CN105300941A - 一种荧光光片显微成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光光片显微成像系统及方法。所述荧光光片显微成像系统包括检测装置、校正装置、成像装置和控制装置，其中：所述检测装置用于检测活体样本内部的组织平面成像视场的各预设等晕区的波前像差畸变，并输送给所述控制装置，所述控制装置用于根据接收到的所述波前像差畸变，向所述校正装置发出校正指令，所述校正装置用于根据接收到的所述校正指令，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正，所述成像装置用于对波前校正后的所述组织平面成像。本发明有助于获得较大视场且高时空分辨率的深层的生物组织平面。

Description

一种荧光光片显微成像系统及方法

技术领域

本发明涉及一种显微镜系统，特别是涉及一种荧光光片显微成像系统及方法。

背景技术

1993年，VoieA.H.等人发明了光片显微镜(OrthogonalplaneFluorescenceOpticalSectioning，OPFOS)，它使用片层光横向照明透明生物组织，从而实现生物组织不同深度的显微成像。但由于当时的成像分辨率较低，且不能用来做活细胞测量，未在随后的十年中得到应用。直到2004年，HuiskenJ.和StelzerE.H.等人应用圆柱形透镜将入射激发光通过入射物镜聚焦到样本上并形成静态高斯光片，然后通过高数值孔径荧光物镜观测，建立了第一代静态荧光光片显微镜(SelectivePlaneIlluminationMicroscopy，SPIM)，并在之后的活体荧光成像中得到了应用。但是，第一代静态荧光光片显微镜的主要缺点是构造的光片厚度在8～10微米且不均匀，不能够做定量测量，且在成像组织深层时图像对比度下降很快。2008年，KellerP.J.和StelzerE.H.等人发明了第二代扫描型荧光光片显微镜。在该显微成像系统中，入射激发光通过管透镜和入射物镜在样本中形成一条聚焦的线，通过扫描反射镜和f-theta物镜使得聚焦光线在组织平面一维快速扫描，从而产生一个虚拟的光片，产生的受激发射荧光经由高数值孔径荧光物镜和中继透镜被超高灵敏度CCD(Electron-MultiplyingCCD，EMCCD)记录，被称为数字扫描型荧光光片显微镜(DigitalScannedLightSheetMicroscopy，DSLM)。随后2010年，KellerP.J.等人发明了将结构光照明(StructureLightIllumination，SIM)引入扫描型荧光光片显微镜中，提高了显微成像的空间分辨率，并观察到两种颜色标记下的细胞核和细胞膜动态变化。2012年，TomerR.等人发明了改进型的荧光光片显微镜系统，它通过左、右两侧物镜同时照明来产生更均匀的激发光片，并在样本的上、下两侧分别使用观测物镜尽可能多地收集受激发射荧光信号。运用上述扫描光片显微镜，近几年国内外多个研究机构开展了细胞生物学、发育生物学以及神经科学的活体成像研究。

由于荧光光片显微镜原理上是2D成像，其成像时间分辨率要显著优于共聚焦显微镜和双光子显微镜的时间分辨率。但是，荧光光片显微镜的空间分辨率会受到对激发光片的厚度限制以及成像组织的深度限制，使其低于共聚焦显微镜和双光子显微镜的空间分辨率。2014年，EricB.和KaiW.等人提出了基于成像视场各等晕区内波前畸变传感和校正的双光子荧光显微镜，使得清晰成像组织的深度达到了200多微米。但是，不同于逐点扫描模式的双光子显微镜，逐层扫描模式的光片显微镜并不适用上述的波前畸变传感和校正方法。为此，需要研究适用于大视场、高时空分辨率、深层生物组织的荧光光片显微镜的新型波前畸变传感和校正方法。

因此，希望有一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的至少一个上述缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光光片显微成像系统及方法来克服或至少减轻现有技术中的至少一个上述缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种荧光光片显微成像系统，所述荧光光片显微成像系统包括检测装置、校正装置、成像装置和控制装置，其中：所述检测装置用于检测活体样本内部的组织平面成像视场的各预设等晕区的波前像差畸变，并输送给所述控制装置，所述控制装置用于根据接收到的所述波前像差畸变，向所述校正装置发出校正指令，所述校正装置用于根据接收到的所述校正指令，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正，所述成像装置用于对波前校正后的所述组织平面成像。

进一步地，所述校正装置至少包括第一校正器和第二校正器，其中：所述第一校正器用于波前校正所述各等晕区的波前像差畸变相同部分，所述第二校正器用于波前校正所述各等晕区的波前像差畸变差异部分。

