CN103472042B - 一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法，在激活光对样品的荧光分子激活后，利用激光经两个渥拉斯顿棱镜形成两束垂直偏振光（s光）和两束平行偏振光（p光），这四束线偏光聚焦在样品上形成的干涉光斑对荧光样品进行漂白，再用激发光激发未被漂白的部分，也就是干涉光斑的暗斑部分并发出荧光，以实现快速超分辨显微，直接成像。本发明还公开了一种基于荧光开关的快速超分辨显微装置。本发明装置结构简单，数据处理方便；能够实现对标记荧光开关的样品进行快速的超分辨显微，无需对获取的图像进行高斯拟合以确定荧光分子中心位置；激活光能够激活更高密度的荧光分子。

Description

一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法和装置

技术领域

本发明属于超分辨显微领域，特别涉及一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法和装置。

背景技术

当普通的光学显微镜需要分辨两个或者更多点光源位置时难以突破衍射极限，其分辨率约为250nm，但当显微镜视野内仅有单个荧光分子时，通过高斯拟合单分子的点扩散函数可以很容易的突破常规光学显微镜分辨率的极限，实现超分辨显微。

基于单分子定位理论，Betzig于2006年提出了光激活定位显微术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)，同年底，美国的华裔科学家庄晓薇提出了一种类似PALM的方法并命名为随机光学重构显微术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)。这两种光学超分辨技术都是利用荧光分子的光开关效应，首先采用一束特定波长的激活光使得同一时间只有极少数稀疏的荧光分子被激活，并具备发射荧光的能力，此时这些荧光分子所发出的荧光将不会由于衍射效应而发生空间上的串扰，再利用另一个波长的激光来观察、精确定位并漂白这些荧光分子，相应的荧光分子就可以被一一区分并通过PSF数字化的方法计算出中心位置，反复这一过程逐个获取数微米尺度范围内所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像，即可实现超分辨显微。

上述两种方法需对荧光分子进行稀疏的激活，以保证被激发的荧光不会由于衍射效应而发生空间上的串扰，同时要对最后获取的图像进行高斯拟合以确定荧光分子的中心位置。

发明内容

本发明提供了一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法和装置，装置结构简单，便于操作，能够实现基于荧光开关的快速超分辨显微成像，可用于光学显微成像领域。

一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法，包括以下步骤：

1）将第一激光光束聚焦到荧光样品表面，对荧光样品进行激活；

2）将第二激光光束分为偏振方向互相垂直的第一线偏光和第二线偏光，再将所述的第一线偏光分为第一平行偏振光和第一垂直偏振光，同时所述的第二线偏光分为第二平行偏振光和第二垂直偏振光，然后将四束偏振光（指第一平行偏振光、第一垂直偏振光、第二平行偏振光和第二垂直偏振光）聚焦至荧光样品表面并发生干涉形成干涉光斑，所述干涉光斑中的亮斑部分对荧光样品进行漂白；

3）将第三激光光束聚焦到荧光样品表面，激发所述荧光样品中未被漂白的荧光分子发出荧光；

4）利用探测器收集所述荧光的信息，并通过计算机对该信息进行数据处理，完成对样品的扫描。

本发明中，在激活光对样品的荧光分子激活后，利用激光经两个渥拉斯顿棱镜形成两束垂直偏振光（s光）和两束平行偏振光（p光），这四束线偏光聚焦在样品上形成的干涉光斑对荧光样品进行漂白，再用激发光激发未被漂白的部分，也就是干涉光斑的暗斑部分并发出荧光，以实现快速超分辨显微，直接成像。

在所述的步骤2）中，所述的第二激光光束经第一渥拉斯顿棱镜分为第一线偏光和第二线偏光，第一线偏光和第二线偏光具有在振动方向和角度互相垂直的特性；

所述的第一线偏光经第二渥拉斯顿棱镜分为第一平行偏振光（p光）和第一垂直偏振光（s光）；

所述的第二线偏光经第二渥拉斯顿棱镜分为第二平行偏振光（p光）和第二垂直偏振光（s光）。

在所述步骤2）的干涉光斑中，相邻两亮斑或两暗斑中心的最小距离为D=λ/2NA，λ为波长，NA为聚焦用物镜的数值孔径。

在聚焦用物镜的入瞳处，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心连线垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的光斑中心连线。

