CN114111625A - 一种光学成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种光学成像系统及方法。利用不同波长的两束激光照射被测物体，从而携带被测物体的相位信息，经显微物镜放大并经准直后形成平行光，利用二维光栅得到不同级次的衍射光，利用一个4f成像系统并结合使用滤波器，让0级衍射光中的直流项以及+1级衍射光全部通过，其余级次的衍射光被滤除，从而形成两幅正交的干涉条纹图像，所述两幅正交的干涉条纹图像被CCD采集并经由计算机程序重建被测物体的三维图像。

Description

一种光学成像系统及方法

技术领域

本申请涉及一种光学成像系统及方法，属于光学成像领域。

背景技术

普通的光学显微镜，主要是通过透镜组获得，这样的显微镜通常只适合于实时进行观察，观察后对图像的细节很快就记不清楚。随着半导体技术和激光技术的不断发展，现阶段出现了一种数字全息显微镜，其能够在获得成像物体的强度图像的同时，获得成像物体的位相图像，或者说其能够获得成像物体的三维图像，并且能够将获得的三维图像永久的保存。

上述数字全息显微镜技术用CCD采集成像物体的全息图，将全息图输入计算机中，在计算机中利用算法模拟实际的全息图再现过程，从而在计算机中重建物体的三维图像。上述采集的全息图叫做数字全息图，数字全息图相对于普通的光学显微镜采集的数字图像，该数字全息图的再现像相对于普通的数码相机获取的图像，全息图的再现像除了具有强度图像外，还有位相图像，即物体的三维形貌图像。数字全息术有多种分类方法，常见的有：根据光束传播方向分为同轴全息和和离轴全息，其中离轴全息能够实现实时成像，因而被广泛采纳。根据光路稳定性不同，又分为共路结构和非共路结构，其中共路结构对外界环境有很高抗干扰能力，可用于样品长期稳定的观测，是近年国际研究重点。根据使用光源个数的不同，又分为单波长、双波长和多波长全息，其中单波长全息光路结构简单，但位相解包裹是该类型全息重构中的难点，而双波长全息虽然光路结构稍显复杂，但该类型全息中位相解包裹变得简单易行；三波长全息是多波长全息最常见的形式，主要用于全息显示领域。现有数字全息显微术中，大都采用共路离轴全息的方式获得数字全息图像，其中双波长共路离轴数字全息显微系统是大家关注的焦点。

发明内容

本发明提供了一种光学成像系统即方法，利用基于二维光栅分光的双波长共路离轴数字全息光路系统，实现大视场、高分辨、高精度的全息图记录与重构，用于静态及动态样品长期稳定的三维定量成像与监测。

本发明包括以下技术方案：

一种光学成像系统，包括第一激光器、第二激光器、第一扩束准直器、第二扩束准直器、反射镜、合束镜、被测物体、显微物镜、准直透镜、二维光栅、第一透镜、第二透镜、滤波器以及CCD；其特征在于：第一激光器发出的第一波长光经第一扩束准直器后形成第一光束、第二激光器发出的第二波长光经第二扩束准直器后形成第二光束，第二光束经反射镜反射与第一光束在合束镜混合形成复合光束，所述复合光束照射被测物体后经显微物镜放大，然后经准直透镜准直得到平行光，该平行光照射二维光栅后形成多级衍射光，该多级衍射光通过第一透镜并经滤波器滤波后经第二透镜到达CCD的靶面形成全息图；其中，第一透镜与第二透镜组成4f成像模块，第一透镜的后焦平面与第二透镜的前焦平面重合，滤波器位于第一透镜的后焦平面上；所述滤波器包括三个透光孔，所述滤波器使得所述衍射光中的零级衍射光的直流项以及正一级衍射光全部透过，其余级次的衍射光被遮挡而被滤除。

优选地，第一激光器发出的激光波长与第二激光器发出的激光波长不同，第一激光器采用He-Ne激光器(λ₁＝632.8nm)，第二激光器GL采用半导体激光器(λ₂＝532nm)。

一种光学成像方法，包括以下步骤：

1)第一激光器与第二激光器发射各自波长的激光光束作为入射光，光束分别经过扩束准直器转化为均匀的平行光束，然后经过合束镜合束后同时入射到被测物体表面；

2)携带被测物体信息的光束经显微物镜MO放大后，通过准直透镜TL使得发散的球面成像光束转化为平行光束；被测物体成像于第一像平面处，放置CCD，通过调整CCD的轴向位置使得被测物体清晰成像，记录CCD的位置即为第一像平面的位置；

