CN103322941A - 一种准确获取三维显微图像的方法 - Google Patents

Abstract

一种获取三维显微图像的方法，将一束激光通过分束镜后分为物光波和参考光波，物光波携带透明物体的三维信息，物光波和参考光波在CCD靶面上形成干涉图像，该图像传输到计算机，在计算机中将干涉图像通过非常规重建方法再现。其中，非常规重建方法中，对干涉图像取自然对数后进行傅里叶变换获得其频谱图，选取频谱图中与物体频谱相对应的一个象限的谱面大小进行滤波，从而获得物体频谱，然后进行逆傅里叶变换，指数运算以及位相补偿，从而获得准确的物体的三维显微图像。

Description

一种准确获取三维显微图像的方法

技术领域

本申请设计一种数字显微镜成像方法，属于光学显微成像领域。

背景技术

传统的显微镜，主要是通过透镜组获得，这样获得的显微图像也只是成像物体的强度图像。随着半导体技术和激光技术的不断发展，现阶段出现了一种数字全息术，其能够在获得成像物体的强度图像的同时，获得成像物体的位相图像，或者说其能够获得成像物体的三维图像。

数字全息术利用光电转换器件(CCD或CMOS)代替传统的全息干板记录干涉条纹，然后送入计算机并通过数值计算重构物体的强度及位相分布。与传统的光学全息相比，数字全息具有许多突山的优点，这些优点使数字全息术得到了广泛关注，已成为一个研究热点。近年来，随着记录飞秒级超快瞬态过程的脉冲数字全息技术的山现，数字全息术更展现山在科学研究及光学无损检测中的活力。

传统的全息术是将成像物体的全息图记录在全息干板上，然后用记录全息图中的参考光或其共轭光照射全息干板，即对全息图进行再现，从而获得物体的三维图像；而数字全息术中，用CCD取代全息干板，用CCD采集成像物体的全息图，将全息图输入计算机中，在计算机中利用算法模拟实际的全息图再现过程，从而在计算机中重建物体的三维图像。全息图的再现像相对于普通的数码相机获取的图像，全息图的再现像除了具有强度图像外，还有位相图像，即物体的三维形貌图像，因此数字全息术中最关键的是物体位相信息的重建。

数字全息位相重建的常规方法是：通过对全息图作傅里叶变换得到其频谱(如图1所示，(a)为原理图，(b)为实验结果)，然后进行频谱滤波将不需要的O级及-1级频谱滤除，之后对滤波后的频谱再作逆傅里叶变换，最后通过衍射计算获得再现像的波前信息。这种方法存在如下问题：(1)由于在重建过程中需要用人工的方法确定+1级衍射谱的范围，极大地降低了位相重建的速度，从而限制了数字全息术对动态变化过程进行实时监测的应用需求。(2)在滤波过程中往往会造成0级谱的滤除不彻底及+1级谱滤山不完整，从而造成噪声干扰及再现像高频信息的丢失，这一方面造成了再现像信噪比的降低，引起位相测量误差，另一方面也降低了再现像的分辨率；(3)离散重建会带来周期性，这个周期等于全息图的在空间的范围，在此范围内，0级、±1级同时存在，且0级项的范围是+1级或-1级像的2倍，并且共轭像是多余的，它不比原始像多带任何信息。这样，有效的面积占到了全息图很小的份额。因此通过压抑不想要的像的面积而增加有用面积是人们非常期望的；(4)最后一步的衍射计算过程中，由于记录距离等记录参量不能准确获得以及数值再现算法本身的原因，都会引入较大的位相重建误差，并物光场中部分高频信息丢失。

发明内容

本发明提供一种数字全息显微中的实时高精度位相重建方法，以克服上述位相重建中存在的问题。无论记录光路及被记录的样品情况如何，再现时选择的滤波区域必须是固定的。考虑到全息图频谱中三个衍射级相对于坐标原点是对称分布的，因此，若选择+1级谱所在的一个完整象限(即再现像视场的四分之一)作为滤波区域(如图2所示)，则可以免除由于滤波区域不固定而带来的重建非实时性问题。这样选择滤波区域，同时还可以解决+1级谱区域不够大而带来的有效高频成分丢失问题。但与此同时也带来了0级谱的高度干扰，因此，这种情况下必须利用非常规重建方法将0级干扰消除。考虑到同态滤波技术可以将乘法运算转换为加法运算，将此思想用于全息图重建，则可以将物光波及其复共轭完全分开，从而彻底消除0级衍射的干扰，高精度、实时性地重建物光波场。

