JP7415063B2 - シングルプレーンイルミネーション顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、試料を照明する照明用光学ユニットを含む光シート顕微鏡に関する。試料は媒質、例えば液体内又はゲル内に入れて試料キャリア上に置かれる。試料キャリアはここで、平坦な基準面に平行であり、この基準面は例えば、試料キャリア、例えば特定の厚さの平行平面ガラス板又は、壁と、前記基準面に平行な透明の底部を有する相応の容器が置かれる試料ステージの平面とすることができる。容器は開放していても、透明なカバーガラスで閉じられてもよい。照明用光学ユニットは、照明ビーム経路を介して試料を照明する機能を果たし、照明は、基準面の法線とゼロ以外の照明角度をなす光シート平面を有する光シートを使って行われる。光シート顕微鏡は、試料キャリアの領域内で基準面の法線とゼロ以外の検出角度をなす光軸を持つ検出ビーム経路を有する検出用光学ユニットをさらに含む。検出及び照明角度間の角度は９０°であることが多いが、これは必須の仕様ではない。

光シート顕微鏡はまた、分離層システムをさらに含み、これは特定の厚さの特定の材料から製作され、その中に試料が置かれる媒質を照明及び検出用光学ユニットから分離する少なくとも１層を有する。分離層システムはここで、少なくとも照明及び検出のために到達可能な領域において、基準面に平行なベース面によって媒質と接触している。倒立光シート顕微鏡の場合、照明及び検出が試料の下に配置され、試料容器又は試料キャリア板の透明な底部は、底部と光学ユニットとの間に配置された空気層又は浸漬媒質と共に分離層システムを形成する。上から観察すると、例えば試料容器の透明な蓋は、空気層又は浸漬媒質と共に蓋と照明及び検出用光学ユニットとの間に分離層システムを形成する。

照明及び検出用光学ユニットは基準面の法線とゼロ以外の角度をなすため、少なくとも１つの補正素子が照明及び／又は検出ビーム経路内に配置されて、検出されるべき光又は試料を照明するための光が分離層システムの界面を斜めに通過することにより生じるこのような収差が低減化される。

光シート顕微鏡は、特に生体試料を調べる際に使用され、試料は、検出の光軸とゼロ以外の角度で交差する平面を有する光シートで照明される。光シートはここで、典型的に検出方向と直角をなし、検出方向は例えば検出のためにのみ使用される検出用対物レンズの光軸に対応していてもよい。ＳＰＩＭ（セレクティブ又はシングルプレーンイルミネーション顕微鏡）とも呼ばれるこの手法を使用することにより、比較的厚い試料の空間記録でも比較的短時間で生成できる。試料の空間的に広い視覚的表現が、光学切片と、試料と光シートとの間の相対移動、すなわち切断面に垂直な方向への移動との組合せに基づいて得ることができる。

ＳＰＩＭは好ましくは蛍光顕微鏡で使用され、これはＬＳＦＭ（光シート蛍光顕微鏡）としても知られる。共焦点レーザ走査型顕微鏡又は二光子励起顕微鏡等の他の確立された方法と比較して、ＬＳＦＭ方式及び装置には幾つかの利点がある：検出を広角で行うことができるため、比較的大きい試料領域を捕捉することがさらに可能である。分解能は共焦点レーザ走査型顕微鏡より低いものの、ＬＳＦＭではより厚い試料を分析することができ、これは、侵入深さがより大きいからである。さらに、この方法では試料の露光が最も低く、それによってとりわけ、試料の望ましくない褪色のリスクが軽減されるが、これは、試料が検出方向に関してゼロ以外の角度で薄い光シートによって照明されるだけであることによる。

使用される光シートはここで、例えばシリンドリカルレンズを使用して生成される静的光シート、又は準静的光シートとすることができる。後者は、試料を光ビームで高速スキャンすることにより生成できる。光シート型の照明は、光ビームが観察対象試料に関してごく高速で相対移動すると行われ、それが時間的に連続して、何度も繰り返されて並べられる。最終的に試料が結像されるセンサを有するカメラの積分時間は、スキャンが積分時間内に終了するように選択される。検出用光学ユニットには、２次元センサフィールドを有するカメラの代わりに、ラインスキャンセンサと他のスキャン（再スキャン）との組合せを使用することもできる。それに加えて、検出はまた、共焦点検出とすることもできる。

ＳＰＩＭはこれまでに確立されており、例えば前者に基づく（特許文献１）及び（特許文献２）、並びに、概論を記した記事である（非特許文献１）等の文献において何度も取り上げられている。

ＳＰＩＭ方法にしたがって動作する光シート顕微鏡は、これまでほとんど、試料の観察にのみ使用されてきた。しかしながら、試料のより深部を調査するために、それに対して光学的操作を行うことが望ましい場合が多い。本発明に関する光学的操作という用語は、光刺激、すなわち、特定の位置及び時間に、試料内に事前設定可能な形状、大きさ、及び、同時に操作する場合は数の、横方向及び軸方向に限定された領域内において光強度(light intensity)を当てることであり、操作光は試料内を貫通してはならず、光強度を当てることにより特定の位置で光学的に反応を起こさせることを意味すると理解される。このような反応は例えば、試料の褪色、光変換、アンケージング等であり得る。操作光が操作対象領域のみで操作方向に沿って試料と相互作用する試料内の光学操作を以下、局所光学的操作という。

先行技術では、この点に関して各種の方法が知られている。例えば、ポイントスキャナ、すなわち検出が共焦点式ではないレーザ走査型顕微鏡は、ある平面、例えば光シート平面内の所望の位置に素早く標的を絞るために使用できる。ここで、焦点において高強度を生成できる。欠点はここで、個別の位置に時間的に連続して標的を絞らなければならないことである。軸方向への位置決めは、フォーカシング、例えば対物レンズ内のインターナルフォーカシングを介して、又はそれに対応する試料の移動によって行わなければならない。他の欠点は、標的位置の下及び上の領域が軸方向に完全に侵入されることであり、すると、強度に応じて、試料との相互作用が実際に集光された領域以外でも発生する可能性がある。適当な光学ユニットを使用することによってマルチポイントスキャナも実現でき、この場合は、複数の点に同時に標的を絞ることができる。

２次元強度パターンを生成するために、例えばデジタルマイクロミラーアレイ（ＤＭＤアレイ）を使用でき、これは照明用光学ユニット内の中間像面内に配置される。個々の画素のオンとオフを切り換え、試料内の照明領域を直接画定できる。これは、例えば（非特許文献２）の記事に記載されている。ＤＭＤアレイの代わりに、透過部（transmission）にＬＣＤアレイを使用することも可能であるが、この場合は入射光のパワーの損失が大きい。ＤＭＤの代わりにＬＥＤアレイを使用することも可能であり、するとこれは照明のために直接使用され、照明の振幅はＤＭＤのように画素ごとに変調される。ＤＭＤアレイと比較した利点は、ＭＨｚ範囲という、より高い変調周波数であり、これに対してＤＭＤアレイの変調周波数はｋＨｚ範囲である。照明光を構成するためのＬＥＤアレイの使用は、例えば（非特許文献３）の記事に記載されている。

空間光変調器（ＳＬＭ）の使用により、空間的に広い区域における、換言すれば例えば検出又は照明方向に垂直な平面内だけでなく、その方向の軸方向への光刺激も可能となる。空間光変調器はそのために、操作ビーム経路の瞳面内に配置され、その上に位相パターンが転写され、それゆえこれが操作に使用される光の位相を変化させる。すると、結像では所望の強度分布が生成される。この手法は例えば、（非特許文献４）の記事に記載されている。ここで、強度分布が明示され、これは例えば過去に記録された概観画像からの、又は空間概観スキャンからの試料構造に基づいて特定できる。逆フーリエ変換に基づくアルゴリズムを使って、ＳＬＭに転写すべき必要な位相パターンが前記明示された強度分布から反復的に計算される。この手順は例えば、（非特許文献５）の記事に記載されている。しかしながら、この手順は複雑で、一般的には液晶素子に基づく空間光変調器のフレームレートが低いことから、パターンはここで、非常に低速な時間的連続、例えば数１０Ｈｚでしか変更できない。２次元構造と比較して、これらの方法はほぼ１００倍遅い。