进一步地，所述检测装置至少包括荧光激发单元、第一波前传感器和第二波前传感器，其中：所述荧光激发单元可操作地向所述组织平面照射激发光或点，所述第一波前传感器用于接收所述组织平面经所述激发光照射后产生的受激发射荧光，并检测出该荧光位于所述各等晕区时的波前像差畸变，所述第二波前传感器用于接收并检测经由所述第一校正器波前校正后的所述各等晕区的剩余波前像差畸变。

进一步地，所述检测装置还包括第一位置调整单元和第二位置调整单元，所述第一位置调整单元和所述第二位置调整单元依次设于所述荧光激发单元和所述成像装置之间，并用于调整所述激发光照射在所述组织平面上的光斑位置。

进一步地，所述成像装置包括载物台、片光照明单元、显微物镜、会聚透镜和图像探测器，其中：所述载物台用于支承所述活体样本，且界定了所述活体样本的轴线以使大致安置在所述轴线上的样品成像；所述片光照明单元可操作以在与所述活体样本相交的所述组织平面内产生激发片层光；所述显微物镜和会聚透镜用于对波前校正后的所述组织平面放大成像在显微成像面，所述图像探测器的探测面与所述显微成像面重合。

进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第一远心成像光路和第二远心成像光路，所述第一远心成像光路具有第一出曈面和第二出曈面，所述第二远心成像光路具有第三出曈面和第四出曈面，所述第一出曈面设所述显微物镜的后出光端面，所述第三出曈面与所述第二出曈面垂直相交且交点处设所述第一位置调整单元，所述第四出曈面设所述第二位置调整单元。

进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第三远心成像光路和第四远心成像光路，所述第三远心成像光路具有第五出曈面和第六出曈面，所述第四远心成像光路具有第七出曈面和第八出曈面，所述第五出曈面与所述第四出曈面垂直相交且交点处设所述第二位置调整单元，所述第七出曈面与所述第六出曈面相交且交点处设所述第一校正器，所述第八出曈面设所述第一波前传感器。

进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第五远心成像光路和第一透/反切换器，所述第五远心成像光路具有第九出曈面和第十出曈面，所述第一透/反切换器位于所述第四远心成像光路中，并用于使所述荧光经所述第一透/反切换器能够透射到达所述第一波前传感器以及使所述荧光或所述激发片层光经所述第一透/反切换器能够反射到达所述第四远心成像光路的另一所述第八出曈面，所述另一第八出曈面后方预设距离的所述第九出曈面设所述第二校正器，所述第十出曈面设所述第二波前传感器。

进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第二透/反切换器，所述第二透/反切换器位于所述另一第八出曈面在所述第五远心成像光路中的像面上，并用于使所述荧光经所述第二透/反切换器能够透射到达所述第二波前传感器以及使所述激发片层光经所述第二透/反切换器能够反射到达所述图像探测器。

进一步地，所述图像探测器沿其光轴前后移动能够接受并检测所述第二透/反切换器所在的出曈面的波前像差畸变，该波前像差畸变也可由所述第一校正器进行波前校正。

进一步地，所述第一远心成像光路的第一透镜、第二远心成像光路、第三远心成像光路和第四远心成像光路的焦距均为f，所述第五远心成像光路的焦距均为1.5f，所述另一第八出曈面与所述第九出曈面的预设距离为0.5f，所述第二透/反切换器与所述另一第八出曈面的距离为6f，所述第一远心成像光路、第二远心成像光路、第三远心成像光路、第四远心成像光路和第五远心成像光路还分别具有像面、出曈面以及后出瞳面，各所述像面成共轭关系，各所述出曈面成共轭关系，各所述后出曈面成共轭关系。

本发明还提供一种采用如上所述的荧光光片显微成像装置的荧光光片显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)检测活体样本A内部的组织平面A1成像视场的各预设等晕区的波前像差畸变；2)根据接收到的所述波前像差畸变，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正；3)对波前校正后的所述组织平面A1成像。

进一步地，步骤2)具体包括：21)波前校正所述各等晕区的波前像差畸变相同部分；22)波前校正所述各等晕区的波前像差畸变差异部分。

应用发明提供的技术方案，首先将组织平面预设(划分)为多个等晕区，然后检测各预设等晕区的波前像差畸变，最后对每一个等晕区的波前像差畸变实施至少一次的波前校正，因此，本发明有助于获得较大视场且高时空分辨率的深层的生物组织平面。