本发明包括以下技术方案：

开启激光器，产生的激光经第一半波片，偏振分束棱镜后，分为物光波和参考光波；通过第一反光镜和第二反光镜反射使得物光波和参考光波垂直相交，在相交处放入合束镜，使得物光波和参考光波经合束镜后重合为一束光；在第一反光镜后依次放入第一扩束准直器、透明物体和第一显微镜，调节第一扩束准直器，使得物光波经第一扩束准直器后成为第一平行光，利用第一平行光照射透明物体；使得透明物体通过第一显微物镜成像，将CCD置于所述合束镜后一定距离；在第二反光镜之前放入第二扩束准直器，在第二反光镜之后放入第二显微镜，调节第二扩束准直器，使得参考光波经第二扩束准直器后成为第二平行光，利用第二反光镜将第二平行光导入第二显微物镜；旋转合束镜，使得物光波倾斜入射合束镜；其中第一显微镜和第二显微镜到合束镜的距离相等；通过CCD采集物光波和参考光波在CCD靶面上形成的全息图，将所述全息图传输到计算机；其中CCD靶面所在平面的物光波和参考光波复振幅分别为O(x，y)、R(x，y)，而上述全息图的复振幅为H(x，y)。

所述获取三维显微图像的方法的特征在于：包括以下步骤：

1)将上述全息图除以测得的参考光强度分布，然后对其取自然对数，得到： $\ln \left[\hat{H}(x,y)\right]=\ln [1+\hat{O}(x,y)]+\ln [1+{\hat{O}}^{*}(x,y)];$

其中 $\hat{H}(x,y)=\frac{H(x,y)}{{\left|R(x,y)\right|}^2},\hat{O}(x,y)=\frac{O(x,y)}{R(x,y)},$ 为

的复共轭；

2)然后对上式作傅里叶变换，获得其频谱分布图

其中FT{}为傅里叶变换；f_x，f_y为x方向和y方向的空间频率；

3)选取频谱图中与物体频谱相对应的四分之一谱面大小(即一个象限)，得到滤波后的全息图对数的频谱分布 $S_{\mathrm{Fil}}(f_x,f_y)={\mathrm{FT}}_{\mathrm{Fil}}\left\{\ln \right[\hat{H}(x,y)\left]\right\};$

4)对S_Fil(f_x，f_y)作逆傅里叶变换，即可得到

再对其作指数运算，可得到

5)对参考光波波矢量进行粗测，得到其传播矢量，从而获得粗略的参考光复振幅分布R(x，y)；

6)由 $\hat{O}(x,y)=O(x,y)/R(x,y)$ 求出O(x，y)；

7)利用角谱衍射公式计算像平面的光波场复振幅分布(对于像面数字全息术，衍射计算可以省略)；

8)根据自动位相补偿方法对得到的波前畸变进行补偿，获得物光波场的真实位相分布。

附图说明

图1常规重建时的全息图频谱模拟分布图；图1中(a)为原理图，(b)为实验图。

图2非常规重建时的全息图频谱模拟分布图。

图3光学显微成像系统示意图。

图4平面参考光预放大数字全息坐标示意图。

图5球面参考光预放大数字全息坐标示意图。

图6非常规重建流程框图。

图7平面参考光预放大数字全息分辨率板实验结果；图7中(a)全息图，(b)频谱图，(c)常规算法重建像，(d)非线性算法重建像。

图8血红细胞的全息图及其频谱；图8中(a)全息图，(b)(a)的频谱。

图9血红细胞的重建结果；图9中(a)常规算法的强度像，(b)非线性算法的强度像，(c)常规算法的二维位相分布，(d)非线性算法的二维位相分布，(e)常规算法三维位相分布，(f)非线性重建算法三维位相分布。

具体实施例

一、数字全息图记录系统

图3为光学显微成像系统示意图。由He-Ne激光器1发出的波长为632.8nm的激光经半波片2后经偏振分束棱镜3后分为光束A和光束B，并分别经扩束准直器4后，一束形成照明样品6(透明物体)的平面光波，并经显微物镜MO₁(7)后形成放大的物光波，另一束经显微物镜MO₂(8)后形成发散的球面参考光波，两束光经棱镜BS(即合束器9)合束后发生干涉，并被位于样品像平面的CCD传感器10所记录，随后送往计算机11进行处理，图中5表示反光镜。为了消除MO₁引入的二次位相畸变，MO₂应与MO₁完全相同，必须精确调整其位置，使平行光经它们后所形成的球面光波相对CCD有完全相同的波面弯曲。同时需要精调棱镜BS的倾角，使所记录的全息图频谱沿对角线方向分离。具体调节方法如下：首先，挡住参考光，调节物平面到显微物镜的距离及CCD位置，使物体被放大合适的倍数并在CCD中成清晰的像。然而，由于衍射效应使像平面难以准确确定，但我们发现，若在物光路中放入一张普通擦镜头纸，可使光的衍射大大削弱，此时便可以精确确定像平面位置。其次，物光路中不放样品，精调MO₂的位置，使所记录的全息图条纹及重建位相分布均为平行等间距直条纹。