空間内の実質的に点の形状の区域への光学操作の特に良好な局所限定はまた、多光子励起の概念でも実現できる。ここで、焦点においてのみきわめて高い強度を有するレーザパルスがその区域で結像される。このようなパルスは、例えばフェムト秒レーザで生成できる。このレーザの波長は、試料中に存在するいずれの染料も蛍光発光のために励起されないように選択される。波長は一般に、近赤外領域内である。しかしながら、焦点における光の強度は非常に高いため、２つ以上の光子が同時に吸収され、対応する蛍光発光励起遷移をトリガする可能性が特に高い。このようにすると、１光子励起の場合のように焦点面の上又は下ではなく、焦点面のみに標的を絞った励起が可能となるが、それは焦点面の上下での強度が非常に低いからである。多光子励起のスキャンシステムを使用すると、結像中の侵入深度を深くすることもできる。さらに、近赤外範囲の波長が使用されるため、この手法は特に生体生物試料において有利である。多光子励起の方法は、点方式のスキャンと、また、試料が多数の地点で同時に照明されるマルチポイント照明とも組み合わせることができる。これは、反復的に計算される位相パターンが転写された、操作ビーム経路内の空間光変調器によって実現できる。２光子励起に関するこの手法は、例えば（非特許文献６）の記事に記載されている。

多光子励起、特に２光子励起を用いるポイントスキャナの場合、励起の二次強度依存性と平面内の強力な集光との組合せによって深さ識別を行うことが容易に可能であるが、これは、広角イメージングではさらに補助的な手段を用いないかぎり不可能である。しかしながら、例えば格子等の回折光学素子を使用すれば、短いレーザパルスを分光的に分割することができる。すると、前記回折光学素子は顕微鏡対物レンズを介して試料へと結像される。その後、照明光のパルスの異なるスペクトル要素が異なる光路をとり、焦点面でのみ再び収束し、ここでもとの超短レーザパルスを形成する。それゆえ、パルスのピークパワーは焦点面においてのみ最大となり、それが２光子励起の上述の二次強度依存性と共に、広角照明であっても所望の深さ識別を可能にする。この方式は、「時間的フォーカシング」とも呼ばれ、例えば（非特許文献７）の記事に記載されている。

非侵襲的な（gentle）光刺激のための上記の方法はすべて、ほとんどが光シート顕微鏡には使用されていない。しかしながら、（特許文献３）は、光シート顕微鏡における試料のフォトマニピュレーションのための各種の装置を提案している。ここで、これらの装置はすべて、常に照明ビーム経路を通じた操作も含んでおり、この操作光も同様に光シートの形状とされ、光シートを生成するために使用される光源又は専用の操作光用光源を使用できる。この方法では、軸方向に局所的に制限された光刺激は不可能である。（特許文献３）にはさらに、光シートによる第１の操作照明に加えて、操作光が検出用光学ユニットを介して試料へと案内される第２の操作用光学ユニットの使用の選択についても記載されている。この点に関して、第２の操作用光学ユニットとしてのレーザ走査型顕微鏡の使用が提案されている。この第２の操作用光学ユニットを用いれば、原理上、光シート平面内の操作だけが可能であるが、第２の光源の操作光は、光シートの法線方向に沿って、より広い領域にわたり試料の中に侵入するか、又はより広い領域にわたりそこに入射する。操作光による操作又は照明はまた、光シート平面内の照明光における軸方向への光シートの範囲全体に沿って行われる。

独国特許出願公開第１０２ ５７ ４２３ Ａ１号明細書 国際公開第２００４／０５３５５８ Ａ１号パンフレット 米国特許第８，５４７，６３４ Ｂ２号明細書

"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｌａｎｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｃｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｊ．Ｈｕｉｓｋｅｎ ｅｔ ａｌ．著、２００９年発行Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、ｖｏｌ．１３６，ｐ．１９６３ "Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ－ｂａｓｅｄ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｈｏｔｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｖｏｌｔａｇｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｙｅ ｉｍａｇｉｎｇ"，Ｓ．Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．著、２０１３年発行"Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅｒａｃｈ"７５（１），ｐ．７６ "Ｍｕｌｔｉ－ｓｉｔｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＣｈＲ２ ａｎｄ ｍｉｃｒｏ－ＬＥＤ ａｒｒａｙ"，Ｎ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．著、２０１０年発行"Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ"７（１），ｐ．０１６００４ "Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｍｏｔｅ－ｆｏｃｕｓｉｎｇ ａｎｄ ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｌｉｇｈｔ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ"，Ｆ．Ａｎｓｅｌｍｉ ｅｔ ａｌ．著、２０１１年発行"Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"１０８（４９），ｐ．１９５０４ｆｆ "Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｇｈｔ ｓｈａｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｒｃｈｂｅｒｇ－Ｓａｘｔｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ"，Ｇ．Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．著、２００５年発行"Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ"７，ｐ．１１７ "ＳＬＭ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｓｃａｎｌｅｓｓ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｐａｔｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ"，Ｖ．Ｎｉｋｏｌｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．著、２００８年１２月１９日発行"Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ"誌、ｖｏｌ．２（５）．ｐ．１ "Ｓｃａｎｎｉｎｇｌｅｓｓ ｄｅｐｔｈ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ"，Ｄ．Ｏｒｏｎ ｅｔ ａｌ．著、２００５年発行"Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ"誌、１３（５），ｐ．１４６８７

したがって、本発明の目的は、導入部で述べた種類の光シート顕微鏡を、試料の試料非破壊観察を可能にするように開発することである。

この目的は、特に試料の倒立観察用に設計された、導入部で述べた種類の光シート顕微鏡において、光シート顕微鏡が、光強度を少なくとも１つの操作ビーム経路を介して、試料上に光シート平面内の実質的に点状の区域において、又は光シート平面を少なくとも一時的に含む特定の体積において衝突させるための、光シート生成とは独立した手段のみを含むことにおいて実現される。

実質的に点状の区域、すなわち例えば、これに限定されないが、平面内の操作の場合に特に横方向にだけでなく、好ましくは試料の体積全体に関して軸方向にも限定される、その大きさが当然、横方向及び軸方向の集光、使用される励起機構、操作手段そのもの等、様々な要素に依存する区域に限定することにより、特に試料非破壊的操作を達成することができる。実質的に点状の区域はここで、それ自体、２次元及び３次元空間のどちらにおいても「注目領域」（ＲＯＩ：ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の意味でより大きい区域を画定でき、すると、そこから今度は、操作対象体積の中で複数の相互に独立した不連続のＲＯＩを画定できる。「点」という用語はここで、数学的意味で理解すべきではなく、選択し、操作すべき区域ができるだけ小さい必要があることを明瞭にすることが意図されている。

操作及び観察／照明はここで、原理上、相互に独立している。例えば、光シートは、体積のある領域又はＲＯＩを、別の領域で操作が行われている間に観察するために使用できる。この、別の領域は、後でのみ光シートにより照明される。操作が行われる体積又は、したがって実質的に点状の区域は、その中に強度が当てられている間に光シート平面内になくてもよい。これらは後でのみ、おそらくは所定の時間が経過した後に光シートにより捕捉される。

