CN116953920A - 一种激光扫描器及激光共聚焦显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种激光扫描器及激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜包括：激光照明单元、激光扫描器、显微物镜和荧光探测单元。激光照明单元用于提供合适波长和功率的激光束，激光扫描器实现激光束的二维扫描，显微物镜将激光束汇聚并激发荧光样品，同时收集荧光信号，荧光探测单元将荧光信号转换为电信号，由计算机重构显微图像，相较于现有技术，本发明的激光共聚焦显微镜中，激光扫描器仅使用了两个扫描镜反射激光束，避免了现有技术中中继光学系统所带来的离轴像差和色差问题，并且简化了激光扫描器及激光共聚焦显微镜的光学结构。

Description

一种激光扫描器及激光共聚焦显微镜

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，具体涉及一种激光扫描器及激光共聚焦显微镜。

背景技术

当今生命科学中的显微成像研究大约80％仍然使用光学显微镜，可以说生命科学的进步伴随着光学显微镜的发展。随着免疫荧光技术在生物学领域发挥着日益重要的作用，对于显微镜分辨率的需求也日益增加。

传统的宽场照明荧光显微镜使用宽场光源，由于离焦面杂散光的干扰，使得细微结构成像不够清晰。为排除离焦面杂散光对显微成像的干扰，提高成像分辨率和对比度，激光共聚焦显微成像技术应运而生。激光共聚焦显微镜利用激光束通过针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，各采集点的光信号通过探测针孔到达点探测器(光电倍增管)，再经信号处理，在计算机上重构图像。

受激辐射损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion，STED)在激光共聚焦显微镜基础上，使用一束损耗光通过位相板的调制，在物镜焦面上形成损耗光斑，将激发光衍射光斑周围的荧光分子通过受激辐射耗尽的方式转换为非辐射态，实现了好于50nm的空间分辨率。

激光共聚焦显微成像技术通过扫描样品然后重构获得显微图像，依赖于扫描技术。最初激光共聚焦技术中使用的扫描技术是通过样品台的平行移动实现逐点扫描，该技术不改变照明光束的入射倾角，成像质量较好。但由于其扫描速度较慢，在激光共聚焦显微成像技术中已较少应用。目前激光共聚焦显微成像技术中应用较多的是激发光束扫描技术。激发光束扫描技术是指对激光光束方向精确控制以及定位的技术。传统的光束扫描一般采用机械式，如：复杂万向节、旋转平面反射镜、三棱镜等。这些扫描方式具有扫描视场广的优点。然而受限其体积和质量，机械式光束扫描的定位精度差、扫描速度慢。

微机电系统(MEMS)扫描镜具有尺寸小、成本低、扫描频率高、响应速度快和功耗低等优点，可大幅提高扫描速度，解决机械式光学扫描方式中振镜组旋转速度较慢、难以同时实现两维扫描的问题。为了保证不同扫描角度下激光束都能入射到物镜后入射口，上述激发光束扫描系统都需要一套扫描透镜和筒镜组合成的4f系统(中继光学系统)，振镜式二维扫描系统甚至需要两套这样的4f系统。透镜的引入不仅带来较大的体积，更严重的是会畸变光束波前，带来严重的离轴像差，多波长成像时还不可避免地具有色差，降低光束质量。在多波长显微成像中，光束质量的退化会影响不同波长通道的成像质量和共定位精度，在受激辐射耗尽超分辨显微成像中，光束质量的退化会降低激发光与损耗光的共轴精度，导致超分辨成像质量的退化。

发明内容

本发明的目的是提供一种激光扫描器及激光共聚焦显微镜，以简化激光扫描器的结构，并解决激光共聚焦显微成像系统的离轴像差问题。

本发明第一方面实施例提供一种激光扫描器，包括：

沿激光束传播方向依次设置的第一扫描镜和第二扫描镜；

所述第一扫描镜，用于对所述激光束进行反射，形成第一扫描激光束，所述第一扫描镜能够在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述第一扫描镜出射的第一扫描激光束的偏转角度；

所述第二扫描镜，用于对所述第一扫描激光束进行反射，形成第二扫描激光束，所述第二扫描镜能够在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述第二扫描镜出射的第二扫描激光束的偏转角度。

在一种可能的实现方式中，所述第一扫描镜和第二扫描镜均包括扫描镜本体和微机电MEMS单元，所述扫描镜本体设置在激光束光路上；

所述MEMS单元，用于驱动相应的所述扫描镜本体在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述扫描镜本体出射的扫描激光束的偏转角度。

在一种可能的实现方式中，还包括：

扫描控制器，用于控制所述第一扫描镜和第二扫描镜在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述第二扫描镜出射的第二扫描激光束的偏转角度，实现激光束的二维扫描。