在图3中，物光与参考光在进入BS之前，其主光束相互垂直，而棱镜BS相对于光轴有一个小角度倾斜(倾斜角θ约为2～3°)，结果使参考光主光束相对于物光主光束产生同样的倾斜，从而实现离轴记录。

二、数字全息图的记录和再现

1、平面参考光数字全息图的记录及再现

图4为平面参考光像前预放大数字全息显微记录及再现采用的坐标系统示意图。其中，MO已用单透镜等效表示，焦距为f；x₀-y₀、x_φ-y_φ、x-y、x_i-y_i依次表示物体、MO、全息图和再现像平面，z轴沿系统的光轴方向并通过以上平面的中心；R(x，y)为离轴平面参考光，其传播方向与主轴的夹角为2～3°。此外，图中d₀为MO的物距、d_φ+d＝d_i为其像距、d为全息图的再现距离。

为了表达上的简洁，下面推导中除特别说明外，一般只给山一维形式。

设待测物体的复振幅分布为O(x₀)，MO的孔径函数为

根据菲涅耳衍射公式，忽略无关紧要的常数位相因子，则MO前、后表面的衍射光场复振幅分别为

$U^{\′}\left(x_{\mathrm{\φ}}\right)=\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}O\left(x_0\right)\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2d_0}{(x_{\mathrm{\φ}}-x_0)}^2\right]{\mathrm{dx}}_0---\left(1\right)$

$U\left(x_{\mathrm{\φ}}\right)=U^{\′}\left(x_{\mathrm{\φ}}\right)P\left(x_{\mathrm{\φ}}\right)\exp [-\frac{\mathrm{jk}}{2f}{x}_{\mathrm{\φ}}^2]---\left(2\right)$

CCD平面物光场分布

$O\left(x\right)=\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}U\left(x_{\mathrm{\φ}}\right)\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2d_{\mathrm{\φ}}}{(x-x_{\mathrm{\φ}})}^2\right]{\mathrm{dx}}_{\mathrm{\φ}}---\left(3\right)$

同理，参考光在CCD平面的复振幅分布为

R(x)＝R₀exp[-j2π(f_xx)]                   (4)

式中f_x为平面参考光波在x方向的空间频率，R₀为其振幅。物光与参考光在CCD平面形成的干涉条纹强度分布为

$H\left(x\right)={\left|O\left(x\right)\right|}^2+R_0^2+R^{*}\left(x\right)O\left(x\right)+O{\left(x\right)}^{*}R\left(x\right)---\left(5\right)$

CCD记录的数字全息图为

$H_D\left(x\right)=[H\left(x\right)\⊗\mathrm{rect}\left(\frac{x}{\mathrm{\α\Δx}}\right)]\mathrm{comb}\left(\frac{x}{\mathrm{\Δx}}\right)\mathrm{rect}\left(\frac{x}{L_x}\right)---\left(6\right)$

式中Δx和L_x分别为CCD沿水平方向的像元尺寸及光敏面尺寸，α为其填充因子。

为了讨论的方便，仍然以连续光场形式进行光波场的再现。采用原参考光波R照射全息图，得到|R|²O，经衍射传播可在MO的像面上得到原始像，为实像，其像场光波分布为

$U_{+1}\left(x\right)=R_0^2\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}\mathrm{rect}\left(\frac{x}{L_x}\right)O\left(x\right)\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2d}{(x_i-x)}^2\right]\mathrm{dx}---\left(7\right)$

式中rect(x/L_x)的作用是限制CCD记录的光场范围。由式(7)便可以得到再现像的强度分布和含有二次及一次位相畸变的包裹位相分布，通过适当的位相畸变补偿及解包裹运算即可获得物体的连续位相分布。

