JP2020030378A - 光切替器および観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】試料の互いに異なる複数の断面を並行して観察する観察装置に適用され、かつ、コンパクトな光切替器を提供する。【解決手段】光切替器２は、光源１からの光Ｂを分割して２つの光路に案内するビームスプリッタ２ａと、前記２つの光路に案内された光Ｂ１，Ｂ２の発散角を、前記光路ごとに異ならせる空間光変調器２ｅ，２ｆと、前記２つの光路に案内された光Ｂ１，Ｂ２の各々を、光切替器２の出射部に案内するビームスプリッタ２ｄと、光がビームスプリッタ２ａからビームスプリッタ２ｄへ到達可能な光路を、前記２つの光路から選択するチョッパー２ｇとを備える。【選択図】図２

Description

本発明は、試料の互いに異なる複数の断面を並行して観察する観察装置、およびこれに適用される光切替器に関する。

例えば、生体試料である脳の基礎研究では、多領域の細胞間の情報伝達機能を解明するために、カルシウム蛍光プローブが用いられている。具体的には、脳神経細胞が活動（発火）するときにカルシウムが細胞内に入るため、カルシウム蛍光プローブを対象となる細胞内に導入しておき、レーザ光を照射してカルシウム蛍光プローブを励起し、その蛍光の強度を検出することにより、脳神経細胞の活動状況を把握できる。

さらに、特許文献１および２では、生体の異なる深さにおける活動状況を、ほぼ同時に観察する技術が開示されている。この技術では、レーザのパルス光を複数のパルス光に分割した後、分割した各パルス光に対し、光路長を異ならせることにより相対的な時間遅延を付与してパルス列を生成するとともに、互いに異なる発散角を付与して、対物レンズを介して生体に照射する。これにより、各パルス列は、生体の異なる深さに集光するため、生体の異なる深さにおける蛍光パルスをほぼ同時に検出し、多面の２次元像を取得することができる。

特開２０１４−１６４０９７号公報 特表２０１５−５１７６８７号公報

しかしながら、上述の先行技術では、分割した各パルス光の光路長を異ならせるための装置が大型化するという問題がある。

顕微鏡で一般的に使用されるパルスレーザの繰り返し周波数は約８０ＭＨｚであり、パルス間隔を時間に換算すると、１２．５ｎｓである。また、蛍光プローブの蛍光寿命（発した蛍光のパルスが尾を引く時間）は、一般的に数ｎｓである。そのため、異なる深さにおける蛍光パルスを区別するためには、生体に集光させるパルス列の間隔を５ｎｓ程度空ける必要がある。５ｎｓに相当するレーザ光の光路長は１．５ｍであり、分割した各パルス光に時間遅延を付与するための装置には、その光路長を確保するための空間が必要となる。

本発明は、上記問題を解決するためになされたものであって、試料の互いに異なる複数の断面を並行して観察する観察装置に適用され、かつ、コンパクトな光切替器を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、光源からの光を複数の光路に分割、または、切り替え可能に案内し、それらの光路を選択する選択部を設けることにより、各光路の光路長を異ならせることなく、光切替器のサイズを大幅に小さくできることを見出した。

即ち、本発明は以下の項に記載の発明を包含する。
項１．
対物レンズを介して試料の互いに異なる複数の断面に光を照射することにより、該複数の断面を並行して観察する観察装置に適用され、光源からの光を、前記対物レンズを通過した場合の焦点位置が互いに異なる複数の光に変換し、前記複数の光を順次切り替えながら前記対物レンズに出射する光切替器であって、
前記光源からの光を分割して複数の光路に案内する、または、前記光源からの光を前記複数の光路のいずれかに切り替え可能に案内する第１の案内部と、
前記複数の光路に案内された光の発散角および光軸の少なくともいずれかを、前記光路ごとに異ならせる変調部と、
前記複数の光路に案内された光の各々を、前記光切替器の出射部に案内する第２の案内部と、
光が前記第１の案内部から前記第２の案内部へ到達可能な光路を、前記複数の光路から選択する選択部と、
を備えたことを特徴とする光切替器。
項２．
前記第１の案内部は、前記光源からの光を分割して複数の光路に案内するビームスプリッタであり、
前記選択部は、前記複数の光路のうち１の光路を切り替え可能に選択し、当該１の光路以外の光路を遮断するチョッパーであることを特徴とする項１に記載の光切替器。
項３．
前記第１の案内部は、前記光源からの光を、偏光方向に応じて前記複数の光路のいずれかに切り替え可能に案内する偏光ビームスプリッタであり、
前記選択部は、前記偏光ビームスプリッタの上流側に設けられ、前記光源からの光を、偏光方向の互いに異なる複数の偏光に切り替え可能に偏光する電気光学位相変調器であることを特徴とする項１に記載の光切替器。
項４．
試料の互いに異なる複数の断面を並行して観察する観察装置であって、
前記試料内の分子または構造を可視化するための光を発生する励起光源と、
前記光を光軸に交差する方向に走査する走査部と、
前記光を前記試料内に収束させる対物レンズと、
前記励起光源と前記対物レンズとの間に設けられ、前記励起光源からの光を、前記対物レンズを通過した場合の焦点位置が互いに異なる複数の光に変換し、前記複数の光を順次切り替えながら前記対物レンズに出射する光切替器と、
前記光の照射によって発生した信号光を検出する検出部と、
を備え、
前記光切替器は、項１から３のいずれかに記載の光切替器であることを特徴とする観察装置。
項５．
前記光切替器は、前記走査部が前記複数の断面の各々の走査を完了する度に、前記複数の光を切り替えることを特徴とする項４に記載の観察装置。
項６．
前記光切替器は、前記検出部が前記複数の断面の各々の１ピクセルの前記信号光を検出する度に、前記複数の光を切り替えることを特徴とする項４に記載の観察装置。
項７．
前記分子は、カルシウム蛍光プローブであり、
前記光は、前記カルシウム蛍光プローブを誘起するレーザ光であることを特徴とする項４から６のいずれかに記載の観察装置。