本发明第二方面实施例提供一种激光共聚焦显微镜，包括：

激光照明单元、显微物镜、荧光探测单元，以及上述第一方面所述的激光扫描器；

所述激光照明单元，用于发射至少一个波长的激光束；

所述激光扫描器，用于接收所述激光照明单元发射的激光束，对所述激光束进行反射，形成扫描激光束，所述扫描激光束以不同的入射角始终入射到所述显微物镜后入射口上；

所述显微物镜，用于将所述激光扫描器提供的扫描激光束汇聚，激发荧光样品发射荧光，同时收集所述荧光，所述荧光沿激光束反方向传播，经所述激光扫描器和所述激光照明单元后到达所述荧光探测单元；

所述荧光探测单元，用于接收所述荧光，并将所述荧光转换为电信号，以根据所述电信号重构形成样品的显微图像。

在一种可能的实现方式中，所述激光照明单元包括：沿激光束传播方向依次设置的激光器、扩束准直透镜和二向色性镜；

所述激光器，用于发射至少一个波长的激光束；

所述扩束准直透镜，用于对激光束进行扩束和准直；

所述二向色性镜，用于反射激光束进入所述激光扫描器，并且透射荧光光束进入所述荧光探测单元。

在一种可能的实现方式中，所述荧光探测单元包括：沿着荧光传播方向依次设置的反射镜、荧光滤波片、汇聚透镜和荧光探测器；

所述反射镜，用于反射荧光光束进入所述荧光滤波片；

所述荧光滤波片，用于从荧光光束中滤出荧光信号；

所述汇聚透镜，用于汇聚所述荧光信号；

所述荧光探测器，用于将所述荧光信号转换为电信号。

本发明与现有技术相比的优点在于：

本发明提供的激光共聚焦显微镜中，激光扫描器仅使用了两个扫描镜反射激光束，无需任何中继4f光学系统，对激光束的波前没有做任何调制，避免了现有技术中中继光学系统(扫描透镜和筒镜组成的4f系统)所带来的离轴像差和色差问题，对激光束的光束质量无任何不良影响。通过控制所述激光扫描器，实现对扫描激光束偏转角度的快速调整，进而实现对视野区域的快速扫描，无需任何中继4f光学系统，简化了光学结构。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1示出了本发明所提供的一种激光扫描器的结构示意图；

图2示出了对应激光扫描器出射光线角度(θ₃)扫描范围、并保证出射光线完全进入物镜后入射口时，第一扫描镜和第二扫描镜的偏转角度(θ₁和θ₂)；

图3示出了经由激光扫描器控制的照明光斑的扫描轨迹示意图；

图4示出了本发明提供的一种激光共聚焦显微镜的结构示意图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方案。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方案，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方案所限制。相反，提供这些实施方案是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整地传达给本领域的技术人员。

应理解的是，文中使用的术语仅出于描述特定示例实施方案的目的，而无意于进行限制。除非上下文另外明确地指出，否则如文中使用的单数形式“一”、“一个”以及“所述”也可以表示包括复数形式。术语“包括”、“包含”、“含有”以及“具有”是包含性的，并且因此指明所陈述的特征、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但并不排除存在或者添加一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、部件、和/或它们的组合。文中描述的方法步骤、过程、以及操作不解释为必须要求它们以所描述或说明的特定顺序执行，除非明确指出执行顺序。还应当理解，可以使用另外或者替代的步骤。

尽管可以在文中使用术语第一、第二等来描述多个元件、部件、区域、层和/或部段，但是，这些元件、部件、区域、层和/或部段不应被这些术语所限制。这些术语可以仅用来将一个元件、部件、区域、层或部段与另一区域、层或部段区分开。除非上下文明确地指出，否则诸如“第一”、“第二”之类的术语以及其它数字术语在文中使用时并不暗示顺序或者次序。因此，以下讨论的第一元件、部件、区域、层或部段在不脱离示例实施方案的教导的情况下可以被称作第二元件、部件、区域、层或部段。

为了便于描述，可以在文中使用空间相对关系术语来描述如图中示出的一个元件或者特征相对于另一元件或者特征的关系，这些相对关系术语例如为“内部”、“外部”、“内侧”、“外侧”、“下面”、“下方”、“上面”、“上方”等。这种空间相对关系术语意于包括除图中描绘的方位之外的在使用或者操作中装置的不同方位。例如，如果在图中的装置翻转，那么描述为“在其它元件或者特征下面”或者“在其它元件或者特征下方”的元件将随后定向为“在其它元件或者特征上面”或者“在其它元件或者特征上方”。因此，示例术语“在……下方”可以包括在上和在下的方位。装置可以另外定向(旋转90度或者在其它方向)并且文中使用的空间相对关系描述符相应地进行解释。

