CN112130306B - 运用于细胞分割下的cmos全息显微成像装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于显微镜成像技术领域，尤其是涉及运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法。运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置，所述成像装置包括：光源，用于发出照明光、且设于成像装置的光轴上，所述照明光为相干光源、或部分相干光源；样品台，用于放置成像样品；CMOS图像传感芯片，该芯片电性连接有计算机。本发明提供了一种基于传统无透镜显微技术，通过使用光强传输放来计算垂轴距离不同的三张图像的光强，获得中间图像的大致相位分布信息，再结合GS算法进行多次迭代获得与样本图像精确的震度和相位信息，最终能提高无透镜视场和系统极限分辨率的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法。
Description
技术领域
本发明属于显微镜成像技术领域，尤其是涉及运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法。
背景技术
无透镜全息显微成像是一种不需要借助透镜进行成像的数字显微技术。它基于Gabor同轴全息原理，利用面阵探测器采集原始全息图，随后通过数字图像处理技术重建样本，从而实现数字显微成像。传统无透镜技术再现结果分辨率受限于光电探测器像素大小，其分辨率于像素大小接近，同样的，受制于传感器制造工艺水平，传感器的像元尺寸不能无限小，所以无透镜显微镜的成像分辨率往往低于相机像元尺寸所决定的奈奎斯特采样分辨率。
如今无透镜显微术已经有很多报道的工作，关注的焦点无外乎如何更快得到分辨率更高图像：在分辨率提高方面，是以亚像素位移为代表的像素超分辨法；在快速处理图像数据方面，当下主要依靠神经网络与机器学习
如今对于细胞的研究，使用显微镜一般取得图像是400倍10X40，600倍10X60以及1000倍10X1000。但是对于细胞密集的图像，这样的分辨率还是不够的，这对于使用图像进行细胞分割的AI深度学习算法来说是相当困难的，分割效果会很不理想。这需要更高分辨率的图像才能提升细胞分割的精度。
在提高分辨率方面，超分辨当下的像素超分辨法需要精度较高平移台将样本移动亚像素位移的距离，这会给实验带来较高成本和负担，不便于集成化和商用化。而使用人工智能的方式进行超分辨率提升的方式又可能使图像失真，同时需要极高的运算成本，这也会给实验室带来较高的成本和负担。
对于无透镜显微成像，目前已有的超分辨率方法难以适应当前的生物医学领域非侵入式成像的需求，即在生物成像领域，生物样品进行染色等手段进行标记时将会对样品活性产生影响。但对大部分未染色的生物细胞样本而言，因其在可见光波段的弱吸收性，不能直接由相机直接采集得到，所以必须借助于相位信息成像。所以如何搭建出简单便捷且高效的超分辨率动态相位无透镜显微成像装置以及提出相应的方法成为了无透镜显微成像技术中必须克服的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于传统无透镜显微技术，通过使用光强传输放来计算垂轴距离不同的三张图像的光强，获得中间图像的大致相位分布信息，再结合GS算法进行多次迭代获得与样本图像精确的震度和相位信息，最终能提高无透镜视场和系统极限分辨率的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法。为此，本发明采用以下技术方案：
运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置，所述成像装置包括：
光源，用于发出照明光、且设于成像装置的光轴上，所述照明光为相干光源、或部分相干光源；
样品台，用于放置成像样品；
CMOS图像传感芯片，该芯片电性连接有计算机；
所述光源、样品台和CMOS图像传感芯片自上而下依次设置以形成成像装置，所述光源与样品台之间的轴向距离Z1为15～20mm，所述样品台与CMOS图像传感芯片之间的轴向距离Z2为5μm～2mm。
