CN102278951A - 一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置。该装置采用数字全息显微技术，对生物活体细胞实现非接触、非破坏、无预处理的动态三维显微观测；通过光纤光路实现物光照明，物光光路部分采用立式结构，便于进行生物活体细胞观测；参考光利用光束转折器控制其与物光的夹角，实现离轴数字全息；采用无穷远校正显微物镜对细胞进行预放大成像，同时利用中继透镜调整成像位置和物光的波前曲率，提高了观测分辨率。该装置通过平台使得多个光学器件的布局结构紧凑、灵活、稳定，并可用于长时间对生物活体细胞进行动态观测。

Description

一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置

技术领域

本发明涉及一种三维显微观测系统，更特别地说，是指一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测系统。

背景技术

目前生物细胞的三维显微观测技术方法主要包括原子力显微技术、激光共聚焦显微技术和数字全息显微技术等。数字全息显微依托于数字全息技术，利用CCD、CMOS等光电图像传感器以数字形式记录全息图，利用计算机模拟再现参考光照射全息图的光学衍射过程重构物光，从而获得待测物体的振幅和相位信息。

为了将数字全息技术应用于活体细胞的三维显微观测，需要解决一些技术问题：(1)数字全息的成像分辨率受图像传感器(CCD、CMOS)性能指标的限制，细胞显微观测时一般采用显微物镜进行预放大处理，提高再现像的分辨率，但此时再现物光易受显微物镜引起的像差和畸变影响，必须进行相应的补偿和矫正。(2)为提高信噪比和成像质量，在记录过程中需要对物光和参考光的光强比、入射夹角和波前曲率进行精确控制。(3)在长时间动态观测中，活体细胞的培养一般需要在水平放置的培养皿中进行，必须合理设计光路，使其结构紧凑，稳定性好，同时便于操作和调试。

发明内容

本发明的目的是提出一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，该装置采用数字全息显微技术，对生物活体细胞实现非接触、非破坏、无预处理的动态三维显微观测；通过光纤光路实现物光照明，物光光路部分采用立式结构，便于进行生物活体细胞观测；参考光利用光束转折器控制其与物光的夹角，实现离轴数字全息；采用无穷远校正显微物镜对细胞进行预放大成像，同时利用中继透镜调整成像位置和物光的波前曲率，提高了观测分辨率。该装置通过平台使得多个光学器件的布局结构紧凑、灵活、稳定，并可用于长时间对生物活体细胞进行动态观测。

本发明的一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，该装置包括有激光光源、分光耦合单元、第一反射镜、光束准直单元、第二反射镜、光束转折器、光纤准直镜、活体细胞培养皿、显微物镜、中继成像透镜、消偏振分光棱镜和CMOS相机；激光光源用于输出中心波长为532nm的激光；分光耦合单元对激光进行分光处理，一路输出空间光，另一路耦合进入单模保偏光纤成为光纤光；空间光顺次经第一反射镜、光束准直单元、第二反射镜、光束转折器后，作为平行参考光，入射进入消偏振分光棱镜；光纤光经光纤准直镜，形成平行照明光照射到待测活体细胞上；照明光经过待测细胞透射，形成携带细胞三维信息的初始物光；物光经显微物镜、中继成像透镜后，形成细胞的放大实像，作为预放大物光入射进入消偏振分光棱镜；消偏振分光棱镜对入射的平行参考光、预放大物光进行合光处理得到合并光束，该合并光束形成的全息图被CMOS相机的光敏面捕获。

本发明的一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，其具有如下优点：

(1)采用数字全息显微技术，可动态获取生物活体细胞的三维信息，具有非接触、非破坏性，且无需预处理，对细胞的影响非常小。

(2)采用无穷远校正显微物镜对细胞进行预放大成像，获取了较高频率的信息，提高了观测分辨率，同时利用中继成像透镜调整成像位置和物光波前曲率，有利于全息图的记录。

(3)采用空间光-光纤光混合光路结构，物光照明通过光纤光路实现，采用立式结构，紧凑灵活；参考光采用空间光路，通过光束转折器调整参考光入射方向，进而控制物光与参考光的夹角，操作方便，稳定性好，可用于长时间观测。

