JP4401897B2 - レシオイメージング装置 - Google Patents

Description

本発明は、光学顕微鏡、特に蛍光顕微鏡等に適用されるレシオイメージング装置に関し、被測定試料に含有させた蛍光色素や蛍光タンパク質等を用いて、試料内の各種イオン濃度の２次元分布などを測定するレシオイメージング装置に関するものである。

一般に、蛍光顕微鏡は、医学や生物学をはじめ、その他の分野において生物組織や細胞等において蛍光標識を施したタンパク質や遺伝子等を検出する目的で広く用いられている。特に、近年では、蛍光色素で染色した標本や蛍光たんぱく質を発現させた標本を生きたまま観察することが行われている。特に、細胞内機能の解明には、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等の各種イオン濃度やｐＨの時空間的変化を求めることが重要である。このため、イオン濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光色素や蛍光タンパク質（以下、蛍光プローブと呼ぶ）を細胞内に導入し、蛍光顕微鏡を用いて、カメラで撮像し、その蛍光強度の時空間的変化から逆にイオン濃度等を求めることが行われている。

しかしながら、このように蛍光強度がイオン濃度に応じて変化するような蛍光プローブでは、細胞内における蛍光プローブの局在にムラがある場合や、測定中に細胞の厚さが変化する場合や蛍光プローブが細胞外へ漏出してしまう場合、または、蛍光プローブ自身が褪色して蛍光強度が低減していく場合、あるいは、励起光の照明ムラや、励起光強度の時間的な変動等の様々な要因の影響を受けるため、イオン濃度の定量的な測定は困難である。

そこで、これらの問題点を解決するために、Fura 2やＩndo 1に代表される励起波長あるいは蛍光波長がある特定の波長の上下の２波長において、イオン濃度に応じて逆方向に変化するような蛍光プローブを用い、それら２波長において励起した２つの画像、あるいは、それら２波長における蛍光の画像を順番に撮像して、その比をとることにより、上述したようなイオン濃度の変化とは無関係な蛍光強度の変動の影響を補償し、イオン濃度の変化のみを定量的に求める手法、いわゆるレシオメトリーが広く用いられている。

これらのレシオメトリーで用いられる蛍光プローブのうち、１波長励起２波長測光型の蛍光プローブ（イオン濃度に応じて蛍光のスペクトルがある波長の上下で逆方向の変化する型の蛍光プローブ）を用いた場合は、励起波長は一波長でよく、蛍光を、ある波長の上下で分離するようなダイクロイックミラーで分離した後に、２台のカメラで同時に撮像することができる。このため、線虫のように動きのある試料や、心筋の拍動に伴うカルシウムイオン濃度の伝播等のように時間的に速い現象でも、２つの蛍光波長による画像間の時間的なずれは全く生じずに正確なイオン濃度の測定ができる。しかし、これら１波長励起２波長測光型の蛍光プローブの種類は極めて少ないという問題がある。

これに対して、２波長励起１波長測光型の蛍光プローブ（イオン濃度に応じて励起スペクトルがある波長の上下で逆方向の変化する型の蛍光プローブ）は、例えば、カルシウムイオン用のプローブでさえもFura 2、Fura Red、BTC等のように種類が多く、また、様々な親和性を持ったものが多く市販されている。

従来、このような２波長励起１波長測光型の蛍光プローブを用いたレシオイメージング装置としては、図１０または図１１に示す構成のものが知られている。

まず、図１０に示す従来例にあっては、光源１１から出た光をコレクタレンズ１２によって平行光にした後、励起フィルタ１３ａまたは１３ｂを通し、投影レンズ１５によって、ダイクロイックミラー１６で反射させた後、対物レンズ１７の瞳位置に光源の像を投影するような構成になっている。さらに、対物レンズ１７を通過した光源１１からの光は被測定試料１８に一様に照射される。試料１８から発した蛍光は対物レンズ１７、ダイクロイックミラー１６、蛍光フィルタ１９、結像レンズ２０を通って、ＣＣＤカメラ２４に結像し、被測定試料１８の蛍光画像が得られるようになっている。

また、光源１１とダイクロイックミラー１６の間に、通過波長帯域の異なる一対の励起フィルタ（光学バンドパスフィルタ）１３ａ、１３ｂを有する光軸変換手段５０が設けられ、これらの励起フィルタ１３ａ、１３ｂの位置を切換えることによって、被測定試料１８に照射される光源１１からの光の波長帯域を変えるようになっている。

ＣＣＤカメラ２４から出力される画像信号は、画像処理部２５に入力されて、各波長帯域で励起されたデジタル画像データに変換され、更に、内部の演算手段（図示せず）が、これらのデジタル画像データの比を演算することによって、被測定試料１８に含まれている物質の量の分布を２次元的に定量する。

なお、励起フィルタ１３ａ、１３ｂの切換えを行う必要があるので、例えば、最初に、励起フィルタ１３ａを通過した光源１１からの光によって励起されて発した蛍光像をカメラ２４で撮像して、画像処理部２５がこのデジタル画像データを一旦フレームメモリに格納し、次に、励起フィルタ１３ｂに切換えて、これを通過した光源１１からの光によって励起されて発した蛍光像をカメラ２４で撮像してもう一方のデジタル画像データを得、そして、画像処理部２５が、このように時間的にずらして撮像を行うことで得られた波長帯域の異なる光で励起されて発した蛍光像の２つのデジタル画像データについて比を演算するようになっている。

図１１の従来例にあっては、光源１１からの光を半透鏡１４ａで分離した後、一方を励起フィルタ１３ａで波長帯域を選択し、他方を励起フィルタ１３ｂで波長帯域を選択し、半透鏡１４ｂで再び光を重ね合わせている。また、偏光板５１ａで一方の光の偏光方向を選択し、偏光板５１ｂで他方の異なる偏光方向を選択するように構成されている。投影レンズ１５を通過し、ダイクロイックミラー１６で反射し、対物レンズ１７を通過して被測定試料１８に照射される。試料１８から発した蛍光は対物レンズ１７、ダイクロイックミラー１６、結像レンズ２０を通過し、反射鏡４５で反射された後、蛍光フィルタ１９で波長帯域を選択し、半透鏡２２で２つに分けらる。半透鏡で二分された光は、それぞれカメラ２４ａ、２４ｂに結像するようになっている。また、偏光板５１ｃで一方の光の偏光方向を選択し、偏光板５１ｄで他方の異なる偏光方向を選択するように構成されている。

ここで、それぞれの波長帯域の励起光を直交する直線偏光になるように偏光板５１ａ、５１ｂで選択し、更に、蛍光を、偏光板５１ｃ、５１ｄで直交する偏光成分に分離して、カメラで撮像するようにする。カメラ２４ａ、２４ｂで撮像されたデジタル画像データを画像処理部２５が、このように直交する偏光成分で分離した２つの画像データから所定の計算を行うことによって、各波長帯域単独で励起した場合と等価な蛍光像を求め、さらに、それの比を演算してレシオ画像を求めるようになっている。
特開平０９−００５２４３号公報 特開平１０−０９０６０８号公報 特開２００４−１７７６６２号公報 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ誌３１７号、７７−８３ページ、２００４年４月２３日発行、著者：Ｔａｋａｓｈｉ Ｆｕｋａｎｏ、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ、Ａｔｓｕｓｈｉ Ｍｉｙａｗａｋｉ。

