JP2004021222A

JP2004021222A - 顕微鏡標本の照明方法とこれを用いた照明装置を有する顕微鏡

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Publication number: JP2004021222A
Application number: JP2002180311A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Suga; 菅　隆之
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2002-06-20
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: JP4172212B2

Abstract

【課題】標本の光軸方向の異なる位置における光像を観察可能とする照明方法と、これを具備する照明装置を有する顕微鏡を提供すること。
【解決手段】標本２と前記標本２に密着している透明基板１１との境界面Ｓで全反射する全反射照明光３と、
前記標本２を照明する前記全反射照明光３以外の照明光２３とを用い、
前記境界面Ｓの近傍において、前記全反射照明光３以外の照明光２３の入射領域が、前記全反射照明光３の全反射領域と異なる領域にあること。
【選択図】　図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡に関するものであり、特に光軸方向の異なる位置の標本の像を同時に検出可能な照明方法と、これを用いた照明装置を具備する顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
従来、蛍光顕微鏡において励起光としてエバネセント波を使用する全反射蛍光顕微鏡が使用されている。この全反射顕微鏡では、標本に密着している透明基板（ガラス基板）と標本との境界面で励起光が全反射し、標本にエバネセント波が照射され、標本の境界面に接している近傍のみのが励起されるため、コントラストよくその部分の蛍光像を観察することができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、標本と標本に密着している透明基板の境界面近傍をコントラストよく観察しながら、同時に境界面から離れた標本内部を観察したいと言った場合には、両方の部分を同時に照明することができないと言った問題点がある。
【０００４】
また、全反射照明光のエバネッセント波で境界面近傍を照射しながら、境界面から離れた部分、または境界面から異なる距離だけはなれた複数の部分を照明することができないと言った問題点もある。
【０００５】
本発明は、上記問題に鑑みて行われたものであり、標本の光軸方向の異なる位置における標本の像を観察可能とする照明方法と、これを具備する照明装置を有する顕微鏡を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明では、標本と前記標本に密着している透明基板との境界面で全反射する全反射照明光と、前記標本を照明する前記全反射照明光以外の照明光とを用い、前記境界面近傍において、前記全反射照明光以外の照明光の入射領域が、前記全反射照明光の全反射領域と異なる領域にあることを特徴とする照明方法を提供する。
【０００７】
また、本発明の照明方法では、前記照明光は落射照明光であり、前記全反射照明光および前記落射照明光は、顕微鏡の第１対物レンズの入射瞳面側から入射することが望ましい。
【０００８】
また、本発明では、前記照明方法を用いる顕微鏡において、前記全反射照明光である第１の光源と、該光源からの光束を広げる第１のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第１の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第１の移動ミラーとからなる第１の照明光学系と、前記落射照明光である第２の光源と、該光源からの光束を広げる第２のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第２の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第２の移動ミラーとからなる第２の照明光学系と、を具備してなることを特徴とする照明装置を提供する。
【０００９】
また、本発明の照明装置では、前記全反射照明光と前記落射照明光は、前記第１の光源と前記第２の光源からそれぞれ光ファイバーで導かれ、該光ファイバーの射出側の端面が、前記第１のビームエキスパンダと前記第２のビームエキスパンダの後側焦点近傍にそれぞれ配設され、前記端面のそれぞれが、光軸に垂直な方向に移動可能であることが望ましい。
【００１０】