其中，Z1的数值设置不得低于15mm是为了防止在载物台上的样品距离光源过近，触碰到光源和阻挡光源的散射。不得大于20mm是防止光线散射，影响成像的效果，在15mm～20mm之间，成像效果最好。
Z2的数值设置不得低于5μm是为了防止样品台与CMOS图像传感芯片过近，碰触到CMOS图像传感芯片，不得大于2mm是为了防止距离过远导致照射到CMOS图像传感芯片阵面得光过少。5μm～2mm之间，成像效果最好。
在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案：
所述光源向下照射、且光源的下方还依次设有滤光片和透镜，所述样品台包括载物台、和设于载物台上的载玻片，所述CMOS图像传感芯片包括主体、设于主体底部的硅衬底、设于主体顶部的顶层金属和氧化硅覆盖层。
硅衬底的晶向估计不错，外延生长佳。其次硅衬底能起到保护作用，有较大的内阻。主体顶部的顶层金属和氧化硅覆盖层一个整体属于CMOS的钝化层，主要作用是有助于提高器件的稳定性和可靠性，有利于控制器件的漏电流和产生稳定栅氧化物，有效地防止器件性能退化，同时能减弱环境对器件表面的影响，包括防潮和避免划伤。
所述成像装置的尺寸为高≤15cm，长≤4cm，宽≤4cm。
所述CMOS图像传感芯片的大小在6mm*4.5mm。
进一步地，本发明同时还提供以下技术方案：
运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像方法，采用上述的成像装置，包括以下步骤:
S1、将成像样品放置于样品台上，并打开光源；
S2、调整样品台与CMOS图像传感芯片之间的距离，以使光源与样品台之间的轴向距离Z1大于样品台与CMOS图像传感芯片之间的轴向距离Z2，此时光源所发出的相干光与所述相干光在成像样品表面发生散射所形成的物波光在CMOS图像传感芯片的阵面叠加而产生干涉；
S3、依次改变光源与样品台之间的轴向距离Z1三次，分别获取三个不同轴向距离Z1的图像，运用光强传输方程获得中间图像的相位分布信息；
S4、使用GS算法对相位分布信息进行至少一次迭代，以获取成像样品的振幅和相位信息。
采用上述方法可提高无透镜视场和系统极限分辨率，这样的无透镜成像系统等效于一个放大倍率为1，数值孔径为1的传统光学显微镜，其最大分辨率取决于CMOS像素尺寸的大小。
其中，相干光的波为UR(x，y),照射样品台(即成像样品表面)发生散射形成的物波光的波为UO(x，y)，两种波在CMOS图像传感芯片的阵面叠加产生干涉。
光强传输方程为：
当光波在自由空间传播时，在菲涅耳区的光强与相位的关系应满足式(1)：
其中，k＝2π/λ,表示波数；I(r)表示聚焦面上的光强；
表示在横向方向r上的梯度算子；φ(r)表示物体的相位。TIE的左边是沿z轴方向的轴向光强微分，为了减少轴向光强微分高阶项的影响，轴向微分将采用多个平面的测量获取。而方程的右边是一个二阶椭圆偏微分方程。它可以在周期或简化的齐次边界下通过快速傅里叶变换(FFT)求解，也可以在非齐次Neumann边界条件下通过离散余弦变换(DCT)求解。TIE最初是Teague在傍轴条件下由亥姆霍兹方程推导得到的，而Teague推导出的TIE以及他的假设都是基于单色相干光的条件，因此TIE不能直接应用于部分相干光照明。在准单色光近似下，WDF应满足式(2)：
其中，r和u分别表示二维空间和空间频率的矢量；
表示在r上的梯度函数。当满足完全相干条件，式(2)可被简化成式(1)。部分相干光场下相位的梯度则自动与维格纳函数的一阶条件空间频率矩相关联，即式(3)：
式(2)和式(3)分别表示广义的光强传输方程形式和部分相干光下求解的相位。因此，不管是相干光场还是部分相干光场，定量相位都可以由TIE恢复。研究发现，无论光源大小，只要光源的分布相对于光轴是对称的，相位就可以被准确恢复。
GS算法为根据想要的图像K求出B应该叠加的相位，即计算全息图F。GS算法全称Gerchberg-Saxton算法，用于空间光场中的相位恢复。二维光场在物平面表示为：
其中ρ(x1，y1)表示入射场的二维振幅分布，
为相位分布。