しかし、図１０に示した従来のレシオイメージング装置にあっては、異なる波長帯域で励起した蛍光像を得るために、一対の励起フィルタ１３ａ、１３ｂを時間的にずらして切換える必要があるので、２つの画像を撮像する時間内に被測定試料１８が移動したり変形するような場合に正確に対応できず、また、カルシウムウェーブのような変化の速い現象を測定することができず、また、被測定試料１８が僅かに移動したり変形するだけで測定精度が著しく低下することから、基本的に優れた測定精度を得ることが困難であった。

また、図１１に示した従来のレシオイメージング装置にあっては、実質的に、異なる２つの波長帯域で励起した蛍光像を同時に得ることができる。しかし、この手法においては、２つのカメラで撮像した蛍光像から複雑な計算処理をしなければならない煩わしさがある。さらに、この手法は、原理的に、多数の蛍光分子集団の統計的な性質を用いているため、１分子イメージングをはじめ蛍光分子の数が少ない場合には適用することができなかった。

そこで本願発明の目的は、従来技術の有する問題点を解消し、二波長励起一波長測光型のプローブを用いた場合に、２つの異なる励起波長を高速に切換えるとともに、それと同期して開閉するシャッターを通して画像を検出することにより、２つの異なる励起波長に対応する画像を実質的に同時に測定しうるレシオイメージング装置を提供することである。

上記課題を解決するために、本願発明は、第１波長で照射する第１照射手段と、第２波長で照射する第２照射手段と、前記第１波長と前記第２波長で照射されたときにイオン濃度の変化に対し逆特性を有するプローブを内部に含む試料を前記第１照射手段で照射して、前記イオン濃度に依存して生成される第１信号光を検出する第１検出手段と、前記第２照射手段で前記試料を照射して、前記イオン濃度に依存して生成される第２信号光を検出する第２検出手段と、基準信号を発生させる基準信号発生手段と、前記第１照射手段と前記第２照射手段とによる前記試料への照射が交互となるように、前記第１照射手段及び前記第２照射手段による照射を前記基準信号に基づき開閉する照射開閉手段と、前記第１検出手段が前記第１信号光のみを検出し前記第２検出手段が前記第２信号光のみを検出するように、前記第１検出手段及び前記第２検出手段による検出を前記基準信号に基づき開閉する検出開閉手段と、前記第１検出手段で検出した前記第１信号光と前記第２検出手段で検出した前記第２信号光との比を演算する演算手段とを備えることを特徴とする。

また、前記照射開閉手段による前記第１照射手段及び前記第２照射手段の照射開閉タイミングと前記検出開閉手段による前記第１検出手段及び前記第２検出手段の検出開閉タイミングとは、同期していることを特徴とする。

また、前記第１照射手段は前記第１波長用の第１光源を有し、前記第２照射手段は前記第２波長用の第２光源を有し、前記照射開閉手段は、前記第１光源及び前記第２光源の駆動自体を変調する駆動変調手段を有することを特徴とする。

また、前記照射開閉手段は、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線強度を変調する強度変調手段を有することを特徴とする。

また、前記強度変調手段は、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線を開閉する単一の共通シャッターを有することを特徴とする。

また、前記強度変調手段は、各々が傾斜角が２通りに設定可能な微小ミラーを多数配列してなるマイクロミラーアレイを有し、前記マイクロミラーアレイは、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線の光路が共通となるように反射させる
ことを特徴とする。

また、前記検出開閉手段は、前記第１検出手段及び前記第２検出手段の各々に入射する前記第１信号光及び前記第２信号光の光線を開閉するシャッターを有することを特徴とする。

また、前記シャッターは、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線を開閉する単一の共通シャッターであることを特徴とする。

また、前記検出開閉手段は、各々が傾斜角が２通りに設定可能な微小ミラーを多数配列してなるマイクロミラーアレイを有し、前記マイクロミラーアレイは、前記第１信号光及び前記第２信号光の光線を前記第１検出手段及び前記第２検出手段の各々に振り分けるように反射させることを特徴とする。

また、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の照射光の光路上に配設された複数の微小開口が形成されてなる回転板と、前記試料の面に前記照射光を照射する対物レンズと、前記第１信号光及び前記第２信号光の各々を前記第１検出手段及び前記第２検出手段の各々の結像面に結像させる結像レンズを備え、前記微小開口は、前記対物レンズに対し前記試料の面と共役位置にあるとともに前記結像レンズに対し前記結像面と共役位置にあることを特徴とする。

また、前記第１照射手段及び前記第２照射手段による照射光を伝送する光ファイバーと、前記光ファイバーの出射端から出射する光線を平行化して前記回転板へ送る投影レンズを備えることを特徴とする。

また、前記第１照射手段及び前記第２照射手段による照射光の一部を通過可能な開口が形成された照射面を有しこの照射面に垂直に移動可能な移動開口部と、前記試料の面に前記照射光を照射する対物レンズと、前記移動開口部の前記開口を前記対物レンズの後側焦点面上に結像可能な投影レンズとを備え、前記対物レンズを出射して前記試料に照射される照射光が前記試料の面で全反射するように、前記移動開口部の前記開口を移動させて前記照射光の前記試料の面への入射角を設定することを特徴とする。

また、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の照射光を伝送する光ファイバーと、前記光ファイバーの出射端を出射面に垂直に移動可能な移動手段と、前記試料の面に前記照射光を照射する対物レンズと、前記光ファイバーの前記出射端を前記対物レンズの後側焦点面上に結像可能な投影レンズとを備え、前記対物レンズを出射して前記試料に照射される照射光が前記試料の面で全反射するように、前記光ファイバーの前記出射端を移動させて前記照射光の前記試料の面への入射角を設定することを特徴とする。

また、前記第１照射手段と前記第２照射手段とによる前記試料への照射は、前記第１検出手段及び前記第２検出手段が一つの画像を形成するに要する時間である１フレーム時間の間に、複数回に渡って繰り返されることを特徴とする。

また、前記第１検出手段及び前記第２検出手段は共通のカメラを有し、前記第１信号光及び前記第２信号光の各々は前記カメラの撮像面上の隣接する位置に並列して検出されることを特徴とする。

本願発明の構成によれば、第１波長と第２波長おいう異なる励起波長の励起光を試料に実質的に同時に照射し、それぞれの励起光照射によって発する第１信号光及び第２信号光を分離して独立に取得することができるレシオイメージング装置を提供することができる。

以下、本発明の実施の実施の形態について図面を参照して説明する。

第１実施例
図１は本発明の第１実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。

本実施例のレシオイメージング装置は、点滅が可能な光源と、光源から出射された光束を顕微鏡に導入するための光学系と、試料から発した蛍光の画像を光源の点滅と同期して検出する装置と、画像の演算装置と、から構成されている。

光源１１ａは、点滅可能な発光ダイオードや半導体レーザー等の光源で構成されている。光源１１ａから発せられた光は、コレクタレンズ１２ａに入射するようになっている。コレクタレンズ１２ａは、光源１１ａからの光を平行光束に変換するように構成されている。コレクタレンズ１２ａを介して平行光束に変換された光は、励起フィルタ１３ａを通過することにより、所定の励起波長が選択された後、半透鏡１４に入射する。

同様に、光源１１ｂは、点滅可能な発光ダイオードや半導体レーザー等の光源で構成されている。光源から発せられた光は、コレクタレンズ１２ｂに入射するようになっている。コレクタレンズ１２ｂは、光源からの光を平行光束に変換するように構成されている。コレクタレンズ１２ｂを介して平行光束に変換された光は、励起フィルタ１３ｂを通過することにより、所定の励起波長が選択された後、半透鏡１４に入射する。

