CN102735670A - 一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于双针孔的超分辨显微方法以及应用此方法的装置，其中方法包括激光器发射出的光束聚焦到样品的表面形成信号光，将该信号光分为强度相等的两束光，这两束光分别通过第一针孔和第二针孔后进入相应探测器并进行对应的处理，所述第一针孔面积为0.5～2个爱里斑，所述第二针孔面积为2～5个爱里斑，且第一针孔的面积小于第二针孔。本发明通过对两个在不同针孔大小滤波作用下的共焦信号进行分析和处理，横向分辨率得到显著改善，实现了横向超分辨。

Description

一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置

技术领域

本发明属于超分辨显微领域，特别涉及一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置。

背景技术

共焦显微镜最早是由M.Minsky于1957年提出，最初目的是为了消除普通光学显微镜在探测样品时产生的散射光影响。之后，共焦显微术因其出色的三维层析能力和高分辨率等特点迅速得到推广。然而，尽管共焦显微镜使其横向分辨率提高到相同孔焦比的普通光学显微镜的1.4倍，但与其轴向分辨率相比仍差两个数量级，横向分辨率和轴向分辨率之间存在着极大的不平衡，因此进一步改善共焦显微系统的成像分辨率特别是横向分辨率变得尤为迫切。

起初，人们通过增大物镜数值孔径NA和减小光波波长等方法来改善共焦系统的成像分辨能力，但是很快发现了这类方法的局限性，光学衍射极限制约了共焦显微系统成像分辨率的进一步提高。超分辨思想最先于1952年由Francia提出，但是直到共焦显微技术的出现和针孔的使用才使光学超分辨真正具有了实际意义。为了打破光学衍射极限的限制，从根本上改善共焦显微镜的成像分辨率，人们尝试了许多方法，例如4PI共焦显微镜、共焦干涉显微镜、基于非线性效应的双光子或多光子显微镜和基于针孔差分的差动共焦显微镜等方法。

国内学者针对基于针孔差分的差动共焦显微镜也做了比较深入的研究，例如，赵维谦等人提出了具有高空间分辨力的差动共焦扫描检测方法，并申请了相关专利(申请专利号CN200410006359.6)。但是基于针孔的超分辨方法并不仅仅局限于上述专利中的方法，本发明提出一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置，与上述专利中通过移动针孔进行差分的差动共焦显微术不同，本发明通过对两个在不同大小针孔的滤波作用下的共焦信号进行分析和处理，横向分辨率得到显著改善，实现了横向超分辨。

发明内容

本发明提供了一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置，装置结构简单，易于操作，共焦显微系统的横向分辨率显著改善，实现了横向超分辨，可用于光学显微领域以及纳米高精度检测、测试和制造等领域。

一种基于双针孔的超分辨显微方法，包括激光器发射出的光束聚焦到样品的表面形成信号光，将该信号光分为强度相等的两束光，这两束光分别通过第一针孔和第二针孔后进入相应探测器并进行对应的处理，所述第一针孔面积为0.5～2个爱里斑，所述第二针孔面积为2～5个爱里斑。

针对非荧光样品，信号光为光束聚焦到样品表面产生的反射光和散射光，针对荧光样品，信号光为光束聚焦到样品表面激发的荧光。

优选的，所述第一针孔面积为1.5个爱里斑，所述第二针孔面积为4.5个爱里斑。

所述第一针孔面积选择1.5个爱里斑的原因是为了与聚焦到样品表面的光斑大小匹配从而构成标准的共聚焦系统，所述第二针孔的面积选择4.5个爱里斑的原因是为了与所述第一针孔的1.5个爱里斑的大小匹配以获得最好的处理结果。

优选的，所述第二针孔为环形孔，所述环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，所述环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑。

第二针孔可替换为环形孔，环形孔的中心不透光面积在0.5～2个爱里斑之间，环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和在2～5个爱里斑之间，环形孔所在平面与于第二针孔所在平面重合，环形孔中心与于第二针孔中心重合。