2、球面参考光数字全息图的记录及再现

图5为利用球面参考光记录的预放大数字全息光路及坐标系统示意图。与图4不同的是参考光为球面光波，图中δ(x_r，y_r)表示球面参考点源的位置，若使其位于MO的焦平面上(图中F为MO焦点)，形成等波面弯曲的物参光像面数字全息术，有利于位相畸变补偿及位相解包裹的正确进行。

由于CCD光敏面较小，可以认为球面参考光在记录平面内的振幅为常数，设其为R′₀，则球面参考光在CCD平面形成的光场复振幅为

$R\left(x\right)=R_0^{\′}\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2(d_i-f-d)}{(x-x_r)}^2\right]---\left(8\right)$

对于预放大数字全息术来说，要想在MO的像面上得到消晰的再现像，经再现光波照射全息图后，在紧贴全息图后表面得到的应该是物体的衍射光场O(x，y)，为此，再现光波应该是与记录参考光等曲率的球面光波。考虑到x_r、y_r无法精确得到，因此，再现光波采用位于光轴上的球面点源。不失一般性，设其在CCD平面的振幅为1，则其表达式为：

$C\left(x\right)=\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2(d_i-f-d)}{x}^2\right]---\left(9\right)$

山此得到原始像光场的复振幅分布为

$U_{+1}\left(x_i\right)=\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}\mathrm{rect}\left(\frac{x}{L_x}\right)C\left(x\right)R^{*}\left(x\right)O\left(x\right)\×\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2d}{(x_i-x)}^2\right]\mathrm{dx}$

$=A\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}\mathrm{rect}\left(\frac{x}{L_x}\right)O\left(x\right)\exp \left[j2\mathrm{\π}\frac{x_r}{\mathrm{\λ}(d_i-f-d)}x\right]\×\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2d}{(x_i-x)}^2\right]\mathrm{dx}---\left(10\right)$

其中A为常数因子。

3、像面数字全息图的记录和再现

将图4和图5中的记录平面移至系统的成像平面处，即可实现平面和球面参考光像面数字全息术。此时，d_φ＝d_i，即x_i-y_i平面与x-y平面重合。

像面数字全息术记录的是物体本身的像光场信息，因此，无论是平面还是球面参考光像面数字全息图，只要用平行于光轴的平面光波照射全息图，就可以在紧贴全息图后的平面内得到物体的像光场。但为了消除零级衍射项及共轭像的干扰，需要对全息图进行频谱滤波。原始像光场的二维复振幅分布如下：

U₊₁(x，y)＝FT^-1{FT[H(x，y)]·W(x，y)}＝R^*(x，y)O(x，y)      (11)式中“FT”和“FT^-1”分别表示二维傅里叶变换及其逆变换，W(x，y)表示透明滤波窗函数。

三、位相重建

1、常规位相重建方法

1)、菲涅耳变换法

菲涅耳变换重建法是最早被提出来、也是用得最多的一种重建方法，它简单、快捷，因此，我们首先来讨论它。菲涅耳变换重建法基于菲涅耳衍射理论，需要满足菲涅耳近似条件，这个条件为

$z_0\≥{\left\{\frac{\mathrm{\π}}{4\mathrm{\λ}}{[{(x_0-x)}^2+{(y_0-y)}^2]}^2\right\}}_{\max }^{1/3}---\left(12\right)$

其中，z₀为观察平面x-y与衍射孔径平面x₀-y₀之间的距离。

根据菲涅耳衍射公式和傅里叶变换的定义，若重建光波在CCD平面上的分布为C(x，y)，则在像平面上的衍射光波的复振幅为

$U(x_i,y_i)=\frac{\exp \left(\mathrm{jk}{z}_i\right)}{\mathrm{j\λ}{z}_i}\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}C(x,y)H(x,y)\exp \left\{\frac{\mathrm{jk}}{2z_i}\right[{(x_i-x)}^2+{(y_i-y)}^2\left]\right\}\mathrm{dxdy}$

$=\frac{\exp \left({\mathrm{jkz}}_i\right)}{{\mathrm{j\λz}}_i}\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2z_i}(x_i^2+y_i^2)\right]\mathrm{FT}\left\{C(x,y)H(x,y)\exp \right[\frac{\mathrm{jk}}{2z_i}(x^2+y^2)\left]\right\}---\left(13\right)$

其中，FT{}表示二维傅里叶变换，H(x，y)为所记录的全息图，z_i为像平面与全息图平面之间的距离。实际中，上式是通过离散傅里叶变换的快速算法(FFT)实现的。但为了表达上的方便，在此及以下的分析中，通常只写山相应的连续形式。