本発明によれば、コンパクトな光切替器を提供することができる。

本発明の第１の実施形態に係る観察装置の全体構成を示す概略図である。 図１に示す光切替器の具体的な構成を示す図である。 図２に示すチョッパーの平面図である。 図２に示す光切替器から出射された２つの光の試料における焦点位置の説明図である。 （ａ）は、図２に示す光切替器から出射される２つの光の切り替えのタイミングを示す図であり、（ｂ）は、試料の２つの断面における走査のタイミングを示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る観察装置の全体構成を示す概略図である。 図６に示す光切替器の具体的な構成を示す図である。 （ａ）は、図７に示す光切替器から出射される２つの光の切り替えのタイミングを示す図であり、（ｂ）は、試料の２つの断面における走査のタイミングを示す図である。 変形例１に係る光切替器の構成を示す図である。 図９に示す光切替器から出射された２つの光の試料における焦点位置の説明図である。 変形例２に係る光切替器の構成を示す図である。

以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。なお、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではない。

〔第１の実施形態〕
（全体構成）
図１は、本発明の第１の実施形態に係る観察装置１００の全体構成を示す概略図である。観察装置１００は、生体である試料Ｓの互いに異なる複数の断面を並行して観察するレーザ走査型顕微鏡であり、励起光源１と、光切替器２と、チューブレンズ３，４と、ｙ走査部５と、ｘ走査部６と、走査レンズ７と、チューブレンズ８と、ダイクロックミラー９と、ｚ走査部１０と、検出レンズ１１と、検出部２０とを備えている。本実施形態では、観察装置１００は、試料Ｓの互いに深さの異なる２つの断面を並行して観察することができる。なお、本明細書において、「並行して」とは、「ほぼ同時に」を意味する。

試料Ｓは、例えば生きたマウスの脳である。試料Ｓには、あらかじめカルシウム蛍光プローブ（分子）が導入されている。カルシウム蛍光プローブは、脳神経細胞の活動（発火）によりカルシウム濃度が高くなったときに所定波長のレーザ光が照射されることにより、蛍光（信号光）Ｌを発する。

励起光源１は、試料Ｓの分子の反応を誘起させて、試料Ｓ内の分子または構造を可視化するための光Ｂを発生する。本実施形態では、光Ｂはカルシウム蛍光プローブの反応を誘起するためのレーザ光である。試料Ｓにおける光Ｂの照射位置のカルシウム濃度が大きくなるほど、カルシウム蛍光プローブからの蛍光Ｌの強度が大きくなる。

光切替器２は、励起光源１からの光Ｂを、後述する対物レンズ１０ｂを通過した場合の焦点位置が互いに異なる複数の光に変換し、前記複数の光を順次切り替えながら対物レンズ１０ｂに出射する装置である。本実施形態では、光切替器２は、光Ｂを、焦点位置の深い光Ｂ１と、焦点位置の浅い光Ｂ２との２つの光に変換し、光Ｂ１と光Ｂ２とを３０Ｈｚの周波数で交互に出射する。

なお、図１では、光切替器２から光Ｂ１が出射されている状態が示されているものとする。また、光切替器２の具体的な構成例については後述する。

チューブレンズ３，４は、光切替器２内の空間光変調器を対物レンズ１０ｂの瞳面と共役な位置に配置し、空間光変調器によって焦点位置や深さを変化させても対物レンズ１０ｂの瞳面におけるレーザ光の位置やビーム径が変化しないようにするためのレンズである。空間光変調器は、まず、ｙ走査部５およびｘ走査部６の中間に結像され、最終的に、走査レンズ７とチューブレンズ８によって、対物レンズの瞳面に結像される。

ｙ走査部５およびｘ走査部６は、観察装置１００が所定の２つの断面を並行して観察しているときに、光Ｂ１，Ｂ２を光軸に交差する方向に走査する部材である。例えば図１に示すように、ｘ走査部６が実線で示す位置から破線で示す位置に変位することにより、光Ｂ１の焦点位置は、試料Ｓにおけるｘ方向に移動する。なお、ｙ走査部５およびｘ走査部６は、特許請求の範囲に記載の走査部に相当する。

走査レンズ７およびチューブレンズ８は、ｙ走査部５およびｘ走査部６の中間を対物レンズ１０ｂの瞳面に結像し、レーザ走査時に、対物レンズ１０ｂの瞳面におけるレーザ光の位置が変化しないようにするためのレンズである。

ダイクロックミラー９は、光Ｂ１，Ｂ２を透過させ、試料Ｓから出射された蛍光Ｌを反射する。

ｚ走査部１０は、光Ｂ１，Ｂ２の光量を調節する絞り１０ａと、光Ｂ１，Ｂ２を試料Ｓ内に収束させる対物レンズ１０ｂとを備えている。ｚ走査部１０の試料Ｓに対する相対位置を変化させることにより、光Ｂ１，Ｂ２の焦点位置がｚ方向に移動する。なお、ｚ走査部１０は、ｙ走査部５およびｘ走査部６とは異なり、観察装置１００が所定の２つの断面を並行して観察している間は動作せず、観察対象となる２つの断面の深さを変更する場合のみ動作する。

光Ｂ１，Ｂ２の焦点位置において神経細胞が活動している場合、カルシウム蛍光プローブが誘起されて蛍光Ｌを発する。蛍光Ｌは、ダイクロックミラー９によって反射され、検出レンズ１１を介して検出部２０に入射する。

検出部２０は、蛍光Ｌを検出する装置であり、例えば光電子増倍管などで構成される。検出部２０により、試料Ｓにおける２つの断面の２次元画像が並行して生成される。

（光切替器）
図２は、光切替器２の具体的な構成を示す図である。光切替器２は、ビームスプリッタ（第１の案内部）２ａと、２つのミラー２ｂ，２ｃと、２つの空間光変調器（変調部）２ｅ，２ｆと、ビームスプリッタ（第２の案内部）２ｄと、チョッパー（選択部）２ｇとを備えている。