本发明实施例提供了一种激光扫描器及使用该激光扫描器的激光共聚焦显微镜，下面结合附图进行说明。

图1示出了本发明所提供的一种激光扫描器的结构示意图，如图1所示，本发明提供的上述激光扫描器02包括：沿激光束传播方向依次设置的两个扫描镜：第一扫描镜201和第二扫描镜202。

具体地，第一扫描镜201对激光束进行反射，形成第一扫描激光束，第一扫描镜201能够在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从第一扫描镜201出射的第一扫描激光束的偏转角度。例如，第一扫描镜201的偏转角度范围可以为：-1°≤θ₁≤1°。

第二扫描镜202对第一扫描镜201出射的第一扫描激光束进行反射，形成第二扫描激光束，第二扫描镜202也能够在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从第二扫描镜202出射的第二扫描激光束的偏转角度。例如，第二扫描镜202的偏转角度范围可以为：-2°≤θ₂≤2°。

第一扫描镜201和第二扫描镜202都包括扫描镜本体和微机电(Micro-Electro-Mechanical System，MEMS)单元，所述扫描镜本体设置在激光束光路上，所述MEMS单元用于驱动相应的所述扫描镜本体二维偏转以改变所述扫描镜本体的出射光偏转角，也就是改变从所述扫描镜本体出射的扫描激光束的偏转角度。

在一些实施例中，上述激光扫描器还可以包括扫描控制器，该扫描控制器可以同时控制所述第一扫描镜201和第二扫描镜202在预设的偏转角度范围内摆动，也可以单独控制任一扫描镜在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从第二扫描镜202出射的第二扫描激光束的偏转角度，实现激光束的二维扫描。

上述激光扫描器可以用于激光共聚焦显微镜中，当然也可以用于其他设备中，本申请对此不做限定。

当应用于激光共聚焦显微镜时，通过设计第一扫描镜201与第二扫描镜202的间距、设计第二扫描镜202与物镜后入射口的间距、设计第二扫描镜202的偏转角以匹配第一扫描镜201的偏转角，实现激光束的二维扫描。图2所示，当第一扫描镜201与第二扫描镜202间距为20毫米、第二扫描镜202与物镜后入射口间距也为20毫米时，为了实现激光扫描器02的出射光线(第二扫描激光束)角度(θ₃)扫描范围从-2°到2°、并保证出射光线完全进入物镜后入射口时，控制第一扫描镜201和第二扫描镜202的偏转角度(θ₁和θ₂)。为了便于理解，图3示出了经由激光扫描器控制的照明光斑的扫描轨迹示意图。

所述激光扫描器02只使用了两个扫描镜201和202反射激光束，避免了目前激光扫描器中的中继4f光学系统，对激光束的波前没有做任何调制，不会带来离轴像差和色差，对激光束的光束质量无任何不良影响。

通过控制所述激光扫描器02，实现对所述扫描镜201和202的出射光偏转角的快速调整，进而实现对视野区域的快速扫描，无需任何中继4f光学系统，简化了光学结构。

图4示出了本发明所提供的一种激光共聚焦显微镜的结构示意图，如图4所示，本发明提供的激光共聚焦显微镜包括：激光照明单元01、显微物镜03、荧光探测单元04，以及上述任一实施例中所述的激光扫描器02。

所述激光照明单元01发射至少一个波长的激光束。具体地，如图4所示，所述激光照明单元01沿激光束传播方向依次包括激光器101、扩束准直透镜102、二向色性镜103。所述激光器101提供合适波长的激光束，对于多色成像，需要提供多个波长激光束，对于受激辐射损耗显微镜还要包含损耗激光束；所述扩束准直镜102用来对所述激光束进行扩束和准直；所述二向色性镜103反射所述激光束进入所述激光扫描器02，并且透射荧光光束进入所述荧光探测单元04。激光照明单元01还需要根据实际使用需求控制输出激光束的功率。

所述激光扫描器02接收所述激光照明单元01发射的激光束，对所述激光束进行反射，形成扫描激光束，所述扫描激光束以不同的入射角始终入射到所述显微物镜03后入射口上。具体的，可以同时控制第一扫描镜201和第二扫描镜202在预设的偏转角度范围内摆动，也可以单独控制任一扫描镜在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从第二扫描镜202出射的第二扫描激光束的偏转角度，实现激光束的二维扫描。

显微物镜03为成像物镜，将所述激光扫描器02提供的扫描激光束汇聚，激发荧光样品发射荧光，同时收集所述荧光，所述荧光沿激光束反方向传播，经所述激光扫描器02和所述二向色性镜103后到达所述荧光探测单元04。