针对非荧光样品，本发明提供了一种基于双针孔的超分辨显微装置，包括用于发出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的偏振片、偏振分束器、四分之一波片、第一透镜和用于承载待测样品的纳米平移台，依次布置在所述偏振分束器的反射光路上的第二透镜和分束器，分别用于对所述分束器射出的第一测量光和第二测量光进行滤波的第一针孔和第二针孔，以及收集通过所述第一针孔和第二针孔的光强信号的探测系统，所述第一针孔面积为0.5～2个爱里斑，所述第二针孔面积为2～5个爱里斑。

探测系统由第一探测光纤、第一探测器、第二探测光纤、第二探测器和计算机组成。其中，第一探测光纤和第二探测光纤参数和性能完全相同，且两光纤端面面积足够收集通过两针孔的全部光强。

优选的，所述第一针孔面积为1.5个爱里斑，所述第二针孔面积为4.5个爱里斑。

所述第一针孔面积选择1.5个爱里斑的原因是为了与聚焦到样品表面的光斑大小匹配从而构成标准的共聚焦系统，所述第二针孔的面积选择4.5个爱里斑的原因是为了与所述第一针孔的1.5个爱里斑的大小匹配以获得最好的处理结果。

优选的，所述第二针孔为环形孔，所述环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，所述环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑。

第二针孔可替换为环形孔，环形孔的中心不透光面积在0.5～2个爱里斑之间，环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和在2～5个爱里斑之间，环形孔所在平面与于第二针孔所在平面重合，环形孔中心与于第二针孔中心重合。

优选的，所述激光器与偏振片之间依次设有用于对光束进行耦合的单模光纤和对光束进行准直的准直透镜。激光器发出的激光具有一定发散角，准直后的激光具有更好的平行性。

针对非荧光样品，本发明的装置工作步骤如下：

(1)激光器发射出光束经单模光纤耦合和第一准直透镜准直，得到准直光束：准直光束经偏振片调制为平行偏振光(p光)，平行偏振光经由偏振分束器全部透射后，再经四分之一波片调制为圆偏振光；圆偏振光经第一透镜聚焦到非荧光样品表面；

(2)非荧光样品表面发生反射和散射，得到的反射光和散射光沿原光路逆向返回，先被第一透镜收集，再经过四分之一波片调制为垂直偏振光(s光)；垂直偏振光经由偏振分束器全部反射形成第一反射光，第一反射光经由第二透镜聚焦后，通过分束器分为强度相等的第一测量光和第二测量光，第一测量光通过第一针孔滤波后聚焦于第一探测光纤的光纤端面，第二测量光通过第二针孔滤波后聚焦于第二探测光纤的光纤端面，第一探测光的焦点与第一探测光纤的光纤端面中心重合，第二探测光的焦点与第二探测光纤的光纤端面中心重合，第一针孔所在平面紧贴第一探测光纤的光纤端面，且第一探测光光轴垂直通过第一针孔中心，第二针孔所在平面紧贴第二探测光纤的光纤端面，且第二探测光光轴垂直通过第二针孔中心；

(3)第一探测光纤另一端连接第一探测器，第二探测光纤连接第二探测器，第一探测器和第二探测器与计算机相连，第一探测光纤通过耦合将经第一针孔滤波的测量光传至第一探测器，第一探测器将光信号转化为电信号传至计算机，信号设为I₁；第二探测光纤通过耦合将经第二针孔滤波的测量光传至第二探测器，第二探测器将光信号转化为电信号传至计算机，信号设为I₂；

(4)计算机将两信号进行数据处理，完成一点扫描；

(5)样品所在纳米平移台与计算机相连，通过计算机来控制纳米平移台使样品在垂直光轴面内移动完成二维扫描成像。

偏振分束器用于使经偏振片调制的平行偏振光全部透射通过，四分之一波片用于将透射后的平行偏振光调制为圆偏振光，第一透镜用于聚焦圆偏振光以及用于收集聚焦后样品反射和散射的光束，四分之一波片还用于将第一透射收集的返回的反射光和散射光调制为垂直偏振光，偏振分束器还用于使垂直偏振光(垂直偏振光是由四分之一波片将第一透镜收集的返回的反射光和散射光调制得到的)通过后全部反射。