ビームスプリッタ２ａは、励起光源１からの光Ｂを分割して２つの光路に案内する部材である。具体的には、ビームスプリッタ２ａは、光Ｂを光Ｂ１および光Ｂ２に分割し、光Ｂ１を、ミラー２ｂおよびビームスプリッタ２ｄを経て光切替器２の出射部に至る光路（以下、第１の光路とする）に案内し、光Ｂ２を、ミラー２ｃおよびビームスプリッタ２ｄを経て光切替器２の出射部に至る光路（以下、第２の光路とする）に案内する。

空間光変調器２ｅ，２ｆは、２つの光路に案内された光の発散角を、光路ごとに異ならせる部材である。具体的には、空間光変調器２ｅは、第１の光路に案内された光Ｂ１の発散角を拡大させ、空間光変調器２ｆは、第２の光路に案内された光Ｂ２の発散角を縮小させる。

なお、空間光変調器２ｅ，２ｆのいずれか一方を省略してもよい。また、空間光変調器２ｅは、第１の光路上の任意の位置に設けることができ、例えば、ビームスプリッタ２ａとミラー２ｂとの間に設けることができる。同様に、空間光変調器２ｆは、第２の光路上の任意の位置に設けることができ、例えば、ビームスプリッタ２ａとミラー２ｃとの間に設けることができる。また、空間光変調器２ｅ，２ｆを可変焦点レンズに置き換えてもよい。

ビームスプリッタ２ｄは、２つ光路に案内された光の各々を、光切替器２の出射部に案内する部材である。具体的には、ビームスプリッタ２ｄは、第１の光路に案内された光Ｂ１を透過させ、第２の光路に案内された光Ｂ２を反射することにより、光Ｂ１，Ｂ２を光切替器２の出射部に案内する。

チョッパー２ｇは、光がビームスプリッタ２ａからビームスプリッタ２ｄへ到達可能な光路を、２つの光路から選択する部材であり、第１および第２の光路のうち１の光路を切り替え可能に選択し、当該１の光路以外の光路を遮断するように構成されている。

図３は、チョッパー２ｇの平面図である。チョッパー２ｇは、内部領域に半円の開口Ａを有する遮光性の円盤で構成されており、図示しない駆動装置により回転可能となっている。チョッパー２ｇは、第１の光路および第２の光路に跨る位置に設けられており、チョッパー２ｇが回転することにより、光Ｂ１および光Ｂ２が交互に開口Ａを通過する。これにより、チョッパー２ｇは、光がビームスプリッタ２ａからビームスプリッタ２ｄへ到達可能な１の光路を、第１および第２の光路から選択する。なお、図３では、光Ｂ２が開口Ａを通過し光Ｂ１が遮断されている、すなわち、第２の光路が選択されている状態が示されている。

このように、チョッパー２ｇが回転して、光Ｂ１および光Ｂ２が交互に開口Ａを通過することにより、光Ｂ１，Ｂ２がビームスプリッタ２ｄによって交互に光切替器２の出射部に案内される。これにより、光切替器２は、光Ｂ１と光Ｂ２とを交互に出射する。

なお、チョッパー２ｇの回転速度は特に限定されないが、例えば１５ｒｐｓである。この場合、光切替器２から出射される光Ｂ１，Ｂ２の切り替え周期は３０Ｈｚとなる。

図４は、光切替器２から出射された光Ｂ１，Ｂ２の試料Ｓにおける焦点位置の説明図である。光Ｂ１は光Ｂ２よりも発散角が大きいため、光Ｂ１の焦点位置Ｆ１は、光Ｂ２の焦点位置Ｆ２よりも深くなる。

光切替器２が光Ｂ１と光Ｂ２とを交互に出射することで、焦点位置Ｆ１と焦点位置Ｆ２とが交互に切り替わる。さらに、図１に示すｙ走査部５およびｘ走査部６によって、焦点位置Ｆ１，Ｆ２をｘｙ方向に走査することにより、焦点位置Ｆ１を含む断面Ｐ１および焦点位置Ｆ２を含む断面Ｐ２を並行して観察することができる。

（走査方法）
図５（ａ）は、光Ｂ１，Ｂ２の切り替えのタイミングを示す図であり、図５（ｂ）は、断面Ｐ１，Ｐ２における走査のタイミングを示す図である。上述のように、光切替器２から出射される光Ｂ１，Ｂ２の切り替え周期が３０Ｈｚであるため、図５（ａ）に示すように、試料Ｓに照射される光Ｂ１，Ｂ２は、１／３０ｓごとに切り替わる。また、図５（ｂ）に示すように、光Ｂ１が照射されている間に、断面Ｐ１の走査が行われ、光Ｂ２が照射されている間に、断面Ｐ２の走査が行われる。すなわち、光切替器２は、ｙ走査部５およびｘ走査部６が２つの断面Ｐ１，Ｐ２の各々の走査を完了する度に、光Ｂ１，Ｂ２を切り替える。これにより、断面Ｐ１，Ｐ２それぞれの２次元画像を、１５ｆｐｓのフレームレートで取得することができる。

（本実施形態の効果）
上述のように、本実施形態に係る光切替器２では、励起光源１からの光Ｂをビームスプリッタ２ａによって光Ｂ１，Ｂ２に分割して２つの光路に案内し、光Ｂ１，Ｂ２の発散角を空間光変調器２ｅ，２ｆによって互いに異ならせて、ビームスプリッタ２ｄによって光Ｂ１，Ｂ２を光切替器２の出射部に案内している。さらに、光切替器２は、チョッパー２ｇによって、光Ｂ１，Ｂ２のいずれかを遮断することにより、光がビームスプリッタ２ａからビームスプリッタ２ｄへ到達可能な光路を、第１および第２の光路から選択している。

チョッパー２ｇを設けることにより、第１および第２の光路の光路長が等しい場合であっても、光切替器２は光Ｂ１，Ｂ２を切り替え可能に出射することができる。すなわち、先行技術のように、分割した光を異なるタイミングで出射するために光路長を互いに異ならせる必要はない。よって、先行技術に比べ、光切替器２のサイズを大幅に小さくすることができる。