荧光探测单元04接收所述荧光，并将所述荧光转换为电信号，以根据所述电信号重构形成样品的显微图像。具体的，如图4所示，所述荧光探测单元04沿着荧光传播方向依次包括反射镜401、荧光滤波片402、汇聚透镜403、荧光探测器404。由显微物镜03收集的样品荧光，沿着激光束的反方向传播依次进入所述激光扫描器02，所述二向色性镜103透射，所述反射镜401反射改变上述荧光传播方向，所述荧光滤波片402滤出荧光信号，所述汇聚透镜403汇聚上述荧光信号，所述荧光探测器404将荧光信号转换为电信号，由计算机根据样品荧光的电信号重构形成样品的显微图像。

本发明提供的激光共聚焦显微镜中，激光扫描器仅使用了两个扫描镜反射激光束，无需任何中继4f光学系统，对激光束的波前没有做任何调制，避免了现有技术中中继光学系统(扫描透镜和筒镜组成的4f系统)所带来的离轴像差和色差问题，对激光束的光束质量无任何不良影响，对多波长激光的共聚焦显微成像、受激辐射损耗超分辨成像尤为重要。通过控制所述激光扫描器，实现对扫描激光束偏转角度的快速调整，进而实现对视野区域的快速扫描，无需任何中继4f光学系统，简化了光学结构。

为了形成同一结构，本领域技术人员还可以设计出与以上描述的方法并不完全相同的方法。另外，尽管在以上分别描述了各实施例，但是这并不意味着各个实施例中的措施不能有利地结合使用。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

以上对本发明的实施例进行了描述。但是，这些实施例仅仅是为了说明的目的，而并非为了限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求及其等价物限定。不脱离本发明的范围，本领域技术人员可以做出多种替代和修改，这些替代和修改都应落在本发明的范围之内。

Claims (6)

1.一种激光扫描器，其特征在于，包括：沿激光束传播方向依次设置的第一扫描镜和第二扫描镜；

所述第一扫描镜，用于对所述激光束进行反射，形成第一扫描激光束，所述第一扫描镜能够在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述第一扫描镜出射的第一扫描激光束的偏转角度；

所述第二扫描镜，用于对所述第一扫描激光束进行反射，形成第二扫描激光束，所述第二扫描镜能够在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述第二扫描镜出射的第二扫描激光束的偏转角度。

2.根据权利要求1所述的激光扫描器，其特征在于，所述第一扫描镜和第二扫描镜均包括扫描镜本体和微机电MEMS单元，所述扫描镜本体设置在激光束光路上；

所述MEMS单元，用于驱动相应的所述扫描镜本体在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述扫描镜本体出射的扫描激光束的偏转角度。

3.根据权利要求1所述的激光扫描器，其特征在于，还包括：

扫描控制器，用于控制所述第一扫描镜和第二扫描镜在预设的偏转角度范围内摆动，以改变从所述第二扫描镜出射的第二扫描激光束的偏转角度，实现激光束的二维扫描。

4.一种激光共聚焦显微镜，其特征在于，包括：激光照明单元、显微物镜、荧光探测单元，以及根据权利要求1-3中任一项所述的激光扫描器；

所述激光照明单元，用于发射至少一个波长的激光束；

所述激光扫描器，用于接收所述激光照明单元发射的激光束，对所述激光束进行反射，形成扫描激光束，所述扫描激光束以不同的入射角始终入射到所述显微物镜后入射口上；

所述显微物镜，用于将所述激光扫描器提供的扫描激光束汇聚，激发荧光样品发射荧光，同时收集所述荧光，所述荧光沿激光束反方向传播，经所述激光扫描器和所述激光照明单元后到达所述荧光探测单元；

所述荧光探测单元，用于接收所述荧光，并将所述荧光转换为电信号，以根据所述电信号重构形成样品的显微图像。

5.根据权利要求4所述的激光共聚焦显微镜，其特征在于，所述激光照明单元包括：沿激光束传播方向依次设置的激光器、扩束准直透镜和二向色性镜；

所述激光器，用于发射至少一个波长的激光束；

所述扩束准直透镜，用于对激光束进行扩束和准直；

所述二向色性镜，用于反射激光束进入所述激光扫描器，并且透射荧光光束进入所述荧光探测单元。

6.根据权利要求4所述的激光共聚焦显微镜，其特征在于，所述荧光探测单元包括：沿着荧光传播方向依次设置的反射镜、荧光滤波片、汇聚透镜和荧光探测器；

所述反射镜，用于反射荧光光束进入所述荧光滤波片；

所述荧光滤波片，用于从荧光光束中滤出荧光信号；

所述汇聚透镜，用于汇聚所述荧光信号；

所述荧光探测器，用于将所述荧光信号转换为电信号。