CN102749834A - 一种光学显微成像系统及成像方法 - Google Patents

Abstract

一种光学显微成像系统及成像方法，属于光学显微镜领域，该系统包括激光器、半波片、偏振分束棱镜、扩束准直器、显微物镜、反光镜、合束镜、CCD以及计算机。激光器发出激光后，偏振分束棱镜分为两束光，其中一束光透射透明物体，所述两束光经合束镜后在CCD上干涉成像，CCD将获得的图像传输到计算机中，并且在计算机中通过数字重建，获得物体的显微强度图像和位相图像，从而获得物体的三维显微图像。

Description

一种光学显微成像系统及成像方法

技术领域

本申请涉及一种显微成像系统，以及通过该系统获得图像的方法，属于光学显微镜领域。

背景技术

传统的显微成像，主要是通过透镜组获得，这样获得的显微图像也只是成像物体的强度图像。随着半导体技术和激光技术的不断发展，现阶段出现了一种数字全息术，其能够在获得成像物体的强度图像的同时，获得成像物体的位相图像，或者说其能够获得成像物体的三维图像。

数字全息术利用光电转换器件(CCD或CMOS)代替传统的全息干板记录干涉条纹，然后送入计算机并通过数值计算重构物体的强度及位相分布。与传统的光学全息相比，数字全息具有许多突出的优点，这些优点使数字全息术得到了广泛关注，已成为一个研究热点。近年来，随着记录飞秒级超快瞬态过程的脉冲数字全息技术的出现，数字全息术更展现出在科学研究及光学无损检测中的活力。

数字全息显微成像是数字全息术的重要应用之一，其最常见的记录光路是平面参考光预放大离轴菲涅耳光路，但该光路会引入二次位相失真，使光场产生很大的位相跳变，增加位相解包裹难度，并且不能最大限度地利用记录器件的有限带宽。球面参考光数字全息术不仅可以充分利用记录器件的带宽，而且可以通过调节参考光路中显微物镜(MO)的位置，使之产生的球面光波与物光路中MO产生的球面光波相对于CCD具有相等的曲率，从而消除物光路中MO引入的二次位相失真。此外，像面数字全息术具有记录过程中可实时观察样品以便选择记录区域、再现过程简单及可实现高质量成像等特点。像面干涉术在许多高精度位相测量技术中都获得了广泛应用，如傅里叶位相显微术、Hilbert位相显微术及衍射位相显微术等。因此，将与物光波同曲率的球面参考光引入像面数字全息术中，构建数字全息记录系统，定可实现高质量显微成像。然而，到目前为止，还没有看到对这种数字全息系统的记录及再现方面较为详尽的研究报道。

发明内容

本发明提供一种光学显微成像系统，本发明的目的是获取高分辨率的三维显微图像。本发明一方面提供一套光学显微成像系统：包括激光器、第一和第二半波片、偏振分束棱镜、第一和第二扩束准直器、第一和第二显微物镜、第一和第二反光镜、合束镜、CCD以及计算机；其特征在于：激光器产生激光，激光经第一半波片，通过偏振分束棱镜后分为光束A和光束B，光束A经第一反射镜反射进入第一扩束准直器成为第一平行光，所述第一平行光照射透明物体并透过所述透明物体后进入第一显微物镜，通过第一显微物镜后，经所述合束镜到达CCD靶面上，所述透明物体通过第一显微物镜成像在CCD靶面上，光束B经过第二片半波片后通过第二扩束准直器成为第二平行光，所述第二平行光经第二反射镜反射进入第二显微物镜，通过第二显微物镜后，经合束镜到达CCD靶面上，与所述透明物体通过第一显微物镜在CCD靶面上所成的像发生干涉，形成干涉图像；所述CCD采集到的图像被传输到计算机并显示。

本发明另一方面提供一种显微成像方法，该显微成像方法包括以下步骤：

1)开启激光器，产生的激光经第一半波片，偏振分束棱镜后，分为光束A和光束B；

2)通过第一反光镜和第二反光镜反射使得光束A和光束B垂直相交，在相交处放入合束镜，使得光束A和光束B经合束镜后重合为一束光；

3)在第一反光镜后依次放入第一扩束准直器、透明物体和第一显微镜，调节第一扩束准直器，使得光束A经第一扩束准直器后成为第一平行光，利用第一平行光照射透明物体；使得透明物体通过第一显微物镜成像，将CCD置于所述像所在的位置；