第二透镜用于对垂直偏振光在偏振分束器的反射光进行聚焦，分束器用于将聚焦反射光分离为两束强度相等的测量光，第一针孔和第二针孔用于分别对两束测量光进行滤波。

第一探测光纤和第二探测光纤用于分别对两束滤波后的测量光进行耦合并各获取一个光强信号。第一探测器和第二探测器用于将两个光强信号转换为电信号，两探测器参数和性能完全相同，计算机用于接收电信号并进行分析处理，同时用于控制纳米平移台移动；纳米平移台用于根据计算机发出的信号对样品二维扫描。

本发明中偏振分束器的作用：一是对于由偏振片调制的平行偏振光透射，二是对于由四分之一波片基于第一透射收集的反射光和散射光所调制的垂直偏振光反射，因此，偏振分束器的反射光路即为垂直偏振光在偏振分束器发生反射的光路。

针对荧光样品，本发明提供了一种基于双针孔的超分辨显微装置，包括：用于发出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的第一透镜和用于承载待测样品的纳米平移台，用于将所述样品表面发出的信号光分为第一测量光和第二测量光的分束器，分别用于对所述分束器射出的第一测量光和第二测量光进行滤波的第一针孔和第二针孔，以及收集通过所述第一针孔和第二针孔的光强信号的探测系统，所述第一透镜和激光器之间设有用于反射所述样品表面发出的信号光二向色镜，所述二向色镜与所述分束器之间设有带通滤光片。

二向色镜用于全部透射准直激光和全部反射由所述第一透镜收集的样品荧光；带通滤光片用于透射所述二向色镜反射的样品荧光并滤去其他波段的杂散光。

探测系统由第一探测光纤、第一探测器、第二探测光纤、第二探测器和计算机组成。其中，第一探测光纤和第二探测光纤参数和性能完全相同，且两光纤端面面积足够收集通过两针孔的全部光强；第一探测器和所述第二探测器参数和性能完全相同。

优选的，所述激光器与二向色镜之间依次设有用于对光束进行耦合的单模光纤和对光束进行准直的准直透镜。激光器发出的激光具有一定发散角，准直后的激光具有更好的平行性。

针对荧光样品，本发明的装置工作步骤如下：

(1)激光器发射出光束经单模光纤耦合和第一准直透镜准直，得到准直光束：准直光束经二向色镜全部透射后，经第一透镜聚焦到荧光样品表面，对样品进行荧光激发；

(2)荧光样品被激发荧光，得到荧光先被第一透镜收集，再经过二向色镜全部反射形成第一反射光，第一反射光经过带通滤光片，带通滤光片仅允许激发荧光波段通过，滤波后第一反射光由第二透镜聚焦后，通过分束器分为强度相等的第一测量光和第二测量光，第一测量光通过第一针孔后聚焦于第一探测光纤的光纤端面，第二测量光通过第二针孔后聚焦于第二探测光纤的光纤端面，第一探测光的焦点与第一探测光纤的光纤端面中心重合，第二探测光的焦点与第二探测光纤的光纤端面中心重合，第一针孔所在平面紧贴第一探测光纤的光纤端面，且第一探测光光轴垂直通过第一针孔中心；第二针孔所在平面紧贴第二探测光纤的光纤端面，且第二探测光光轴垂直通过第二针孔中心；

(3)第一探测光纤另一端连接第一探测器，第二探测光纤连接第二探测器，第一探测器和第二探测器与计算机相连；第一探测光纤通过耦合将经第一针孔滤波的测量光传至第一探测器，第一探测器将光信号转化为电信号传至计算机，信号设为I₁；第二探测光纤通过耦合将经第二针孔滤波的测量光传至第二探测器，第二探测器将光信号转化为电信号传至计算机，信号设为I₂；