なお、本実施形態では、第１および第２の光路は、光路長が等しいが、光切替器２が必要以上に大型化しない程度に、光路長を互いに異ならせてもよい。

〔第２の実施形態〕
（全体構成）
図６は、本発明の第２の実施形態に係る観察装置２００の全体構成を示す概略図である。観察装置２００は、第１の実施形態に係る観察装置１００と同様、生体である試料Ｓの互いに異なる複数の断面を並行して観察する装置である。図６に示すように、観察装置２００は、励起光源１と、光切替器１２と、チューブレンズ３，４と、ｙ走査部５と、ｘ走査部６と、走査レンズ７と、チューブレンズ８と、ダイクロックミラー９と、ｚ走査部１０と、検出レンズ１１と、検出部２０とを備えている。すなわち、観察装置２００は、観察装置１００において、光切替器２を光切替器１２に置き換えた構成である。そのため、光切替器１２以外の各部材については、詳細な説明を省略する。

（光切替器）
図７は、光切替器１２の具体的な構成を示す図である。光切替器１２は、２つのミラー２ｂ，２ｃと、２つの空間光変調器（変調部）２ｅ，２ｆと、偏光ビームスプリッタ（第１の案内部）２ｈと、電気光学位相変調器（選択部）２ｉと、２つの１／２波長板２ｊ，２ｋと、偏光ビームスプリッタ（第２の案内部）２ｍとを備えている。すなわち、光切替器１２は、図２に示す光切替器２において、ビームスプリッタ２ａ，２ｄをそれぞれ偏光ビームスプリッタ２ｈ，２ｍに置き換え、電気光学位相変調器２ｉおよび１／２波長板２ｊ，２ｋをさらに備えた構成である。

偏光ビームスプリッタ２ｈは、励起光源１からの光Ｂを、偏光方向に応じて２つの光路（第１の光路および第２の光路）のいずれかに切り替え可能に案内する部材である。本実施形態では、偏光ビームスプリッタ２ｈは、Ｓ偏光を反射し、Ｐ偏光を透過させる。

電気光学位相変調器２ｉは、偏光ビームスプリッタ２ｈの上流側に設けられ、励起光源１からの光Ｂを、偏光方向の互いに異なる２つの偏光（Ｓ偏光およびＰ偏光）に切り替え可能に偏光する部材である。電気光学位相変調器２ｉが光ＢをＳ偏光に偏光した場合、光Ｂは偏光ビームスプリッタ２ｈに反射されて第１の光路に案内される。一方、電気光学位相変調器２ｉが光ＢをＰ偏光に偏光した場合、光Ｂは偏光ビームスプリッタ２ｈを透過して第２の光路に案内される。

このように、電気光学位相変調器２ｉは、光Ｂが偏光ビームスプリッタ２ｈからビームスプリッタ２ｄへ到達可能な光路を、２つの光路から選択する選択部として機能する。以下では、第１の光路に案内された光Ｂを光Ｂ１とし、第２の光路に案内された光Ｂを光Ｂ２とする。

１／２波長板２ｊは、第１の光路における空間光変調器２ｅの上流側に設けられており、空間光変調器２ｅに入る偏光を制御する。また、１／２波長板２ｋは、第２の光路における空間光変調器２ｆの上流側に設けられており、空間光変調器２ｆに入る偏光を制御する。なお、１／２波長板２ｊをビームスプリッタ２ａとミラー２ｂとの間に設けてもよく、１／２波長板２ｋをビームスプリッタ２ａとミラー２ｃとの間に設けてもよい。

光Ｂ１は、１／２波長板２ｊを経て空間光変調器２ｅにおいて発散角が拡大される。一方、光Ｂ２は、１／２波長板２ｋを経て空間光変調器２ｆにおいて発散角が縮小される。

偏光ビームスプリッタ２ｍは、２つ光路に案内された光の各々を、光切替器２の出射部に案内する部材である。本実施形態では、偏光ビームスプリッタ２ｍは、第１の光路に案内されたＳ偏光である光Ｂ１を透過し、第２の光路に案内されたＰ偏光である光Ｂ２を反射することにより、光Ｂ１，Ｂ２を光切替器１２の出射部に案内する。また、１／２波長板２ｊ，２ｋを設けずに、第１の光路に案内されたＰ偏光である光Ｂ１を反射し、第２の光路に案内されたＳ偏光である光Ｂ２を透過することにより、光Ｂ１，Ｂ２を光切替器１２の出射部に案内してもよい。

上述のように、電気光学位相変調器２ｉは、光Ｂを、Ｓ偏光およびＰ偏光に切り替え可能に偏光する。これにより、Ｓ偏光である光Ｂ１が第１の光路を経て光切替器１２から出射される状態と、Ｐ偏光である光Ｂ２が第２の光路を経て光切替器１２から出射される状態とが切り替わり、光切替器１２は、光Ｂ１と光Ｂ２とを交互に出射する。

電気光学位相変調器２ｉによる偏光方向の切り替え周期は特に限定されないが、第１の実施形態におけるチョッパー２ｇよりもはるかに高速に偏光方向を切り替えることができる。本実施形態では、電気光学位相変調器２ｉの切り替え周期を８０ＭＨｚとする。

なお、光Ｂ１，Ｂ２の試料Ｓにおける焦点位置は、図４に示すものと同様である。光切替器１２から光Ｂ１と光Ｂ２とが交互に出射されることにより、試料Ｓにおける深さの異なる断面Ｐ１，Ｐ２を並行して観察することができる。