附图说明

图1为本发明所提供的荧光光片显微成像系统一实施方式的结构原理示意图；

图2a为等晕区划分的一实施方式的分布示意图；

图2b为等晕区划分的另一实施方式的分布示意图；

图3为根据图2a的等晕区点扫描累积下的S-H波前传感示意图；

图4为显微镜出瞳面的远心成像光路的原理示意图；

图5为本发明所提供的荧光光片显微成像系统的具体实施方式的结构示意图。

附图标记：

具体实施方式

在附图中，使用相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

在本发明的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

如图1和图5所示，本实施方式中所采用的生物样本是活体样本A，并通过本实施方式所提供的荧光光片显微成像系统欲获得生物组织平面A1的成像。组织平面A1指的是活体样本A的身体内部几百微米深层处的一个平面，比如横向平面，也可以是纵向平面，甚至是横向与纵向之外的某一个平面，类似于被平面切开的生物样本的被切面，但是目前常见的被平面切开的生物样本均处于死亡状态，而本实施方式却是在生物样本保持正常生命体征的状态下，实现对待测的组织平面A1所进行的成像。但是，一旦组织平面A1被激发光照明后，该层面上的受激发射荧光经由后续光学成像器件到达图像探测器的探测面时，均会引入波前扰动产生图像质量下降，而且每一个荧光点引入的波前扰动各不相同，因此组织平面A1的图像需要较多地考虑成像视场、时空分辨率以及组织平面A1在活体样本A1中的深度。

如图1所示，本实施方式所提供的荧光光片显微成像系统包括检测装置1、校正装置2、成像装置3和控制装置，其中：所述控制装置用于将活体样本A内部的组织平面A1成像视场预设(划分)为多个等晕区，并接收各所述等晕区的波前像差畸变以及发出校正指令。检测装置1用于检测活体样本A内部的组织平面A1的各预设等晕区的波前像差畸变，并输送给所述控制装置。校正装置2用于接收所述控制装置发送的所述校正指令，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正，成像装置3用于对波前校正后的组织平面A1成像。

鉴于此，通过本实施方式，首先将组织平面A1预设(划分)为多个等晕区，然后检测各预设等晕区的波前像差畸变，最后对每一个等晕区的波前像差畸变实施至少一次的波前校正，因此，本实施方式所提供的荧光光片显微成像系统中有助于获得较大视场且高时空分辨率的深层的生物组织平面A1。

本实施方式中，组织平面A1的各预设等晕区波前像差畸变的检测方法可以采用目前的双光子显微镜提出的分等晕区波前畸变传感方法获得。下面对等晕区以及双光子显微镜提出的分等晕区波前畸变传感方法进行说明。

等晕区的划分在如图4示出的像面上，其可以预设为九宫方格(如图2a所示)或七个边边重合的正六边形形式(如图2b所示)。如图3所示，图3的左侧为预设的3×3阵列的九宫方格，每一个方格划分为一个等晕区，等晕区指的是区域内各点均满足空不变线性系统的性质，即各点对应的出瞳面波前分布一致，其具体解释如下：

以该方格对应等晕区中标识的3个荧光点斑为例分析，假设这三个点斑对应到右侧图中的3个波前分布(即图2中的各自大致沿竖直方向延伸的波浪线M)，3个波前经由微透镜阵列ML(MicroLens)成像后点斑中心偏离每一微透镜光轴的距离Δx/Δy相同，也就是说，在同一个等晕区内的各点的波前像差畸变相同。

需要说明的是，在实际成像时，等晕区定义的太小则增加了传感和校正的复杂度，区域定义的太大则会造成各区域内尚存在一定程度的波前畸变分布不一致性。因此，在实际划分成像视场的等晕区时可遵循以下的划分评估准则：在初定的等晕区内完成逐点扫描以及传感器探测面上的点阵光强累积成像，并分别计算各点斑沿水平/竖直/45度/135度方向的一阶中心矩在数值上是否具有一致性，如果不一致，则需要进一步减小划分的区域。各等晕区内的点发出的光束在出瞳面上的区域完全重合，如图4中H2平面上的圆形区域，但是各等晕区内的点发出的光束在后出瞳面上的区域会出现错位分离，如图4中H4平面上的多圆排布，其中每个圆区域分别对应各等晕区中心点发出的光束。

此外，采用双光子显微镜提出的分等晕区波前畸变传感方法的优势体现在：当逐点扫描获得的微透镜阵列各区域内光强信号很微弱时，采用整个等晕区内扫描点光强累积的方法，可以在确保逐点强度累加的正确性下增强微透镜阵列各区域内点斑的信噪比，从而有利于保证检测装置1检测结果的准确性。

为了清楚起见，下面以两个校正器为例，详细说明校正装置2的实现方式。但是，本领域技术人员将理解到，所述校正器的数量和位置的变化，校正次数仅仅适应性地发生变化，其所有功能均相同。