半透鏡１４は、入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる機能を有している。光源１１ａから出た光束Ａは半透鏡１４を通過し、また、光源１１ｂから出た光束Ｂは半透鏡１４で反射し、光束Ａと光束Ｂは重ね合わされ同軸の光束となる。

図１中、１５は半透鏡１４で合成された光束Ａ及び光束Ｂの光源像を対物レンズ１７の瞳面に導く投影レンズである。ダイクロイックミラー１６は、投影レンズ１５を透過した光束ＡおよびＢを対物レンズ１７側に反射すると共に、試料１８から発した蛍光を透過するようになっている。２０はダイクロイックミラー１６を透過した試料１８からの蛍光をカメラ２４ａ及び２４ｂの撮像面上に結像させる結像レンズである。

また、図中、１９は試料１８からの蛍光のうちを、特定の波長域のみを透過させる蛍光フィルタである。

さらに、図中、２１は試料１８からの蛍光を反射させてカメラ２４ａ及びカメラ２４ｂに偏向させる反射鏡であり、半透鏡２２は入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる機能を有している。

半透鏡２２で反射された光束Ａ’は、シャッター２３ａを通ってカメラに結像する。また、半透鏡２２を透過した光束Ｂ’は、シャッター２３ｂを通ってカメラに結像する。

画像処理部２５は、カメラ２４ａ及びカメラ２４ｂから出力される電気信号をメモリーに蓄積し、さらに、得られた蛍光画像（デジタル画像データ）をもとに種々の演算を行うように構成されている。特に、カメラ２４ａおよびカメラ２４ｂで得られたそれぞれの蛍光画像に関して、まず、背景光を減算し、次に、それぞれのデジタル画像データの比を演算することによりレシオ画像を算出する。

図１中、２６は画像表示部である。画像表示部２６は、画像処理部２５で処理された画像を表示する機能を有している。

図１中、信号発生器３１は光源１１ａ、１１ｂの点滅とシャッター２３ａ、２３ｂの開閉を同期させるための基準信号を２つ発生する。この基準信号としては、ＴＴＬパルス信号のような矩形波がその好例である。第１の基準信号と第２の基準信号との関係は、周波数は同一であるが、位相が１８０度反転している。

信号発生器３１から送出された第１の信号は、光源制御部３２ａに入力される。光源１１ａは、光源制御部３２ａによってその点滅が制御されるようになっている。したがって、光源１１ａは入力された第１の信号に基づいて点滅する。

同様に、信号発生器３１から送出された第２の信号は、光源制御部３２ｂに入力される。光源１１ｂは、光源制御部３２ｂによってその点滅が制御されるようになっている。したがって、光源１１ｂは入力された第２の信号に基づいて点滅する。

こうようにすることにより、光源１１ａから発する光束Ａと光源１１ｂから発する光束Ｂとは点滅周波数が同一で、かつ、その位相が１８０度ずれていることになる。

また、光源１１ａから発する光束Ａで励起された試料１８から発する蛍光と光源１１ｂから発する光束Ｂで励起された試料１８から発する蛍光も、点滅周波数が同一で、かつ、その位相が１８０度ずれていることになる。

また、信号発生器３１から送出された第１の信号は、シャッター制御部３３ａに入力される。シャッター２３ａはシャッター制御部３３ａによってその開閉が制御されるようになっている。したがって、シャッター２３ａは入力された第１の信号に基づいて開閉する。

同様に、信号発生器３１から送出された第２の信号は、シャッター制御部３３ｂに入力される。シャッター２３ｂはシャッター制御部３３ｂによってその開閉が制御されるようになっている。したがって、シャッター２３ｂは入力された第２の信号を基づいて開閉する。

このようにすることにより、シャッター２３ａの開閉とシャッター２３ｂの開閉は、周波数が同一で、かつ、その位相が１８０度ずれていることになる。

図２に光源１１ａ（あるいは光源１１ａから発する光束Ａ）および光源１１ｂ（あるいは光源１１ｂから発する光束Ｂ）の点滅の様子とシャッター２３ａおよび２３ｂの開閉の様子と、カメラ２４ａとカメラ２４ｂの露光時間とのタイミング関係を模式的に示す。光源１１ａが点灯しているときは、光源１１ｂは消灯し、シャッター２３ａは開放し、シャッター２３ｂは閉じている。逆に、光源１１ａが消灯しているときは、光源１１ｂは点灯し、シャッター１１ａは閉じており、シャッター１１ｂは開いている。したがって、光源１１ａからの光束Ａにより励起されて発した試料１８からの蛍光は、シャッター２３ａのみを通り抜けてカメラ２４ａに到達することができるが、シャッター２３ｂで遮断されるためカメラ２４ｂには到達することができない。逆に、光源１１ｂからの光により励起されて発した蛍光は、シャッター２３ｂのみを通り抜けてカメラ２４ｂに到達することができるが、シャッター２３ａで遮断されるためカメラ２４ａには到達することができない。このようにして、カメラ２４ａは光源１１ａの光によって励起して発した蛍光のみを、カメラ２４ｂは光源１１ｂの光によって励起して発した蛍光のみを、カメラ２４ａおよび２４ｂの１フレームの露光時間内において、それぞれ蓄積する。露光が完了すると、カメラの読み出しによって、画像処理部２５のメモリーに転送される。次のフレームも同様な処理がなされる。ここで、１フレームの時間とは、１フレームを構成する複数の画素による撮像のために要する時間と複数の画素により撮像されたデータに所定のデータ処理を行うのに要する時間とからなり、主に、露光時間と撮像データをメモリーに転送するのに要するフレーム転送時間とからなっている。

このように構成されたレシオイメージング装置によれば、光源１１ａを点灯すると、光源から発せられた光は、コレクタレンズ１２ａを介して平行光束に変換され、励起フィルタ１３ａを所定の波長域の光が通過し、半透鏡１４に入射する。半透鏡１４を通過した光束Ａは、投影レンズ１５を通りダイクロイックミラー１６で反射し対物レンズ１７を経て、試料１８を照射する。試料１８は光束Ａの光を照射されることで試料内部に導入された蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

光束Ａを照射することにより試料１８で発した蛍光は、対物レンズ１７を逆進し、ダイクロイックミラー１６、蛍光フィルタ１９を通過し、結像レンズ２０を通過し、反射鏡２１で反射し、半透鏡２２で反射し、シャッター２３ａを通過し、蛍光像としてカメラ２４ａにより撮像される。

一方、光源１１ｂを点灯すると、光源１１ｂから発せられた光は、コレクタレンズ１２ｂを介して平行光束に変換され、励起フィルタ１３ｂを所定の波長域の光が通過し、半透鏡１４に入射する。半透鏡１４で反射した光束Ｂは、投影レンズ１５を通りダイクロイックミラー１６で反射し対物レンズ１７を経て、試料１８を照射する。試料１８は光束Ｂの光を照射されることで試料内部に導入された蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

光束Ｂを照射することにより試料１８で発した蛍光は、対物レンズ１７を逆進し、ダイクロイックミラー１６、蛍光フィルタ１９を通過し、結像レンズを２０通過し、反射鏡２１で反射し、半透鏡２２を透過し、シャッター２３ｂを通過し、蛍光像としてカメラ２４ｂにより撮像される。

さらに、カメラ２４ａ及びカメラ２４ｂで撮像された試料１８の蛍光像は、画像処理部２５においてそれらの画像間の輝度比が演算され、画像表示部２６に原画像及びレシオ画像が表示される。