光シート顕微鏡の照明用光学ユニットは一般に、好都合な方法で（expediently）照明用対物レンズを含み、検出用光学ユニットは検出用対物レンズを含み、照明及び検出はまた、同じ対物レンズでも行うことができ、すなわち、照明用対物レンズは検出用対物レンズと同じとすることができる。また、照明と検出がビーム経路内の個々の光学素子、例えば補正素子を共有することも可能である。操作のための手段は、操作ビーム経路内の別の操作用対物レンズを含むことができるが、操作はまた、照明用対物レンズにより、又は検出用対物レンズにより行うこともでき、これらの場合、操作用対物レンズは照明用対物レンズと、又は検出用対物レンズと同じである。これら２つの変形型には、追加の対物レンズが不要であるという利点があるが、その構成は専用の操作用対物レンズを使用する場合と比較して、幾分自由度が低下する。特に好ましくは、操作は検出用対物レンズにより行われ、それはこれが光シートに対して垂直に配置されることが多く、それによって光シート平面内の、又は光シート平面周辺の体積内の区域を対象とする(area-covering)操作がより容易になるからである。

操作はそれゆえ、上述の３つの対物レンズの各々によって行うことができ、操作のための手段を補足する素子（詳しくは後述する）は一般に、３つの対物レンズの各々において使用でき、すなわち、照明ビーム経路の中、検出ビーム経路の中、又は専用の操作ビーム経路の中のいずれにも連結できる。照明ビーム経路を使用する場合、操作及び照明は光学素子を共有するが、これは相互に独立して行われ、相互に影響を与え合うことはない。特に、操作に使用される光は、光シートに成形されない。

実現しやすい実施形態において、操作のための手段は、光強度を試料の個別の実質的に点状の区域に時間的に連続して衝突させるポイントスキャナ又は、試料の実質的に点状の複数の区域に時間的に連続して衝突させるマルチポイントスキャナを含み、そのそれぞれの数（a respective quantity）に光強度を同時に衝突させることができる。マルチポイントスキャナはポイントスキャナと同様に構成され、例えばマルチポイントの生成のためにマイクロレンズアレイを使用できる。

第１の空間光変調器を使用して、特定の強度分布を試料に衝突させることもでき、これは実質的に一定の振幅で行われる。特定の振幅分布も特定の強度分布上に転写するために、操作のための手段は第２の空間光変調器を含むことができる。

別の構成では、操作のための手段は、好ましくは光シート平面に平行な平面内、特に好ましくは光シート平面内に特定の強度分布を生成するためにデジタルマイクロミラーアレイ（ＤＭＤ）を含む。光シート平面に平行な向きの場合、操作は、好都合な方法で、検出用対物レンズ又は別の操作用対物レンズによって行われる。

上述の操作のための手段は、特に好ましい構成において、相互に組み合わせて操作速度を高めることができ、これは、ＤＭＤが空間光変調器より高速で切り換え可能であるからである。したがって、好ましい構成では、光シート顕微鏡は、第１の空間光変調器、デジタルマイクロミラーアレイ、又はこれらの組合せの間で切り換えを行うためのスイッチング手段、好ましくはスイッチングミラーも含む。第２の空間光変調器も、第１の空間光変調器に加えて使用できる。このようにして、例えば、空間光変調器を、相応の位相パターンと共に、複数の空間区域を画定するために使用でき、その後これは、ＤＭＤにより個別にオンとオフに高速で切り換えることができる。

操作用対物レンズが検出用対物レンズと同じである場合、第１又は第２の空間光変調器は、特に好ましい構成では、試料の操作と収差の補正のどちらのためにも使用できる。このために、空間光変調器のうちの一方の第１の領域は、特定の強度又は振幅分布を試料に衝突させために、且つ補正素子として具現化され、空間光変調器の第２の領域は、検出ビーム経路内の補正要素としてのみ具現化される。これは、ＳＬＭを適切に制御することによって実現できる。ここで、偏向手段が提供され、これは検出されるべき光を第２の領域へと、また操作に使用される光を第１の領域へと偏向させる。これはまた、操作が照明用対物レンズを介して行われる場合、すなわちそれが操作用対物レンズと同じである場合は、照明用対物レンズで同様に、又は、必要であれば、操作用対物レンズでも実現できる。

このようにして、検出ビーム経路又は照明ビーム経路のために別の補正素子を提供する必要がないため、コストを削減できる。それに加えて、又はその代わりに、先行技術から知られているような補正素子を使用することももちろん可能であり、これは例えばアルバレスプレートと呼ばれるものであり、それは２つの移動可能な実質的にプレート状の素子で、その上に収差を補正するための対応する表面構造が転写され、これらは相互に関して横方向に移動可能である。表面構造はフリーフォーム表面とすることができ、プレートは波面変調器の機能を有する。例えば、このような補正素子は独国特許出願公開第１０ ２０１４ １０４ ９７７ Ａ１号明細書に記載されている。補正素子はそれに加えて、又はその代わりに、光伝送システムとしても構成でき、これは仮想リレイとして知られ、例えば独国特許出願公開第１０ ２０１３ １１２ ６００ Ａ１号明細書に記載されている。前記補正素子は、それを照明用対物レンズと検出用対物レンズ両方に使用できるような寸法とすることができ、これらの対物レンズと分離層システムとの間に設置される。その他の補正素子は、これも同様に個別にも前述のものと組み合わせても使用でき、変形可能なミラー又は、前述のように、空間光変調器を含む。

偏向手段は好ましくはダイクロイック素子を含み、これは相互に関して平行に、好ましくは空間光変調器の活性光学面に垂直に配置された活性光学面を有し、ビーム経路は、操作に使用され、検出されるべき光がそれぞれダイクロイック素子へと２回案内され、それぞれの領域への偏向が、ダイクロイック素子の厚さにより実現される。ダイクロイック素子はこの場合、必ずしも上述のように垂直に配置されなければならないわけではないが、相応に傾斜される場合は、はるかにより厚くする必要がある可能性がある。

ＳＬＭを異なる照明が行われる２つの領域に分割する構成は、照明ビーム経路にも同様に当てはまり、ここで、１つの領域は光シート生成のため、他方の領域は操作用の照明（manipulation illumination）のためである。それに加えて、ＳＬＭは、両方の領域において、補正素子の機能も果たすことができる。

特に有利なこととして、操作光の光源、波長、及び強度は、２つ以上の光子遷移を励起するために設計され、その結果、局所的に空間的にきわめて限定された区域において、特に試料非破壊操作を実現できる。操作に使用される光の強度を操作ビーム経路の、すなわち例えば検出用対物レンズの軸に沿って軸方向に局在化させるために、好ましくは、時間的フォーカシング機構が提供され、これは好ましくは、フェムト秒パルスレーザと、群速度分散を制御するためのコントローラとを含む。

言うまでもなく、上述の特徴及び以下に説明するものは、明示された組合せでだけでなく、その他の組合せでも、又はそれら自体でも使用でき、その場合も本発明の範囲から逸脱しない。

本発明は、例えば、本発明に不可欠な特徴も開示している添付の図面に基づいて、以下により詳しく説明されている。

試料非破壊光シート顕微鏡のための一般的な構成を示す。 検出用対物レンズによる操作の第１の構成を示す。 検出用対物レンズによる操作の、また別の２つの構成を示す。 検出用対物レンズによる操作の、また別の２つの構成を示す。 検出用対物レンズによる操作の第３の構成を示す。 検出用対物レンズによる操作の第５の構成を示す。 別の操作用対物レンズによる操作の構成を示す。 別の操作用対物レンズによる操作の構成を示す。 別の操作用対物レンズによる操作の構成を示す。 照明用対物レンズによる操作の２つの考えられる例を示す。 照明用対物レンズによる操作の２つの考えられる例を示す。 照明用対物レンズにより操作を行う光シート顕微鏡の第１の構成を示す。 照明用対物レンズによる操作の第２の構成を示す。 照明用対物レンズによる操作の第３の構成を示す。 光シートの時間的フォーカシングの利用を示す。 ２方向からの操作の原理図を示す。 多光子操作のための装置を示す。 操作及び結像のための手順を示す。 操作及び結像のための手順を示す。 操作及び結像のための手順を示す。