3)移开CCD并放置二维光栅使其置于第一像平面之后的距离d处，以产生携带被测物体信息的不同衍射级次的衍射光；在二维光栅的后方布置4f成像模块，并在4f成像模块后布置CCD，调整CCD的位置，使得被测物体通过4f成像系统所成的像位于CCD的靶面上；

4)在第一透镜的后焦平面上放置滤波器，所述第一透镜的后焦平面为傅里叶平面；对于每个波长分量，在4f成像模块的傅里叶平面利用滤波器分别在两个相互正交的方向上提取出0级和+1级衍射光；让+1级衍射光完全通过，对0级衍射光进行低通滤波仅使其中的直流成分通过，并使其他级次的衍射光被阻挡；因此，在CCD靶面上，可以得到包含原始图像的所有信息的物光和只携带原始图像的直流项的参考光；带有被测物体信息的物光束将与CCD靶面上的参考光束干涉，生成两幅干涉条纹图，该两幅干涉条纹图的条纹彼此正交，两幅干涉条纹图由CCD一次性捕获并记录；

5)调整二维光栅和滤波器的角度，使二维光栅沿竖直轴旋转45度，使傅里叶平面上的+1级光由原来的竖直水平正交分布旋转45度，以最大化提高CCD的空间带宽利用率；

6)移除被测物体，记录未含有被测物体信息的背景干涉图，采用数字全息领域中的角谱重构算法对CCD记录捕捉到的全息图进行重构，并利用上述背景干涉图消除相位畸变，从而得到被测物体的相位图像。

本发明对现有技术的贡献体现在：第一、本发明采用两种不同波长的光束进行全息图记录，从而能够一次曝光就可以获得两幅全息图，提高了全息图的采集效率；第二、将两种不同波长的光束合束，采用一条光路的光束照射物体，并利用二维光栅产生不同级次的衍射光，并利用4f成像模块分离出物光波和参考光波，省略了离轴全息图成像光路中的参考光所在的光路支路，从而简化了离轴全息图的成像光路；第三，在本发明的光学成像光路中，将二维光栅旋转45度从而使得在CCD靶面上物光波和参考光波重叠面最大化，从而最大化地利用CCD的靶面记录全息图，这样扩大视场，获得物光的高频信息更多，得到的图像的分辨率更高。

附图说明

图1、本发明的光学成像系统的结构示意图；

图2、4f系统傅里叶平面频谱分布图；

图3、4f系统模块示意图；

图4a、相机平面光强分布图；

图4b、二维光栅旋转45°后相机平面光强分布图；

图5、双波长CO-DHM的USAF1951分辨率板相位成像图；

图6、洋葱表面细胞相位成像图；

图7、标准聚苯乙烯微珠定量相位成像图；

图8、不同视场下重叠区域的同一微珠对应白色线条的一维相位及高度再现图

具体实施方式

一、本发明的光学成像系统。

如图1所示，其为本发明的光学系统，包括第一激光器RL，第二激光器GL，第一扩束准直器SF₁，第二扩束准直器SF₂，反射镜M₁、M₂、M₃，合束镜BS，样品S，显微物镜MO，准直透镜TL，二维光栅G，第一透镜L₁，第二透镜L₂以及滤波器，CCD。第一激光器RL采用He-Ne激光器(λ₁＝632.8nm)，第二激光器GL采用半导体激光器(λ₂＝532nm)。第一激光器发出的光经第一扩束准直器SF₁获得第一光束，第二激光器发出的光经第二扩束准直器SF₂获得第二光束，两束光束经合束镜BS合束后同时照射样品，然后经显微物镜MO放大，经准直透镜准直后，照射二维光栅G。从二维光栅衍射的光经透镜L₁和L₂组成的4f光学模块后到达CCD的靶面，从而在CCD的靶面形成离轴全息图。第一透镜和第二透镜构成4f光学模块，第一透镜的后焦平面与第二透镜的前焦平面重叠(即傅里叶平面)，在第一透镜的后焦平面处设置过滤器，所述过滤器包括三个透光孔。