次に、この実施例を蛍光顕微鏡に適用した場合の適用例を説明する。

細胞の機能を研究する分野では、ある細胞を被測定試料として、細胞内のカルシウムイオン濃度の２次元分布から細胞の機能を定量的に知るとことが一般的に行われている。

例えば、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）と呼ばれる蛍光色素を細胞に加えると、この色素は細胞内で加水分解されてＦｕｒａ Ｒｅｄに変化し、カルシウムイオンと特異的に結び付く。そして、この実施例のレシオイメージング装置にこのような処理を施した細胞（ここでは、ラットの心筋細胞）を被測定試料として観察状態にセットして測定を開始する。

Ｆｕｒａ Ｒｅｄは４５８ｎｍ付近に等吸収点を有し、この波長より短波長で励起した場合は、カルシウムイオン濃度が高いときに、蛍光量が多くなり、カルシウムイオン濃度が少ないときには蛍光量が少なくなるという特性を有する。また、等吸収点より長波長で励起した場合は、カルシウムイオン濃度が高いときに、蛍光量が少なくなり、カルシウムイオン濃度が少ないときには蛍光量が多くなるという特性を有する。

したがって、図１に示す実施例において、光源１１ａには、青色発光ダイオード（発光中心波長４７０ｎｍ、スペクトル半値全幅５０ｎｍ）を用い、励起フィルタ１３ａには、４７５ＡＦ２０（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社、中心波長４７５ｎｍ、透過波長帯域４６５−４８５ｎｍ）を用いた。また、光源１１ｂには、紫外発光ダイオード（発光中心波長３９５ｎｍ、スペクトル半値全幅４０ｎｍ）を用い、励起フィルタ１３ｂには、４０５ＤＦ４０（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社、中心波長４０５ｎｍ、透過波長帯域３８５−４２５ｎｍ）を用いた。

ダイクロイックミラー１６には、５０５ＤＲＬＰＸＲ（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社）を用いた。これは、波長５０５ｎｍより短波長の光を反射し、長波長の光を透過する。対物レンズには４０倍の油浸対物レンズ（オリンパス社、ＵＡＰＯ３４０、４０倍、ＮＡ１．３５）を用いた。また、蛍光フィルタ１９には、５３０ＡＬＰ（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社、波長５３０ｎｍより長波長を透過）を用いた。シャッター２３ａ、２３ｂには、強誘電性液晶の液晶シャッター（Ｄｉｓｐｌａｙｔｅｃｈ社、ＬＶ２５００Ｐ−ＯＥＭ）を用いた。カメラ２４ａ、２４ｂには、冷却ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＣｏｏｌＳｎａｐ−ＨＱ）を用いた。また、画像処理部には、市販のイメージングソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ社、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）を用いた。信号発生器３１には、ファンクションジェネレーター（ＳＯＮＹ Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ社、ＡＦＧ−３２０）を用いた。これより、矩形波（０から５Ｖ）を発生させ、これを光源制御部３２ａおよびシャッター制御部３３ａ（Ｄｉｓｐｌａｙｔｅｃｈ社、ＤＲ９５）に入力した。また、上述した矩形波を分岐させ、ＮＯＴ回路を通して、位相を反転させた矩形波を生成し、光源制御部３２ｂおよびシャッター制御部３３ｂ（Ｄｉｓｐｌａｙｔｅｃｈ社、ＤＲ９５）に入力した。光源制御部３２ａおよび光源制御部３２ｂには自作した定電流回路を用い、信号発生器３１からの信号によって接続された発光ダイオードを点滅できるようにした。信号発生器３１からの矩形波信号の周波数は４ｋＨｚに設定した。したがって、光源１１ａおよび１１ｂから発する光の点滅は、同じく周波数４ｋＨｚであり、その位相が反転している。また、シャッター２３ａ、２３ｂも同様に周波数４ｋＨｚで開閉し、その位相が反転している。また、信号発生器３１から送出する矩形波のデューティー比を変えることにより光源１１ａおよび１１ｂからの光量の調整を行った。カメラ２４ａおよび２４ｂは、露光時間３０ｍｓで撮像すると同時に、瞬時に画像処理部２５によってレシオが計算され画像表示部２６に表示される。これより、ラット心筋の拍動（周波数約２Ｈｚ）に伴うカルシウムの増減が、心筋の収縮による厚さの変化の影響を受けることなく確実に撮像できた。

従って、本実施例のレシオイメージング装置によれば、カメラの１フレーム内において、時間的に完全に同時に、異なる２波長の光で励起した蛍光像を、クロストークなしに確実に取得できる。したがって、変化の速い現象や、動きの速い試料のレシオ画像を確実に得ることができる。

なお、半透鏡１４にかえて、ダイクロイックミラーを用いても良い。この場合、光束Ａを透過し、光束Ｂを反射するような特性を持つダイクロイックミラーを用いることにより、夫々の光源１１ａおよび１１ｂから出た光を有効に顕微鏡に導入することができる。

また、光源１１ａ及び光源１１ｂの点灯時間の比は１：１だけでなく、その比を変えてもよい。このようにすることにより、光源１１ａ及び光源１１ｂから出射される単位時間あたりの励起光強度を調整することができ、結果として得られる蛍光像の強度のバランスを最適にすることが可能である。

なお、光源１１ａの点灯持続時間はシャッター２３ａの開放時間と同じか、あるいは、短くする必要がある。同様に、光源１１ｂの点灯持続時間はシャッター２３ｂの開放時間と同じか、あるいは、短くする必要がある。このようにすることにより、クロストークなしに確実に蛍光像を得ることができる。

また、光源１１ａは、カメラ２３ａの露光時間内に少なくとも１回点滅すればよいが、望ましくは、１０回以上点滅させるのが良い。同様に、光源１１ｂは、カメラ２３ｂの露光時間内に少なくとも１回点滅すればよいが、望ましくは、１０回以上点滅させるのが良い。

なお、カメラ２３ａとカメラ２３ｂの露光時間及び露光開始時間は同じにすることが、同時性を担保する上で望ましい。

なお、光源１１ａと光源１１ｂは、異なる波長の光源を用いてもよいが、同じ波長の光源を用いてもよい。この場合、励起フィルタ１３ａも１３ｂを異なる波長透過特性のものを用いる必要がある。

第２実施例
図３は本発明の第２実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

第１実施例では、光源１１ａ、１１ｂとしては発光ダイオード等のような光源自身が点滅可能な光源を用いたが、キセノンランプや水銀ランプ等のように光源自身は点滅ができない光源を用い、さらに、外部に変調器を用いて点滅を行っても良い。

第２実施例では、光源１１ａは、キセノンランプや水銀ランプ等の点滅が不能な白色光源である。光源１１ａから発せられた光は、コレクタレンズ１２ａに入射するようになっている。コレクタレンズ１２ａは、光源からの光を平行光束に変換するように構成されている。コレクタレンズ１２ａを介して平行光束に変換された光束Ａは、シャッター２３ｃを透過し、励起フィルタ１３ａを通過することにより、所定の励起波長が選択された後、半透鏡１４に入射する。

同様に、光源１１ｂは、キセノンランプや水銀ランプ等の点滅が不能な白色光源を想定する。光源から発せられた光は、コレクタレンズ１２ｂに入射するようになっている。コレクタレンズ１２ｂは、光源１１ｂからの光を平行光束Ｂに変換するように構成されている。コレクタレンズ１２ｂを介して平行光束Ｂに変換された光は、シャッター２３ｄを透過し、励起フィルタ１３ｂを通過することにより、所定の励起波長が選択された後、半透鏡に入射する。半透鏡１４を透過した光束Ａおよび半透鏡１４で反射された光束Ｂは重ね合わされ投影レンズ１５を介して顕微鏡に導入される。