図面の詳細な説明
まず、図１は、操作が同時に行われる試料非破壊光シート顕微鏡法に使用できる一般的なセットアップを示す。試料１は試料キャリア２の上に配置される。光シート顕微鏡法を用いた検査はここで、倒立型で行われ、照明用対物レンズＯ１及び検出用対物レンズＯ２は、分離層システムの一部である試料キャリア２の下に配置される。試料キャリア２は、例えば試料キャリア２の底面に対応することが可能な平坦な基準面３に平行である。試料１は、ここでは特に示されていない媒質の中に埋め込むことができる。照明用対物レンズＯ１を使用して、試料１は光シートで照明ビーム経路を介して照明され、光シートは光シート面を有し、これはここで、照明用対物レンズＯ１の光軸４に対応し、これは基準面の法線とゼロ以外の照明角度をなす。検出用対物レンズＯ２は、検出ビーム経路を有する検出用光学ユニットの一部であり、その光軸５は試料キャリア２の領域内で基準面３の法線とゼロ以外の検出角度をなす。光軸５はここで、検出用対物レンズＯ２の光軸に対応する。検出されるべき光の、又は分離層システム（試料キャリア２とその下にある空気層を含む）を通じて試料１を照明するための光が斜めに通過することにより発生する収差を補正又は低減するために、光シート顕微鏡は少なくとも１つの補正素子、この場合は複数の補正素子を含む。第一に、照明用対物レンズＯ１は波面マニピュレータ６の形態の補正素子を含み、検出用対物レンズＯ２は別の波面マニピュレータ７の形態の補正素子を含み、波面マニピュレータ６及び７は、光軸４及び５に関して相互に横方向に相対移動可能なフリーフォーム面を有するプレートにより形成され、これらのプレートはまた、アルバレスプレートとも呼ばれる。それに加えて、対物レンズＯ１及びＯ２に共通の、仮想リレイの形態のまた別の補正素子、いわば光伝送システム８は、これらの対物レンズと試料キャリア２の底面との間に配置される。例えば、別の操作用対物レンズＯ３がここで、例として操作のために使用される。この対物レンズを使用して、又は他の２つの対物レンズを使用して、少なくとも１つの操作ビーム経路を介して、光強度を、好ましくは光シート平面の実質的に点状の区域内又は光シート平面を少なくとも一時的に含む特定の体積内のみにおいて試料に衝突させるための、光シートの生成とは独立した手段を、好ましくは排他的に実現することが可能である。図１の右側において、破線の四角により示される部分に、２つの操作光線９が示されており、それらの端は光シート内、及びそれゆえ検出用対物レンズＯ２の焦点面の中にあり、そこに特定の強度が衝突することになる。

光強度を試料１に衝突させるための手段について、各種の例示的実施形態を参照しながら以下により詳しく説明する。

図２は、操作が検出用対物レンズＯ２により行われる、すなわち操作用対物レンズが検出用対物レンズＯ２と同じである光シート顕微鏡のある実施形態を示している。試料キャリア２を有する試料ステージにはここで、３つすべての空間方向へと試料１を空間的に位置決めするための試料ステージコントローラ１０が設けられている。照明は、光シート顕微鏡にとって典型的な手段により行われる。照明レーザ１１は、照明波長を有する光を発する。ビーム整形ユニット１２の中で、ビームが整形され、それが光シートスキャナ１３へと案内され、これは準静的光シート生成及び光シートの位置決めの役割を果たす。光シートは、チューブレンズ１４及び対物レンズＯ１を介して試料１に結像される。ビーム整形ユニット１２は、所望の強度プロファイルを光ビーム上に、例えばガウス分布又はベッセルビームにしたがって転写する役割を果たし、これはすると、スキャニングにより、光シート平面に垂直な断面において光シートにも転写される。

検出される光は検出用対物レンズＯ２を通過し、第クロックビームスプリッタ１５を通過し、チューブレンズ１６を介してエリアスキャン検出器、例えばカメラ１７の一部へと結像される。検出された信号はその後さらに処理され、及び／又は表示される。

操作のために、刺激レーザ１８が使用され、その光は刺激スキャナ１９へと案内され、これはここで、ポイントスキャナの形態で具現化されており、単に装置の構成をコンパクトにする役割を果たすミラー２０の形態の偏向素子が相互接続されている。また別のレンズ２１と、レンズ１６に対応するチューブレンズ２２とを介して、操作光はダイクロイックビームスプリッタ１５を介して検出ビーム経路へと結合される。

図２に示される光シート顕微鏡の実施形態では、試料の点状操作が行われ、焦点は光シート平面に、又は光シート平面の上下の領域に設定でき、それによって事実上の空間操作が可能であるが、原理上、個々の点について連続的にしか行われない。このように焦点を光シート平面の外側領域に移動させるために、また別の調節可能な光学ユニット、例えばコリメータをビーム経路内の刺激レーザ１８と刺激スキャナ１９との間に挿入でき、それによって操作焦点は検出焦点とは独立して調節可能となる。刺激レーザ１８及び操作用光学ユニットを相応に構成することにより、図２に示される実施形態は多光子励起にも使用できる。１つ又は複数の別の光学素子、例えばマイクロレンズアレイを刺激レーザ１８と刺激スキャナ１９との間に組み入れて、レーザビームが各マイクロレンズアレイの前で拡張され、その後再びコリメートされるようにすることにより、図２に関連して使用されるポイントスキャナをマルチポイントスキャナへと変換できる。これはここでは図示されていない。

図３は、図面ａ）及びｂ）において、検出用対物レンズによって操作が行われる光シート顕微鏡の２つのまた別の実施形態を示している。図３ｂ）に示されるモジュールは、図３ａ）に示されるモジュールと取り換えることができ、どちらも同じ位置でビーム経路に結合され、ダイクロイックビームスプリッタ１５により特徴付けられる。ここで、構成は必ずしもモジュール式でなくてもよく、むしろ、２つの独立した光シート顕微鏡を製作でき、これらを相互に融合させることはできない。図２に示される装置では、ポイントスキャナの場合、試料の実質的に点状の区域に光強度が時間的に連続して衝突し、又はマルチポイントスキャナの場合、複数のそのような点状区域に光強度が時間的に連続して衝突し、いずれの場合も、多数のそれらに同時に光強度が衝突するが、図３ａ）、ｂ）に示される装置では、試料内の強度パターンの空間生成が可能であり、すなわち、これらは多数の実質的に点状の区域への光強度の同時衝突が可能で、各点は他の点とは独立して衝突され、点は平面だけでなく、ある体積内で空間的にも分散させることができる。

図３ａ）に示される実施形態において、操作手段は、特定の強度分布を試料に衝突させるための第１の空間光変調器２３を含む。使用される光源はここでも刺激レーザ１８である。光の位相は空間光変調器２３を使って変更されるため、空間光変調器（ＳＬＭ）２３は瞳面内に配置しなければならず、したがって、結像のためにはワイドレンズ２４が必要となる。それに加えて、この装置はまた、テレスコープ２５を含み、それによってＳＬＭ ２３の瞳の照明を利用できる。偏光を利用するために、任意選択的に、偏光素子２６、例えば偏光器又は１／２波長板をビーム経路内に配置できる。図３ｂ）の場合、ＳＬＭ ２３の代わりに、デジタルマイクロミラーアレイ（ＤＭＤ）２７が使用され、この場合、レンズ２４をなくすことができ、それは、強度の操作が、その目的のために操作ビーム経路の中間像面内に配置されたＤＭＤ ２７によって直接行われるからである。この場合に使用される光源はここでも刺激レーザ１８とすることができるが、原理上、インコヒーレント光源２８も使用でき、例えばこれは、特にＵＶ範囲の典型的なランプ、又はＬＥＤである。ＤＭＤ ２７は、強度パターン、すなわち平面内、好ましくは光シート平面に平行な平面又は光シート平面内の特定の強度分布を生成するために使用される。