实施例所采用的透镜L₁、L₂焦距为6cm且所有的透镜都是消色差的，以最小化色散，4f模块实际横向放大倍数M_4f＝1。二维光栅位于第一个透镜L1(d＝3cm)的前焦平面，CCD(Basler acA2500-14um，分辨率：2592×1944，像素大小2.2um)位于4f系统的后焦平面，用于记录全息图。显微物镜为一个40×(0.60NA)物镜。对于滤波器的设计，0级滤波孔的直径为50um，两个1级矩形孔应足够大，需保证对应波长的+1级光完全通过，并滤除同方向上的另一波长的+1级光。为保证较好的条纹对比度，于频谱面0级滤波孔后放置透过率为50％的衰减片。

图1展示了本发明的光学系统。首先，传统的双波长倒置显微镜将样品成像于像平面IP处，二维光栅被放置于像平面IP之后的距离d处，以产生携带样品信息的不同衍射级。在此基础上附加4f成像模块，将样品图像成像到CCD靶面所在的平面。然后，对于每个波长分量在4f成像系统的傅里叶平面(即第一透镜的后焦平面)利用滤波器分别在两个相互正交的方向上透射0级和+1级光。其中强度最强的第0级衍射光束通过滤波器上的针孔，成为理想的均匀球面波作为干涉中的参考光束，较弱的+1级衍射光束分别单独通过一个更大的滤波器透光孔，出射光束作为物光。最后，带有样品信息的+1级物光束将与CCD传感器靶面上的第0级衍射光束重叠，生成斜正交干涉条纹图，两幅全息图由CCD传感器一次性捕获并记录。

由于两个波长的光束在该系统中传播模式完全相同且彼此独立，光束经傅里叶平面频谱滤波，如图2所示，只有单个方向的0阶和+1阶光通过。为简单起见，先考虑单一波长在一维平面的光场分布情况，并假设系统中五个平面的坐标是x_o(样品的成像平面，第一像平面)、x_G(二维光栅所在的平面)、x_L(第一透镜所在的平面)、x_F(滤波器所在的平面、也就是第一透镜的后焦平面，也即文中所述的傅里叶平面)和x_I(CCD靶面所在的平面)，如图3所示。

附图3为4f成像模块示意图，其中，f₁、f₂为透镜L₁、L₂的焦距；α为离轴干涉夹角；d为光栅距像平面的距离；d₀为第一透镜到二维光栅的距离。

对于单波长通过二维光栅的透过率函数可以化简为：

t(x_G)＝c₀+c₁exp(jβx_G)， (1)

其中：β＝2π/Λ；Λ为光栅周期；c₀、c₁为傅里叶级数。在透镜L₁的后焦平面(傅里叶平面)上放置滤波器，让+1级光完整通过并对0级光进行低通滤波，而其他级次被阻挡。因此，在第二像平面上，可以得到包含原始图像的所有信息的+1阶物光，和只携带原始图像的直流内容的0阶参考光。考虑到透镜傅里叶变换性质，单个波长的像平面的复振幅及光强(省略常指数系数)分布为：

α＝λf₂/Λ/f₁， (4)

其中：定义了4f成像模块的放大倍数：M_4f＝-f₂/f₁；α为离轴干涉角。由公式(4)可知，对于确定的系统，干涉夹角α为常数，并且与光栅G的位置无关。α不受光栅G的位置的影响，仅由光栅周期和透镜L₁和L₂的焦距所控制。由几何关系得，参考光与物光束在CCA靶面(相机平面)的剪切距离为：

l＝αd， (5)

剪切距离l即物光光束中心相对于参考光中心偏离的程度，该剪切距离决定了像平面的干涉区域，它由光栅位置d所控制。本发明的光学成像系统中，各波长光束经二维光栅分光后分别在相互正交的方向上生成对应的剪切视场如图4所示，图4a为相机平面光强分布图，l₁、l₂为第一波长(红光)和第二波长(绿光)的剪切距离；图4b为二维光栅旋转45°后相机平面光强分布，b为相机靶面横向宽度。

视场相较于原相机视场面积扩大率可表示为：

其中l₁、l₂为不同频率光场对应的剪切距离：l₁＝λ₁df₂/f₁/Λ，l₂＝λ₂df₂/f₁/Λ。

为了准确地恢复相位信息，在数值重建中，首先对CCD记录的像面数字全息图进行傅里叶变换,得到可分离的+1级谱。通过对频谱图不同位置的+1谱分别进行频域滤波，再经傅里叶逆变换得到原始物光场分布，对物光波复振幅求反正切值得到包裹相位。并采用基于横向剪切的最小二乘解包裹算法(LS-LS)，该方法只需将光场在一定的方向做微平移后再与原光场相互干涉即可实现剪切干涉。其中，采用背景光复振幅与原始物光场相除的相位补偿方法。由于未加样本全息图记录载频和系统二次畸变信息，可通过简单的除法运算即可准确去除由载频和系统引起的相位畸变。在后续的相位恢复过程中，只需要对离轴干涉角造成的一次相位畸变进行补偿(该过程采用最小二乘拟合算法实现)。值得指出的是，相机可一次性采集并记录不同波长的背景全息图。