また、本発明の照明装置では、前記照明方法を用いる照明装置において、１つの光源と、前記光源からの光を前記全反射照明光と、前記全反射照明光以外の照明光とに分割する光路分割部材と、前記全反射照明光の光束を広げる第１のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第１の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第１の移動ミラーとからなる前記第１の照明光学系と、前記全反射照明光以外の照明光の光束を広げる第２のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第２の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第２の移動ミラーとからなる前記第２の照明光学系と、を具備することを特徴とする照明装置を提供する。
【００１１】
また、本発明では、前記記載の照明装置を用いる顕微鏡において、前記全反射照明光および前記全反射照明光以外で照明された前記標本からの光は、前記第１対物レンズで集光され、第２対物レンズを介して観察光学系に入射する顕微鏡であって、前記観察光学系は、前記入射光を分割する入射光分割素子と、該分割された前記全反射照明光から得られる蛍光像を撮像する光軸方向に移動可能な第１の撮像装置と、該分割された前記全反射照明光以外の照明光から得られる蛍光像を撮像する光軸方向に移動可能な第２の撮像装置とを有し、
前記標本の光軸上の異なる位置の蛍光像が観察可能であることを特徴とする顕微鏡を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
（第１実施形態）
図１は、第１実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成図であり、図２は本発明にかかる照明方法を示す概略図である。
【００１３】
図１、図２における照明装置では、光源１は、標本２を全反射照明する照明光３（以後、照明光３と記す）を出射するものである。この光源１から出射された照明光３はビームエキスパンダ４により所定のビーム径にひろげられる。この照明光３は、集光レンズ５を通過後ミラー７で反射され倒立顕微鏡８に入射する。このようにして、第１の照明光学系が構成されている。
【００１４】
一方、光源２１は、標本２を落射照明する照明光２３（以後、照明光２３と記す）を出射するものである。光源２１から出射された照明光２３は、ビームエキスパンダ２４で所定のビーム径にひろげられる。この照明光２３は集光レンズ２５を透過した後ミラー３０で反射され、倒立顕微鏡８に入射する。このようにして、第２の照明光学系が構成されている。
【００１５】
なお、本実施の形態では、上述の照明光３と照明光２３は同時に標本に照射されている。
【００１６】
そして、集光レンズ５は照明光３を対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光する。この入射瞳面Ｉの近傍には、瞳位置も含まれる。ミラー７で反射された照明光３は倒立顕微鏡８のダイクロイックミラー９で反射され、対物レンズ６の中心軸と略平行な角度で対物レンズ６に入射し、一旦対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光され対物レンズ６から出射する。照明光３は対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光されているため、対物レンズ６からは略平行光が標本２に向けて出射される。対物レンズ６は開口数ＮＡが１．４以上の油浸のものを使用する。対物レンズ６から出射した照明光３はオイル１０、カバーガラス１１を透過し、標本２に照射される。標本２としてはカバーガラス１１に吸着した培養細胞を蛍光染色し、その周りを細胞を生かしておくための塩溶液で満たしたものや、固定細胞を蛍光染色したもの、組織切片を蛍光染色したもの等が使用される。照明範囲は、例えば１００倍の対物レンズ６を使用した場合、直径１００μｍ程度である。照明光３が対物レンズ６の入射瞳面Ｉに入射する位置は、ミラー７を図中の上下方向に動かすことによって変えることができ、対物レンズ６の入射瞳面Ｉの中心近傍に入射した場合には、対物レンズ６の中心近傍から略鉛直方向に照明光３が出射する。次に、照明光３の入射位置を対物レンズ６の入射瞳面Ｉの中心から周辺部方向へ移動させると、それに従って対物レンズ６からの出射光は傾き、ついには対物レンズ６から出射する照明光３は標本２とカバーガラス１１との境界面Ｓですべて反射するようになる。この全反射状態にあるとき、標本２とカバーガラス１１との境界面Ｓの近傍にはエバネセント波が発生し、標本２の境界面Ｓの近傍のみがこのエバネッセント波によって選択的に励起される。このとき、常に視野の中心付近が照明光３で照明されており、視野の位置（照明光３が全反射している領域）はほとんど変化しない。
【００１７】