（走査方法）
図８（ａ）は、光Ｂ１，Ｂ２の切り替えのタイミングを示す図であり、図８（ｂ）は、断面Ｐ１，Ｐ２における走査のタイミングを示す図である。上述のように、光切替器１２から出射される光Ｂ１，Ｂ２の切り替え周期が８０ＭＨｚであるため、図８（ａ）に示すように、試料Ｓに照射される光Ｂ１，Ｂ２は、１２．５ｎｓごとに切り替わる。また、図８（ｂ）に示すように、光Ｂ１が照射されるタイミングでは、断面Ｐ１における１ピクセルの領域が照射され、検出部２０が当該１ピクセルの蛍光Ｌを検出する。続いて、光Ｂ２が照射されるタイミングでは、断面Ｐ２における１ピクセルの領域が照射され、検出部２０が当該１ピクセルの蛍光Ｌを検出する。すなわち、光切替器１２は、検出部２０が２つの断面Ｐ１，Ｐ２の各々の１ピクセルの蛍光Ｌを検出する度に、２つの光Ｂ１，Ｂ２を切り替える。例えば、断面Ｐ１，Ｐ２のピクセル数が約１３０万ピクセル（１２８０×９６０）であるとすると、断面Ｐ１，Ｐ２それぞれの２次元画像を、約３０ｆｐｓ（８０Ｍ÷２÷１．３Ｍ）のフレームレートで取得することができる。

第１の実施形態では、断面Ｐ１の２次元画像を取得した後に、断面Ｐ２の２次元画像を取得するため、２つの断面Ｐ１，Ｐ２の２次元画像を取得するために２回の走査が必要となる。そのため、断面Ｐ１，Ｐ２の各々のフレームレートは、元のフレームレートの１／２となり、フレームレートが低下する。これに対し、本実施形態では、１回の走査で２つの断面Ｐ１，Ｐ２の２次元画像を取得するため、断面Ｐ１，Ｐ２の各々のフレームレートは低下しない。

（本実施形態の効果）
上述のように、本実施形態に係る光切替器１２では、励起光源１からの光Ｂを偏光方向に応じて偏光ビームスプリッタ２ｈによって２つの光路のいずれかに切り替え可能に案内し、各光路に案内された光Ｂ１，Ｂ２の発散角を空間光変調器２ｅ，２ｆによって互いに異ならせて、ビームスプリッタ２ｄによって光Ｂ１，Ｂ２を光切替器２の出射部に案内している。さらに、光切替器１２は、電気光学位相変調器２ｉによって、光Ｂの偏光方向をＳ偏光とＰ偏光に切り替えることにより、光がビームスプリッタ２ａからビームスプリッタ２ｄへ到達可能な光路を、第１および第２の光路から選択している。

これにより、第１および第２の光路の光路長が等しい場合であっても、光切替器２は光Ｂ１，Ｂ２を切り替え可能に出射することができる。よって、第１の実施形態に係る光切替器２と同様、第１のおよび第２の光路の光路長を互いに異ならせる必要はなく、先行技術に比べ、光切替器１２のサイズを大幅に小さくすることができる。

また、第１の実施形態では、励起光源１からの光Ｂをビームスプリッタ２ａによって分割し、分割された光の一方を遮断していたため、光切替器２においてパワーロスが生じていた。これに対し、本実施形態では、電気光学位相変調器２ｉによって光Ｂの偏光を制御し、偏光方向に応じて、光Ｂを案内する光路を切り替えているため、光切替器１２におけるパワーロスがない。よって、高パワーのレーザ光源を用いる必要がない。

（変形例１）
上記では、図２および図７に示すように、光Ｂ１，Ｂ２の発散角を互いに異ならせることにより、光Ｂ１，Ｂ２を試料Ｓの異なる深さ（ｚ方向に異なる位置）に収束させていた。これに対し、変形例１では、光Ｂ１，Ｂ２の焦点位置Ｆ１，Ｆ２を試料Ｓの同じ深さで、かつ、ｘｙ方向に異ならせることにより、試料Ｓのｘｙ方向において異なる断面を観察する。

図９は、変形例１に係る光切替器１２’の構成を示す図である。光切替器１２’は、２つのミラー２ｂ，２ｃと、２つの空間光変調器（変調部）２ｅ，２ｆと、偏光ビームスプリッタ（第１の案内部）２ｈと、電気光学位相変調器（選択部）２ｉと、２つの１／２波長板２ｊ，２ｋと、偏光ビームスプリッタ（第２の案内部）２ｍとを備えている。このように、光切替器１２’は、図７に示す光切替器１２と同様の構成であるが、空間光変調器２ｅ，２ｆが光Ｂ１，Ｂ２の光軸を変調するように設定されている点で、光切替器１２と相違している。

空間光変調器２ｅ，２ｆは、それぞれ光Ｂ１，Ｂ２の光軸を屈折させる。これにより、空間光変調器２ｅを経て偏光ビームスプリッタ２ｍを透過した光Ｂ１は、図中斜め上方向に進行して光切替器１２’の出射部に到達する。一方、空間光変調器２ｆを経て偏光ビームスプリッタ２ｍに反射された光Ｂ２は、図中斜め下方向に進行して光切替器１２’の出射部に到達する。このように、空間光変調器２ｅ，２ｆは、光Ｂ１，Ｂ２の光軸を、光路ごとに異ならせる。なお、本変形例１において、空間光変調器２ｅ，２ｆのいずれか一方を省略してもよい。

図１０は、光切替器１２’から出射された光Ｂ１，Ｂ２の試料Ｓにおける焦点位置の説明図である。光Ｂ１，Ｂ２は、発散角は同一であるが、光Ｂ１は図中斜め上方向に進行し、光Ｂ２は図中斜め下方向に進行する。そのため、光Ｂ１の焦点位置Ｆ１、および光Ｂ２の焦点位置Ｆ２は、試料Ｓにおける同じ深さで、ｘ方向に異なる位置となる。

焦点位置Ｆ１と焦点位置Ｆ２とを交互に切り替え、さらに、焦点位置Ｆ１，Ｆ２をｘｙ方向に走査することにより、焦点位置Ｆ１を含む断面Ｐ１および焦点位置Ｆ２を含む断面Ｐ２を並行して観察することができる。

（変形例２）
上述した３つの光切替器２、１２，１２’で、発散角または光軸の互いに異なる２つの光を順次切り替えながら出射する構成であった。これに対し、変形例２では、発散角の互いに異なる４つの光を順次切り替えながら出射する光切替器の一例について、説明する。