例如：校正装置2包括第一校正器21和第二校正器22，其中：第一校正器21用于波前校正所述各等晕区的波前像差畸变相同部分，第二校正器22用于波前校正所述各等晕区的波前像差畸变差异部分。由于各等晕区的波前像差畸变基本不一致，但也存在相同部分，那么首先对相同的波前像差畸变部分进行校正，再分别对各等晕区剩余的波前像差畸变部分，即相差异的部分分别进行校正，那么可以获得空间分辨率更高的组织平面A1的成像。第一校正器21和第二校正器22分别可以采用连续表面的薄膜变形镜，分别置于出曈面和后出曈面上。所述控制装置根据接收到检测装置获得的各预设等晕区的波前像差畸变，运用基于相干光衍射传播理论的波前分配算法计算出瞳面上的平均波前校正量和后出瞳面上的剩余波前校正量，并可以对上述分配算法采用GPU(GraphicsProcessingUnit，图形处理器)并行加速，计算出上述两个薄膜变形镜中各个位移致动器的控制电压，从而调整镜面变形改变光路行程实现对波前像差畸变的校正。

以上基于相干光衍射传播理论的波前分配算法的原理和计算过程如下：由于出瞳面和后出瞳面上的单色相干光场分布理论上满足自由空间相干光衍射传播条件呈卷积作用模型，但由于涉及传感和校正的后出瞳面8a和8b相对于涉及传感和校正的出瞳面7a和7b的所有几何参数(包括相对距离，光轴在分别放置波前传感器和校正器的出瞳面和后出瞳面上的相对位置，以及传感器与校正器之间的旋转误差等等)精确值仍需要在线标定，用以修正所述传播模型的卷积核真实分布。具体标定方法是：在使用第一波前传感器12a和第二波前传感器12b先、后传感组织平面A1上各等晕区的出瞳面波前畸变和后出瞳面波前畸变时，由于此时各等晕区均采用双光子点扫描形式激发和成像，各点激发光都会因为上述扫描形式在经过第二位置调整单元13b后在光路中成为轴上光场成像。此时，结合传感获得各等晕区的出瞳面波前畸变和后出瞳面波前畸变基于上述卷积形式可以建立离散光场的超定线性方程组，由此基于最优化算法估计出上述出后出瞳面相对于出瞳面的所有几何参数，由此修正从第一波前传感器12a到第二波前传感器12b的传感器传播模型1。同理，使用第一波前校正器21和第二波前校正器22实施分配波前的校正以及使用第一波前传感器12a和第二波前传感器12b分别传感剩余波前像差畸变分布，同样可以建立针对第一波前校正器21和第二波前校正器22上离散光场的超定线性方程组进而修正校正器传播模型2。利用上述两个传播模型可以计算在光片激发光照明下各等晕区在第七出瞳面7a的任意波前像差畸变传播至第八出瞳面7b、第九出瞳面8a、第十出瞳面8b的实际区域和分布以及对应传感器上的输出形式和对应校正器上的输入形式。

藉由上述原理，本实施方式中的检测装置1至少包括荧光激发单元11、第一波前传感器12a和第二波前传感器12b，其中：

荧光激发单元11可操作地向所述组织平面A1照射激发光或点，荧光激发单元11具体包括两个不同波长的双光子/多光子激发光光源11a、准直镜11b和二向色分光立方11c，双光子/多光子激发光光源11a使用近红外高能锁模脉冲激光器，其发出的脉冲激光(100飞秒)经准直镜11b准直后经二向色分光立方11c(镀膜为高反低通)反射至第二位置调整单元13b，再经第一透镜52和第一透镜51至第一位置调整单元13a，再经第一透镜42和中继透镜41和显微物镜32会聚到组织平面A1上某点，并且该点的位置可由第一位置调整单元11a和第一位置调整单元11b电动二轴控制。同时可通过TTL(Transistor-TransistorLogic，逻辑门电路)信号精确控制上述双光子/多光子激发光光源11a的开关时序。

第一波前传感器12a用于接收组织平面A1经所述激发光照射后产生并传播到出瞳面的受激发射荧光，并根据Shack-Hartmann(S-H)波前传感算法计算出该荧光在所述各等晕区的波前像差畸变。第二波前传感器12b用于接收并根据Shack-Hartmann(S-H)波前传感算法计算经由第一校正器21波前校正后的所述各等晕区的剩余波前像差畸变。由于上述Shack-Hartmann(S-H)波前传感算法为线性处理速度，满足检测装置的实时性要求，适用于各等晕区在出瞳面和后出瞳面上的波前传感。也可由第一波前传感器12a和第二波前传感器12b采集光强信号后再发送给所述控制装置，由所述控制装置根据不同的波前传感算法(例如相位恢复(PR)波前传感算法，Shack-Hartmann(S-H)波前传感算法)获得当前传感平面上的波前像差畸变，若波前传感器放在出瞳面，则检测出瞳面波前畸变；若放在后出瞳面则检测出后出瞳面上波前像差畸变。