一方、集光レンズ２５は照明光２３を対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光する。この入射瞳面Ｉの近傍には、瞳位置も含まれる。ミラー３０で反射された照明光２３はミラー７に入射し反射される。反射された照明光２３は倒立顕微鏡８のダイクロイックミラー９で反射され、対物レンズ６の光軸に対して傾けて入射し、一旦対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光され対物レンズ６から出射する。照明光２３は対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光されているため、対物レンズ６からは略平行光が出射される。対物レンズ６から出射した照明光２３はオイル１０カバーガラス１１を透過し、標本２に照射される。照明範囲は、例えば１００倍の対物レンズ６を使用した場合、直径１００μｍ程度である。照明光２３が対物レンズ６の入射瞳面Ｉに入射する位置はミラー３０の位置を図中で左右方向に動かすことによって変えることができる。対物レンズ６の入射瞳面への入射位置を移動させると、光軸に対する照明光２３の出射角度は傾き、標本２は照明光２３で斜に照明される。対物レンズ６で標本を見た場合、視野の一部のみに焦点が合うため、対物レンズ６を上下させると焦点の合う位置が視野中で斜の照明光２３に沿って移動する。ミラー３０を図中で左右方向に動かすことで照明光２３の光軸に対する出射角度が変わるため、視野の中心近傍で照明光２３によって照射される標本２部分の光軸方向に対する境界面Ｓからの距離を変化させることができる。
【００１８】
照明光３が対物レンズ６を出射後、標本２とカバーガラス１１との境界面Ｓで全反射するようにミラー７の位置を調整する。次に照明光２３が境界面Ｓから光軸上で所望の距離はなれた場所で視野の中心を照明するように、ミラー３０の位置を調整する。このように照明光２３で標本２を照明すると、光軸方向の異なる場所を照明光３とは独立に照明することができ、この結果、照明光３のエバネッセント波による境界面Ｓの近傍の光像と、照明光２３により光軸上で境界面Ｓから離れた場所の光像とを同時に観察することが可能となる。
【００１９】
なお、上述の説明では、標本２の境界面Ｓの付近と標本２の内部の２ケ所を同時に照明しているが、これに限らず、標本２の内部の２ケ所を同時に照明することもできる。すなわち上記の説明では、照明光３が対物レンズに入射する位置をミラー７で中心からずらして行き、最終的には全反射照明になるようにしているが、全反射照明になる前までの状態では、照明光２３と同様に照明光３も標本２の内部を照明している。従って照明光３と照明光２３のそれぞれで標本２の内部を照明し、かつ照明光３と照明光２３の照明する場所を、境界面Ｓからの距離が異なるように、それぞれの照明光の対物レンズ６への入射位置をミラー７とミラー３０で調整すればよい。ただし、この場合の照明光３は、対物レンズ６の光軸に対して傾けて入射されている。また、照明光３と照明光２３の波長を変えて、両方を全反射照明光として用いることもできる。
【００２０】
また、上述の説明では、全反射する照明光３と落射照明する照明光２３がそれぞれ１つの場合について説明しているが、これに限らず、全反射する照明光３と落射照明する照明光２３を複数本用いるようにすれば、同時に複数の異なる場所を照明するようにすることもできる。
【００２１】
また複数本の照明光を個々に波長を変えることによって波長の異なる励起光による蛍光像を観察することもできる。
【００２２】
また、上述の説明では、照明光３と照明光２３は同時に標本に照射しているが、照明光３と照明光２３を別々に標本に照射して標本の像を観察しても良い。
【００２３】
また、ミラー７とミラー３０の移動範囲は、照明光３、照明光２３がダイクロイックミラー９から外れない範囲に制限されている。これらは以下に示す他の実施の形態においても同様である。
（第２実施形態）
図３は、本発明の第２実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成図を示す。照明方法は第１実施の形態と同様である。第２の実施の形態が第１実施の形態と異なるところは、第１実施の形態では、第２のミラー３０で反射した照明光２３を全反射ミラー７に入射していたが、本第２実施の形態では、第２のミラー３０に入射した照明光２３を直接倒立顕微鏡８に入射している。
【００２４】
図３では第２のミラー３０で反射された照明光２３は、ミラー７を避けて倒立顕微鏡８に入射しているが、ミラー７にハーフミラーを用いた場合には、ミラー３０で反射された照明光２３は、ミラー７を透過して倒立顕微鏡８に入射しても構わない。また照明光３と照明光２３の波長が違う場合には、ミラー７にダイクロイックミラーを使用し、ミラー３０で反射された照明光２３は、ミラー７を透過して倒立顕微鏡８に入射するようにしても構わない。その他の作用、効果は第１実施の形態と同様であるので説明を省略する。
（第３実施形態）
図４は、本発明の第３実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成図を示す。照明方法は第１実施の形態と同様である。
【００２５】
第１実施の形態では、照明光３と照明光２３はそれぞれ独立の光源である光源１と光源２１から出射しているが、本第３実施の形態では１つの光源１（または光源２１）を２つの光路に分割し、照明光３及び照明光２３として用いる場合を示している。
【００２６】