図１１は、変形例２に係る光切替器１２”の構成を示す図である。光切替器１２”は、３つの電気光学位相変調器（選択部）２ｉ，２ｒ，２ｓと、３つの偏光ビームスプリッタ（第１の案内部）２ｈ，２ｎ，２ｏと、２つのファラデー回転子２ｐ，２ｑと、２つの１／２波長板２ｊ，２ｋと、４つの空間光変調器（変調部）２ｅ，２ｆ，２ｔ，２ｕとを備えている。

電気光学位相変調器２ｉは、励起光源１からの光Ｂを、偏光方向の互いに異なる２つの偏光（Ｓ偏光およびＰ偏光）に切り替え可能に偏光する。

偏光ビームスプリッタ２ｈ，２ｎ，２ｏは、Ｓ偏光を反射し、Ｐ偏光を透過させる部材である。これらのうち偏光ビームスプリッタ２ｈは、電気光学位相変調器２ｉの下流側に設けられている。電気光学位相変調器２ｉが光ＢをＳ偏光に偏光した場合、光Ｂは偏光ビームスプリッタ２ｈに反射されて、図中上方向に進行する。このＳ偏光を光Ｂ１とする。一方、電気光学位相変調器２ｉが光ＢをＰ偏光に偏光した場合、光Ｂは偏光ビームスプリッタ２ｈを透過して図中右方向に進行する。このＰ偏光を光Ｂ２とする。

ファラデー回転子２ｐ，２ｑは、透過光の偏光方向を４５度回転させる部材である。ファラデー回転子２ｐは、光Ｂ１の進行方向における偏光ビームスプリッタ２ｈの下流側に設けられており、ファラデー回転子２ｑは、光Ｂ２の進行方向における偏光ビームスプリッタ２ｈの下流側に設けられている。

１／２波長板２ｊ，２ｋは、それぞれ電気光学位相変調器２ｒ，２ｓに入る偏光を制御する。１／２波長板２ｊは、光Ｂ１の進行方向におけるファラデー回転子２ｐの下流側に設けられており、１／２波長板２ｋは、光Ｂ２の進行方向におけるファラデー回転子２ｑの下流側に設けられている。

電気光学位相変調器２ｒは、１／２波長板２ｊからの光Ｂ１の偏光方向を互いに異なる２つの偏光（Ｓ偏光およびＰ偏光）に切り替え可能に偏光する。

偏光ビームスプリッタ２ｎは、光Ｂ１の進行方向における電気光学位相変調器２ｒの下流側に設けられている。電気光学位相変調器２ｒが光Ｂ１をＳ偏光に偏光した場合、光Ｂ１は偏光ビームスプリッタ２ｎに反射されて、図中右方向に進行する。このＳ偏光を光Ｂ３とする。一方、電気光学位相変調器２ｒが光Ｂ１をＰ偏光に偏光した場合、光Ｂ１は偏光ビームスプリッタ２ｎを透過して、図中上方向に進行する。このＰ偏光を光Ｂ３とする。

空間光変調器２ｅは、光Ｂ３の進行方向における偏光ビームスプリッタ２ｎの下流側に設けられており、発散角を拡大して入射光を反射するように設定されている。また、空間光変調器２ｆは、光Ｂ４の進行方向における偏光ビームスプリッタ２ｎの下流側に設けられており、発散角を変えずに入射光を反射するように設定されている。これにより、光Ｂ３は、発散角が拡大されて空間光変調器２ｆに反射され、光Ｂ４は、発散角が変わらずに空間光変調器２ｅに反射される。

空間光変調器２ｅに反射された光Ｂ３は、Ｓ偏光であるため偏光ビームスプリッタ２ｎに反射され、その後、電気光学位相変調器２ｒ、１／２波長板２ｊ、ファラデー回転子２ｐを経て偏光ビームスプリッタ２ｈを透過し、光切替器１２”の出射部に到達する。また、空間光変調器２ｆに反射された光Ｂ４は、Ｐ偏光であるため偏光ビームスプリッタ２ｎを透過し、光Ｂ３と同様に、電気光学位相変調器２ｒ、１／２波長板２ｊ、ファラデー回転子２ｐを経て偏光ビームスプリッタ２ｈを透過し、光切替器１２”の出射部に到達する。なお、光Ｂ３，Ｂ４を透過させるときの偏光ビームスプリッタ２ｈは、第２の案内部として機能する。

電気光学位相変調器２ｓは、１／２波長板２ｋからの光Ｂ２の偏光方向を互いに異なる２つの偏光（Ｓ偏光およびＰ偏光）に切り替え可能に偏光する。

偏光ビームスプリッタ２ｏは、光Ｂ２の進行方向における電気光学位相変調器２ｓの下流側に設けられている。電気光学位相変調器２ｓが光Ｂ２をＳ偏光に偏光した場合、光Ｂ２は偏光ビームスプリッタ２ｏに反射されて、図中下方向に進行する。このＳ偏光を光Ｂ５とする。一方、電気光学位相変調器２ｓが光Ｂ２をＰ偏光に偏光した場合、光Ｂ２は偏光ビームスプリッタ２ｏを透過して、図中右方向に進行する。このＰ偏光を光Ｂ６とする。

空間光変調器２ｔは、光Ｂ５の進行方向における偏光ビームスプリッタ２ｏの下流側に設けられており、発散角を縮小して入射光を反射するように設定されている。また、空間光変調器２ｕは、光Ｂ６の進行方向における偏光ビームスプリッタ２ｏの下流側に設けられており、発散角を空間光変調器２ｔよりも大きく縮小して入射光を反射するように設定されている。これにより、光Ｂ５は、発散角が拡大されて空間光変調器２ｔに反射され、光Ｂ６は、発散角がさらに大きく拡大されて空間光変調器２ｕに反射される。