将所述的荧光样品放置在纳米平移台上，并通过计算机控制纳米平移台在垂直光轴方向上移动，重复步骤1）～步骤4），完成对荧光样品的二维平面扫描。

本发明还提供了一种基于荧光开关的快速超分辨显微装置，包括：

第一激光器，用于发出激活荧光样品的激活光；

第二激光器，用于发出漂白荧光样品的漂白光；

第三激光器，用于发出激发未被漂白的荧光样品产生荧光的激发光；

沿所述第二激光器光路依次布置的双折射偏光器件、准直透镜、物镜和纳米平移台，所述的物镜用于将所述的激活光、漂白光和激发光聚焦于纳米平移台上的荧光样品；

用于收集所述荧光信息的探测器；

以及与所述探测器和纳米平移台连接的计算机。

所述的双折射偏光器件为依次布置的第一渥拉斯顿棱镜和第二渥拉斯顿棱镜；

所述的第一渥拉斯顿棱镜用于将漂白光分为偏振方向互相垂直的第一线偏光和第二线偏光；

所述的第二渥拉斯顿棱镜用于将第一线偏光分为第一平行偏振光和第一垂直偏振光，并将第二线偏光分为第二平行偏振光和第二垂直偏振光。

在所述物镜的入瞳处，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心连线垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的光斑中心连线。

本发明原理如下：

在基于荧光开光的快速超分辨显微中，首先利用一束激活光对样品的荧光分子进行激活，然后另一束激光经过两个渥拉斯顿棱镜，在系统入瞳处形成四束线偏振光，如图2所示。这四束偏振光经物镜聚焦到样品表面发生干涉并形成干涉光斑，干涉光斑如图3所示，其中两亮斑或两暗斑中心的最小距离为D=λ/2NA，大小恰好等于一个艾里斑的直径，其中NA为物镜的数值孔径。干涉光斑中的亮斑部分对荧光样品漂白，因此最后的激发光实际只能够激发干涉光斑中暗斑的荧光分子，而暗斑的大小远小于衍射极限，这样就能够实现对荧光分子的定位，同时两暗斑之间的距离恰好等于一个艾里斑的直径，而暗斑的大小远小于衍射极限，所以相比于原有的基于荧光开光的单分子定位方法，激活光能够激活更高密度的荧光分子，并能保证不会由于衍射效应发生空间上的串扰。荧光样品发出荧光后被探测器接收完成单点扫描，接着计算机控制纳米平移台使样品完成二维扫描成像，实现快速的超分辨成像。同原有的基于荧光开光的单分子定位方法相比，本发明无需对获取的图像进行高斯拟合以确定荧光分子的中心位置，同时激活光能够激活更高密度的荧光分子，实现更快速的超分辨成像。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）相对于原有的基于荧光开光的单分子定位方法，激活光能够激活更高密度的荧光分子；

（2）能够实现对标记荧光开关的样品进行快速的超分辨显微，无需对获取的图像进行高斯拟合以确定荧光分子中心位置；

（3）装置结构简单，数据处理方便。

附图说明

图1为针对荧光样品的一种基于荧光开关的快速超分辨显微装置示意图；

图2为第二激光器发出的光束在入瞳处形成的四束线偏光光斑图样；

图3为四束线偏光经物镜透射聚焦到荧光样品表面，发生干涉形成的干涉光斑图样；

图4为干涉光斑图样中截取的部分示意图。

具体实施方式

如图1所示，一种针对荧光样品的基于荧光开关的快速超分辨显微装置，包括第二激光器1，第一渥拉斯顿棱镜2，第二渥拉斯顿棱镜3，第二透镜4，第一双色镜5，第二双色镜6，第三双色镜7，物镜9，荧光样品10，纳米平移台11，第一透镜12，第一激光器13，第三透镜14，第三激光器15，滤波片16，探测器17，计算机18。

第一激光器13，用于发出激活光，实现对荧光样品的激活；第二激光器1，用于发出激光，实现对荧光样品的漂白；第三激光器15，用于发出激发光，实现对荧光样品的激发，使其发出荧光。

第一透镜12、第二透镜4和第三透镜14分别用于将对应激光器发出的光束进行准直。

第一渥拉斯顿棱镜2的作用是将所述第二激光器发出的激光分成两束分开的，角度、振动方向互相垂直的线偏光，第二渥拉斯顿棱镜4的作用是将这两束线偏光分别分成平行偏振光（p光）和垂直偏振光（s光）。这样在系统入瞳处就得到四束线偏光，分别是两束平行偏振光（p光），两束垂直偏振光（s光），且入瞳处，第一平行偏振光（p光）和第一垂直偏振光（s光）的光斑中心连线垂直于所述第二平行偏振光（p光）和第二垂直偏振光（s光）的光斑中心连线，如图2所示，图中四束线偏光的光斑分别用abcd来编号，其中，a和c为两束垂直偏振光（s光）的光斑，b和d为两束平行偏振光（p光）的光斑。

第一双色镜5用于全部反射第一激光器13发出的激活光和全部透射的第二激光器1发出的激光；第二双色镜6用于全部反射第三激光器15发出的激发光和全部透射经第一双色镜5全部透射的激光；第三双色镜7用于全部透射经第二双色镜6全部透射的激光和全部反射物镜9收集的样品被激发出的荧光。

滤波片16的作用是将物镜9收集的非信号光波段过滤；计算机18的作用是用于处理探测器17的信号，同时控制纳米平移台11完成对样品的二维平面扫描。

采用图1所示的装置实现针对荧光样品的基于荧光开关的快速超分辨显微方法，其过程如下：

（1）第一激光器13发出激活光，经第一透镜12准直后形成准直光，准直光经第一双色镜5全部反射，再经第二双色镜6和第三双色镜7全部透射，最后经物镜9聚焦到荧光样品10表面，激活荧光样品10的荧光分子；