図４において、光源１から出射した光は、光路分割部材３２で２つの照明光３と照明光２３に分割される。照明光３は、ビームエキスパンダ４で所定のビーム径にされ、ミラー７、ダイクロイックミラー９で反射されて対物レンズ６に入射される。このとき照明光３は集光レンズ５で対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光され、標本２に対物レンズ６を介して照射される。ミラー７を図中上下方向に動かすことによって、照明光３を対物レンズ６の光軸中心から外周部に向かって移動させることができ、標本２とカバーガラス１１との境界面Ｓに照明光３を全反射照明光として入射できる。その他の作用、効果は第１実施の形態の照明光３と同様であるので説明を省略する。
【００２７】
一方、照明光２３は、ミラー３３、３４で反射されてビームエキスパンダ２４に導かれ所定のビーム径にされ、ミラー３０、ミラー７、ダイクロイックミラー９で反射されて対物レンズ６に入射される。このとき照明光２３は集光レンズ２５で対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光され、標本２に対物レンズ６を介して照射される。ミラー３０を図中で左右方向に動かすことによって、照明光２３を対物レンズ６の光軸中心から外周部に向かって移動させることができる。その他の作用、効果は第１実施の形態の照明光２３と同様であるので説明を省略する。
（第４実施形態）
図５は、本発明の第４実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成図を示す。照明方法は第１実施の形態と同様である。
【００２８】
第２実施の形態では、照明光３と照明光２３はそれぞれ独立の光源である光源１と光源２１から出射しているが、本第４実施の形態では１つの光源１（または光源２１）を２つの光路に分割し、照明光３及び照明光２３として用いる場合を示している。
【００２９】
図５において、光源１から射出した光は、光路分割部材３２で２つの照明光３と照明光２３に分割される。照明光３は、ビームエキスパンダ４で所定のビーム径にされ、ミラー７、ダイクロイックミラー９で反射されて対物レンズ６に入射される。このとき照明光３は集光レンズ５で対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光され、標本２に対物レンズ６を介して照射される。ミラー７を図中で上下方向に動かすことによって、照明光３を対物レンズ６の入射瞳面Ｉ上で光軸中心から外周部方向に向かって移動させることができ、標本２とカバーガラス１１との境界面Ｓに照明光３を全反射照明光として入射できる。その他の作用、効果は第２実施の形態の照明光３と同様であるので説明を省略する。
【００３０】
一方、照明光２３は、ミラー３３で反射されビームエキスパンダ２４に導かれ所定のビーム径にされ、ミラー３０、ダイクロイックミラー９で反射されて対物レンズ６に入射される。このとき照明光２３は集光レンズ２５で対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光され、標本２に対物レンズ６を介して照射される。ミラー３０を図中で上下方向に動かすことによって、照明光２３を対物レンズ６の入射瞳面Ｉ上で光軸中心から外周部に向かって移動させることができる。その他の作用、効果は第２実施の形態の照明光２３と同様であるので説明を省略する。
（第５実施形態）
図６は、本発明の第５実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成図を示す。照明方法は第１実施の形態と同様である。
【００３１】
上記の第１ないし第４実施の形態では、光源１または光源２１から出射した光をそのまま、ビームエキスパンダ４、２４に入射しているが、本第５実施の形態では、第１実施の形態において、光源１、光源２１からの光を、ビームエキスパンダ４、ビームエキスパンダ２４に導く照明光の誘導部材として光ファイバーを使用する場合を示している。光源１、光源２１から出射した光は光ファイバー１０１、１０２に導入される。光ファイバー１０１、１０２はシングルモードファイバーが好ましいが、マルチモードファイバーでも構わない。光ファイバーの出射端１０３、１０４は、不図示のスライドステージに保持されている。光ファイバーの出射端１０３、１０４のから出射した光はレンズ１０５、１０６によってそれぞれ平行光になり、対物レンズ６の入射瞳面Ｉの近傍に集光するための集光レンズ５、２５に入射する。対物レンズ６の入射瞳面Ｉ上への入射位置を調整する方法として、上記実施の形態と同様にミラー７、ミラー３０を移動させることにより調整することもできるが、スライドステージに保持したファイバーの出射端１０３、１０４を光軸と垂直方向に移動させて調整することも可能である。その他の作用、効果は第１実施の形態と同様であるので説明を省略する。
【００３２】
なお、光ファイバー１０２、１０３を第２、第３、第４の各実施の形態においても、同様に使用することができる。
（第６実施形態）