二、本发明的光学成像方法。

上面具体介绍了本发明的光学系统，下面将具体介绍如何利用上述光学系统进行成像的方法。

本发明的光学成像方法包括以下步骤：

1、He-Ne激光光源与半导体激光光源发射各自波长的激光光束作为入射光，光束分别经过扩束准直器转化为均匀的平行光束，然后经过合束镜合束后同时入射到样本表面。

2、携带样本信息的光束经显微物镜MO放大后，通过准直透镜TL使得发散的球面成像光束转化为平行光束。样品成像于第一像平面IP处，放置CCD图像传感器，通过调整CCD的轴向位置使得样品清晰成像，记录CCD的位置即为第一像平面IP的位置。

3、移开CCD并竖直放置二维光栅使其置于第一像平面IP之后的距离d处，以产生携带样品信息的不同衍射级次。在此基础上附加4f成像模块，并在4f成像模块后放入CCD，调整CCD的位置，使得样本成像到CCD靶面。

4、在透镜L1的后焦平面(傅里叶平面)上放置滤波器。对于每个波长分量，在4f系统的傅里叶平面利用滤波器分别在两个相互正交的方向上提取出0级和+1级衍射光。让+1级衍射光完全通过，对0级光进行低通滤波从而仅使其直流项通过，其他级次衍射光被阻挡。因此，在CCD靶面平面上，可以得到包含原始图像的所有信息的物光和只携带原始图像的直流项的参考光。带有样本信息的物光束将与CCD传感器成像面上的参考光束干涉，生成正交干涉条纹图，两幅干涉条纹图由CCD一次性捕获并记录。

5、调整二维光栅和滤波器的角度，使二维光栅沿竖直轴旋转45度，使频谱面中的傅里叶级次呈斜对角方向(使得傅里叶平面上的+1级光由原来的竖直水平正交分布旋转45度，即红光的+1级光与0级光的连线方向由原来的竖直方向旋转45度，绿光的+1级光与0级光的连线方向由原来的水平方向旋转45度，两个连线方向仍然呈正交关系)，以最大化提高CCD的空间带宽利用率。

6、移除样本，记录未含有样本信息的背景干涉图，采用数字全息领域中的角谱重构算法对CCD记录捕捉到的离轴全息图进行重构，利用上述背景干涉图消除相位畸变，得到被测物体的相位图。

三、利用本发明的光学成像系统与方法的实验验证。

下面通过不同的样品验证本发明的光学系统一次性获得两幅全息图并实现扩大视场的能力。

1、USAF1951分辨率板成像

如图5所示，通过对USAF1951分辨率板(正片)定量相位成像，验证了系统一次性获得两幅全息图并实现扩大视场的能力。图5(a)显示了被CCD相机同时记录两幅不同视场的分辨率板全息图，将红色矩形框内部分全息图放大可看到彼此正交的条纹放大图如图5(b)所示，图5(c)为全息图的空间傅里叶变换图像，两个波长(λ₁＝532nm和λ₂＝632.8nm)的±1阶频谱被分离并用相应的颜色圆标记。通过对频谱图不同位置的+1谱分别进行频域滤波得到包裹相位。图5(d)、(g)红光频域滤波后重建强度图和解包裹相位图。图5(e)、(h)波长为532nm的绿光重建强度图和相位图。最后我们通过对两个不同视场的分辨率版强度图像素拼接得到最终的视场大小如图(f)、(i)所示。

2、洋葱表皮细胞成像

如图6所示，通过对植物洋葱表皮细胞成像，验证了该技术在大尺寸的生物细胞定量相位成像的能力。(a)在单个CCD相机曝光中记录的多路复用离轴干涉图；(b)全息图的空间傅里叶变换；(c)、(f)、(h)λ₁＝532nm重建强度图、相位图和高度图；(d)、(g)、(j)λ₂＝632.8nm重建相位图和高度图。(e)、(k)通过将两个视场拼接后得到的强度图和高度图。