4)在第二反光镜之前放入第二扩束准直器，在第二反光镜之后放入第二显微镜，调节第二扩束准直器，使得光束B经第二扩束准直器后成为第二平行光，利用第二反光镜将第二平行光导入第二显微物镜；

5)旋转合束镜，使得光束A倾斜入射合束镜；

6)通过CCD采集光束A和光束B在CCD靶面上形成的图像，所述图像传输到计算机，所述图像为全息图；

7)对所述全息图进行傅里叶变换，得到其频谱；用窗口滤波，将零级频谱和负1级频谱滤除，剩余正1级频谱；

8)对正1级频谱进行逆傅里叶变换得到成像物体的再现像，该再现像包括强度图像和包裹位相图像；

9)对上述再现像中的包裹位相图像进行位相解包裹，获取成像物体的解包裹位相图像。

在上述步骤9)中得到的物体的再现像中的解包裹位相图像存在位相失真，因此在重建位相图像时，需要对失真的位相进行复原处理，可采用以下方法进行位相复原处理；

在上述解包裹相位图边缘部分中选取一部分噪声小的区域，并在该区域上建立X轴，以及与其垂直的Y轴；沿X轴提取一定数量的位相数据，同时沿Y轴提取与X轴上位相数量对应的位相数据；对提取的位相数据基于最小二乘法进行线性拟合，分别得到X轴和Y轴方向的各项拟合系数，从而获得实际的位相失真表达式，即位相掩膜；将得到的位相掩模与步骤9)中获得的解包裹位相图像相减，从而获得消除了位相失真的位相图像，即物体的三维形貌图像。

附图说明

图1是本发明的显微成像系统的结构图；

图2是图1所对应的简化的成像原理图；

图3(a)是无样品时CCD获取的全息图像，图3(b)为图3(a)重建的位相图；

图4(a)是透明物体为分辨率板USAF1951的全息图，图4(b)为图4(a)的频谱图，图4(c)为USAF1951的重建强度图像；

图5(a)是透明物体为洋葱细胞的全息图，图5(b)为重建的包裹位相图，图5(c)是解包裹位相，图5(d)、(e)为分别沿两个方向的拟合结果图，图5(f)、(g)为失真校正后的包裹位相图和解包裹位相图，图5(h)是图5(g)的三维显示图。

具体实施例

图1为光学显微成像系统示意图。由He-Ne激光器1发出的波长为632.8nm的激光经半波片2后经偏振分束棱镜3后分为光束A和光束B，并分别经扩束准直器4后，一束形成照明样品6(透明物体)的平面光波，并经显微物镜MO₁(7)后形成放大的物光波，另一束经显微物镜MO₂(8)后形成发散的球面参考光波，两束光经棱镜BS(即合束器9)合束后发生干涉，并被位于样品像平面的CCD传感器10所记录，随后送往计算机11进行处理，图中5表示反光镜。为了消除MO₁引入的二次位相失真，MO₂应与MO₁完全相同，必须精确调整其位置，使平行光经它们后所形成的球面光波相对CCD有完全相同的波面弯曲。同时需要精调棱镜BS的倾角，使所记录的全息图频谱沿对角线方向分离。具体调节方法如下：首先，挡住参考光，在物光路中垂直光束方向放置一张擦镜头纸，调节物平面到显微物镜的距离及CCD位置，使物体被放大合适的倍数并在CCD中成清晰的像。其次，物光路中不放样品，精调MO₂的位置，使所记录的全息图条纹及重建位相分布均为平行等间距直条纹。

为便于分析，建立如图2所示的坐标系统，其中，显微物镜已用单透镜等效表示。物平面、MO₁平面及CCD平面分别用x₀，y₀)、(x_φ，y_φ)及(x，y)表示(图中y₀、y_φ和y三个坐标轴未画出)，z轴沿系统的光轴方向并通过以上三个平面的中心，d₀、f和d_i分别为物距、显微物镜焦距和像距。在图1中，物光与参考光在进入BS之前，其主光束相互垂直，而棱镜BS相对于光轴有一个小角度倾斜(倾斜角θ约为2-3°)，结果使参考光主光束相对于物光主光束产生同样的倾斜，从而实现离轴记录。在图2中，我们令MO₂相对于MO₁倾斜同样的角度θ(图中θ被放大了)，而BS不发生倾斜，从而达到与图1中完全一样的效果。