附图说明

图1是本发明生物活体细胞动态三维显微观测装置的光路传输结构框图。

图2是本发明分光耦合单元的光路传输结构图。

图3是本发明物光光路的光路传输结构图。

图4是本发明一种具体生物活体细胞动态三维显微观测装置的实施方式结构图。

图4A是本发明光束调整器结构图。

图4B是本发明光束调整器中第一夹具的分解图。

图4C是本发明第一夹具中三角镜架的另一视角结构图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明做进一步的详细说明。

参见图1所示，本发明是一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，该装置包括有激光光源1、分光耦合单元2、第一反射镜3、光束准直器4、第二反射镜5、光束转折器6、光纤准直镜7、活体细胞培养皿8、显微物镜9、中继成像透镜10、消偏振分光棱镜11和CMOS相机12；其中，第一反射镜3与第二反射镜5的结构相同。

(一)激光光源1

在本发明中，光源1用于提供532nm的激光1a，即光信息，该光源提供了中心波长为532nm的单纵模激光，可以选取可选用瑞典Cobolt公司生产的型号为Samba TM 532nm的激光器。

(二)分光耦合单元2

参见图2所示，分光耦合单元2包括有A半波片201、偏振分光棱镜202、B半波片203、可调衰减器204、光纤耦合器205和单模保偏光纤206。

分光耦合单元2用于接收从激光光源1出射的中心波长为532nm的激光1a，将其分为空间光2a和光纤光2b输出，并可调整改变两路光(空间光2a和光纤光2b)的光强比(一般为1∶5～5∶1)。

激光1a经A半波片201后射入偏振分光棱镜202上后被分为两束偏振方向正交的反射光和透射光；其中反射光经过B半波片203、可调衰减器204后成为空间光2a，所述空间光2a进入参考光路；另一路透射光经光纤耦合器205耦合进入单模保偏光纤206中成为光纤光2b，所述光纤光2b进入物光光路。在本发明中，通过旋转调整A半波片201和可调衰减器204，可以改变空间光2a与光纤光2b之间的光强比(一般为1∶5～5∶1)，进而改变平行参考光6a和预放大物光10a的光强比(一般为1∶5～5∶1)。旋转调整B半波片203，能够保证空间光2a与光纤光2b的偏振方向一致。

在本发明中，A半波片201和B半波片203可选取北京大恒光电公司的GCL-060411型石英零级半波片；偏振分光棱镜202可以选取北京大恒光电公司的GCC-402102型偏振分光棱镜；可调衰减器204可选取北京大恒光电公司的GCO-0701M型圆形可调衰减器；光纤耦合器205可选用美国OZ光学公司的HPUC-23AF-532-S-6.2AS-2型光纤耦合器；单模保偏光纤206可选用美国OZ光学公司的QPMJ-3AF3S-532-3.5/125-3-2-1型532nm单模保偏光纤。

(三)第一反射镜3

在本发明中，第一反射镜3和第二反射镜5用于转折光束，采用相同结构的反射镜，可选取北京大恒光电公司的GCC-102104型反射镜。

(四)光束准直器4

在本发明中，光束准直器4由空间滤波器和平凸透镜构成；空间滤波器用于对接收到的反射光3a进行扩束处理后，准直为平行光4a后照射至平凸透镜上，经平凸透镜后形成平行光4a输出。用于对反射后的空间光2a进行扩束，并将其准直为平行光出射。光束准直器4可以由北京大恒光电公司生产的GCO-01M型空间滤波器和GCL-010147型平凸透镜组合而成。

(五)光束转折器6

在本发明中，光束转折器6用于改变参考光的入射角度，进而调整参考光与物光的夹角。

参见图4A所示，光束转折器6包括有齿轮齿条平移台、第一夹具63、第二夹具64、第一支撑杆65、升降杆66、第二支撑杆67、第一平面反射镜68和第二平面反射镜69；其中，第一夹具63与第二夹具64的结构相同；第一平面反射镜68与第二平面反射镜69的结构相同。第一夹具63安装在第一支撑杆65上，第二夹具64安装在第二支撑杆67上。