また、シャッター制御部３３ｃは、信号発生器３１から送出される第１の信号に基づいてシャッター２３ｃの開閉を制御する。同様に、シャッター制御部３３ｄは、信号発生器３１から送出される第２の信号に基づいてシャッター２３ｄの開閉を制御する。

シャッター２３ｃおよび２３ｄとの関係は、シャッター２３ｃが開放しているときは、シャッター２３ｄは閉じており、また、逆に、シャッター２３ｃが閉じているときは、シャッター２３ｄが開放している。これにより、図１に示した実施例と同様に光源１１ａからの出射光束Ａと光源１１ｂから出射光束Ｂの点滅を逆位相で制御できる。また、光束Ａ、光束Ｂの点滅とシャッターの２３ｃ、２３ｄの開閉との関係は、図２に示したもの結果的に同じになる。

このように構成された本発明の第２実施例にかかるレシオイメージング装置によれば、光源自身が点滅できないような白色光源を用いても、外部に変調器を設けることにより、それぞれの光源からの光を結果的に点滅させることができるので、図１および図２に示した第１実施例と同様な効果を奏する。

なお、第２実施例では、シャッター２３ｃおよび２３ｄのかわりに、２台の光チョッパーを用いても良い。この場合、それぞれの光チョッパーは、チョッピング周波数を同一にし、光束Ａと光束Ｂのチョッピングの位相が互いに逆になるように設置する必要がある。光チョッパーを用いた場合には、高速なチョッピング（ｋＨｚオーダー）が可能であるため変調周波数を高くすることができるので、特に、動きのある試料を観察する場合に有効である。

また、第２実施例では、シャッター２３ｃおよび２３ｄは機械的なシャッターのほかに、液晶シャッターを用いることができる。液晶シャッターを用いた場合には、機械的な駆動部分がないので、機械的なシャッターを用いた場合と比較して、不要な振動の発生を抑えることができるので、測定中において、焦点位置がずれてしまう等の問題の発生を抑えることができる。特に、強誘電性液晶を用いた液晶シャッターを用いると、高速な開閉（ｋＨｚオーダー）が可能であるため変調周波数を高くすることができるので、特に、動きのある試料を観察する場合に有効である。

さらに、第２実施例においては、他のシャッターとして、電気光学効果や磁気光学効果を用いた電気シャッターを用いることができる。この場合も、液晶シャッターと同様、機械的な可動部分がないので、機械的なシャッターを用いた場合と比較して、不要な振動の発生を抑えることができるので、測定中において、焦点位置がずれてしまう等の問題の発生を抑えることができる。また、高速な開閉が可能であるため変調周波数を高くすることができるので、特に、動きのある試料を観察する場合に有効である。

なお、光源部は図１２に示すような構成にしても良い。光源１１ａから出た光束Ａおよび光源１１ｂから出た光束Ｂはそれぞれ光チョッパーに入射するように構成されている。光チョッパー５２は、円周上に等間隔で複数の開口が配置されている。光チョッパー５２を一定の速度で回転させると、光束Ａの光軸上に、ある開口がきたときは、光束Ａは光チョッパー５２を通過し、顕微鏡に導入される。逆に、開口でない部分がきたときには、光束Ａは遮光される。また、光チョッパー５２の顕微鏡側の面は鏡面で構成する。このようにすると、光束Ｂの光軸上に光チョッパー５２の開口がきたときには、光束Ｂは光チョッパー５２を通過してしまい、顕微鏡には光が到達しない。逆に、光束Ｂの光軸上に光チョッパー５２の開口でない部分がきたときは、光束Ｂは光チョッパー５２で反射されて顕微鏡に導入される。また、光チョッパー５２を通過した光束Ａと光チョッパー５２で反射した光束Ｂは光軸が一致するように調整しておく。

このようにすると、光源１１ａおよび１１ｂが点滅できないような光源を用いても、光束Ａと光束Ｂは、点滅の周波数が同じで、互いに逆位相で点滅させることができ、図２で示した実施例と同様な効果を奏する。また、光チョッパーを一台で構成できるので安価になる。

さらに、光源部は図１３に示すような構成にしてもよい。光源１１ａから出た光束Ａおよび光源１１ｂから出た光束Ｂはそれぞれマイクロミラーアレイ５３に入射するようになっている。このマイクロミラーアレイ５３は、多数の微小なミラーで構成されており、夫々の微小ミラーの傾きを２通りに変化させることができるようになっている。微小ミラーが第１の方向に傾いているときに、光源１１ａからの光束Ａがこの微小ミラーで反射した後、マイクロミラーアレイ５３の法線方向に反射するようにする。また、微小ミラーが第２の方向に傾いているときに、光源１１ｂからの光束Ｂがこの微小ミラーで反射した後、マイクロミラーアレイ５３の法線方向に反射するようにする。このように配置すると、ミラーの傾きが第１の方向に傾いているときにミラーで反射した光束Ａと、第２の方向に傾いているときにミラーで反射した光束Ｂとは同軸となり、それぞれの光束を顕微鏡に導入させることができる。このように構成された光源部を用いれば、マイクロミラーアレイ５３を構成するすべてのミラーの傾きを同期させて変化させると、光源１１ａからの光束Ａと光源１１ｂからの光束Ｂとを交互に顕微鏡に導入させることができ、結果として、２つの光源１１ａと１１ｂを交互に点滅させたのと同様となる。こうすることにより、図２に示した実施例と同様な効果を奏する。また、マイクロミラーアレイを用いれば、それぞれの傾きを電気的に制御できるので、確実に光源の点滅をさせることができる。また、シャッターを用いるのと比較して不要な振動の発生を抑えることができる。

第３実施例
図４は本発明の第３実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。図１、図３の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

本実施例では、図３に示した２つの光源１１ａ、１１ｂの代わりに、図４に示すような１つの光源１１を用いている。

第３実施例において、光源１１は、キセノンランプや水銀ランプ等の点滅が不能な白色光源である。光源１１から発せられた光は、コレクタレンズ１２に入射するようになっている。コレクタレンズ１２は、光源１１からの光を平行光束に変換するように構成されている。コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換された光は、半透鏡１４ａに入射する。半透鏡１４ａは入射した光束のうち、一部を透過し、一部を反射する。半透鏡１４ａで反射した光束Ａは、反射鏡２１ａで反射されてシャッター２３ｃを通過し、励起フィルタ１３ａを通過し、半透鏡１４ｂを透過して顕微鏡に導入される。他方、半透鏡１４ａを透過した光束Ｂは反射鏡２１ｂで反射されてシャッター２３ｄを通過し、励起フィルタ１３ｂを通過し、半透鏡１４ｂで反射されて顕微鏡に導入される。

このように構成すると、光源は１つで済むので、光源を２つ用いた場合に比べ、安価になる。また、キセノンや水銀ランプ等のアーク灯を用いた場合に、２個のランプで構成した場合では、アークのちらつきによる強度の時間的な変動は、それぞれのランプによって異なるため、レシオ画像を計算しても、光源強度の時間的な変動は補正できず、結果として得られるレシオの値の信頼性が低下してしまう。これに対して、１個のランプを用いた場合には、２つのカメラで撮像される蛍光画像におけるアークのちらつきに起因する強度の時間的な変動は同じであるため、比をとることによりその強度の変動をキャンセルすることができる。