(4)计算机将两信号进行数据处理，完成一点扫描；

(5)样品所在纳米平移台与计算机相连，通过计算机来控制纳米平移台使样品在垂直光轴面内移动完成二维扫描成像。

第二透镜用于对带通滤光片滤波的反射光进行聚焦，分束器用于将第二透镜的聚焦光分离为两束强度相等的测量光，第一针孔和第二针孔用于分别对两测量光进行滤波。

二向色镜用于全部透射准直激光和全部反射由第一透镜收集的样品荧光，带通滤光片用于透射二向色镜反射的样品荧光并滤去其他波段的杂散光，第二透镜用于对带通滤光片滤波的反射光进行聚焦，分束器用于将第二透镜的聚焦光分离为两束强度相等的测量光，第一针孔和第二针孔用于分别对两测量光进行滤波。

第一针孔和第二针孔面积大小不同，第一针孔面积在0.5～2个爱里斑之间，第二针孔面积在2～5个爱里斑之间，第一针孔面积小于第二针孔面积；其中，第二针孔可替换为环形孔，环形孔的中心不透光面积在0.5～2个爱里斑之间，环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和在2～5个爱里斑之间，环形孔所在平面与于第二针孔所在平面重合，环形孔中心与于第二针孔中心重合。

第一探测光纤和第二探测光纤参数和性能完全相同，且两光纤端面面积足够收集通过两针孔的全部光强；第一探测光纤和第二探测光纤用于分别对两束滤波后的测量光进行耦合并各获取一个光强信号；第一探测器和第二探测器用于将两个光强信号转换为电信号，两探测器参数和性能完全相同，计算机用于接收电信号并进行分析处理，同时用于控制纳米平移台移动；纳米平移台用于根据计算机发出的信号对样品二维扫描。

本装置中二向色镜的作用有：一是对于准直后的激光完全透射，二是对于由第一透镜收集的样品荧光完全反射，因此，二向色镜的反射光路即为样品荧光在二向色镜发生反射的光路。

本发明的工作原理如下：

在共焦系统中，对于荧光样品或者非荧光样品进行点对点扫描成像。由于聚焦到样品上的激光并不是理想的无限小的点而是一个有受光学衍射限制的有一定大小的爱里斑，因而由此爱里斑产生的样品信号光中包含了大量焦外点信息(理想聚焦照明点以外的信息)，使得成像的分辨率下降。将信号光分成强度相同的两束测量光，同时将共焦系统的探测光路分成除了针孔不同其他参数完全相同的两测量光路并将两束测量光分别导入，当使用两针孔滤波时，由于两针孔的面积大小不同(以第一针孔面积小于第二针孔面积为例子说明)，则两测量光的点扩散函数受到的调制不同。

设第一探测器探测的光强大小为I₁，第二探测器探测的光强大小为I₂，第一探测器的光强主要包含焦内信息和少量的焦外信息，第二探测器的光强则除了包含第一探测器的所有焦内信息外，还包含比第一探测器强度更强和更多的焦外信息，则两者之差I₂-I₁主要包含信号光的焦外信息，对于共焦显微系统来说，真正有用的信号为焦内信息，焦外信息属于干扰，则我们可以将两针孔相减分离出的焦外信息从第一探测器探测的光强I₁中减去以获得更高的横向分辨率。

一般第一针孔面积在0.5～2个爱里斑之间，第二针孔面积在2～5个爱里斑之间，优选的方案中，第一个针孔面积为1.5个爱里斑，第二个针孔为4.5个爱里斑，则最终信号强度为I₃＝I₁-α(I₂-I₁)，α是为了使I₁中的焦外信息强度和相应的I₂-I₁中的焦外信息强度匹配，优选的α大小为0.5，结果如图3所示，可以看到处理后的信号具有更高的横向分辨率。