第一支撑杆65、升降杆66和第二支撑杆67为圆筒结构，升降杆66的一端上安装第一支撑杆65，升降杆66的另一端上安装第二支撑杆67。通过安装在升降杆66内的长度(第一支撑杆65、第二支撑杆67各自的长度)来调节第一平面反射镜68与第二平面反射镜69之间的高度。第一支撑杆65的另一端穿过第一夹具63的夹持架634的A通孔634a后安装在齿轮齿条平移台的Y轴向基座62上。

参见图4B所示，第一夹具63包括有三角镜架631、U形架632、转台633和夹持架634；

第一平面反射镜68安装在三角镜架631的圆盘631a内；

参见图4C所示，三角镜架631一侧的侧板上设有A销孔(图4B中未示出)，三角镜架631另一侧的侧板上设有B销孔631b，三角镜架631的底板上设有锁紧杆631c；A销孔内安装有U形架632上A凸耳632a，B销孔631b内安装有U形架632上B凸耳632b，锁紧杆631c插入U形架632的矩形孔632c内，并通过螺钉顶紧；三角镜架631通过两侧侧板上的两个销孔与U形架632上的两个凸耳实现活动安装，为了调整第一平面反射镜68与第二平面反射镜69之间的相对位置，通过螺钉顶紧锁紧杆631c实现。即第一夹具63上的第一平面反射镜68向上抬起的仰视角度，第二夹具64上的第二平面反射镜69向下的俯视角度，这都是为了保证照射在第一平面反射镜68镜面上的反射参考光5a能够照射在第二平面反射镜69上后形成平行参考光6a。

U形架632的一侧立板上设有A凸耳632a，U形架632的另一侧立板上设有B凸耳632b，U形架632的底部设有一圆台(图2A中未示出)；A凸耳632a安装在三角镜架631的A销孔内，B凸耳632b安装在三角镜架631的B销孔内631b，圆台安装在转台633的圆孔633a内；

夹持架634上设有A通孔634a、B通孔634b和限位槽634c；A通孔634a用于第一支撑杆65的一端穿过，并通过螺钉使第一夹具63夹紧安装在第一支撑杆65上；B通孔634b内安装有转台633，转台633上的A限位板633b和B限位板633c置于限位槽634c内；A限位板633b和B限位板633c与螺钉的配合能够实现第一平面反射镜68在圆台(设在U形架632的底部)的轴向上的调节。

齿轮齿条平移台包括X轴向基座61和Y轴向基座62，Y轴向基座62垂直安装在X轴向基座61上，Y轴向基座62上安装有第一支撑杆65的一端；

本发明设计的光束转折器6用于调整反射参考光5a的角度和位置，从而控制平行参考光6a与平行照明光7a的夹角。当反射参考光5a照射到第一平面反射镜68时，反射参考光5a经反射后照射至第二平面反射镜69上，再反射后形成平行参考光6a出射；通过调节两个反射镜的旋转、俯仰能够使经第二平面反射镜69反射的调节后平行参考光6a达到最佳的出射角度。在本发明中，通过改变第一夹具63与第二夹具64之间的相对高度，在不改变反射参考光5a方向的前提下，分别粗调、细调出射光束的高度；然后通过调整齿轮齿条平移台调节出射光束的照明横向位置。

在本发明中，光束转折器6中的齿轮齿条平移台(包括有X轴向基座61、Y轴向基座62)可以选用大恒新纪元科技股份有限公司的GCM-150101M型齿轮齿条平移台。

在本发明中，光束转折器6中的第一平面反射镜68与第二平面反射镜69的可以选用大恒新纪元科技股份有限公司的GCO-1101M型光束提升器中的可调反射镜机构。

(六)光纤准直镜7

在本发明中，光纤准直镜7将光纤光2b准直为平行照明光7a，可选用北京大恒光电公司的GCX-L005-FC型光纤准直镜。

(七)活体细胞培养皿8

在本发明中，活体细胞培养皿8用于放置被观测目标。

(八)显微物镜9

在本发明中，显微物镜9用于对活体细胞进行预放大，提高观测分辨率。显微物镜9可选用新加坡Edmund光学公司的M Plan Apo 20X型长工作距离无穷远校正显微物镜，其放大倍数为20。