作为检测装置1的一种优选实施方式，检测装置1还包括第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b，其中：第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b依次设于荧光激发单元11和成像装置3之间，具体地：第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b依次设于中继透镜41和荧光激发单元11之间的两个出瞳面共轭面上，并且用于调整激发光照射在组织平面A1上的光斑位置。由于光斑在组织平面A1上位置包括水平位移和竖向位移，因此可以选择第一位置调整单元13a调整光斑在A1的水平方向的位置，第二位置调整单元13b调整光斑在组织平面A1的竖直方向的位置。第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b分别可以采用电流计驱动的单轴振镜，通过输入电流值改变单轴振镜的转动角度，可以调整光斑在组织平面A1的位置。

本实施方式所提供的荧光光片显微成像系统的成像装置3包括载物台、片光照明单元31、显微物镜32、会聚透镜33和图像探测器34，其中：所述载物台用于支承活体样本A，且界定了活体样本A的轴线以使大致安置在所述轴线上的样品成像。所述载物台采用的是电动载物台，该载物台具有三轴电动平移功能，一个升降轴和两个平移轴，它们均需要闭环控制，且具有小步长下(<5微米)的高速响应，其中升降轴用来精确定位片光照明单元31当前照明的深度位置，即组织平面A1的深度位置。由于所述载物台装调误差的存在，当所述载物台升降时会造成活体样本A相对于显微物镜32的光轴具有微小的横向偏移，使用高倍数显微物镜时该横向偏移量在图像上将不可忽略，需要通过初始化标定装置10初始化标定后，驱动载物台的两个平移轴在不同深度上予以实时的横向位置补偿。

优选地，初始化标定装置10包括LED光源10a、会聚透镜10b和中性分光立方10c，LED光源10a可通过TTL信号精确控制光源的开关时序。在初始化标定中，该LED光源发出的发散光经由会聚镜10b和中性分光立方10c(镀膜为反射/透射比8:92)反射后汇聚在显微物镜32的后出光端面(第一出瞳面4a)上，再经过显微物镜32反向传播到工作平面上形成准直照明光，此时将刻有多组已知交叉线条结构的反射镜平片放置在该工作平面上，随即可开展载物台三个运动轴相对图像探测器34坐标的各项几何标定。

片光照明单元31可操作以在与活体样本A相交的组织平面A1内产生激发片层光，优选地，片光照明单元31的数量至少为两个，并且对称地布置在组织平面A1的左侧和右侧，并用于使激发片层光能够较为均匀地将组织平面A1照明，利于获得清晰的组织平面A1的图像。片光照明单元31具体包括激发光源31a和光片显微物镜31b，激发光源31a发出的激发光通过光片显微物镜31b形成激发片层光，用以照射活体样本A，由此活体样本A的组织平面A1被选定。显微物镜32的光轴与活体样本A的轴线位于同一条直线上，并用于对波前校正后的组织平面A1进行放大。会聚透镜33和图像探测器34用于对经放大的组织平面A1成像。

本发明藉由多个远心成像光路，即4f系统，搭建荧光光片显微成像系统。其原因在于：如图4所示，图4中示出的远心成像光路包括两个相同焦距的透镜L1，两透镜L1位于同一光轴上，且距离是透镜L1焦距的2倍，那么在两透镜L1的两侧分别具有一个出曈面H1、H2，两透镜L1之间的中点处具有一个像面H3，出曈面H2的后方还具有一个后出曈面H4。出曈面H1、H2均为平行光，且组织平面A1成像视场各等晕区波前像差畸变将呈现在出曈面H1、H2的同一区域，因此可以在出曈面H2放置第一波前传感器12a和第一校正器21。后出瞳面H4上各个等晕区波前像差畸变分布可分离，这样组织平面A1成像视场各等晕区波前像差畸变将分别呈现在后出曈面H4的不同区域，因此可以在后出曈面H4放置第二波前传感器12b和第二校正器22。

如图5所示，根据上述光学原理，本实施方式中的荧光光片显微成像系统还包括第一远心成像光路4和第二远心成像光路5，其中：第一远心成像光路4具有第一出曈面4a和第二出曈面4b，第二远心成像光路5具有第三出曈面5a和第四出曈面5b，第一出曈面4a与显微物镜32的后出光端面重合，第三出曈面5a与第二出曈面4b垂直相交且交点处设第一位置调整单元13a，第四出曈面5b设第二位置调整单元13b。第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b在光路中处于共轭位置，分别用来调整出瞳面上光束的两倾斜分量，由此实现激发光在组织平面A1上的二维点扫描，以及扫描点产生的受激发射光按原路返回至第二位置调整单元13b后均成为轴上点激发光束。