若第二针孔被环形孔替代，则通过环形孔的光强则本身就具有I₂-I₁的特性，即有I′₂＝I₂-I₁，同时I′₁＝I₁，则I′₃＝I′₁-αI′₂，优选的方案为第一个针孔面积为1.5个爱里斑，环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑，α大小为0.5，结果如图4所示，可以看到处理后的信号具有更高的横向分辨率。

其中，若I₃和I′₃出现负值部分，我们采取将负值部分舍去(归0)，舍去原则是不使信号失真，负值部分的大小可由α来控制，优选的α可以保证信号的不失真。

其中，本发明中的第一针孔和第二针孔大小可以互换，互换后只是数据处理上有差异，有I₃＝I₂-α(I₁-I₂)，若此时要以环形孔替换，此时需要替换针孔较大的第一针孔，则有I′₃＝I′₂-αI′₁。因为两测量光路共轭，所以互换无特别实际意义，所以本发明以第一针孔为小针孔和第二针孔为大针孔为例说明。

本发明具有以下有益的技术效果：

(1)横向分辨率显著提高，打破横向光学衍射极限的限制；

(2)装置结构简洁，数据处理方便，特别适用于共焦显微系统；

(3)与现有基于针孔的超分辨显微方法相比，无需对针孔进行移动，操作简单，且可以在保持高信噪比的情况下提高系统的横向分辨率。

附图说明

图1为本发明针对非荧光样品的一种基于双针孔的超分辨显微装置示意图。

图2为本发明针对荧光样品的一种基于双针孔的超分辨显微装置示意图。

图3为本发明的第一针孔示意图。

图4为本发明的第二针孔示意图。

图5为本发明的环形孔示意图。

图6为本发明的两不同大小针孔下两点扩散函数归一化曲线以及它们处理后的信号归一化曲线，I₁对应小针孔，I₂对应大针孔，I₃＝I₁-0.5(I₂-I₁)。

图7为本发明的第一针孔和环形孔下两点扩散函数归一化曲线以及它们处理后的信号归一化曲线，I′₁对应小针孔，I′₂对应环形孔，I′₃=I′₁-0.5I′₂。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

实施例1

如图1所示，一种针对非荧光样品的基于双针孔的超分辨显微装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，偏振片4，偏振分束器5，四分之一波片6，第一透镜7，纳米平移台9，第二透镜10，分束器11，第一针孔12，第一探测光纤13，第一探测器14，第二针孔15，第二探测光纤16，第二探测器17，计算机18。

其中，激光器1发出激光光束，单模光纤2、准直透镜3、偏振片4、偏振分束器5、四分之一波片6和第一透镜7依次设置在激光光束光路的光轴上。单模光纤2的出射端面位于准直透镜3的物方焦点处，单模光纤2和准直透镜3对激光光束进行准直，偏振片4将准直后光束调制为平行偏振光，偏振分束器5使该平行偏振光全部透射通过，四分之一波片6将透射后的平行偏振光调制为圆偏振光，第一透镜7聚焦该圆偏振光并收集聚焦后反射和散射的光束，四分之一波片6还将第一透射7收集的返回的反射光和散射光调制为垂直偏振光，偏振分束器5还使该垂直偏振光通过后全部反射。