3、标准聚苯乙烯微珠成像

如图7所示，对标准聚苯乙烯微珠成像，验证系统成像准确度。标准聚苯乙烯微球直径为(10+0.05)μm,折射率为1.59(室温下25℃)。用滴管取少量微球滴落于载玻片,等原乙醇溶液蒸发完后,然后使用折射率匹配溶液浸没微珠。最后将此标准样品放入载物台,进行调焦,使之成像于CCD相机平面。图7(a)、(c)和(b)、(d)分别显示了λ₁＝632.8nm和λ₂＝532nm的微球珠的相位图像。红色矩形框标识区域为不同视场重叠区域。图(7)(e)、(f)分别为λ₁＝632.8nm和λ₂＝532nm的微球珠的高度图像。图8为不同视场下重叠区域的同一微珠对应白色线条的一维相位及高度再现。

Claims (3)

1.一种光学成像系统，包括第一激光器、第二激光器、第一扩束准直器、第二扩束准直器、反射镜、合束镜、被测物体、显微物镜、准直透镜、二维光栅、第一透镜、第二透镜、滤波器以及CCD；其特征在于：第一激光器发出的第一波长光经第一扩束准直器后形成第一光束、第二激光器发出的第二波长光经第二扩束准直器后形成第二光束，第二光束经反射镜反射与第一光束在合束镜混合形成复合光束，所述复合光束照射被测物体后经显微物镜放大，然后经准直透镜准直得到平行光，该平行光照射二维光栅后形成多级衍射光，该多级衍射光通过第一透镜并经滤波器滤波后经第二透镜到达CCD的靶面形成全息图；其中，第一透镜与第二透镜组成4f成像模块，第一透镜的后焦平面与第二透镜的前焦平面重合，滤波器位于第一透镜的后焦平面上；所述滤波器包括三个透光孔，所述滤波器使得所述衍射光中的零级衍射光的直流项以及正一级衍射光全部透过，其余级次的衍射光被遮挡而被滤除。

2.根据权利要求1所述的光学成像系统，其特征在于：第一激光器发出的激光波长与第二激光器发出的激光波长不同，第一激光器采用He-Ne激光器(λ₁＝632.8nm)，第二激光器GL采用半导体激光器(λ₂＝532nm)。

3.一种光学成像方法，利用权利要求1或2所述的光学成像系统进行光学成像，其特征在于：包括以下步骤：

1)第一激光器与第二激光器发射各自波长的激光光束作为入射光，光束分别经过扩束准直器转化为均匀的平行光束，然后经过合束镜合束后同时入射到被测物体表面；

2)携带被测物体信息的光束经显微物镜MO放大后，通过准直透镜TL使得发散的球面成像光束转化为平行光束；被测物体成像于第一像平面处，放置CCD，通过调整CCD的轴向位置使得被测物体清晰成像，记录CCD的位置即为第一像平面的位置；

3)移开CCD并放置二维光栅使其置于第一像平面之后的距离d处，以产生携带被测物体信息的不同衍射级次的衍射光；在二维光栅的后方布置4f成像模块，并在4f成像模块后布置CCD，调整CCD的位置，使得被测物体通过4f成像系统所成的像位于CCD的靶面上；

4)在第一透镜的后焦平面上放置滤波器，所述第一透镜的后焦平面为傅里叶平面；对于每个波长分量，在4f成像模块的傅里叶平面利用滤波器分别在两个相互正交的方向上提取出0级和+1级衍射光；让+1级衍射光完全通过，对0级衍射光进行低通滤波从而仅使其中的直流项通过，其他级次的衍射光被阻挡；因此，在CCD靶面上，可以得到包含原始图像的所有信息的物光和只携带原始图像的直流项的参考光；带有被测物体信息的物光将与参考光在CCD靶面上发生干涉，生成两幅干涉条纹图，该两幅干涉条纹图的条纹彼此正交，两幅干涉条纹图由CCD一次性捕获并记录；

5)调整二维光栅和滤波器的角度，使二维光栅沿竖直轴旋转45度，使傅里叶平面上的+1级光由原来的竖直水平正交分布旋转45度，以最大化提高CCD的空间带宽利用率；

6)移除被测物体，记录未含有被测物体信息的背景干涉图，采用数字全息领域中的角谱重构算法对CCD记录捕捉到的全息图进行重构，并利用上述背景干涉图消除相位畸变，从而得到被测物体的相位图像。

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