(九)中继成像透镜10

在本发明中，中继成像透镜10用于调整成像位置和物光的波前曲率，得到预放大物光10a。中继成像透镜10可选用与显微物镜9配套的MT-1型中继成像透镜。

(十)消偏振分光棱镜11

在本发明中，消偏振分光棱镜11用于将平行参考光6a和预放大物光10a合成一束光，可选用新加坡Edmund光学公司生产的47571型消偏振分光棱镜。

(十一)CMOS相机12

在本发明中，CMOS相机12用于捕获记录数字全息图，可以选取加拿大Lumenera公司的LU125M型CMOS相机，其分辨率为1280×1024像素，最高帧频15fps，光敏面尺寸2/3英寸，数据接口为USB2.0。

本发明的基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置的光路结构为：激光光源1出射的激光1a入射至分光耦合单元2中，经分光耦合单元2的分光处理后输出空间光2a和光纤光2b；

所述空间光2a顺次经第一反射镜3、光束准直单元4、第二反射镜5、光束转折器6后输出平行参考光6a入射进入消偏振分光棱镜11；

参见图3所示，所述光纤光2b经光纤准直镜7后形成平行照明光7a，所述平行照明光7a对活体细胞培养皿8中的被测目标进行照射，透射后形成包含细胞三维信息的初始物光8a；所述初始物光8a顺次经显微物镜9和中继成像透镜10后形成细胞的放大实像，即预放大物光10a入射进入消偏振分光棱镜11；

所述消偏振分光棱镜11对入射的平行参考光6a和预放大物光10a进行合光处理得到合并光束11a，该合并光束11a被CMOS相机12的光敏面捕获，从而在CMOS相机12中形成干涉全息图。

在本发明中，由分光耦合单元2分出的空间光2a经第一反射镜3、光束准直单元4、第二反射镜5、光束转折器6后入射进入消偏振分光棱镜11，这部分可以称为参考光路。

在本发明中，由分光耦合单元2分出的光纤光2b经光纤准直镜7、活体细胞培养皿8、显微物镜9、中继成像透镜10后入射至消偏振分光棱镜11，这部分可以称为物光光路。

为了实现如图1所示的光路结构中各镜子的相对位置关系，本发明通过在一金属平台13上安装多个具有升降功能的支撑架或者是磁力座，然后在所述的多个支撑架上分别安装上光学器件，通过在具有升降调节功能的支撑架或者是磁力座上安装多个光学器件，其目的是为了保证传输过程中的光路畅通且保持等高，如图4所示。其中物光光路部分采用立式结构，便于进行生物活体细胞的培养和动态观测；参考光路采用多次折反的光路模式，且光学器件保持等高共轴布局，实现了光路结构的紧凑。图4仅为图1的一个具体实现方式，并不限制本发明依据图1获得的其他结构。

本发明设计的基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，能够适用于生物细胞的三维显微观测，可对细胞处于活体状态下的生长过程进行长时间的动态观测。该装置(1)以非接触、非破坏、无预处理的方式获取生物活体细胞三维信息，对活体细胞的影响非常小；(2)属于全场观测，视场较大，无扫描过程，实时性好，且系统结构简单；(3)记录与再现过程都以数字化形式完成，可对活体细胞的三维信息进行定量分析。

Claims (5)

1.一种基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，该装置包括有激光光源(1)、活体细胞培养皿(8)、显微物镜(9)、消偏振分光棱镜(11)、CMOS相机(12)，其特征在于：还包括有分光耦合单元(2)、第一反射镜(3)、光束准直器(4)、第二反射镜(5)、光束转折器(6)、光纤准直镜(7)、中继成像透镜(10)；其中，第一反射镜(3)与第二反射镜(5)的结构相同；

该装置的光路结构为：激光光源(1)出射的激光(1a)入射至分光耦合单元(2)中，经分光耦合单元(2)的分光处理后输出空间光(2a)和光纤光(2b)；

所述空间光(2a)顺次经第一反射镜(3)、光束准直单元(4)、第二反射镜(5)、光束转折器(6)后输出平行参考光(6a)入射进入消偏振分光棱镜(11)；

所述光纤光(2b)经光纤准直镜(7)后形成平行照明光(7a)，所述平行照明光(7a)对活体细胞培养皿(8)中的被测目标进行照射，透射后形成包含细胞三维信息的初始物光(8a)；所述初始物光(8a)顺次经显微物镜(9)和中继成像透镜(10)后形成细胞的放大实像，即预放大物光(10a)入射进入消偏振分光棱镜(11)；