なお、上記、シャッター２３ｃおよび２３ｄのかわりに、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッターを用いることができる。これらを用いた効果は図３に示した第２実施例で述べたとおりである。

また、光チョッパーは、１台で構成することも可能である。すなわち、光チョッパーの円盤上の異なる開口が２つの光束Ａ及び光束Ｂを互いに逆位相でチョッピングできるような位置に配置すればよい。この場合、光チョッパーは１台のみで構成することができるので、安価になるだけでなく、２台のチョッパーの同期を取る必要がなくなるため、システムが簡略化される。

なお、図１、図３、図４では、カメラ２４ａおよびカメラ２４ｂの直前に配置されたシャッター２３ａおよび２３ｂは機械的なシャッターの替わりに光チョッパーを用いることができる。この場合、それぞれの光チョッパーは、チョッピング周波数を同一にし、光束Ａと光束Ｂのチョッピングの位相が互いに逆になるように設置する必要がある。光チョッパーを用いた場合には、高速なチョッピング（ｋＨｚオーダー）が可能であるため変調周波数を高くすることができるので、特に、動きのある試料を観察する場合に有効である。

また、他のシャッター２３ａおよび２３ｂの例としては機械的なシャッターの替わりに液晶シャッターを用いることもできる。液晶シャッターを用いた場合には、機械的な駆動部分がないので、機械的なシャッターを用いた場合と比較して、不要な振動の発生を抑えることができるので、測定中において、焦点位置がずれてしまう等の問題の発生を抑えることができる。特に、強誘電性液晶を用いた液晶シャッターを用いると、高速な開閉（ｋＨｚオーダー）が可能であるため変調周波数を高くすることができるので、特に、動きのある試料を観察する場合に有効である。

他のシャッター２３ａおよび２３ｂの例としては電気光学効果や磁気光学効果を用いた電気シャッターを用いることができる。この場合も、液晶シャッターと同様、機械的な可動部分がないので、機械的なシャッターを用いた場合と比較して、不要な振動の発生を抑えることができるので、測定中において、焦点位置がずれてしまう等の問題の発生を抑えることができる。また、高速な開閉が可能であるため変調周波数を高くすることができるので、特に、動きのある試料を観察する場合に有効である。

さらに、シャッター２３ａおよび２３ｂのかわりに増幅率を可変できるイメージインテンシファイアーを用いることもできる。この場合、光源の変調と同期して増幅率を変調できるので、シャッターと同様な効果を奏する。また、液晶シャッターや電気シャッターと同様、機械的な可動部分を持たないため、液晶シャッターおよび電気シャッターと同様な効果を奏する。イメージインテンシファイアーの増幅率の変調周波数は１００ＭＨｚ程度まで可能であり、また、イメージインテンシィファイアー自身において検出した蛍光を増幅する機能を有しているため、特に、微弱な蛍光の試料を測定する場合に有効である。

なお、検出部は図１４に示すような構成にしてもより。試料18から発した蛍光は結像レンズ２０を通って、光チョッパーに入射するように構成されている。光チョッパー５２は、円周上に等間隔で複数の開口が配置されている。この光チョッパーは顕微鏡側の面は鏡面で構成する。このようにすると、光チョッパー５２を一定速度で回転させたときに、光束Ｃの光軸上に、光チョッパー５２の開口部でない部分がきたときには、光チョッパー５２で反射された光束Ｃは、光束Ａ’となりカメラ２４ａに到達することができるが、カメラ２４ｂには到達することができない。また逆に、光束Ｃの光軸上に、光チョッパー５２の開口部がきたときには、光チョッパー５２を透過した光束Ｃは、光束Ｂ’となりカメラ２４ｂに到達することができるが、カメラ２４ａには到達することができない。なお、結像レンズ２０は、光束Ａおよび光束Ｂそれぞれがカメラ２４ａおよび２４ｂの撮像面に結像するような位置に配置する必要がある。

このようにすると、図１，２，４で示した実施例と同様な効果を奏する。また、光チョッパーを一台で構成できるので安価になる。また、蛍光のロスを最小限にすることができる。

また、検出部は図１５に示すような構成にしてもよい。試料１８から発した蛍光は結像レンズ２０を通ったあと、マイクロミラーアレイ５３に入射するようになっている。このマイクロミラーアレイ５３は、多数の微小なミラーで構成されており、夫々の微小ミラーの傾きを２通りに変化させることができるようになっている。微小ミラーが第１の方向に傾いているときに、試料からの蛍光の光束Ｃはこの微小ミラーで反射した後、光束Ａ’に偏向されカメラ２４ａに入射するようになる。また、微小ミラーが第２の方向に傾いているときに、試料からの蛍光の光束Ｃはこの微小ミラーで反射した後、光束Ｂ’に偏向されカメラ２４ｂに入射するようになる。なお、結像レンズ２０はマイクロミラーアレイ５３で反射した光束Ａ’あるいは光束Ｂ’がそれぞれのカメラ２４ａおよび２４ｂに結像するような位置に配置されている。このように構成された検出部を用いれば、マイクロミラーアレイ５３を構成するすべてのミラーの傾きを同期させて変化させると、試料からの蛍光をマイクロミラーアレイ５３で反射させた後、交互に２つのカメラ２４ａおよび２４ｂに結像させることができる。こうすることにより、図１，２，４に示した実施例と同様な効果を奏する。また、マイクロミラーアレイ５３を用いれば、それぞれの傾きを電気的に制御できるので、確実に蛍光画像を取得できる。また、蛍光のロスを最小限にでき、さらに、光学系が簡素化される。また、機械的なシャッターを用いる場合と比較して不要な振動の発生を抑えることができる。

第４実施例
図５は本発明の第４実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

本実施例例では、図１に示した２台のカメラ２４ａ、２４ｂの代わりに、図５に示すように１台のカメラ２４を用いている。

図５に示すように、試料１８から発した蛍光は、ダイクロイックミラー１６を通過し、蛍光フィルタ１９を通過し、結像レンズ２０を通過し、反射鏡２１で反射し、半透鏡２２ａに入射する。半透鏡２２ａは、入射した蛍光の一部を反射し、一部を透過する。半透鏡２２ａを透過した光束Ａ’は、シャッター２３ａを通過し、反射鏡２１ｃで反射され、半透鏡２２ｂで反射し、カメラ２４に結像する。また、半透鏡２２ａを透過した光束Ｂ’は、シャッター２３ｂを通過し、反射鏡２１ｄで反射され、半透鏡２２ｂを透過し、カメラ２４に結像する。この場合、半透鏡２２ａ、半透鏡２２ｂ、反射鏡２１ｃ、反射鏡２１ｃのうち１つ以上を若干傾けることにより、例えば、光束Ａ’は、カメラの撮像領域の右側（あるいは左側）に、光束Ｂ’は、カメラの撮像領域の左側（あるいは右側）に結像させるようにする。

このようにすることにより、図１に示した実施例と同様な効果を奏するだけでなく、カメラが１台で一時に撮像できるので、カメラ２台の場合に比べて安価になるばかりでなく、２つのカメラを同期させる必要がなくなるので、システム構成を簡略化できる。また、２台のカメラの感度の違いを補正する手間もなくなる。

なお、この場合でも、シャッター２３ａ、２３ｂのかわりに、第２実施例で示したように、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッター、イメージインテンシファイアーを用いることができる。