図３ａ）に加えて、操作手段は特定の強度分布に特定の振幅分布を付与するための第２の空間光変調器（ここでは図示せず）を含むことができる。

図４は、操作が検出ビーム経路によって行われる光シート顕微鏡のまた別の構成を示す。この実施形態において、空間光変調器２３は、所定の強度又は振幅分布を試料上に衝突させるため、且つ補正素子として具現化される第１の領域２９と、検出ビーム経路内の補正素子として具現化される第２の領域３０とを含む。検出されるべき光を第２の領域３０へと、また操作に使用される光を第１の領域２９へと偏向させるための偏向手段がここで提供される。この場合、検出用対物レンズＯ２内の波面マニピュレータ７はなくすことができる。光が試料キャリア２を有する分離層システムを斜めに通過することに起因する収差の補正のみの役割を果たす位相パターンは、この場合、第２の領域３０内のＳＬＭ ２３に転写され、操作に使用される光はこの第２の領域３０には入射せず、それを通り過ぎるように偏向される。試料内に設置されるべき空間強度分布の位相パターンは、ＳＬＭ ２９の第１の領域２９に転写され、さらに、斜めの光の通過の補正のための位相パターンも同様である。ビームの進み方が図４に示されている。検出されるべき光は、破線で示されており、刺激レーザ１８の操作光は実線で示される。偏向手段はここで、ダイクロイック素子３１を含み、その活性光学面は、相互に関して平行で、好ましくは空間光変調器２３の活性光学面に垂直に配置される。同様にダイクロイック素子３１の活性光学面に平行に配置された鏡面を有する２つの平面ミラー３２、３３は、操作に使用される、及び検出されるべき光がそれぞれダイクロイック素子３１に２回向けられるようにビーム経路を案内するために使用される。ダイクロイック素子３１を使って（その厚さは、ＳＬＭ上の部分ビーム経路の必要なビームオフセットに基づいて決定され、ビームオフセット自体はＳＬＭの活性面の大きさに依存する）、第１の領域２９への、及び第２の領域３０への偏向が実現される。それに加えて、２つのまた別のレンズ３４及び３５は、検出ビーム経路内に配置され、これは４ｆ結像系を実現し、追加の構成要素、すなわち偏向手段を収容するためのスペースが創出される。

操作が検出用光学ユニットにより行われる、光シート顕微鏡の特に好ましい構成が図５に示されている。操作手段はここで、刺激レーザ１８を用いるＳＬＭ ２３と２つの光源２８、２８ａを用いるＤＭＤ ２７の両方を含み、２つの光源は、光源切り換えミラー３６を介して、ＤＭＤ ２７を照明するためのビーム経路に任意選択的に結合できる。ＤＭＤビーム経路の場合、テレスコープシステム２５はレンズのみで記号化され、これはコンデンサも表すことが意図される。ＤＭＤ ２７とチューブレンズ２２との間に、また別のレンズ３７が配置され、これはＤＭＤ ２７をレンズ３７とチューブレンズ２２との間に位置する中間像面に結像する。図５による実施形態において、光シート顕微鏡はそれに加えて、切り換え手段、スイッチングミラー３８を含み、これは操作手段を選択するためのビーム経路内の対応する調節／回転により中心要素としての役割を果たす。ＤＭＤ ２７のみかＳＬＭ ２３のみのいずれかが操作手段として接続され、又は両方組み合わせて接続される。特に、ＳＬＭ ２３及びＤＭＤ ２７がビームコンバイナ３８ａを使って同時にビーム経路に結合される後者の場合は操作速度を高めることができるが、これは約１ｋＨｚの周波数のＤＭＤは、約６０Ｈｚでの切り換えが可能な効率的なＬＣｏＳ ＳＬＭより高速であるからである。相応の位相パターンを使用すると、ＳＬＭ ２３は例えば、ＲＯＩ（注目領域）としての複数の空間的に範囲が限定された区域を画定でき、するとこれは、ＤＭＤ ２７によって素早く個別にオンとオフを切り換えることができる。

他の可能性（図示せず）も、ＳＬＭ若しくはＤＭＤ又は複数のＳＬＭ及びＤＭＤによる所望のパターンの生成と、パターン間の高速切り換えのためのスキャニングシステムの使用とにある。

図５に示される例において、光源スイッチングミラー３６は、ここでＤＭＤ ２７を照明することのできる２つの光源の一方を選択するために使用される。２つの光源、例えばレーザ及び従来のランプのみから選択しようとする場合、強度分布を生成するためにＤＭＤ ２７を使用するケースでは、光源とＤＭＤ ２７が特定の位置に相互に関して配置されていれば、このような光源スイッチングミラー３６をなくすことが可能である：ＤＭＤ ２７はマイクロミラーのアレイを有し、これらは、それぞれマイロクミラーがその上に配置されるＤＭＤ ２７の底部の法線から測定した場合の２つの固定角度、例えば第１の「オン」状態の－１２°の角度と第２の「オフ」状態の＋１２°との間で切り換えられる。光源又はそのビームステアリングが、ＤＭＤ ２７が「オン」状態の一方の光源によって、及び「オフ」状態の他方の光源によって照明され、また別の操作ビーム経路が当初はＤＭＤ ２７の底部の法線の方向に従うように配置されていれば、光源スイッチングミラー３６は不要である。しかしながら、図５に示される変形型のケースのように、使用可能な光源の選択肢を増やすために１つ又は複数の光源スイッチングミラーと組み合わせることができる。

操作手段はまた、専用の操作用対物レンズを含むこともでき、これはすると、試料の上に、すなわち試料キャリア２の反対側に配置される。この例は図６ａ）～ｃ）の原理図に示されている。操作用対物レンズＯ３はここで、その光軸が基準面３の法線と平行になるように配置される。しかしながら、これは必須ではなく、操作用対物レンズＯ３は前記法線に関していずれの所望の角度でも配置でき、特に、その光軸が照明用対物レンズＯ１の光軸４又は検出用対物レンズＯ２の光軸５に平行となるような向きにすることができ、操作用対物レンズＯ３の光軸はまた、照明用対物レンズＯ１の、又は検出用対物レンズＯ２の光軸のうちの一方と一致させることもできる。図６ａ）は、図２と同様にポイントスキャナと共に専用の操作用対物レンズＯ３を使用した場合を示しており、その中に示される構成に関して行われた記述は、実質的にこの構成にも当てはめることができる。同様に、図６ｂ）に示される、ＳＬＭ ２３を備える実施形態は図３ａ）の実施形態に対応し、図６ｃ）に示される、ＤＭＤ ２７を備える実施形態は図３ｂ）に対応する。ここで、検出用対物レンズについて図５に関連して説明した組合せと同様に、複数の操作の可能性の組合せも可能である。上記の操作の場合、カバーガラスで閉じられる試料容器が使用されず、操作用対物レンズが基準面の法線に関してゼロ以外の角度に向けられていないかぎり、上述の操作の場合、補正素子をなくすことができる。

操作に関して、原理上、２つの場合を区別しなければならず、これについて専用の操作用対物レンズＯ３による上からの操作に基づいて以下に説明するが、これは検出又は照明用対物レンズによる操作にも同様に当てはまる。操作強度（manipulation intensity）が光シートシステムによって実質的に点状の区域に衝突する、体積の高速結像の場合、操作及び結像のシーケンスを体積によって規定することができる。この場合、試料体積内で操作デバイスにより生成される光分布の効果はまた、前記体積の結像のタイムスケールでも観察できる。すると、操作は光シート平面内でも体積領域でも、検出用対物レンズＯ２による操作に関して説明した操作と同様に行うことができる。しかしながら、操作放射の効果を観察する際のタイムスケールが短すぎて、操作をカメラフレーム内で、すなわち照明用対物レンズＯ１により生成され、検出用対物レンズＯ２により検出される光シート内で直接観察しなければならない場合、図６ａ）の破線の四角で示されているように操作用対物レンズＯ３により試料上に転写される強度分布が確実に光シート平面内にあるようにしなければならい。図６ａ）の場合、これはポイントスキャナの高速フォーカシングによって、例えば操作用対物レンズＯ３のインターナルフォーカシングによって、チューブレンズ２２の変位によって、素早く変形できるレンズ、例えばＯｐｔｏｔｕｎｅ社のレンズＥＬ－１０－３０の使用によって、又は変形可能ミラー等の適応型光学素子によって実行できる。ＳＬＭの場合、光シートの平面内にある、対応する空間強度分布を特定できる。