第二透镜10，分束器11，第一针孔12和第一探测光纤13依次设置在偏振分束器5的反射光路(垂直偏振光经过偏振分束器5反射出来的光路)的光轴上，且第一探测光纤14的光纤端面放置在第二透镜10的焦平面，第二探测光纤16的光纤端面放置在第二透镜10的焦平面关于分束器11所成的镜像平面上；第一针孔12紧贴第一探测光纤13的光纤端面放置，光轴依次通过第一针孔12中心和第一探测光纤13的光纤端面中心；第二针孔15紧贴第二探测光纤16的光纤端面放置，光轴依次通过第二针孔15中心和第二探测光纤16的光纤端面中心；第一探测光纤13和第二探测光纤16能够分别完全收集第一针孔12和第二针孔15透射过来的测量光；第一探测光纤13与第一探测器14相连，第二探测光纤16与第二探测器17相连；第一探测器14和第二探测器17分别与计算机18相连，计算机18同时连接纳米平移台9，纳米平移台9用于接收计算机18的信号来水平扫描待测样品8，样品8放置在第一透镜7的焦平面上。第二透镜10将通过偏振分束器5的反射光进行聚焦，分束器11将聚焦后的反射光为两束测量光，第一针孔12和第二针孔15分别对这两束测量光进行滤波，第一探测光纤13和第二探测光纤16分别对这两束滤波后的测量光进行耦合并各获取一个光强信号，第一探测器14和第二探测器17分别将这两个光强信号转化为电信号，计算机18收到两电信号后进行分析处理，并同时输出指令信号给纳米平移台9，纳米平移台9根据该指令进行移动，从而精确完成样品扫描。

如图1所示的装置，其工作步骤如下：

(1)激光器1发射出光束，经单模光纤2耦合和准直透镜3准直，得到准直光束；准直光束经偏振片4调制为平行偏振光(p光)，平行偏振光经由偏振分束器5全部透射后，再经四分之一波片6调制为圆偏振光；圆偏振光经第一透镜7聚焦到样品8表面；

(2)圆偏振光在样品表面发生反射和散射，得到的反射光和散射光沿原光路逆向返回，先被第一透镜7收集，再经过四分之一波片6调制为垂直偏振光(s光)；垂直偏振光经由偏振分束器5全部反射形成第一反射光，第一反射光经由第二透镜10聚焦后，通过分束器11分为强度相等的第一测量光和第二测量光，第一测量光通过第一针孔12后聚焦于第一探测光纤13的光纤端面，第二测量光通过第二针孔16后聚焦于第二探测光纤17的光纤端面；第一探测光的焦点与第一探测光纤13的光纤端面中心重合，第二探测光的焦点与第二探测光纤16的光纤端面中心重合；第一针孔12所在平面紧贴第一探测光纤13的光纤端面，且第一探测光光轴垂直通过第一针孔12中心；第二针孔15所在平面紧贴第二探测光纤16的光纤端面，且第二探测光光轴垂直通过第二针孔15中心；第一探测光纤13和第二探测光纤16能够分别完全收集第一针孔12和第二针孔15透射过来的信号光；

(3)第一探测光纤13另一端连接第一探测器14，第二探测光纤16连接第二探测器17，第一探测器14和第二探测器17分别与计算机18相连；第一探测光纤13通过耦合将经第一针孔12滤波的测量光传至第一探测器14，第一探测器14将光信号转化为电信号传至计算机18，信号设为I₁；第二探测光纤16通过耦合将经第二针孔15滤波的测量光传至第二探测器17，第二探测器17将光信号转化为电信号传至计算机18，信号设为I₂；

(4)计算机18将两信号进行数据处理，完成一点扫描；

(5)样品8所在纳米平移台9与计算机18相连，通过计算机18来控制纳米平移台9使样品8在垂直光轴面内移动完成二维扫描成像。

分析系统的点扩散函数，已知第一探测器14探测的光强大小为I₁，第二探测器17探测的光强大小为I₂，优选的方案中，第一个针孔面积为1.5个爱里斑(如图3所示)，第二个针孔为4.5个爱里斑(如图4所示)。则最终信号强度为I₃＝I₁-α(I₂-I₁)，优选的α大小为0.5，理论结果如图6所示，可以看到处理后的信号具有更高的横向分辨率。

实施例2

采用图1所示的装置针对非荧光样品进行基于双针孔的超分辨显微成像，与实施例1的区别在于将实施例1中的第二针孔15换为环形孔，其他装置不变。环形孔形状优选的方案中，第一针孔12面积为1.5个爱里斑(如图3所示)，环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑(如图5所示)。设第一探测器探测的光强大小为I′₁，环形孔15探测的光强大小为I′₂，则最后点扩散函数的处理变为I′₃＝I′₁-αI′₂，优选的α大小为0.5，理论结果如图7所示，可以看到处理后的信号具有更高的横向分辨率。