为了完全抵消MO₁引入的二次位相畸变，须使平面光波经MO₁、MO₂后所形成的球面光波相对CCD具有相同的弯曲，也即使图2中MO₂的焦点F₂在光轴上的投影点与MO₁的焦点F₁重合。F₂点的坐标可以表示为(x-x_r，y-y_r，d_i-f)，其中x_r、y_r的大小决定了全息图±1级谱与0级谱分离的程度。

根据菲涅耳衍射公式，略去无关紧要的常数位相因子，当物光路中不放物体时，MO₁后表面的光场复振幅分布为

$U(x_{\mathrm{\φ}},y_{\mathrm{\φ}})=A(x_{\mathrm{\φ}},y_{\mathrm{\φ}})\exp [-\frac{\mathrm{jk}}{2f}(x_{\mathrm{\φ}}^2+y_{\mathrm{\φ}}^2)]P(x_{\mathrm{\φ}},y_{\mathrm{\φ}})---\left(1\right)$

式中A(x_φ，y_φ)为物光路中照明样品的平面光波振幅，根据数字全息术的特点，不失一般性，通常设其为1。若设MO₁的孔径半径为R，则 $P(x_{\mathrm{\φ}},y_{\mathrm{\φ}})=\mathrm{circ}(\sqrt{x_{\mathrm{\φ}}^2+y_{\mathrm{\φ}}^2}/R)=\mathrm{circ}(r/R)$ 为其孔径函数。则CCD平面的物光波复振幅为

$O(x,y)=\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{{2d}_i}(x^2+y^2)\right]$

$\×\underset{\∞}{\∫\∫}U(x_{\mathrm{\φ}},y_{\mathrm{\φ}})\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{{2d}_i}(x_{\mathrm{\φ}}^2+y_{\mathrm{\φ}}^2)\right]\exp [-j2\mathrm{\π}(\frac{x}{{\mathrm{\λd}}_i}{x}_{\mathrm{\φ}}+\frac{y}{{\mathrm{\λd}}_i}{y}_{\mathrm{\φ}})]{\mathrm{dx}}_{\mathrm{\φ}}{\mathrm{dy}}_{\mathrm{\φ}}---\left(2\right)$

对于理想成像情况，P(x_φ，y_φ)＝1，带入上式得到：

$O(x,y)=\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{{2d}_i}(x^2+y^2)\right]\underset{\∞}{\∫\∫}\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2}(\frac{1}{d_i}-\frac{1}{f})(x_{\mathrm{\φ}}^2+y_{\mathrm{\φ}}^2)\right]\exp [-j2\mathrm{\π}(\frac{x}{{\mathrm{\λd}}_i}{x}_{\mathrm{\φ}}+\frac{y}{{\mathrm{\λd}}_i}{y}_{\mathrm{\φ}})]{\mathrm{dx}}_{\mathrm{\φ}}{\mathrm{dy}}_{\mathrm{\φ}}$

$=\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{{2d}_i}(x^2+y^2)\right]\×\mathrm{FT}{\left\{\exp \right[\frac{\mathrm{jk}}{2}(\frac{1}{d_i}-\frac{1}{f})(x_{\mathrm{\φ}}^2+y_{\mathrm{\φ}}^2)\left]\right\}}_{|f_x=\frac{x}{{\mathrm{\λd}}_i},f_y=\frac{y}{{\mathrm{\λd}}_i}}---\left(3\right)$

式中

“FT”表示二维傅里叶变换，f_x、f_y分别表示空间频率，经计算得：

$O(x,y)=O_0\exp \left[\frac{\mathrm{jk}}{2(d_i-f)}(x^2+y^2)\right]---\left(4\right)$

同理，参考光在CCD平面形成的光波场复振幅为

$R(x,y)=R_0\exp \left\{\frac{\mathrm{jk}}{2(d_i-f)}\right[{(x-x_r)}^2+{(y-y_r)}^2\left]\right\}---\left(5\right)$

其中R₀为参考光在CCD平面的振幅。CCD平面干涉条纹强度分布为

H(x，y)＝|R(x，y)+O(x，y)|²                     (6)