上述实施方式中，所述荧光光片显微成像系统还包括第三远心成像光路6和第四远心成像光路7，其中：第三远心成像光路6具有第五出曈面6a和第六出曈面6b，第四远心成像光路7具有第七出曈面7a和第八出曈面7b，第五出曈面6a与第四出曈面5b垂直相交且交点处设第二位置调整单元13b。第七出曈面7a与第六出曈面6b相交且交点处设第一校正器21，第八出曈面7b设第一波前传感器12a，通过第一波前传感器12a传感得到的出瞳面波前像差畸变可以通过第一校正器21产生的附加波前分布补偿，这样可以满足上述光学原理提及的在出曈面H2放置第一波前传感器12a和第一校正器21的要求。

上述实施方式中，所述荧光光片显微成像系统还包括第五远心成像光路8和第一透/反切换器9a，第五远心成像光路8具有第九出曈面8a和第十出曈面8b，第一透/反切换器9a位于第四远心成像光路7中，并用于使所述荧光经所述第一透/反切换器9a能够透射到达第一波前传感器12a以及使所述荧光或所述激发片层光经第一透/反切换器9a能够反射到达所述第四远心成像光路7的另一所述第八出曈面7b′。另一第八出曈面7b′后方预设距离设置有第五远心成像光路8的后出曈面，该后出曈面与第九出曈面8a相交且交点处设所述第二校正器22，第十出曈面8b设第二波前传感器12b，通过第二波前传感器12b传感得到的后出瞳面上波前像差畸变可以通过第二校正器22产生的附加波前分布补偿，这样可以满足上述光学原理提及的在后出曈面H4放置第二波前传感器12b和第二校正器22的要求。使用第一透/反切换器9a可以确保上述反射/透射两种模式下传输的荧光能量均无损失。

上述实施方式中，所述荧光光片显微成像系统还包括第二透/反切换器9b，第二透/反切换器9b位于另一第八出曈面7b′在所述第五远心成像光路8中的像面上，并用于使所述受激发射荧光经第二透/反切换器9b能够透射到达第二波前传感器12b以及使所述受激发射荧光经第二透/反切换器9b能够反射到达所述会聚透镜33以及图像探测器34。使用第二透/反切换器9b可以确保上述反射/透射两种模式下传输的荧光能量均无损失。

上述各实施方式中，图像探测器34除了上述各实施方式中提及的采集受激发射荧光图像的功能之外，其还具有另一功能，实际可作为第三波前传感器，具体如下：

通过使所述图像探测器34沿其光轴前后移动(图5中的双箭头方向)能够获得一系列离焦图像，再通过相位恢复波前传感算法可计算得到第二透/反切换器9b所在的出曈面上的波前畸变，该波前像差畸变由第一校正器21进行波前校正。由于相位恢复波前传感算法为迭代计算方法，传感精度高，但是处理速度无法满足实时性要求，仅能用于光学系统内部波前像差的初始化标定。

上述各实施方式中，第一远心成像光路4中第一透镜42、第二远心成像光路5、第三远心成像光路6和第四远心成像光路7的焦距均为f，第五远心成像光路8的焦距均为1.5f，另一第八出曈面7b′与第九出曈面8a的预设距离为0.5f，中继透镜的焦距需要匹配显微物镜的厂家型号，会聚透镜33的焦距可以调控显微成像的实际放大率，会聚透镜10b的焦距用于将LED光束汇聚在第一出瞳面4a上。第二透/反切换器9b与另一第八出曈面7b′的距离为6f，这样第二透/反切换器9b所在的出曈面与另一第八出曈面7b′之间物像共轭。第一远心成像光路4、第二远心成像光路5、第三远心成像光路6、第四远心成像光路7和第五远心成像光路8还分别具有像面、出曈面以及后出瞳面，各所述像面成共轭关系，各所述出曈面成共轭关系，各所述后出曈面成共轭关系。

本发明还提供一种采用如上所述的荧光光片显微成像装置的荧光光片显微成像方法，该方法包括以下步骤：

1)检测活体样本A内部的组织平面A1的各预设等晕区的波前像差畸变。

2)根据接收到的所述波前像差畸变，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正。

3)对波前校正后的所述组织平面A1成像。

鉴于此，通过本实施方式所提供的方法，首先将组织平面A1预设(划分)为多个等晕区，然后检测各预设等晕区的波前像差畸变，最后对每一个等晕区的波前像差畸变同时实施至少一次的波前校正，因此，本实施方式所提供的荧光光片显微成像方法有助于获得较大视场且高时空分辨率的深层的生物组织平面A1。

所述的荧光光片显微成像方法的步骤2)具体包括：

21)波前校正所述各等晕区的波前像差畸变相同部分。

22)波前校正所述各等晕区的波前像差畸变差异部分。

由于各等晕区的波前像差畸变基本不一致，但也存在相同部分，那么同时在出瞳面的共轭面上对相同的波前像差畸变部分进行校正，以及同时在后出瞳面的共轭面上分区域对各等晕区的剩余波前像差畸变部分进行校正，即实现了对各个等晕区的波前像差畸变同时实施波前校正，那么该方法有利于获得空间分辨率更高的组织平面A1的成像。