（2）第二激光器1发出激光，经第一渥拉斯顿棱镜2和第二渥拉斯顿棱镜3后形成四束偏振光，这四束偏振光经第二透镜4透射后，再经第一双色镜5，第二双色镜6和第三双色镜7全部透射，在入瞳8处形成如图2所示的光斑，最后经物镜9聚焦到荧光样品10表面，四束偏振光发生干涉形成干涉光斑，其中亮斑部分漂白荧光样品10中的荧光分子，四束线偏光形成的干涉光斑如图3所示，其中两亮点的最小距离为D=λ/2NA，λ为激光波长，NA为物镜的数值孔径，详见图4；

（3）第三激光器15发出激发光，经第三透镜14准直后形成准直光，准直光经第二双色镜6全部反射，再经第三双色镜7全部透射，最后经物镜9聚焦到荧光样品10的表面，激发荧光样品10中未被漂白的也就是第二激光器发出的光束形成的干涉光斑中暗斑部分的荧光分子；

（4）荧光样品10荧光被激发，得到的激发荧光被物镜9收集，并经第三双色镜7全部反射，再经滤波片16过滤掉非信号光波段，最后被探测器17所接收，所述探测器17将光信号转化为电信号传至计算机18；

（5）计算机18将信号进行数据处理，完成第一次扫描；

（6）荧光样品10所在的纳米平台11与计算机18相连，通过计算机18来控制纳米平移台11使荧光样品10在垂直光轴面内移动完成二维扫描成像。

Claims (6)

1.一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将第一激光光束聚焦到荧光样品表面，对荧光样品进行激活；

2)将第二激光光束分为偏振方向互相垂直的第一线偏光和第二线偏光，再将所述的第一线偏光分为第一平行偏振光和第一垂直偏振光，同时所述的第二线偏光分为第二平行偏振光和第二垂直偏振光，然后将四束偏振光聚焦至荧光样品表面并发生干涉形成干涉光斑，所述干涉光斑中的亮斑部分对荧光样品进行漂白；

在聚焦用物镜的入瞳处，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心连线垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的光斑中心连线，且两暗斑之间的距离恰好等于一个艾里斑的直径；

3)将第三激光光束聚焦到荧光样品表面，激发所述荧光样品中未被漂白的荧光分子发出荧光；

4)利用探测器收集所述荧光的信息，并通过计算机对该信息进行数据处理，完成对样品的扫描。

2.如权利要求1所述的基于荧光开关的快速超分辨显微方法，其特征在于，在所述的步骤2)中，所述的第二激光光束经第一渥拉斯顿棱镜分为第一线偏光和第二线偏光；

所述的第一线偏光经第二渥拉斯顿棱镜分为第一平行偏振光和第一垂直偏振光；

所述的第二线偏光经第二渥拉斯顿棱镜分为第二平行偏振光和第二垂直偏振光。

3.如权利要求1所述的基于荧光开关的快速超分辨显微方法，其特征在于，在所述步骤2)的干涉光斑中，相邻两亮斑或两暗斑中心的最小距离为D＝λ/2NA，λ为波长，NA为聚焦用物镜的数值孔径。

4.如权利要求1所述的基于荧光开关的快速超分辨显微方法，其特征在于，将所述的荧光样品放置在纳米平移台上，并通过计算机控制纳米平移台在垂直光轴方向上移动，重复步骤1)～步骤4)，完成对荧光样品的二维平面扫描。

5.一种基于荧光开关的快速超分辨显微装置，其特征在于，包括：

第一激光器，用于发出激活荧光样品的激活光；

第二激光器，用于发出漂白荧光样品的漂白光；

第三激光器，用于发出激发未被漂白的荧光样品产生荧光的激发光；

沿所述第二激光器光路依次布置的双折射偏光器件、准直透镜、物镜和纳米平移台，所述的物镜用于将所述的激活光、漂白光和激发光聚焦于纳米平移台上的荧光样品；

在所述物镜的入瞳处，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心连线垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的光斑中心连线，且两暗斑之间的距离恰好等于一个艾里斑的直径；

用于收集所述荧光信息的探测器；

以及与所述探测器和纳米平移台连接的计算机。

6.如权利要求5所述的基于荧光开关的快速超分辨显微装置，其特征在于，所述的双折射偏光器件为依次布置的第一渥拉斯顿棱镜和第二渥拉斯顿棱镜；

所述的第一渥拉斯顿棱镜用于将漂白光分为偏振方向互相垂直的第一线偏光和第二线偏光；

所述的第二渥拉斯顿棱镜用于将第一线偏光分为第一平行偏振光和第一垂直偏振光，并将第二线偏光分为第二平行偏振光和第二垂直偏振光。