図７は、本発明の実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の結像装置の構成の例を示す。照明光３および照明光２３の標本２への入射状態は、第１実施の形態と同様であるので説明を省略する。
【００３３】
標本２において、照明光３によって生じた蛍光Ａ及び照明光２３によって生じた蛍光Ｂは、照明に使用したのと同じ対物レンズ６によってそれぞれ集光され、ダイクロイックミラー９を透過し、倒立顕微鏡８中の結像レンズ１５を透過し、倒立顕微鏡８から出射する。同じ光軸中に出射した蛍光Ａ及び蛍光Ｂは入射光分割素子５１により蛍光Ａと蛍光Ｂに分割される。入射光分割素子５１は、ハーフミラーや、波長が異なる場合にはダイクロイックミラー等が使用される。分割された蛍光Ａと蛍光Ｂをリレーレンズ５２、５３を介して全反射カメラ５４と第２のカメラ５５のそれぞれに結像し、不図示のモニター等で観察する。視野の中心において、標本２が照明される位置（標本２とカバーガラス１１との境界面Ｓから距離）は、照明光３と照明光２３では異なっている。このため、リレーレンズ５２は蛍光Ａの像を全反射カメラ５４に、リレーレンズ５３は蛍光Ｂの像を第２のカメラ５５にそれぞれ結像させる為の、補正機構を設けている。この補正機構は例えば、リレーレンズ５２，５３の位置を光軸方向にずらすことができる。
【００３４】
また、リレーレンズ５３、５４に可変焦点距離レンズを用いることもできる。
【００３５】
また、蛍光Ａの像を全反射カメラ５４に、蛍光Ｂの像を第２のカメラ５５にそれぞれ結像させる為に、リレーレンズ５２、５３は固定し、全反射カメラ５４、第２のカメラ５５の位置を光軸方向に移動させても構わない。
【００３６】
なお、上述の実施の形態で記載の光源１および光源２１には、用途により様々なものが用いられるが、例えば、アルゴンイオンレーザ、ＹＡＧレーザ、ＹＡＧレーザの第二高調波、半導体レーザ、色素レーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどの各種レーザ、水銀ランプ、キセノンランプ等の各種ランプが用いられる。また、光源１の波長と光源２１の波長は同じものでも、異なるものでも構わない。
【００３７】
また、上述の照明装置は倒立顕微鏡８の落射照明の取り付け部分に、落射照明装置と同様の取り付けマウント部１２等を設け、着脱可能にすることもできる。
【００３８】
また、上述の結像装置は倒立顕微鏡８の取り付け部分に、取り付けマウント部６０等を設け、着脱可能にすることもできる。
（第７実施形態）
図８は、本発明にかかる別の照明方法を示す図である。第１ないし第６実施の形態では、標本への照明光は対物レンズを通過して行われていたが、本第７実施の形態にかかる照明方法では、標本への照明光は対物レンズを通過せずに行われる。
【００３９】
図８において、標本２はカバーガラス２００上に培養したものが使用されている。標本２はスペーサ２０１と別のカバーガラス２０２とで、培養細胞を生かしておくための塩溶液中に封入されている。この標本２を不図示の倒立顕微鏡のステージ上に載置する。標本２に対して全反射照明を行うためにカバーガラス２００上にオイル２０３を介してプリズム２０４を配置する。全反射照明光２０５はカバーガラス２００の対物レンズ６側の面と標本２との境界面Ｓで全反射し、その全反射する位置が対物レンズ２の視野中にあるように、不図示の光学系等で照明光２０５のプリズム２０４に入射する角度、位置を調整する。
【００４０】
一方、落射照明光２０６はカバーガラス２００の対物レンズ６側の面で、全反射照明光２０５が全反射する領域とは異なる位置に入射し、標本２中を斜めに照明光２０６が通過するように、不図示の光学系等で照明光２０６のプリズム２０４への入射角度、入射位置を調整する。
【００４１】
全反射照明光２０５のエバネッセント波による蛍光Ａと、落射照明光２０６による蛍光Ｂは対物レンズ６を介して、例えば第６実施の形態に示すような結像系で観察される。
【００４２】
なお、本実施の形態で用いられる照明装置は、第１から第６実施の形態で述べた照明装置を適宜変更して用いることが可能である。
【００４３】
なお、上述で記載の照明光２０５および照明光２０６には、用途により様々なものが用いられるが、例えば、アルゴンイオンレーザ、ＹＡＧレーザ、ＹＡＧレーザの第二高調波、半導体レーザ、色素レーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどの各種レーザ、水銀ランプ、キセノンランプ等の各種ランプが用いられる。また、照明光２０５の波長と照明光２０６の波長は同じものでも、異なるものでも構わない。
【００４４】
なお、この実施の形態は例に過ぎず、この構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【００４５】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、標本の光軸方向の異なる位置における標本の像を観察可能とする照明方法と、これを具備する照明装置を有する顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成を示す図。
【図２】本発明にかかる照明方法を示す概略図である。