本发明所提供的荧光光片显微成像装置的工作过程如下：

第一步、成像光路的初始化标定：

包括几何参数标定和系统内部波前像差标定，均可使用LED光源在同轴照明下完成。其中，使用LED光源在工作平面上形成准直照明光，将刻有多组已知交叉线条结构的反射镜平片放置在该工作平面上，随即可开展载物台三个运动轴相对图像探测器坐标的各项几何标定。另外，针对成像光路中存在的波前像差，可在工作平面上放置直径200nm的荧光珠作为理想点光源，使用第一第一波前传感器12a或是第三波前传感器可完成对第八出瞳面的波前像差传感或是对第二透/反切换器9b所在的出曈面的波前像差传感，并驱动波前第一校正器21完成系统的初始化校正。

第二步、使用左右两侧显微物镜31b同时照明产生均匀的激发片层光(光片)。

第三步、运用载物台来精确定位当前组织平面A照明的深度位置.

第四步、分等晕区波前畸变传感：

通过二向色分光立方11c将双光子/多光子激发光光源发射出的激发光引入光路，并依次通过第二位置调整单元13b、第一透镜52、第一透镜51、第一位置调整单元13a、第一透镜42、中继透镜41和显微物镜32，最终聚焦在组织平面A1的某一点上，其中第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b可精确控制该点在组织平面A1的水平和竖直坐标位置。此时，先将第一透/反切换器9a设置为透射模式，驱动第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b控制激发光点在该层生物组织上进行逐个等晕区内的逐点扫描，在完成一个等晕区的扫描过程中，第一波前传感器12a上的点阵光强分布一直处于累积状态，待扫描结束时才算完成一次曝光，此时可计算出在第八出曈面7b上当前等晕区对应的波前畸变分布。之后，将第一透/反切换器9a设置为反射模式，将透/反射切换器2设置为透射模式，再次驱动第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b重复对该层生物组织逐个等晕区进行逐点扫描，在完成一个等晕区的扫描过程中，第二波前传感器12b上的点阵光强分布一直处于累积状态，待扫描结束时才算完成一次曝光，此时可计算出在第十出曈面8b上当前等晕区对应的波前畸变分布。如上往复，即可分别完成各个等晕区在第八出曈面7b和第十出曈面8b上波前畸变分布的传感。

第五步、(不分等晕区)全视场波前畸变校正与荧光成像：

将第一透/反切换器9a和第二透/反切换器9b均设置为反射模式，使用自研的基于相干光衍射传播理论的波前分配算法计算出各等晕区在第六出曈面6b上的波前畸变平均分布，由此驱动波前第一校正器21产生镜面变形完成波前校正。同时由上述分配算法计算出各等晕区在第六出曈面6b上的剩余波前畸变传播到第九出曈面8a上的对应分布，由此驱动第二校正器22对各等晕区剩余波前畸变进行同时波前校正。在校正完成的同时即控制图像探测器34(sCMOS或EMCCD相机)开始曝光完成对该层的全视场荧光显微成像记录。

第六步、反复第三步至第五步的操作，即可实现对整个深层组织A进行大视场、高时空分辨率、逐层扫描荧光显微成像。

最后需要指出的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.一种荧光光片显微成像系统，其特征在于，包括检测装置(1)、校正装置(2)、成像装置(3)和控制装置，其中：所述检测装置(1)用于检测活体样本(A)内部的组织平面(A1)成像视场的各预设等晕区的波前像差畸变，并输送给所述控制装置，所述控制装置用于根据接收到的所述波前像差畸变，向所述校正装置(2)发出校正指令，所述校正装置(2)用于根据接收到的所述校正指令，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正，所述成像装置(3)用于对波前校正后的所述组织平面(A1)成像。

2.如权利要求1所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，所述校正装置(2)至少包括第一校正器(21)和第二校正器(22)，其中：所述第一校正器(21)用于波前校正所述各等晕区的波前像差畸变相同部分，所述第二校正器(22)用于波前校正所述各等晕区的波前像差畸变差异部分。

3.如权利要求1或2所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，所述检测装置(1)至少包括荧光激发单元(11)、第一波前传感器(12a)和第二波前传感器(12b)，其中：所述荧光激发单元(11)可操作地向所述组织平面(A1)照射激发光或点，所述第一波前传感器(12a)用于接收所述组织平面(A1)经所述激发光照射后产生的受激发射荧光，并检测出该荧光位于所述各等晕区时的波前像差畸变，所述第二波前传感器(12b)用于接收并检测经由所述第一校正器(21)波前校正后的所述各等晕区的剩余波前像差畸变。