实施例3

如图2所示，一种针对荧光样品的基于双针孔的超分辨显微装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，二向色镜19，第一透镜7，纳米平移台9，第二透镜10，分束器11，第一针孔12，第一探测光纤13，第一探测器14，第二针孔15，第二探测光纤16，第二探测器17，计算机18，带通滤光片20。

其中，激光器1发出激光光束，单模光纤2、准直透镜3、二向色镜19、和第一透镜7依次设置在激光光束光路的光轴上。单模光纤2的出射端面位于准直透镜3的物方焦点处，单模光纤2和准直透镜3对激光光束进行准直，二向色镜19使准直激光全部透射通过，第一透镜7聚焦准直激光并收集样品被激发的荧光，第一透镜7收集返回的荧光，二向色镜19将荧光全部反射。

带通滤光片20，第二透镜10，分束器11，第一针孔12和第一探测光纤13依次设置在二向色镜19的反射光路(荧光经过二向色镜19反射出来的光路)的光轴上，且第一探测光纤13的光纤端面放置在第二透镜10的焦平面，第二探测光纤16的光纤端面放置在第二透镜10的焦平面关于分束器11所成的镜像平面上；第一针孔12紧贴第一探测光纤13的光纤端面放置，光轴依次通过第一针孔12中心和第一探测光纤13的光纤端面中心；第二针孔15紧贴第二探测光纤16的光纤端面放置，光轴依次通过第二针孔15中心和第二探测光纤16的光纤端面中心；第一探测光纤13与第一探测器14相连，第二探测光纤16与第二探测器17相连；第一探测器14和第二探测器17与计算机18相连，计算机18同时连接纳米平移台9，纳米平移台9用于待测样品8，样品8放置在第一透镜7的焦平面上。第二透镜10对样品8的荧光在带通滤光片20滤波的透射光进行聚焦，分束器11分离为两束测量光，第一针孔12和第二针孔15分别对这两束测量光进行滤波，第一探测光纤13和第二探测光纤16分别对这两束滤波的测量光进行耦合并各获取一个光强信号，第一探测器14和第二探测器17分别将这两个光强信号转化为电信号，计算机18收到两电信号后进行分析处理，并同时输出指令信号给纳米平移台9，纳米平移台9根据该指令信号进行移动，从而精确完成样品扫描。

如图2所示的装置，其工作步骤如下：

(1)激光器1发射出光束，经单模光纤2耦合和准直透镜3准直，得到准直光束；准直光束经二向色镜19全部透射后，经第一透镜7聚焦到样品8表面；

(2)样品8荧光被激发，得到的激发荧光沿原光路逆向返回，先被第一透镜7收集，再由二向色镜19全部反射形成第一反射光，第一反射光先经带通滤光片20滤除非信号光波段，后经由第二透镜10聚焦后，通过分束器11分为强度相等的第一测量光和第二测量光，第一测量光通过第一针孔12后聚焦于第一探测光纤13的光纤端面，第二测量光通过第二针孔15后聚焦于第二探测光纤16的光纤端面；第一探测光的焦点与第一探测光纤13的光纤端面中心重合，第二探测光的焦点与第二探测光纤16的光纤端面中心重合；第一针孔12所在平面紧贴第一探测光纤13的光纤端面，且第一探测光光轴垂直通过第一针孔12中心；第二针孔15所在平面紧贴第二探测光纤16的光纤端面，且第二探测光光轴垂直通过第二针孔15中心；

(3)第一探测光纤13另一端连接第一探测器14，第二探测光纤16连接第二探测器17，第一探测器14和第二探测器17与计算机18相连；第一探测光纤13通过耦合将经第一针孔12滤波的测量光传至第一探测器14，第一探测器14将光信号转化为电信号传至计算机18，信号设为I₁；第二探测光纤16通过耦合将经第二针孔15滤波的测量光传至第二探测器17，第二探测器17将光信号转化为电信号传至计算机18，信号设为I₂；