操作はまた、照明用対物レンズＯ１によっても行うことができ、この場合、照明用対物レンズの開口数は一般に、検出用対物レンズＯ２のそれより低い。しかしながら、例えばＦＲＡＰ（光褪色後蛍光回復法）等の幾つかの方法では、より高いＮＡが必要ではなく、操作のために照明用対物レンズＯ１を使用できる。専用の操作用対物レンズＯ３を使用する操作の場合と全く同様に、ここでも２つの場合を区別しなればならない。第１の場合、光シートシステムによる体積の結像は非常に速いため、操作と結像のシーケンスを体積によって規定することができる。試料体積内で操作デバイスにより生成される光分布の効果はまた、前記体積の結像のタイムスケールでも観察できる。この場合は図７ａ）に示されている。選択された試料体積３９において、特定の時点で、光強度は試料の空間的に分散された実質的に点状の区域に衝突し、例えばこれは、逆フーリエ変換アルゴリズムを使って空間光変調器に転写される位相パターンへと変換される特定の強度分布である。これは、図８に関して説明するように、例えば光シート顕微鏡を使って実現できる。

第２の場合、操作放射の効果を観察する際のタイムスケールが短すぎて、操作をカメラフレーム内で、すなわち照明用対物レンズＯ１により生成され、検出用対物レンズＯ２により検出される光シート内で直接観察しなければならない。これは図７ｂ）に示されており、図中、点状区域は光シートの線として見ることができ、これらは図７ａ）の体積内で十字の形態で分散される。

前述のように、図８は、操作用対物レンズが照明用対物レンズＯ１と同じである光シート顕微鏡を示す。操作手段はここでも、ＳＬＭ ２３と、それに関連する光生成及び結像用光学ユニットとを含む。照明ビーム経路内への入力結合は、ダイクロイックビームスプリッタ４０を介して行われる。

空間光変調器は、高価で技術的に複雑な構成要素である。この理由から、操作が照明用対物レンズＯ１により実行される場合に、光シートの生成と広角のホログラフ方式による強度分布の特定の両方に１つの同じＳＬＭを使用することが有利である。操作用対物レンズが照明用対物レンズＯ１と同じである、図９及び図１０に示される好ましい構成では、照明用光学ユニットは空間光変調器４１を含み、その上で特定の強度分布又は振幅分布を試料に転写させるための位相パターンが操作領域４２に転写され、また、その上で光シート形成ための位相パターンが光シート生成領域４３に転写される。どちらの領域も相互に独立して動作可能であり、すなわち、同じ要素が使用されていても、光シートの生成を操作とは独立して引き続き行うことができるが、このことは絶対的に必要というわけではない。図４に関連して説明した装置と同様に、ＳＬＭ ４１はここでも補正素子として機能し、すなわち、光が斜めに通過することにより生じる収差を補正するための相応の位相パターンをさらにその上に転写できる。操作のための光が操作領域（４２）のみに向けられ、光シート生成のための光が光シート生成領域（４３）のみに向けられるようにするために、照明用光学ユニットは、スペクトル分解も行うことのできる相応の偏向手段を含み、これは一般に、光シートの生成のためと操作のためにはそれぞれ異なる波長が使用されるからである。

ＳＬＭ ４１が光シートの生成及び強度分布のために使用される光シート顕微鏡の２つの例が図９及び１０に示されている。刺激レーザ１８が照明レーザ１１とは異なる波長を発することが前提条件であり、それは、これがビーム分離に使用されるからである。まず、両方の光源の光はダイクロイックビームコンバイナ４４により結合され、その後、図９のダイクロイックビームスプリッタ４５により、又は図１０のダイクロイックビームスプリッタ４６により分割され、図９に示される構成では、図４に関連して説明した装置と同様に、ダイクロイックビームスプリッタ４５の厚さは偏向の目的のために使用される。照明に使用される光は、光シート生成領域４３へと向けられ、特定の強度分布を生成するために使用される刺激レーザ１８の操作光は、ＳＬＭ ４１の操作領域４２へと向けられる。次に、両方の光ビームは、図９に示されるように結合されるか、又は図１０に示されるように、また別のダイクロイックビームスプリッタ４７へと平行に案内される。ＳＬＭ ４１の照明の場合、レーザビームは相応のレンズの組合せ（図示せず）により拡張され、それによってこれらはＳＬＭ ４１上のそれぞれの領域を均一に照明する。ＳＬＭ ４１の、光シート形成のための位相パターンを含む領域、すなわち光シート生成領域４３は、さらに結像される場合、照明用対物レンズＯ１のイメージングの中間像面４８内に位置付けられなければならない。他方で、操作領域４２は、照明用対物レンズＯ１のイメージングの瞳面４９の中に位置付けられなければならない。ＳＬＭ ４１のどちらの領域もそれゆえ、異なる方法で具現化されなければならず、これは、操作光と照明光のためのビーム経路を再び分割するまた別のダイクロイックビームスプリッタ４７により実現できる。第１の光学ユニット５０を使用することにより、操作領域４２は照明用対物レンズＯ１の瞳面４９に結像される。光シート生成領域４３は、それによって操作領域４２もまた結像される第２の光学ユニット５１によってのみ、光シートスキャナ１３及びスキャニングレンズ５２を介して照明用対物レンズＯ１の中間像面４８に結像される。２つの波長は再び、ダイクロイックビームコンバイナ５３を使って重ねられる。

図９及び図１０による実施形態は実質的に、色分離の方法においてのみ実質的に異なる。図９は、図４と同様の解決策を示しており、ビームは常に重ねられるが、空間光変調器４１で十分に分離できるように、比較的厚い基板上のダイクロイックビームスプリッタ４５を必要とする。レーザの異なる波長は、例えば共通の光ファイバ５４によって案内することができ、操作及び／又は光シート生成のために複数の光波長を使用することも可能である。これに対して図１０は、異なる波長の光学ビーム経路に沿った異なる経路への、別の典型的な分離を示している。

操作領域４２の瞳面４９への結像をなくすことも可能であり、すなわち、操作のために、中間平面４８内に結像されるＳＬＭ ４１を使用することも可能である。操作領域４２は光シート生成領域４３から分光的に分離されていることが前提条件である。他の可能性は、操作が高速で逐次的に進められるようにすることであり、この場合、特定の強度分布と光シート生成のためのパターンとを、それぞれのレーザ波長の切り替えと時刻同期的に切り換えるだけでよい。しかしながら、このようにして、試料内で生成可能な強度分布は、数の点で大きく限定される。

また、原理上、検出用対物レンズＯ２による操作も、光シート生成領域４３及び操作領域４２の２つの領域に分割されるＳＬＭ ４１を使って行うことができるが、この場合、ビームの案内は照明用対物レンズＯ１による操作の場合より幾分複雑である。