从式(13)可知，利用菲涅耳变换重建算法，只需要作一次傅里叶变换即可得到像光场的分布。

菲涅耳变换重建表达式(13)是由菲涅耳衍射公式得来的，光在空间总是向前传播的，因此，公式中的参量z_i表示光波传播的距离，总是正值。这种情况对应着再现像平面位于CCD平面后方，即再现像是实像的情况。那么，对于数字全息中的虚像如何再现呢？

从系统的角度来看，式(13)表达的是一种变换，可以称作菲涅耳变换。物光波从CCD平面传播到其后方像平面的过程是一个衍射过程，可以用菲涅耳公式表示，若我们把这个变换看作正菲涅耳变换的话，则光波从CCD平面衍射最后反向会聚到其前方形成虚像的过程就可以等效为一个逆菲涅耳变换的过程。也就是说，在数字全息中，虚像光场的计算也可以通过式(13)表达的变换进行计算，只不过这时应将公式的距离z_i换成-z_i。这个结论不仅可用于菲涅耳变换重建法中，对于下面卷积重建法、角谱重建法也是适用的。

2)、卷积法

基尔霍夫衍射积分公式和瑞利-索末菲衍射积分公式都是衍射在空间的准确描述，卷积重建法是基于瑞利-索末菲衍射积分公式和线性系统理论而得到的。根据瑞利-索末菲衍射积分公式，上述衍射场的复振幅表示为

$U(x_i,y_i)=\frac{1}{\mathrm{j\λ}}\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}C(x,y)H(x,y)\frac{\exp \left(\mathrm{jk\ρ}\right)}{\mathrm{\ρ}}\cos \mathrm{\θdxdy}---\left(14\right)$

其中

由线性系统理论，(14)式可以写成如下卷积形式：

$U(x_i,y_i)=\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}C(x,y)H(x,y)g(x_i-x,y_i-y)\mathrm{dxdy}---\left(15\right)$

式中

$g(x,y)=\frac{1}{\mathrm{j\λ}}\frac{\exp \left[\mathrm{jk}{(z_i^2+x^2+y^2)}^{1/2}\right]}{z_i^2+x^2+y^2}---\left(16\right)$

为自由空间的脉冲相应。根据卷积理论，(15)式可以表示为如下的傅里叶变换形式：

U＝FT^-1[FT(H·C)·FT(g)]               (17)

由式(17)可知，利用卷积法重建需要作三次傅里叶变换，而菲涅耳近似重建法只需要作一次傅里叶变换，因而菲涅耳近似法重建速度较快。此外，二者有以下根本的区别：若把全息图平面视为空域，则经(13)式变换后再现像到了频域，冈此再现像面的像素大小，即抽样间隔为

${\mathrm{\Δx}}_i=\frac{{\mathrm{\λz}}_i}{N_x\mathrm{\Δx}},{\mathrm{\Δy}}_i=\frac{{\mathrm{\λz}}_i}{N_y\mathrm{\Δy}}---\left(18\right)$

这个间隔与再现像的分辨率是一致的。而由(17)式表示的变换最终又回到了空域，因此卷积法重建像面的像素大小为

Δx_i＝Δx，Δy_i＝Δy                      (19)

根据全息原理，数字全息成像的分辨率是由记录时全息图的数值孔径决定的，冈此，记录高数值孔径全息图，可以实现高分辨率成像。然而，如果采用卷积法再现，由于再现像面的抽样间隔等于CCD的像元大小，即使理论上可以达到极高的分辨率，实际再现中物面上小于CCD像元尺寸的精细结构也是不能被再现出来的。也就是说，常规的卷积再现法限制了数字全息成像系统的分辨率。

3)、角谱法

角谱理论是衍射的平面波理论，它严格遵从标量衍射的亥姆霍兹方程，而且没有任何限制条件，因此它是衍射现象在频域的准确描述。其表达式如下

G(f_x，f_y)＝G₀(f_x，f_y)G_B(f_x，f_y)           (20)

其中

$G_B(f_x,f_y)=\exp \left[j\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}z\sqrt{1-{\left(\mathrm{\λ}{f}_x\right)}^2-{\left(\mathrm{\λ}{f}_y\right)}^2}\right]---\left(21\right)$

为光波在自由空间的传递函数，G₀(f_x，f_y)为孔径平面上光波场的角谱。式(20)表达了光波场从衍射屏传播到相距为z的观察屏的频谱变化关系。自由空间的传递函数与脉冲响应之间有如下的关系：