(4)计算机18将两信号进行数据处理，完成一点扫描；

(5)样品8所在纳米平移台9与计算机18相连，通过计算机18来控制纳米平移台9使样品8在垂直光轴面内移动完成二维扫描成像。

分析系统的点扩散函数，已知第一探测器14探测的光强大小为I₁，第二探测器17探测的光强大小为I₂，优选的方案中，第一针孔12面积为1.5个爱里斑(如图3所示)，第二个针孔15为4.5个爱里斑(如图4所示)，则最终信号强度为I₃＝I₁-α(I₂-I₁)，优选的α大小为0.5，，理论结果如图6所示，可以看到处理后的信号具有更高的横向分辨率。

实施例4

采用图2所示的装置针对荧光样品进行基于双针孔的超分辨显微成像，与实施例3的区别在于将实施例3中的第二针孔15换为环形孔，其他装置不变。优选的方案中，第一针孔12面积为1.5个爱里斑(如图3所示)，环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑(如图5所示)，设第一探测器探测的光强大小为I′₁，环形孔探测的光强大小为I′₂，则最后点扩散函数的处理变为I′₃＝I′₁-αI′₂，优选的α大小为0.5，理论结果如图7所示，可以看到处理后的信号具有更高的横向分辨率。

Claims (9)

1.一种基于双针孔的超分辨显微方法，包括激光器发射出的光束聚焦到样品的表面形成信号光，将该信号光分为强度相等的两束光，这两束光分别通过第一针孔和第二针孔后进入相应探测器并进行对应的处理，其特征在于，所述第一针孔面积为0.5～2个爱里斑，所述第二针孔面积为2～5个爱里斑。

2.如权利要求1所述的基于双针孔的超分辨显微方法，其特征在于，所述第一针孔面积为1.5个爱里斑，所述第二针孔面积为4.5个爱里斑。

3.如权利要求2所述的基于双针孔的超分辨显微方法，其特征在于，所述第二针孔为环形孔，所述环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，所述环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑。

4.一种基于双针孔的超分辨显微装置，包括用于发出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的偏振片、偏振分束器、四分之一波片、第一透镜和用于承载待测样品的纳米平移台，依次布置在所述偏振分束器的反射光路上的第二透镜和分束器，分别用于对所述分束器射出的第一测量光和第二测量光进行滤波的第一针孔和第二针孔，以及收集通过所述第一针孔和第二针孔的光强信号的探测系统，其特征在于，所述第一针孔面积为0.5～2个爱里斑，所述第二针孔面积为2～5个爱里斑。

5.如权利要求4所述的基于双针孔的超分辨显微装置，其特征在于，所述第一针孔面积为1.5个爱里斑，所述第二针孔面积为4.5个爱里斑。

6.如权利要求5所述的基于双针孔的超分辨显微装置，其特征在于，所述第二针孔为环形孔，所述环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，所述环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑。

7.如权利要求4所述的基于双针孔的超分辨显微装置，其特征在于，所述激光器与偏振片之间依次设有用于对光束进行耦合的单模光纤和对光束进行准直的准直透镜。

8.一种基于双针孔的超分辨显微装置，包括：用于发出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的第一透镜和用于承载待测样品的纳米平移台，用于将所述样品表面发出的信号光分为第一测量光和第二测量光的分束器，分别用于对所述分束器射出的第一测量光和第二测量光进行滤波的第一针孔和第二针孔，以及收集通过所述第一针孔和第二针孔的光强信号的探测系统，其特征在于，所述第一透镜和激光器之间设有用于反射所述样品表面发出的信号光的二向色镜，所述二向色镜与所述分束器之间设有带通滤光片。

9.如权利要求8所述的基于双针孔的超分辨显微装置，其特征在于，所述激光器与二向色镜之间依次设有用于对光束进行耦合的单模光纤和对光束进行准直的准直透镜。

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