また、この場合、光チョッパーは、１台で構成することも可能である。すなわち、光チョッパーの円盤上の異なる開口が２つの光束Ａ及び光束Ｂを互いに逆位相でチョッピングできるような位置に配置すればよい。この場合、光チョッパーは１台のみで構成することができるので、安価になるだけでなく、２台のチョッパーの同期を取る必要がなくなるため、システムが簡略化される。

第５実施例
図６は本発明の第５実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

本実施例において、投影レンズ１５を通過した光束Ａおよび光束Ｂは反射鏡２１で反射した後、ダイクロイックミラー１６を通過して、ニポウディスク４１に照射される。ニポウディスクは、多数の微小開口（ピンホール）を有した円盤であり、その円盤が高速に回転する。各ピンホールを通りぬけた光束ＡおよびＢは、対物レンズ１７を通過して、試料１８に照射される。なお、ニポウディスク４１は顕微鏡の視野絞りの位置、すなわち、ニポウディスク４１と試料面とは、対物レンズ１７に対して共役位置に配置されている。したがって、あるピンホールから出た光は対物レンズ１７の焦点位置に集光されて、その点にある蛍光物質を効率的に励起する。また、その点において励起されて発した蛍光は、対物レンズ１７を逆進し、再び、同じピンホールを通過することができる。これに対して、共役面外から発した蛍光は、対物レンズ１７を通過しても、ニポウディスク４１上では、その光束が広がってしまうため、ピンホールを通過できる光量は大幅に減少する。したがって、このような配置にすることにより、焦点が合っている面のみを選択的に画像化することができる。ピンホールを通り抜けた蛍光は、さらに、ダイクロイックミラー１６で反射され、蛍光フィルタ１９を通り、レンズ２０を通過し、半透鏡２２により２分される。半透鏡２２で反射した蛍光は、さらに、シャッター２３ａを通り、カメラ２４ａに結像する。また、半透鏡２２を通過した蛍光は、さらに、シャッター２３ｂを通り、カメラ２４ｂに結像する。

このような構成にすると、試料の焦点が合っている部分のみのレシオ画像を、焦点が外れた部分からのボケた像に影響されることなく確実に得ることができる。その他、図１で示した実施例と同様な効果を奏する。

また、光源の部分を図３に示す第２実施例のように、外部に点滅可能な変調器を設けて変調を行っても良い。この場合、機械的なシャッターの他、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッターを用いても良い。これらの効果は図３に示した実施例と同様な効果を奏する。

また、カメラ直前のシャッター２３ａ、２３ｂのかわりに、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッター、イメージインテンシファイアーを用いてもよい。さらに、図５に示した実施例のように、１台のカメラのみで構成してもよい。

第６実施例
図７は本発明の第６実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。図１、図６の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

本実施例において、光源１１ａおよび１１ｂにはレーザーを用いるのが望ましい。光源１１ａから出た光はシャッター２３ｃを通り、半透鏡２２を通過する。また、光源１１ｂから出た光はシャッター２３ｄを通り、反射鏡２１によって反射されて、半透鏡２２で反射される。光源１１ａから出た光束Ａと光源１１ｂから出た光束Ｂは、半透鏡２２において重ね合わせられ、同一の光軸となる。さらに、レンズ３６によって光ファイバー４２に入射される。光ファイバー４２は光束Ａと光束Ｂをともに伝播し、出射端から顕微鏡に導入される。光ファイバー４２の出射端から出射した光束Ａおよび光束Ｂはレンズ１５により平行光にされ、反射鏡２１で反射され、ダイクロイックミラー１６を通過した後、ニポウディスク４１に照射される。ニポウディスクの各ピンホールを通りぬけた光束ＡおよびＢは、対物レンズ１７を通過して、試料１８に照射される。なお、ニポウディスク４１は顕微鏡の視野絞りの位置、すなわち、ニポウディスク４１と試料面とは、対物レンズ１７に対して共役位置に配置されている。したがって、あるピンホールから出た光は対物レンズ１７の焦点位置に集光されて、その点にある蛍光物質を効率的に励起する。試料面で励起された蛍光は、対物レンズ１７を逆進し、再び、同じピンホールを通過することができる。これに対して、共役面外から発した蛍光は、対物レンズ１７を通過しても、ニポウディスク４１上では、その光束が広がるため、ピンホールを通過できる光量は大幅に減少する。したがって、このような配置にすることにより、焦点が合っている面のみを選択的に画像化することができる。ピンホールを通りぬけた蛍光は、さらに、ダイクロイックミラー１６で反射され、蛍光フィルタ１９を通り、レンズ２０を通過し、半透鏡２２により、２分される。半透鏡２２で反射した蛍光は、さらに、シャッター２３ａを通り、カメラ２４ａに結像する。また、半透鏡２２を通過した蛍光は、さらに、シャッター２３ｂを通り、カメラ２４ｂに結像する。

なお、ニポウディスク４１は多数の円形開口だけでなく、スリットが刻まれたものを用いても良い。

このような構成にすると、試料１８の焦点が合っている部分のみのレシオ画像を、焦点が外れた部分からのボケた像に影響されることなく確実に得ることができる。その他、図１および図６で延べた効果を奏する。

また、シャッター２３ｃおよび２３ｄのかわりに、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッターを用いても良い。これらの効果は図３した実施例と同様な効果を奏する。さらに、シャッター２３ｃおよび２３ｄのかわりに、音響光学素子や音響光学可変フィルタを用いることができる。特に、音響光学可変フィルタを用いれば、光源１１ａおよび光源１１ｂを複数の波長で発振するレーザーを用いれば、１台のレーザーで済むので、安価になるだけでなく、システムが簡素化される。

また、カメラ直前のシャッター２３ａ、２３ｂのかわりに、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッター、イメージインテンシファイアーを用いてもよい。さらに、図５に示した実施例のように、１台のカメラのみで構成してもよい。

第７実施例
図８は本発明の第７実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

半透鏡１４において重ねあわされた光束ＡおよびＢは、レンズ３６によって、開口４３の部分に集光される。開口４３を通り抜けた光は、投影レンズを１５通り、ダイクロイックミラー１６で反射して、対物レンズ１７の瞳に投影される。ここで、対物レンズ１７の瞳とは、試料１８の側とは反対側にある対物レンズ１７の後側焦点面１７ａに対応する。さらに、対物レンズ１７を透過すると、平行光になり、試料１８に対して斜めに入射する。開口は、図示していない微動機構により、図中の矢印方向に微動できるようになっている。開口の位置を調整することにより、対物レンズ１７の瞳の位置に結ぶスポット位置が移動し、さらに、対物レンズ１７を通りぬけると、その出射角が変化する。例えば、カバーガラスと水との屈折率差によって全反射するような角度以上で入射させることができる。このようにすると、全反射する時に、カバーガラスから水側に波長程度の浸入長で励起光が染み出す。この励起光によって、カバーガラスと接着している試料１８の低部のみを選択的に励起することができる。選択的に励起されて発した蛍光は、対物レンズ１７を逆進して、ダイクロイックミラー１６を通過し、蛍光フィルタ１９を通過し、結像レンズ２０により、カメラ２４ａおよび２４ｂに結像する。

このような構成にすると、カバーガラスに接着している細胞の底部のみのレシオ画像を、確実に得ることができる。また、細胞の底部における極めて少数の蛍光分子のみのレシオ画像を確実に得ることができる。その他、図１に示した実施例と同様な効果を奏する。