将R(x，y)、O(x，y)的表达式带入上式，得到

$H(x,y)=R_0^2+O_0^2+2R_0{O}_0\cos \mathrm{Dj}---\left(7\right)$

其中

为物光与参考光之间的位相差分布，由此可以求出全息图条纹的局部空间频率分布：

可见，条纹空间频率与全息图平面坐标(x，y)无关，即对于一个确定的记录系统，全息图条纹空间频率为定值，表明等曲率物参光像面数字全息图为平行等间距的直条纹分布。

接下来分析全息图数字再现。像面数字全息图记录的是物体的放大像，且全息图记录距离为零，因此，菲涅耳衍射不成立。角谱算法没有最小再现距离的限制，又可以很方便地用于频域滤波处理，因此，采用角谱算法对像面数字全息图进行数值再现是恰当的。对全息图进行傅里叶变换，然后滤除0级及共轭像频谱(即负1级频谱)，从而得到原始像光场的复振幅分布

U₊₁(x，y)＝FT^-1<{FT[H(x，y)]}_Fi1>＝R^*(x，y)O(x，y)                    (9)

式中“FT^-1”表示二维逆傅里叶变换，角标“Fil”表示频谱滤波。将式(4)、(5)带入上式，得到

$U_{+1}(x,y)=\mathrm{Aexp}\left[\frac{-\mathrm{jk}}{d_i-f}(x_{r}x+y_{r}y)\right]---\left(10\right)$

式中同样可得到共轭像光场的复振幅分布，它与原始像光场有类似的形式。对于确定的记录系统来说，(10)式中除x、y之外，其余参量均为定值，因此，再现像光场发生了一次位相失真，表明在不放被测物体时，重建像光场的位相为平行等间距直条纹分布。

由以上分析可知，可以根据不放物体时所记录的全息图条纹及再现的位相分布是否为平行直条纹来精调参考光路中显微物镜的位置，以确保再现像光场中二次位相因子的彻底消除。

根据上面的分析，由上述显微成像系统得到的重建像光场存在一次位相失真，当对位相信息进行重建时，必须对此失真加以消除。关于像光场的一次位相失真的消除，通过以下位相复原法进行失真消除：

1、对全息图进行数值再现，得到再现像的包裹位相图，对包裹位相图像进行解包裹处理，得到解包裹位相图；

2、在上述解包裹相位图边缘部分中选取一部分噪声小的区域，并在该区域上建立X轴，以及与其垂直的Y轴；沿X轴提取一定数量的位相数据，同时沿Y轴提取与X轴上位相数量对应的位相数据；对提取的位相数据基于最小二乘法进行线性拟合，分别得到X轴和Y轴方向的各项拟合系数，从而获得实际的位相失真表达式，即位相掩膜；将得到的位相掩模与获得的解包裹位相图像相减，从而获得消除了位相失真的位相图像。

上述显微成像系统中，在没有放入透明物体时所记录的图像的部分放大及原始像光场的位相重建结果如图3所示。两幅图中的条纹均为平行等间距直条纹分布。图3(a)为全息图部分放大图，图3(b)为对图3(a)所示的全息图进行傅里叶变换后得到的位相分布图。

在上述显微成像系统中，用美国空军分辨率测试板(USAF1951)作为透明物体，在CCD上获得的图像如图4(a)所示，其为USAF1951的全息图像，该全息图像的频谱图如图4(b)所示，从图4(b)中可以看出，由于光束A倾斜入射到合束镜中，因此其正负1级频谱与零级频谱分离，这为重建物体图像提供了便利。通过对USAF1951的全息图的再现，得到USAF1951的强度再现图如图4(c)所示，此分辨率板最精细的结构9.3组被清晰再现，该组线条宽度为0.78微米，表明系统的成像分辨率超过了0.78微米。由此可见，上述显微成像系统能够得到亚微米级别的分辨率，然而该显微成像系统不仅能得到物体的强度显微图像，而且还能够得到物体的三维立体显微图像，下面利用洋葱细胞进行显微成像进行说明。