G_B(f_x，f_y)＝FT{g(x，y)}            (22)

由全息原理，用重建光波C(x，y)照射全息图时，紧贴衍射屏后表面的光波场的频谱为

G₀(f_x，f_y)＝FT{C(x，y)H(x，y)}           (23)

根据角谱理论，可得到离全息图平面距离为z_i的像平而x_i-y_i上再现光场的频谱，对其作逆傅里叶变换即为再现光波场的复振幅分布。

U＝FT^-1{FT[C·H]·G_B}          (24)

可见，由角谱方法重建全息图需要经过一次正傅里叶变换和一次逆傅里叶变换，因此再现像平面的像素大小也等于CCD的像元尺寸。

此外，菲涅耳衍射公式也可以写成卷积形式和角谱形式。冈此，除了上述基于严格的衍射理论之上的卷积重建法和角谱重建法以外，还应该存在基于菲涅耳衍射理论的卷积重建法和角谱重建法。

根据线性系统理论，菲涅耳变换重建公式(13)也可以写成如下的卷积形式：

U＝[H(x，y)C(x，y)]*g_F(x，y)         (25)

其中

$g_F=\frac{\exp \left({\mathrm{jkz}}_i\right)}{{\mathrm{j\λz}}_i}\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2z_i}(x^2+y^2)\right]---\left(26\right)$

为菲涅耳衍射系统的脉冲响应。在近轴近似条件下，由式(16)可以得到式(26)。利用卷积定理，(24)式可以写为

U＝FT^-1[FT(H·C)·FT(g_F)]            (27)

式(27)表达的重建方法可以称为菲涅耳卷积法。

对式(26)作傅里叶变换，得到

$\mathrm{FT}\left\{g_F\right\}=\exp \left({\mathrm{jkz}}_i\right)\exp [-\mathrm{j\π\λ}{z}_i(f_x^2+f_y^2)]---\left(28\right)$

与由式(21)在菲涅耳近似条件下得到的结果是一样的，因此称为菲涅耳衍射系统的传递函数，并用G_F表示。这样式(27)又可以写为

U＝FT^-1[FT(H·C)·G_F]              (29)

与式(24)相似，式(29)表达的重建算法可以称为菲涅耳角谱法。

2、非常规位相重建方法

设全息图平面的物光波和参考光波复振幅分别为O(x，y)、R(x，y)，在CCD平面全息图分布为

H(x，y)＝|O(x，y)+R(x，y)|²＝|O(x，y)|²+|R(x，y)|²+O(x，y)R^*(x，y)+O^*(x，y)R(x，y)    (30)

|O(x，y)|²是与物函数相关的0级项，它表示物函数的自相关。此项的消除是数字全息再现的关键。式(30)可以写成下面的形式：

$H(x,y)={\left|R(x,y)\right|}^2{|1+\frac{O(x,y)}{R(x,y)}|}^2=A^2{|1+\hat{O}(x,y)|}^2=A^2[1+\hat{O}(x,y)][1+{\hat{O}}^{*}(x,y)]---\left(31\right)$

其中

其中

的复共轭，A²＝|R(x，y)|²为记录参考光的光强分布。由式(31)可得如下关系：

$\ln \left[\frac{H(x,y)}{{\left|R(x,y)\right|}^2}\right]=\ln [1+\hat{O}(x,y)]+\ln [1+{\hat{O}}^{*}(x,y)]---\left(32\right)$

可以证明，在|R(x，y)|＞|O(x，y)|的情况下，若

完全分布于某一象限范围(如第I象限)，则

必完全位于与其对称的象限内(第III象限)。这样，就可以将

彻底滤出，之后再对其作指数运算，即可得到

由此可以得到物光波复振幅分布 $O(x,y)=\hat{O}(x,y)R(x,y).$

可见，利用上述非常规方法重建全息图，须满足如下条件：

(1)参考光强度远于物光强度，即|R(x，y)|²＞|O(c，y)|²。参考光强比物光强大得越多，重建精确到越高(全息记录过程中，参考光强通常是物光强的3-5倍，因而这个条件是满足的)；

(2)物体的频谱范围在一个象限范围内，且所记录的全息图的+1及-1级谱在空间不能重叠，并且要沿着谱面的对角线方向排列；

(3)参考光在全息图平面的强度分布需要预先知道(可以在记录过程中随时用CCD记录下来)。

3、非常规位相重建步骤

根据上面的分析可见，全息图函数可以看作两个函数的乘积，因此可以用基于相乘信号的同态信号处理技术对其进行重建，其处理流程框图如图6所示.图中，H(x，y)为所记录的数字全息图。