空間光変調器２ｔに反射された光Ｂ５は、Ｓ偏光であるため偏光ビームスプリッタ２ｏに反射され、その後、電気光学位相変調器２ｓ、１／２波長板２ｋ、ファラデー回転子２ｑを経て偏光ビームスプリッタ２ｈに反射され、光切替器１２”の出射部に到達する。また、空間光変調器２ｕに反射された光Ｂ６は、Ｐ偏光であるため偏光ビームスプリッタ２ｎを透過し、光Ｂ５と同様に、電気光学位相変調器２ｓ、１／２波長板２ｋ、ファラデー回転子２ｑを経て偏光ビームスプリッタ２ｈに反射され、光切替器１２”の出射部に到達する。なお、光Ｂ５，Ｂ６を反射するときの偏光ビームスプリッタ２ｈは、第２の案内部として機能する。

以上のように、光切替器１２”では、電気光学位相変調器２ｉ，２ｒ，２ｓによって、励起光源１からの光Ｂは、以下の４つの光路に案内される。
第３の光路：偏光ビームスプリッタ２ｈ→偏光ビームスプリッタ２ｎ→空間光変調器２ｅ→偏光ビームスプリッタ２ｎ→偏光ビームスプリッタ２ｈ→光切替器１２”の出射部
第４の光路：偏光ビームスプリッタ２ｈ→偏光ビームスプリッタ２ｎ→空間光変調器２ｆ→偏光ビームスプリッタ２ｎ→偏光ビームスプリッタ２ｈ→光切替器１２”の出射部
第５の光路：偏光ビームスプリッタ２ｈ→偏光ビームスプリッタ２ｏ→空間光変調器２ｔ→偏光ビームスプリッタ２ｏ→偏光ビームスプリッタ２ｈ→光切替器１２”の出射部
第６の光路：偏光ビームスプリッタ２ｈ→偏光ビームスプリッタ２ｏ→空間光変調器２ｕ→偏光ビームスプリッタ２ｏ→偏光ビームスプリッタ２ｈ→光切替器１２”の出射部

そして、光Ｂ３〜Ｂ６は、それぞれ第３〜第６の光路を経て光切替器１２”から出射される。さらに、４つの空間光変調器２ｅ，２ｆ，２ｔ，２ｕは、反射光の発散角が互いに異なるように設定されているため、光Ｂ３〜Ｂ６の発散角を互いに異ならせることができる。

また、電気光学位相変調器２ｒ，２ｓの偏光切り替え周期を、電気光学位相変調器２ｉの偏光切り替え周期の２倍に設定する。さらに、電気光学位相変調器２ｉが光ＢをＳ偏光に偏光している期間において、電気光学位相変調器２ｒが当該期間の前半に光Ｂ１をＳ偏光に偏光し、当該期間の後半に光Ｂ１をＰ偏光に偏光し、電気光学位相変調器２ｉが光ＢをＰ偏光に偏光している期間において、電気光学位相変調器２ｓが当該期間の前半に光Ｂ２をＳ偏光に偏光し、当該期間の後半に光Ｂ２をＰ偏光に偏光する。これにより、光Ｂ３〜Ｂ６は、互いに異なるタイミングで光切替器１２”の出射部に到達するため、光切替器１２”は、光Ｂ３〜Ｂ６を順次切り替えながら出射することができる。また、光切替器１２”を適用した観察装置は、試料Ｓにおける４つの異なる深さの断面を並行して観察することができる。

なお、空間光変調器２ｅ，２ｆ，２ｔ，２ｕを、発散角の代わりに入射光の光軸を互いに異なる方向に変調するように設定してもよい。これにより、光切替器１２”は、光軸の互いに異なる４つの光を順次切り替えながら出射することができ、光切替器１２”を適用した観察装置は、試料Ｓのｘｙ方向における４つの異なる断面を並行して観察することができる。

また、光切替器１２”では、３つの偏光ビームスプリッタ２ｈ，２ｎ，２ｏによって、光Ｂを４つの光路に切り替え可能に案内していたが、さらに多数の偏光ビームスプリッタを用いて、光Ｂをさらに多数の光路に切り替え可能に案内する構成としてもよい。これにより、発散角等が互いに異なるより多数の光を順次切り替えながら出射可能な光切替器を構成することができる。

なお、先行技術では、励起光源からの１つのパルス光を複数のパルス光に分割しているが、複数のパルスの間隔は蛍光寿命（数ｎｓ）よりも長くする必要がある。そのため、パルスレーザの間隔が１２．５ｎｓとすると、分割可能な最大パルス数は４程度となる。一方本発明では、１つのパルス光単位ではなく、複数のパルス光ごとに電気光学位相変調器の偏光制御によって切り替え可能に出射しているため、５以上の光を切り替え可能に出射することができる。また、電気光学位相変調器の偏光制御による光の切り替えでは、パワーロスがないため、光の切り替え数にかかわらず、同じパワーの励起光源を用いることができるという利点もある。

〔総括〕
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて種々の変更が可能であり、例えば、上記の各実施形態に開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる形態も、本発明の技術的範囲に属する。

また、上記の各実施形態では、光の照射によって誘起される分子がカルシウム蛍光プローブであったが、本発明ではあらゆる蛍光プローブを用いることができる。

カルシウム蛍光プローブには、化合物のカルシウム蛍光プローブとタンパク質のカルシウム蛍光プローブとがある。化合物のカルシウム蛍光プローブには、Oregon Green BAPTA、Cal-520、Fura-2などがある。タンパク質のカルシウム蛍光プローブには、GCaMP6f、GCaMP6m、GCaMP6s、RCaMP、jRGECO1aなどがある。

カルシウム蛍光プローブ以外の蛍光プローブとしては、例えば、膜電位感受性色素や膜電位感受性蛍光タンパク質がある。膜電位感受性色素には、Di-2-ANEPEQ、Di-4-ANEPPS、Di-8-ANEPPQ、Di-8-ANEPPS、Di-12-ANEPPQ、DiBAC₄(3)、DiIC₁(5)、DiOC₂(3)、DiOC₅(3)、DiOC₆(3)、RH237、RH414、RH421、RH795、TMRE、TMRMなどがある。膜電位感受性蛍光タンパク質には、QuasAr2-mCitrineやQuasAr2-mRuby2、Ace1Q-mNeon、Ace2N-mNeon、FlicR1などがある。