从洋葱上取一薄皮层，作为上述显微成像系统中的透明物体，然后开启激光器，通过CCD采集图像，CCD采集的图像如图5(a)所示。图5(b)是位相重建后得到的包裹位相图，图5(c)是其解包裹位相，可以看到整体的线性位相倾斜。在图5(c)右下角的一个细胞上沿水平和竖直方向分别提取位相数据，然后利用前文所述的位相失真校正方法进行位相复原，图5(d)、(e)分别沿两个方向的拟合结果。由此求出一次位相失真掩膜，并与失真位相相减，即可求出消除了位相失真的包裹位相和解包裹位相，如图5(f)、(g)所示。图5(h)是图5(g)的三维显示。

Claims (10)

1.一种光学显微成像系统，包括光源，图像获取单元和图像处理单元。

2.根据权利要求1所述的显微成像系统：所述光源为激光器，所述图像获取单元包括第一和第二半波片、偏振分束棱镜、第一和第二扩束准直器、第一和第二显微物镜、第一和第二反光镜、合束镜、CCD；图像处理单元包括计算机；其特征在于：激光器产生激光，激光经第一半波片，通过偏振分束棱镜后分为光束A和光束B，光束A经第一反射镜反射进入第一扩束准直器成为第一平行光，所述第一平行光照射透明物体并透过所述透明物体后进入第一显微物镜，通过第一显微物镜后，经所述合束镜到达CCD靶面上，所述透明物体通过第一显微物镜成像在CCD靶面上，光束B经过第二半波片后通过第二扩束准直器成为第二平行光，所述第二平行光经第二反射镜反射进入第二显微物镜，通过第二显微物镜后，经合束镜到达CCD靶面上，与所述透明物体通过第一显微物镜在CCD靶面上所成的像发生干涉，形成干涉图像；所述CCD采集到的图像被传输到计算机。

3.根据权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述第一和第二扩束准直器均由中心具有针孔的金属圆薄板、显微物镜以及凸透镜构成。

4.根据权利要求3所述的成像系统；其特征在于，所述针孔的孔径为25-10微米，优选15微米；显微物镜的放大倍数为20-60，优选40。

5.根据权利要求2所述的成像系统，其特征在于，第一和第二显微物镜的放大倍率为40，第一和第二显微物镜到合束镜的距离相等。

6.根据权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述合束镜为非偏振合束镜，且所述光束A倾斜入射合束镜。

7.根据权利要求6所述的成像系统，其特征在于，所述光束A与合束镜的表面法线的夹角为2-3°。

8.一种利用权利要求2-7任一项所述的光学显微成像系统获取图像的方法：其包括以下步骤：

1)开启激光器，产生的激光经第一半波片，偏振分束棱镜后，分为光束A和光束B；

2)通过第一反光镜和第二反光镜反射使得光束A和光束B垂直相交，在相交处放入合束镜，使得光束A和光束B经合束镜后重合为一束光；

3)在第一反光镜后依次放入第一扩束准直器、透明物体和第一显微镜，调节第一扩束准直器，使得光束A经第一扩束准直器后成为第一平行光，利用第一平行光照射透明物体；使得透明物体通过第一显微物镜成像，将CCD置于所述像所在的位置；

4)在第二反光镜之前放入第二扩束准直器，在第二反光镜之后放入第二显微镜，调节第二扩束准直器，使得光束B经第二扩束准直器后成为第二平行光，利用第二反光镜将第二平行光导入第二显微物镜；

5)旋转合束镜，使得光束A倾斜入射合束镜；

6)通过CCD采集光束A和光束B在CCD靶面上形成的图像，所述图像传输到计算机，所述图像为全息图。

7)对所述全息图进行傅里叶变换，得到其频谱；用窗口滤波，将零级频谱和负1级频谱滤除，剩余正1级频谱；

8)对正1级频谱进行逆傅里叶变换得到成像物体的再现像，该再现像包括强度图像和包裹位相图像；

9)对上述包裹位相图像进行位相解包裹，获取成像物体的解包裹位相图像，即物体的形貌图像。

9.根据权利要求8所述的成像方法：其特征在于，所述步骤4)中放入第二显微镜时，调节第二显微镜到合束镜的距离，使得第二显微镜和第一显微镜到合束镜的距离相等。

10.根据权利要求9所述的成像方法：其特征在于，先将透明物体从系统中撤出，沿光传播方向移动第二显微镜，同时用CCD记录光束A和光束B在CCD靶面上形成的图像，通过计算机显示，观看图像，直到所述图像为多条平行等间距直条纹，然后将透明物体放回原米在系统中的位置。

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