検出用対物レンズＯ２による操作の図２の場合又は専用の操作用対物レンズＯ３による操作の場合の図６ａ）の場合のように、操作手段は、たとえ照明用対物レンズが操作用対物レンズと同じ場合でも、試料の個別の実質的に点状の区域に光強度を時間的に連続して衝突させるためのポイントスキャナを含むことができる。しかしながら、このようなポイントスキャナは逐次的に動作し、非常に高速の光シートイメージングの場合、ある露光シーケンス内で光シートのきわめて限定的な数の位置しか対象にできず、これは特に、強度分布の位置決めを軸方向に、すなわち照明用対物レンズＯ１の光軸４に沿って、そしてその結果、リフォーカシングによって行わなければならないからである。したがって、試料の検査の場合に初めに逐次的に操作放射を当てる、すなわち光シートに沿って逐次的に、特定の点で光軸に沿って強度分布を当て、その後、光シートで試料１のこの実質的に平坦な体積を素早く結像させることが有利である。光シートスキャナ１３及び刺激スキャナ１９は相互に独立して動作するため、光シート結像中に、光シートの前又は後で所望の時間的及び／又は空間的インタバルにより操作を実行することも可能である。

特に、ここで、操作光の光源、波長、及び強度が二光子及び多光子遷移を励起させるように設計されていれば有利であり、このようにして、試料への相応の強度（intensity）の衝突をそれぞれの焦点に限定させることが可能であり、なぜなら、線形励起の場合に、ポイントスキャナのガウシアンビームが照明用対物レンズＯ１の光軸４に沿って試料１の中に完全に、また特定の状況では相互作用的に侵入するからである。

多光子励起のポイントスキャナを使用する場合、操作軸に沿った軸方向の限定はまた、時間的フォーカシングによっても実現できる。これは、図１１において、例えば光シート顕微鏡について示されている。時間的フォーカシングはここで、スキャニングにより生成される光シートにおいて実行される。操作のための強度が衝突する位置を介した制御は、光シートのスキャンにより横方向に行われ、これは図１１において上から見た状態で示されている。光シート軸に沿った、すなわち照明用対物レンズＯ１の光軸４に沿った焦点の位置は、ＳＬＭを使って、及び刺激レーザ１８の群速度分散制御を用いた時間的フォーカシングによって特定される。このようにして、例えば図１１において上から見た状態で示される光シート内の３つの焦点５５に強度を逐次的に当てることが可能である。

もちろん、図１２に示されるように、試料の区域に１方向からでなく複数の方向から強度を衝突させることも同様に可能であり、この場合、操作用対物レンズＯ３、検出用対物レンズＯ２、及び照明用対物レンズＯ１の３つの対物レンズのすべてが試料への光強度の衝突に使用される。すると、異なる操作方法及び／又は異なる波長を異なる方向から使用することが可能となる。例えば、検出用対物レンズＯ２によりＤＭＤ及び第１の波長を使って２次元領域を同時に生成でき、操作用対物レンズＯ３によりＳＬＭを使って空間的に分散された区域を逐次的に生成できる。ＤＭＤは、光シート平面内での高速スキャンを想定でき、これは、レーザ源としてはほとんど利用できない、例えばＵＶ範囲内の波長のインコヒーレント光源でも実現できる。すると、その位相パターンが試料に操作用対物レンズＯ３により強度分布として衝突するＳＬＭは、他の波長で空間的区域を逐次的に操作することが可能となる。

２つ以上の操作用対物レンズを有する光シート装置はまた、操作放射をコヒーレントに重ねる可能性、すなわち試料に光強度を実質的に点状の区域に２又は３方向から衝突させる放射も提供する。この場合、例えば検出用対物レンズＯ２及び操作用対物レンズＯ３が共通の光軸を有していれば有利である可能性があり、これは、その場合、対向する波面が干渉し得る光シート平面内の強度分布の範囲をできるだけ小さくできるからである。操作用対物レンズＯ３は、そのためには、例えば試料がその中に配置される試料溶液（図１２では図示せず）の中に浸漬させることができる。コヒーレンス合成については、一緒に使用される刺激レーザ１８は検出用対物レンズＯ２及び操作用対物レンズＯ３のための対応するビーム経路上で（over）分割されなければならない。

共通の光軸を持たない対物レンズペアが使用される場合、ＣＡＲＳ等のポンプ－サンプル方式を使用することも可能であり、ポンプ放射及びサンプル放射がここで、装置の異なる対物レンズを通って案内することができる。所望の相互作用はポンプ放射及びサンプル放射の重複領域でのみ発生するため、これによって区域をさらに限定することが可能となる。

前述のように、操作に使用される対物レンズの光軸の方向への強度分散の限定は、特に相応の光強度を試料に衝突させるためにポイントスキャナを使用するとき、多光子励起を使って非常に有利に設定でき、それはここで、集光されたビームが常に存在するからである。空間光変調器及び／又はＤＭＤの使用に基づく広角での顕微鏡法では、所望の操作パターンによっては、ポイントスキャナを使用する場合より存在する集光されたビームが少ないが、この場合、時間的フォーカシングを使用すると、広角での伝播方向への操作及び強度分散を限定することも可能となる。このようにして、ポイントスキャニング二光子顕微鏡法の場合に、励起の二次強度依存と強力な集光との組合せにより発生する深さ識別の効果は、広角イメージングでも実現できる。

図１３は、検出用対物レンズＯ２による操作のために多光子励起が使用される相応の装置を示す。フェムト秒短パルスレーザ５６はここで、操作光源として使用される。例えば、チタンサファイアレーザを使用できる。テレスコープ２５を使用して、そのビームは、できるだけ完全にＳＬＭ ２３を照明するように相応に拡張される。試料内に特定の強度分布を生成するために、相応の空間位相パターンがＳＬＭ ２３に転写される。位相パターンの第１のフーリエ変換像がレンズ５７を介して、相応に具現化された回折格子５８に結像される。回折格子５８は、検出ビーム経路内の中間像面内に配置され、チューブレンズ２２及び検出用対物レンズＯ２により、補正素子、ここでは波面マニピュレータ７を使って試料に結像される。回折格子５８でのパルスのスペクトル分解により、照明の軸方向の限定は、試料内の所望の点状区域に限定された、時間的フォーカシングにより行われる。

個々のレンズ５７の代わりに、ＳＬＭ ２３の位相パターンはまた、２つのレンズ６０及び６１を用いる４ｆ装置５９を介して格子に結像させることもできる。この４ｆ装置５９の瞳面にある位相素子６２により、回折した放射に関してπのゼロ次回折の位相シフト又はその逆が生じる。このようにして、位相パターンは４ｆ結像系の後に回折格子５８上の強度分布へと直接変換される。

上述の光シート顕微鏡の場合の結像は一般に、２つの方法で行うことができる。

試料スキャンとして知られているものにおいては、照明用対物レンズＯ１及び検出用対物レンズＯ２が一定の位置に固定され、光シートが光シートスキャナ１３を介して検出用対物レンズＯ２の焦点面に位置決めされる。すると、試料は試料ステージコントローラ１０を介して、図１の破線の画像部分に示されている方向に案内される。

光シートスキャンとして知られているものにおいては、試料１は一定の位置に固定されたままで、光シートを結像のためにスキャンしなければならない。光シートを移動させたときに確実に焦点がずれないようにするために、光シートのビームウェストが結像領域の中央に留まるように検出用対物レンズＯ２を調節しなければならず、また照明用対物レンズＯ１も同様である。その代わりに、ビームウェストは、インターナルフォーカシング等、他の種類のフォーカシングによって調整することもできる。

図１４は、操作及び結像の異なる時間及び空間シーケンスを示す。図１４ａ）は、光シート平面内での同時の操作及び結像を示している。操作に使用される光強度はここで、ある時点ｔで光シート平面内に当てられ、その効果をこの平面内ですぐに観察できる。この手順は、試料スキャンの場合及び光シートスキャンの場合に、検出用対物レンズＯ２により、平面操作(planar manipulation)を使って、例えばＤＭＤを利用して、すなわち例えば図３又は図４に示される装置を使って、最もよく実現できる。

図１４ｂ）は、空間的及び時間的両方の操作及び結像の逐次的シーケンスを示す。まず、特定の空間強度分布が観察対象体積内の所望の実質的に点状の区域（十字で示される）に当てられ、その後、試料内の長方形の四角で示されるこの観察対象体積は、おそらく複数回結像され、操作の効果の時間的進展が観察される。この手順は、試料スキャンの場合と光シートスキャンの場合とのどちらにおいても、空間操作を可能にする、原理上、前述の変形型のすべてで使用でき、これは、逐次的シーケンスによる操作にいかなる制約もないからである。