像平面的出射光场表示为
入射光场和出射光场之间存在可逆变换关，正向变换为
E2(x2，y2)＝F[E1(x1，y1)]，反向变换为
E1(x1，y1)＝F-1[E2(x2，y2)]。
在相位恢复中，振幅分布ρ(x1，y1)和ρ(x2，y2)已知，GS算法采用多次迭代的方法求解未知相位分布
和
步骤S1中，光源与样品台之间的轴向距离Z1小于20mm。
步骤S3中获得中间图像的相位分布信息包括以下步骤：在集合光学模型下描述采集的散焦面光强分布于聚焦面光强分布之间的关系，利用图像插值法计算出模糊参数不同的散焦面的光强分布，将新得到的散焦图和采集的聚焦图代入光强传输方程以计算出相位。
步骤S4中的相位分布信息迭代包括以下步骤：将已知图像在各自光学面上的强度运用傅里叶变换进行计算。
图像插值是在基于模型框架下，从低分辨率图像生成高分辨率图像的过程，用以恢复图像中所丢失的信息。对于试验中使用的是双线性插值。双线性插值又称为双线性内插，在数学上，双线性插值是有两个变量的插值函数的线性插值扩展，其核心思想是在两个方向分别进行一次线性插值。广泛应用在信号处理，数字图像和视频处理等方面。
傅里叶变换表示能将满足一定条件的某个函数表示成三角函数(正弦和/或余弦函数)或者它们的积分的线性组合。在不同的研究领域，傅立叶变换具有多种不同的变体形式，如连续傅立叶变换和离散傅立叶变换。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用相干光源与物光在CMOS传感器阵面叠加产生干涉获取需要成像样本的相位信息，同时采用光强传输方程将三张垂轴上传播距离不同的图像中中间图像大致的相位分布信息，之后使用GS算法进行多次的迭代，获得样本精确的振幅和相位信息，提高无透镜视场和系统极限分辨率。本发明方法简单，制造和维护成本低，操作简单，只需要根据垂轴的不同操作载物台三次进行测量就可以提高图像的分辨率。有利于实现小型化、低成本、便携式显微成像检测系统，有效提高条件受限地区的医疗检测技术水平。
附图说明
图1为本发明运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法的装置结构示意图。
图2为本发明运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法的流程示意图。
图3为本发明运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法的实施例一成像结果图。
具体实施方式
结合附图，对本发明提供的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置及方法作进一步说明。
如图1所示，运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置，所述成像装置包括：
光源，用于发出照明光、且设于成像装置的光轴上，所述照明光为相干光源、或部分相干光源。
进一步地，光源向下照射、且光源的下方还依次设有滤光片和透镜，光源采用发光二极管。
样品台，用于放置成像样品，样品台包括载物台、和设于载物台上的载玻片。
CMOS图像传感芯片，该芯片通过数据线、或蓝牙连接有计算机，CMOS图像传感芯片包括主体、设于主体底部的硅衬底、设于主体顶部的顶层金属和氧化硅覆盖层。
进一步地，CMOS图像传感芯片的大小在6mm*4.5mm。
其中，光源、样品台和CMOS图像传感芯片自上而下依次设置以形成成像装置，光源与样品台之间的轴向距离Z1为15～20mm，样品台与CMOS图像传感芯片之间的轴向距离Z2为5μm～2mm。
进一步地，成像装置的尺寸为高≤15cm，长≤4cm，宽≤4cm。
实施例一，如图2所示，运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像方法，包括以下步骤:
S1、将成像样品放置于样品台上，并打开光源。
S2、调整样品台与CMOS图像传感芯片之间的距离，以使光源与样品台之间的轴向距离Z1大于样品台与CMOS图像传感芯片之间的轴向距离Z2，此时光源所发出的相干光与所述相干光在成像样品表面发生散射所形成的物波光在CMOS图像传感芯片的阵面叠加而产生干涉。