全息图的非常规重建步骤如下：

(1)将记录的全息图除以测得的参考光强度分布，然后对其取自然对数，得到： $\ln \left[\hat{H}(x,y)\right]=\ln [1+\hat{O}(x,y)]+\ln [1+{\hat{O}}^{*}(x,y)];$

(2)然后对上式作傅里叶变换，获得其频谱分布图

(3)选取频谱图中与物体频谱相对应的四分之一谱面大小(即一个象限)，得到滤波后的全息图对数的频谱分布 $S_{\mathrm{Fil}}(f_x,f_y)={\mathrm{FT}}_{\mathrm{Fil}}\left\{\ln \right[\hat{H}(x,y)\left]\right\};$

(4)对S_Fil(f_x，f_y)作逆傅里叶变换，即可得到

再对其作指数运算，可得到

(5)对参考光波波矢量进行粗测，得到其传播矢量，从而获得粗略的参考光复振幅分布R(x，y)＝|R(x，y)|exp[j2π(k_xx+k_yy)]；

(6)由 $\hat{O}(x,y)=O(x,y)/R(x,y)$ 求出O(x，y)；

(7)利用角谱衍射公式计算像平面的光波场复振幅分布(对于像面数字全息术，衍射计算可以省略)；

(8)根据自动位相补偿方法对得到的波前畸变进行补偿，获得物光波场的真实位相分布。

四、位相畸变的矫正

1、双曝光法

双曝光法是指在有样品和无样品两种情况下分别记录一幅全息图，然后利用相同的重建方法对两幅全息图分别进行位相重建，最后将获得的两个位相图相减即可得到物体的位相分布。

2、自动位相补偿法

在相位图中选取一部分噪声小的区域，并在该区域上建立X轴，以及与其垂直的Y轴；沿X轴获得一定数量的位相数据，同时沿Y轴获取与X轴上位相数量对应的位相数据，并执行最小二乘法，提取位相数据；所述最小二乘法优选基于横向剪切干涉的最小二乘法；对提取的位相数据进行线性拟合，分别得到X轴和Y轴方向的各项拟合系数，从而获得实际的位相畸变表达式，即位相掩膜；将得到的位相掩模与获得的位相图像相减，矫正一次位相畸变，从而获得位相畸变矫正的位相图像。

3、频移法

对于离轴记录引入的一次位相畸变，可以通过获取全息图+1频谱中心坐标之后，将该频谱移至重建平面中心，同时滤除0级和-1级谱，然后进行位相重建。

4、平均法

该方法同样仅适用于光场的一次位相畸变补偿。平均法是利用再现光场位相的线性变化性质，对样品附近平坦区域的位相分布分别沿水平和竖直方向求偏导，然后分别求出其平均值，从而得到一次位相畸变分布，再与原始位相分布相减，即可得到无畸变的位相分布。

五、实验结果

为了验证非线性重建算法在实验中的可行性，首先利用平面参考光预放大数字全息显微光路对分辨率测试板进行了实验，结果如图7所示，其中图7(a)、(b)、(c)和(d)分别是分辨率板的全息图、全息图的频谱分布、常规算法强度重建像和非线性算法的强度重建像。实验中，参考光与物光夹角θ约为1.51°、光强比γ约为1.53。可见，利用非线性重建算法得到的结果明显优于常规算法得到的结果。更为重要的是，利用非线性算法避免到了手工选取滤波窗口的过程，因而可以真正实现全息图的实时再现。

保持以上光路不变，将分辨率板换为人体血红细胞，为了保证系统具有更高的成像分辨率和更好的成像像质，减小显微物镜的成像距离到d_i＝273mm，记录距离到d＝44mm，结果如图8所示，其中图(a)为血红细胞的全息图，(b)为全息图的频谱分布，图中的正负一级谱与零级谱有部分交叠但又彼此分离，首先对该频谱图进行滤波，两种算法的滤波范围分别如图白色方框和白色虚线圈出的区域所示，有部分零级谱包含在再现光场的区域中。然后利用常规算法和非线性重建算法对全息图进行进行数值重建，重建结果如图9所示，常规算法得到的图9(a)受到了零级谱的影响，噪声比较历害，从而直接影响了位相的重建的准实时性，图9(c)、(e)为常规算法再现的二维和三维位相分布，通过位相预补偿和基于多线对平均的自动位相补偿算法后仍然不能高精准的再现血红细胞的位相信息；而采用非线性重建算法得到的结果能够很好地抑制零级项，结果如图9(b)所示，通过位相预补偿后直接得到了图9(d)和(f)所示的二维和三维位相结果，细胞表面光滑、形态清晰可见。实验结果与理论分析、计算机模拟结果高度吻合，表明了基于同态信号处理技术的非线性重建算法高精度、准实时的再现特点，为数字全息显微术进一步的发展奠定了基础。