【図３】本発明の第２実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成を示す図。
【図４】本発明の第３実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成を示す図。
【図５】本発明の第４実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成を示す図。
【図６】本発明の第５実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の部分構成を示す図。
【図７】本発明の第６実施の形態にかかる照明装置を有する顕微鏡の結像装置の構成例を示す図。
【図８】本発明にかかる別の照明方法を示す概略図。
【符号の説明】
１、２１　　　　光源
２　　　　　　　標本
３、２３　　　　照明光
４、２４　　　　ビームエキスパンダ
５、２５　　　　集光レンズ
６　　　　　　　対物レンズ
７、３０　　　　ミラー
８　　　　　　　倒立顕微鏡
９　　　　　　　ダイクロイックミラー
１０　　　　　　オイル
１１　　　　　　カバーガラス
１２、６０　　　マウント部
１５　　　　　　結像レンズ
３２　　　　　　光路分割部材
３３、３４　　　ミラー
５１　　　　　　光分割素子
５２、５３　　　リレーレンズ
５４　　　　　　全反射カメラ
５５　　　　　　第２のカメラ
１０１、１０２　光ファイバー
１０３，１０４　射出端
１０５、１０６　レンズ
Ａ，Ｂ　　　　　蛍光
Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　入射瞳面
Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　境界面

Claims

標本と前記標本に密着している透明基板との境界面で全反射する全反射照明光と、
前記標本を照明する前記全反射照明光以外の照明光とを用い、
前記境界面近傍において、前記全反射照明光以外の照明光の入射領域が、前記全反射照明光の全反射領域と異なる領域にあることを特徴とする照明方法。
前記照明光は落射照明光であり、
前記全反射照明光および前記落射照明光は、顕微鏡の第１対物レンズの入射瞳面側から入射することを特徴とする請求項１に記載の照明方法。
請求項１または２に記載の照明方法を用いる照明装置において、
前記全反射照明光である第１の光源と、該光源からの光束を広げる第１のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第１の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第１の移動ミラーとからなる第１の照明光学系と、
前記落射照明光である第２の光源と、該光源からの光束を広げる第２のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第２の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第２の移動ミラーとからなる第２の照明光学系と、を具備してなることを特徴とする照明装置。
請求項３に記載の照明装置において、
前記全反射照明光と前記落射照明光は、前記第１の光源と前記第２の光源からそれぞれ光ファイバーで導かれ、
該光ファイバーの射出側の端面が、前記第１のビームエキスパンダと前記第２のビームエキスパンダの後側焦点近傍にそれぞれ配設され、
前記端面のそれぞれが、光軸に垂直な方向に移動可能であることを特徴とする照明装置。
請求項１または２に記載の照明方法を用いる照明装置において、
１つの光源と、
前記光源からの光を前記全反射照明光と、前記全反射照明光以外の照明光とに分割する光路分割部材と、
前記全反射照明光の光束を広げる第１のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第１の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第１の移動ミラーとからなる前記第１の照明光学系と、
前記全反射照明光以外の照明光の光束を広げる第２のビームエキスパンダと、該光束を前記第１対物レンズの瞳面近傍に集光する第２の集光レンズと、前記瞳面上の集光位置を該瞳面内で移動させる第２の移動ミラーとからなる前記第２の照明光学系と、を具備することを特徴とする照明装置。
請求項３乃至５の何れか１項に記載の照明装置を用いる顕微鏡において、
前記全反射照明光および前記全反射照明光以外で照明された前記標本からの光は、前記第１対物レンズで集光され、第２対物レンズを介して観察光学系に入射する顕微鏡であって、
前記観察光学系は、前記入射光を分割する入射光分割素子と、
該分割された前記全反射照明光から得られる蛍光像を撮像する光軸方向に移動可能な第１の撮像装置と、
該分割された前記全反射照明光以外の照明光から得られる蛍光像を撮像する光軸方向に移動可能な第２の撮像装置とを有し、
前記標本の光軸上の異なる位置の蛍光像が観察可能であることを特徴とする顕微鏡。