S3、依次改变光源与样品台之间的轴向距离Z1三次，分别获取三个不同轴向距离Z1的图像(20MM，18mm,16mm)，在集合光学模型下描述采集的散焦面光强分布于聚焦面光强分布之间的关系，利用图像插值法计算出模糊参数不同的散焦面的光强分布，将新得到的散焦图和采集的聚焦图代入光强传输方程以计算出相位。
S4、使用GS算法对相位分布信息进行至少一次迭代，将已知图像在各自光学面上的强度运用傅里叶变换进行计算，以获取成像样品的振幅和相位信息。
如图3所示，以染色的细胞为样品，图3中的图(a)为原始图像，图(b)光轴的第一张图像，图(c)光轴的第二张图像，图(d)光轴的第三张图像，图(e)输出全息显微成像结果图。
虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了图示和描述，但是，本专业普通技术人员应当了解，在权利要求书的范围内，可作形式和细节上的各种各样变化。
Claims (7)
1.运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像方法，其特征在于包括以下步骤:
S1、将成像样品放置于样品台上，并打开光源；
S2、调整样品台与CMOS图像传感芯片之间的距离，以使光源与样品台之间的轴向距离Z1大于样品台与CMOS图像传感芯片之间的轴向距离Z2，此时光源所发出的相干光与所述相干光在成像样品表面发生散射所形成的物波光在CMOS图像传感芯片的阵面叠加而产生干涉；
S3、依次改变光源与样品台之间的轴向距离Z1三次，分别获取三个不同轴向距离Z1的图像，运用光强传输方程获得中间图像的相位分布信息；
S4、使用GS算法对相位分布信息进行至少一次迭代，以获取成像样品的振幅和相位信息；
所述光源、样品台和CMOS图像传感芯片自上而下依次设置以形成成像装置，所述光源与样品台之间的轴向距离Z1为15~20mm，所述样品台与CMOS图像传感芯片之间的轴向距离Z2为5μm~2mm。
2.根据权利要求1所述的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像方法，其特征在于步骤S1中，光源与样品台之间的轴向距离Z1小于20mm。
3.根据权利要求1所述的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像方法，其特征在于步骤S3中获得中间图像的相位分布信息包括以下步骤：在集合光学模型下描述采集的散焦面光强分布于聚焦面光强分布之间的关系，利用图像插值法计算出模糊参数不同的散焦面的光强分布，将新得到的散焦图和采集的聚焦图代入光强传输方程以计算出相位。
4.根据权利要求1所述的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像方法，其特征在于步骤S4中的相位分布信息迭代包括以下步骤：将已知图像在各自光学面上的强度运用傅里叶变换进行计算。
5.运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置，其特征在于应用于如权利要求1-4中任意一项所述的成像方法，所述成像装置包括：
光源，用于发出照明光、且设于成像装置的光轴上，所述照明光为相干光源、或部分相干光源；
样品台，用于放置成像样品；
CMOS图像传感芯片，该芯片电性连接有计算机。
6.根据权利要求5所述的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置，其特征在于所述光源为LED光源，所述光源向下照射、且光源的下方还依次设有滤光片和透镜，所述样品台包括载物台、和设于载物台上的载玻片，所述CMOS图像传感芯片包括主体、设于主体底部的硅衬底、设于主体顶部的顶层金属和氧化硅覆盖层。
7.根据权利要求5所述的运用于细胞分割下的CMOS全息显微成像装置，其特征在于所述成像装置的尺寸为高≤15cm，长≤4cm，宽≤4cm。
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