図１４ｃ）に示される折衷的手順において、操作放射は結像用光シートのスキャン中に、所望の時点で、及び／又は光シート内の、その前及び／又はその背後の所望の位置に導入される。さらに、空間操作体積を、その体積を結像させながら連続的に適合させることにより、このような試料の非常に高速な形態変化を補償するか、又は操作強度を当てるための光シート位置のための２つの異なる体積を生成することも可能である。

光シート顕微鏡のための上述の装置により、操作と同時の特に非侵襲的な試料の観察が可能となる。

１ 試料
２ 試料キャリア
３ 平面基準面
４、５ 光軸
６、７ 波面マニピュレータ
８ 光伝送システム
９ 操作ビーム
１０ 試料ステージコントローラ
１１ 照明レーザ
１２ ビーム整形ユニット
１３ 光シートスキャナ
１４ チューブレンズ
１５ ダイクロイックビームスプリッタ
１６ チューブレンズ
１７ カメラ
１８ 刺激レーザ
１９ 刺激スキャナ
２０ ミラー
２１ レーザ
２２ チューブレンズ
２３ 第１の空間光変調器（ＳＬＭ）
２４ レンズ
２５ テレスコープ
２６ 偏光素子
２７ デジタルマイクロミラーアレイ（ＤＭＤ）
２８、２８ａ 光源
２９ 第１の領域
３０ 第２の領域
３１ ダイクロイック素子
３２、３３ 平面ミラー
３４、３５ レンズ
３６ 光源スイッチングミラー
３７ レンズ
３８ スイッチングミラー
３８ａ ビームコンバイナ
３９ 試料体積
４０ ダイクロイックビームスプリッタ
４１ 空間光変調器
４２ 操作領域
４３ 光シート生成領域
４４ ダイクロイックビームコンバイナ
４５、４６ ダイクロイックビームスプリッタ
４７ また別のダイクロイックビームスプリッタ
４８ 中間像面
４９ 瞳面
５０ 第１の光学ユニット
５１ 第２の光学ユニット
５２ 操作レンズ
５３ ダイクロイックビームコンバイナ
５４ 光ファイバ
５５ 焦点
５６ フェムト秒レーザ
５７ レンズ
５８ 回折格子
５９ ４ｆ装置
６０、６１ レンズ
６２ 位相素子
Ｏ１ 照明用対物レンズ
Ｏ２ 検出用対物レンズ
Ｏ３ 操作用対物レンズ

Claims (12)

1. 光シート顕微鏡であって、
   － 媒質内に入れて、平面基準面（３）に平行な試料キャリア（２）の上に置かれた試料（１）を、照明ビーム経路を介して、光シートであって、前記基準面（３）の法線とゼロ以外の照明角度をなす光シート平面を有する光シートで照明するための照明用光学ユニットと、
   － 前記試料キャリア（２）の領域において前記基準面（３）の法線とゼロ以外の検出角度をなす光軸（５）を持つ検出ビーム経路を有する検出用光学ユニットと、
   － 特定の厚さの特定の材料から製作され、前記照明用及び検出用光学ユニットから前記媒質を分離する少なくとも１層を持つ分離層システムであって、少なくとも照明及び検出のために到達可能な領域において、前記基準面（３）に平行な底面によって前記媒質と接触する分離層システムと、
   － 検出されるべき光又は前記試料（１）を照明するための光が前記分離層システムの界面を通じて斜めに通過することにより生じる収差を軽減させるための、前記照明及び／又は前記検出ビーム経路内の少なくとも１つの補正素子と、
   を含む光シート顕微鏡において、
   － 前記光シート顕微鏡は、前記試料（１）に、前記光シート平面内の実質的に点状の区域、又は前記光シート平面を少なくとも一時的に含む特定の体積において、少なくとも１つの操作ビーム経路を介して光を衝突させるための、前記光シートの生成とは独立した、操作のための手段を含み、
   前記照明用光学ユニットは照明用対物レンズ（Ｏ１）を含み、前記検出用光学ユニットは検出用対物レンズ（Ｏ２）を含み、
   前記操作のための手段は、特定の強度分布の光を前記試料に衝突させるための第１の空間光変調器（２３、４１）及び特定の振幅分布の光を前記特定の強度分布の光に付加するための第２の空間光変調器を含み、前記第１の空間光変調器は瞳面内に配置されることを特徴とする光シート顕微鏡。
2. 前記照明用対物レンズ（Ｏ１）と前記検出用対物レンズ（Ｏ２）とは、同じ構成であることを特徴とする、請求項１に記載の光シート顕微鏡。
3. 前記操作のための手段は、前記操作ビーム経路内の操作用対物レンズ（Ｏ３）を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の光シート顕微鏡。
4. 前記照明用対物レンズ（Ｏ１）又は前記検出用対物レンズ（Ｏ２）のいずれか一方が、前記操作のための手段として操作を行うことを特徴とする、請求項１または２に記載の光シート顕微鏡。
5. 前記操作のための手段は、前記試料（１）の個別の実質的に点状の区域に時間的に連続して光を衝突させるためのポイントスキャナ又は、前記試料（１）の複数の実質的に点状の区域に時間的に連続して光を衝突させるためのマルチポイントスキャナを含み、そのそれぞれの点状の区域に光が同時に衝突することができることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の光シート顕微鏡。
6. 前記操作のための手段は、特定の強度分布の光を生成するためのデジタルマイクロミラーアレイ（２７）を含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の光シート顕微鏡。
7. 前記第１の空間光変調器（２３）、前記デジタルマイクロミラーアレイ（２７）、又はその両者の組合せの間を切り換えるためのスイッチング手段を含む、請求項６に記載の光シート顕微鏡。
8. 前記検出用対物レンズ（Ｏ２）が前記操作のための手段として操作を行い、
   前記第１の空間光変調器（２３）の第１の領域（２９）は特定の強度又は振幅分布の光を前記試料に衝突させるために、及び補正素子として具現化され、前記第１の空間光変調器（２３）の第２の領域（３０）は前記検出ビーム経路内の補正素子としてのみ具現化され、前記検出されるべき光を前記第２の領域（３０）へと、且つ前記操作に使用される前記光を前記第１の領域（２９）へと案内するための偏向手段が提供される、請求項１～７のいずれか一項に記載の光シート顕微鏡。
9. 前記偏向手段は、相互に関して平行に配置される活性光学面を有するダイクロイック素子（３１）を含み、前記検出ビーム経路は前記操作に使用され、検出されるべき前記光がそれぞれ前記ダイクロイック素子（３１）へと２回案内され、前記それぞれの領域への偏向は前記ダイクロイック素子（３１）の厚さにより実現されることを特徴とする、請求項８に記載の光シート顕微鏡。
10. 前記照明用対物レンズ（Ｏ１）が前記操作のための手段として操作を行い、
    前記照明用光学ユニットは前記第１の空間光変調器（４１）を含み、その上に前記光シートの生成のための位相パターンが光シート生成領域（４３）において転写され、特定の強度分布の光を前記試料に衝突させるための位相パターンが操作領域（４２）に転写されることと、前記照明用光学ユニットは、前記操作のための前記光を前記操作領域（４２）のみへと、且つ前記光シートの生成のための光を前記光シート生成領域（４３）のみへと偏向させるための手段を含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の光シート顕微鏡。
11. 操作用の光の光源、波長、及び強度は二光子及び多光子遷移を励起するように設計されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の光シート顕微鏡。
12. 操作に使用される前記光の強度の、前記操作ビーム経路の軸に沿った軸方向の局在化のために、時間的フォーカシングのための機構が提供されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の光シート顕微鏡。