その他のタンパク質の蛍光プローブとしては、GFP、YFP、Venus、RFP、tdTomato、BFP、CFP、iRFPなどの様々な色の蛍光タンパク質；iGluSnFRやiGABASnFRなどのグルタミン酸やGABAなどの神経伝達物質のセンサータンパク質；dLight1、GAChなどのドパミンやアセチルコリンなどの神経修飾物質センサータンパク質がある。

細胞の樹状突起やスパイン、シナプスなどの微小構造、細胞内のミトコンドリア、核、小胞体などのオルガネラを標識する蛍光プローブには、Synaptophysin-GFP、MitoTracker、Hoechst、DAPI、ER-GFP BacMam 2.0などがある。

さらに本発明では、光の照射によって誘起される分子として、蛍光プローブだけでなく、例えばラマンプローブや、試料自身がもともと有している内在性の分子などのあらゆる分子を用いることができる。内在性の分子からの発光は、自家蛍光、第２高調波、第３高調波、誘導ラマン散乱、コヒーレント反ストークスラマン散乱、４光波混合などがある。

また、上記の各実施形態では、観察対象となる試料が、マウスの脳であったが、脳以外の組織であってもよいし、あるいは植物の組織であってもよい。さらに、生体ではない試料を観察対象としてもよく、そのような試料として、半導体材料などの工業用試料が挙げられる。

本発明は、脳科学、創薬、医療用検査装置などの生化学分野の他、工業分野にも適用できる。例えば、半導体検査装置に本発明を適用することにより、半導体材料の検査時間短縮を図ることが可能となる。

１ 励起光源
２ 光切替器
２ａ ビームスプリッタ（第１の案内部）
２ｂ ミラー
２ｃ ミラー
２ｄ ビームスプリッタ（第２の案内部）
２ｅ 空間光変調器（変調部）
２ｆ 空間光変調器（変調部）
２ｇ チョッパー（選択部）
２ｈ 偏光ビームスプリッタ（第１の案内部、第２の案内部）
２ｉ 電気光学位相変調器（選択部）
２ｊ １／２波長板
２ｋ １／２波長板
２ｍ 偏光ビームスプリッタ（第２の案内部）
２ｎ 偏光ビームスプリッタ（第１の案内部）
２ｏ 偏光ビームスプリッタ（第１の案内部）
２ｐ ファラデー回転子
２ｑ ファラデー回転子
２ｒ 電気光学位相変調器（選択部）
２ｓ 電気光学位相変調器（選択部）
２ｔ 空間光変調器（変調部）
２ｕ 空間光変調器（変調部）
３ チューブレンズ
４ チューブレンズ
５ ｙ走査部（走査部）
６ ｘ走査部（走査部）
７ 走査レンズ
８ チューブレンズ
９ ダイクロックミラー
１０ ｚ走査部
１０ａ 絞り
１０ｂ 対物レンズ
１１ 検出レンズ
１２ 光切替器
１２’ 光切替器
１２” 光切替器
２０ 検出部
１００ 観察装置
２００ 観察装置
Ａ 開口
Ｆ１ 焦点位置
Ｆ２ 焦点位置
Ｌ 蛍光（信号光）
Ｐ１ 断面
Ｐ２ 断面
Ｓ 試料

Claims (7)

1. 対物レンズを介して試料の互いに異なる複数の断面に光を照射することにより、該複数の断面を並行して観察する観察装置に適用され、光源からの光を、前記対物レンズを通過した場合の焦点位置が互いに異なる複数の光に変換し、前記複数の光を順次切り替えながら前記対物レンズに出射する光切替器であって、
   前記光源からの光を分割して複数の光路に案内する、または、前記光源からの光を前記複数の光路のいずれかに切り替え可能に案内する第１の案内部と、
   前記複数の光路に案内された光の発散角および光軸の少なくともいずれかを、前記光路ごとに異ならせる変調部と、
   前記複数の光路に案内された光の各々を、前記光切替器の出射部に案内する第２の案内部と、
   光が前記第１の案内部から前記第２の案内部へ到達可能な光路を、前記複数の光路から選択する選択部と、
   を備えたことを特徴とする光切替器。
2. 前記第１の案内部は、前記光源からの光を分割して複数の光路に案内するビームスプリッタであり、
   前記選択部は、前記複数の光路のうち１の光路を切り替え可能に選択し、当該１の光路以外の光路を遮断するチョッパーであることを特徴とする請求項１に記載の光切替器。
3. 前記第１の案内部は、前記光源からの光を、偏光方向に応じて前記複数の光路のいずれかに切り替え可能に案内する偏光ビームスプリッタであり、
   前記選択部は、前記偏光ビームスプリッタの上流側に設けられ、前記光源からの光を、偏光方向の互いに異なる複数の偏光に切り替え可能に偏光する電気光学位相変調器であることを特徴とする請求項１に記載の光切替器。
4. 試料の互いに異なる複数の断面を並行して観察する観察装置であって、
   前記試料内の分子または構造を可視化するための光を発生する励起光源と、
   前記光を光軸に交差する方向に走査する走査部と、
   前記光を前記試料内に収束させる対物レンズと、
   前記励起光源と前記対物レンズとの間に設けられ、前記励起光源からの光を、前記対物レンズを通過した場合の焦点位置が互いに異なる複数の光に変換し、前記複数の光を順次切り替えながら前記対物レンズに出射する光切替器と、
   前記光の照射によって発生した信号光を検出する検出部と、
   を備え、
   前記光切替器は、請求項１から３のいずれかに記載の光切替器であることを特徴とする観察装置。
5. 前記光切替器は、前記走査部が前記複数の断面の各々の走査を完了する度に、前記複数の光を切り替えることを特徴とする請求項４に記載の観察装置。
6. 前記光切替器は、前記検出部が前記複数の断面の各々の１ピクセルの前記信号光を検出する度に、前記複数の光を切り替えることを特徴とする請求項４に記載の観察装置。
7. 前記分子は、カルシウム蛍光プローブであり、
   前記光は、前記カルシウム蛍光プローブを誘起するレーザ光であることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の観察装置。

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