4.如权利要求3所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，所述检测装置(1)还包括第一位置调整单元(13a)和第二位置调整单元(13b)，所述第一位置调整单元(13a)和所述第二位置调整单元(13b)依次设于所述荧光激发单元(11)和所述成像装置(3)之间，并用于调整所述激发光照射在所述组织平面(A1)上的光斑位置。

5.如权利要求4所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，所述成像装置(3)包括载物台、片光照明单元(31)、显微物镜(32)、会聚透镜(33)和图像探测器(34)，其中：所述载物台用于支承所述活体样本(A)，且界定了所述活体样本(A)的轴线以使大致安置在所述轴线上的样品成像；所述片光照明单元(31)可操作以在与所述活体样本(A)相交的所述组织平面(A1)内产生激发片层光；所述显微物镜(32)和会聚透镜(33)用于对波前校正后的所述组织平面(A1)放大成像在显微成像面(3a)，所述图像探测器(34)的探测面与所述显微成像面(3a)重合。

6.如权利要求5所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，还包括第一远心成像光路(4)和第二远心成像光路(5)，所述第一远心成像光路(4)具有第一出曈面(4a)和第二出曈面(4b)，所述第二远心成像光路(5)具有第三出曈面(5a)和第四出曈面(5b)，所述第一出曈面(4a)设所述显微物镜(32)的后出光端面，所述第三出曈面(5a)与所述第二出曈面(4b)垂直相交且交点处设所述第一位置调整单元(13a)，所述第四出曈面(5b)设所述第二位置调整单元(13b)。

7.如权利要求6所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，还包括第三远心成像光路(6)和第四远心成像光路(7)，所述第三远心成像光路(6)具有第五出曈面(6a)和第六出曈面(6b)，所述第四远心成像光路(7)具有第七出曈面(7a)和第八出曈面(7b)，所述第五出曈面(6a)与所述第四出曈面(5b)垂直相交且交点处设所述第二位置调整单元(13b)，所述第七出曈面(7a)与所述第六出曈面(6b)相交且交点处设所述第一校正器(21)，所述第八出曈面(7b)设所述第一波前传感器(12a)。

8.如权利要求7所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，还包括第五远心成像光路(8)和第一透/反切换器(9a)，所述第五远心成像光路(8)具有第九出曈面(8a)和第十出曈面(8b)，所述第一透/反切换器(9a)位于所述第四远心成像光路(7)中，并用于使所述荧光经所述第一透/反切换器(9a)能够透射到达所述第一波前传感器(12a)以及使所述荧光或所述激发片层光经所述第一透/反切换器(9a)能够反射到达所述第四远心成像光路(7)的另一所述第八出曈面(7b′)，所述另一第八出曈面(7b′)后方预设距离的所述第九出曈面(8a)设所述第二校正器(22)，所述第十出曈面(8b)设所述第二波前传感器(12b)。

9.如权利要求8所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，还包括第二透/反切换器(9b)，所述第二透/反切换器(9b)位于所述另一第八出曈面(7b′)在所述第五远心成像光路(8)中的像面上，并用于使所述荧光经所述第二透/反切换器(9b)能够透射到达所述第二波前传感器(12b)以及使所述激发片层光经所述第二透/反切换器(9b)能够反射到达所述图像探测器(34)。

10.如权利要求10所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，所述图像探测器(34)沿其光轴前后移动能够接受并检测所述第二透/反切换器(9b)所在的出曈面的波前像差畸变，该波前像差畸变也可由所述第一校正器(21)进行波前校正。

11.如权利要求12所述的荧光光片显微成像系统，其特征在于，所述第一远心成像光路(4)的第一透镜(42)、第二远心成像光路(5)、第三远心成像光路(6)和第四远心成像光路(7)的焦距均为f，所述第五远心成像光路(8)的焦距均为1.5f，所述另一第八出曈面(7b′)与所述第九出曈面(8a)的预设距离为0.5f，所述第二透/反切换器(9b)与所述另一第八出曈面(7b′)的距离为6f，所述第一远心成像光路(4)、第二远心成像光路(5)、第三远心成像光路(6)、第四远心成像光路(7)和第五远心成像光路(8)还分别具有像面、出曈面以及后出瞳面，各所述像面成共轭关系，各所述出曈面成共轭关系，各所述后出曈面成共轭关系。

12.一种采用如权利要求1至11所述的荧光光片显微成像装置的荧光光片显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)检测活体样本(A)内部的组织平面(A1)成像视场的各预设等晕区的波前像差畸变；

2)根据接收到的所述波前像差畸变，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正；及

3)对波前校正后的所述组织平面(A1)成像。

13.如权利要求12所述的荧光光片显微成像方法，其特征在于，步骤2)具体包括：

21)波前校正所述各等晕区的波前像差畸变相同部分；和

22)波前校正所述各等晕区的波前像差畸变差异部分。