Claims (3)

1.一种获取三维显微图像的方法，开启激光器，产生的激光经第一半波片和一偏振分束棱镜后，分为物光波和参考光波；通过第一反光镜和第二反光镜反射使得物光波和参考光波垂直相交，在相交处放入合束镜，使得物光波和参考光波经合束镜后重合为一束光；在第一反光镜后依次放入第一扩束准直器、透明物体和第一显微物镜，调节第一扩束准直器，使得物光波经第一扩束准直器后成为第一平行光，利用第一平行光照射透明物体；使得透明物体通过第一显微物镜成像，将CCD置于所述合束镜后一定距离；在第二反光镜之前放入第二扩束准直器，在第二反光镜之后放入第二显微物镜，调节第二扩束准直器，使得参考光波经第二扩束准直器后成为第二平行光，利用第二反光镜将第二平行光导入第二显微物镜；旋转合束镜，使得物光波倾斜入射合束镜；其中第一显微物镜和第二显微物镜到合束镜的距离相等；通过CCD采集物光波和参考光波在CCD靶面上形成的全息图，将所述全息图传输到计算机；其中CCD靶面所在平面的物光波和参考光波复振幅分别为O(x，y)和R(x，y)，而上述全息图的复振幅为H(x，y)。

所述获取三维显微图像的方法的特征在于：包括以下步骤：

1)将上述全息图除以测得的参考光强度分布，然后对其取自然对数，得到：

$\ln \left[\hat{H}(x,y)\right]=\ln [1+\hat{O}(x,y)]+\ln [1+{\hat{O}}^{*}(x,y)];$ 其中 $\hat{H}(x,y)=\frac{H(x,y)}{{\left|R(x,y)\right|}^2},$ $\hat{O}(x,y)=\frac{O(x,y)}{R(x,y)},$

为的复共轭；

2)然后对上式作傅里叶变换，获得其频谱分布图

其中FT{}为傅里叶变换，f_x，f_y为x方向和y方向的空间频率；

3)选取频谱图中与物体频谱相对应的四分之一谱面大小(即一个象限)，得到滤波后的全息图对数的频谱分布 $S_{\mathrm{Fil}}(f_x,f_y)={\mathrm{FT}}_{\mathrm{Fil}}\left\{\ln \right[\hat{H}(x,y)\left]\right\};$

4)对S_Fil(f_x，f_y)作逆傅里叶变换，即可得到

再对其作指数运算，可得到

5)对参考光波波矢量进行粗测，得到其传播矢量，从而获得粗略的参考光复振幅分布R(x，y)；

6)由 $\hat{O}(x,y)=O(x,y)/R(x,y)$ 求出O(x，y)；

7)利用角谱衍射公式计算像平面的光波场复振幅分布(对于像面数字全息术，衍射计算可以省略)；

8)根据自动位相补偿方法对得到的位相畸变进行补偿，获得物光波场的真实位相分布。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述角谱衍射公式为：

G(f_x，f_y)＝G₀(f_x，f_y)G_B(f_x，f_y)；

其中

为光波在自由空间的传递函数，f_x，f_y为x方向和y方向的空间频率，G₀(f_x，f_y)为孔径平面上光波场的角谱，G(f_x，f_y)为从孔径平面传播距离z后的光波场角谱，该式表达了光波场从衍射屏传播到相距为z的观察屏的频谱变化关系。

3.如权利要求1所述的方法，其中自动位相补偿方法为：在相位图中选取一部分噪声小的区域，并在该区域上建立X轴，以及与其垂直的Y轴；沿X轴获得一定数量的位相数据，同时沿Y轴获取与X轴上位相数量对应的位相数据，并执行最小二乘法，提取位相数据；所述最小二乘法优选基于横向剪切干涉的最小二乘法；对提取的位相数据进行线性拟合，分别得到X轴和Y轴方向的各项拟合系数，从而获得实际的位相畸变表达式，即位相掩膜；将得到的位相掩模与获得的位相图像相减，矫正一次位相畸变，从而获得位相畸变矫正的位相图像。

Images