所述消偏振分光棱镜(11)对入射的平行参考光(6a)和预放大物光(10a)进行合光处理得到合并光束(11a)，该合并光束(11a)被CMOS相机(12)的光敏面捕获，从而在CMOS相机(12)中形成干涉全息图。

2.根据权利要求1所述的基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，其特征在于：由分光耦合单元(2)分出的空间光(2a)经第一反射镜(3)、光束准直单元(4)、第二反射镜(5)、光束转折器(6)后入射进入消偏振分光棱镜(11)，这部分称为参考光路。

3.根据权利要求1所述的基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，其特征在于：由分光耦合单元(2)分出的光纤光(2b)经光纤准直镜(7)、活体细胞培养皿(8)、显微物镜(9)、中继成像透镜(10)后入射至消偏振分光棱镜(11)，这部分称为物光光路。

4.根据权利要求1所述的基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，其特征在于：分光耦合单元(2)包括有A半波片(201)、偏振分光棱镜(202)、B半波片(203)、可调衰减器(204)、光纤耦合器(205)和单模保偏光纤(206)；激光(1a)经A半波片(201)后射入偏振分光棱镜(202)上后被分为两束偏振方向正交的反射光和透射光；其中反射光经过B半波片(203)、可调衰减器(204)后成为空间光(2a)，所述空间光(2a)进入参考光路；另一路透射光经光纤耦合器(205)耦合进入单模保偏光纤(206)中成为光纤光(2b)，所述光纤光(2b)进入物光光路；通过旋转调整A半波片(201)和可调衰减器(204)，能够改变空间光(2a)与光纤光(2b)之间的光强比，进而改变平行参考光(6a)和预放大物光(10a)的光强比；旋转调整B半波片(203)，能够保证空间光(2a)与光纤光(2b)的偏振方向一致。

5.根据权利要求1所述的基于数字全息的生物活体细胞动态三维显微观测装置，其特征在于：光束转折器(6)包括有齿轮齿条平移台、第一夹具(63)、第二夹具(64)、第一支撑杆(65)、升降杆(66)、第二支撑杆(67)、第一平面反射镜(68)和第二平面反射镜(69)；其中，第一夹具(63)与第二夹具(64)的结构相同；第一平面反射镜(68)与第二平面反射镜(69)的结构相同；第一夹具(63)安装在第一支撑杆(65)上，第二夹具(64)安装在第二支撑杆(67)上；

第一支撑杆(65)、升降杆(66)和第二支撑杆(67)为圆筒结构，升降杆(66)的一端上安装第一支撑杆(65)，升降杆(66)的另一端上安装第二支撑杆(67)；第一支撑杆(65)的另一端穿过第一夹具(63)的夹持架(634)的A通孔(634a)后安装在齿轮齿条平移台的Y轴向基座(62)上；

第一夹具(63)包括有三角镜架(631)、U形架(632)、转台(633)和夹持架(634)；第一平面反射镜(68)安装在三角镜架(631)的圆盘(631a)内；

三角镜架(631)一侧的侧板上设有A销孔，三角镜架(631)另一侧的侧板上设有B销孔(631b)，三角镜架(631)的底板上设有锁紧杆(631c)；U形架(632)的一侧立板上设有A凸耳(632a)，U形架(632)的另一侧立板上设有B凸耳(632b)，U形架(632)的底部设有一圆台，圆台安装在转台(633)的圆孔(633a)内；A销孔内安装有U形架(632)上A凸耳(632a)，B销孔(631b)内安装有U形架(632)上B凸耳(632b)，锁紧杆(631c)插入U形架(632)的矩形孔(632c)内；

夹持架(634)上设有A通孔(634a)、B通孔(634b)和限位槽(634c)；A通孔(634a)用于第一支撑杆(65)的一端穿过，并通过螺钉使第一夹具(63)夹紧安装在第一支撑杆(65)上；B通孔(634b)内安装有转台(633)，转台(633)上的A限位板(633b)和B限位板(633c)置于限位槽(634c)内。

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