发出荧光(11)，发出的荧光的一部分经过第三透镜(8)，变成准直光传播到第四透镜(12)上，会聚到第四透镜(12)的后焦平面的针孔(13)上，光电探测器(14)接收荧光，将该点的荧光信号转化电信号，数字化进入计算机(15)；

4)移动生物芯片(10)，使第三透镜(8)汇聚的激光斑点逐点二维扫描整个生物芯片(10)。

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