また、光源の部分を図３に示す実施例のように、外部に点滅可能な変調器を設けて変調を行っても良い。この場合、機械的なシャッターの他、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッターを用いても良い。これらの効果は図３に示した実施例と同様な効果を奏する。

また、カメラ直前のシャッター２３ａ、２３ｂのかわりに、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッター、イメージインテンシファイアーを用いてもよい。さらに、図５に示した実施例のように、１台のカメラのみで構成してもよい。

第８実施例
図９は本発明の第８実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。図１、図８の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

この場合、光源１１ａおよび１１ｂにはレーザーを用いるのが望ましい。光源１１ａから出た光はシャッター２３ｃを通り、半透鏡２２を通過する。また、光源１１ｂから出た光はシャッター２３ｄを通り、反射鏡２１によって反射されて、半透鏡２２で反射される。光源１１ａから出た光束Ａと光源１１ｂから出た光束Ｂは、半透鏡２２において重ね合わせられ、同一の光軸となる。さらに、レンズ３６によって光ファイバー４２に入射される。光束Ａと光束Ｂは光ファイバー４２を伝播し、出射端から顕微鏡に導入される。光ファイバー４２の出射端から出射した光束Ａおよび光束Ｂはレンズ１５を通過し、ダイクロイックミラー１６で反射した後、対物レンズ１７の瞳に投影される。さらに、対物レンズ１７を透過すると、平行光になり、試料１８に対して斜めに入射する。光ファイバー４２の出射端は、図示していない微動機構により、図中の矢印方向に微動できるようになっている。光ファイバー４２の出射端の位置を調整することにより、対物レンズ１７の瞳の位置に結ぶスポット位置が移動し、さらに、対物レンズ１７を通りぬけると、その出射角が変化する。例えば、カバーガラスと水との屈折率差によって全反射するような角度以上で入射することができる。このようにすると、全反射すると同時に、カバーガラスから水側に波長程度の浸入長で励起光が染み出す。この励起光によって、カバーガラスと接着している試料１８の低部のみを選択的に励起することができる。選択的に励起されて発した蛍光は、対物レンズ１７を逆進し、ダイクロイックミラー１６を通過し、蛍光フィルタ１９を通過し、結像レンズ２０により、カメラ２４ａおよび２４ｂに結像する。

このような構成にすると、カバーガラスに接着している細胞の底部のみのレシオ画像を、確実に得ることができる。その他の効果は、図１及び図８に示した実施例と同様である。

また、シャッター２３ｃおよび２３ｄのかわりに、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッターを用いても良い。これらの効果は図３に示した実施例と同様な効果を奏する。さらに、シャッター２３ｃおよび２３ｄのかわりに、音響光学素子や音響光学可変フィルタを用いることができる。特に、音響光学可変フィルタを用いれば、光源１１ａおよび光源１１ｂを一台のレーザーにまとめることができるので、安価になるだけでなく、システムが簡素化される。

また、カメラ直前のシャッター２３ａ、２３ｂのかわりに、光チョッパー、液晶シャッター、電気シャッター、イメージインテンシファイアーを用いてもよい。さらに、図５に示した実施例のように、１台のカメラのみで構成してもよい。

本発明の第１実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 光源の点滅と、シャッターの開閉と、カメラの露光時間との関係を示す説明図である。 本発明の第２実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 本発明の第３実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 本発明の第４実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 本発明の第５実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 本発明の第６実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 本発明の第７実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 本発明の第８実施例にかかるレシオイメージング装置の概略構成図である。 従来のレシオイメージング装置の構成を示す構成説明図である。 従来の他のレシオイメージング装置の構成を示す構成説明図である。 光源部の変形例を示す説明図である。 光源部の他の変形例を示す説明図である。 検出部の変形例を示す説明図である。 検出部の他の変形例を示す説明図である。

符号の説明

１１，１１ａ，１１ｂ 光源
１２，１２ａ，１２ｂ コレクタレンズ
１３ａ，１３ｂ 励起フィルタ
１４，１４ａ，１４ｂ 半透鏡
１５ 投影レンズ
１６ ダイクロイックミラー
１７ 対物レンズ
１８ 試料
１９ 蛍光フィルタ
２０ 結像レンズ
２１，２１ａ，２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅ 反射鏡
２２，２２ａ，２２ｂ 半透鏡
２３ａ，２３ｂ，２３ｃ，２３ｄ シャッター
２４，２４ａ，２４ｂ カメラ
２５ 画像処理部
２６ 画像表示部
３１ 信号発生器
３２ａ，３２ｂ 光源制御部
３３ａ，３３ｂ，３３ｃ，３３ｄ シャッター制御部
３６ レンズ
４１ ニポウディスク
４２ 光ファイバー
４３ 開口
５０ 光軸変換手段
５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ 偏光板
５２ 光チョッパー
５３ マイクロミラーアレイ

Claims (14)

1. 第１波長で照射する第１照射手段と、
   第２波長で照射する第２照射手段と、
   前記第１波長と前記第２波長で照射されたときにイオン濃度の変化に対し逆特性を有するプローブを内部に含む試料を前記第１照射手段で照射して、前記イオン濃度に依存して生成される第１信号光を検出する第１検出手段と、
   前記第２照射手段で前記試料を照射して、前記イオン濃度に依存して生成される第２信号光を検出する第２検出手段と、
   基準信号を発生させる基準信号発生手段と、
   前記第１照射手段と前記第２照射手段とによる前記試料への照射が交互となるように、前記第１照射手段及び前記第２照射手段による照射を前記基準信号に基づき開閉する照射開閉手段と、
   前記第１検出手段が前記第１信号光のみを検出し前記第２検出手段が前記第２信号光のみを検出するように、前記第１検出手段及び前記第２検出手段による検出を前記基準信号に基づき開閉する検出開閉手段と、
   前記第１検出手段で検出した前記第１信号光と前記第２検出手段で検出した前記第２信号光との比を演算する演算手段と
   を備え、
   前記第１検出手段及び前記第２検出手段は共通のカメラを有し、前記第１信号光及び前記第２信号光の各々は前記カメラの撮像面上の隣接する位置に並列して検出される
   ことを特徴とするレシオイメージング装置。
2. 前記照射開閉手段による前記第１照射手段及び前記第２照射手段の照射開閉タイミングと前記検出開閉手段による前記第１検出手段及び前記第２検出手段の検出開閉タイミングとは、同期している
   ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
3. 前記第１照射手段は前記第１波長用の第１光源を有し、前記第２照射手段は前記第２波長用の第２光源を有し、前記照射開閉手段は、前記第１光源及び前記第２光源の駆動自体を変調する駆動変調手段を有する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
4. 前記照射開閉手段は、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線
   強度を変調する強度変調手段を有する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
5. 前記強度変調手段は、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線を開閉する単一の共通シャッターを有する
   ことを特徴とする請求項４に記載のレシオイメージング装置。
6. 前記強度変調手段は、各々が傾斜角が２通りに設定可能な微小ミラーを多数配列してな
   るマイクロミラーアレイを有し、前記マイクロミラーアレイは、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線の光路が共通となるように反射させる
   ことを特徴とする請求項４に記載のレシオイメージング装置。
7. 前記検出開閉手段は、前記第１検出手段及び前記第２検出手段の各々に入射する前記第１信号光及び前記第２信号光の光線を開閉するシャッターを有する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
8. 前記シャッターは、前記第１照射手段及び前記第２照射手段の各々から出射した光線を開閉する単一の共通シャッターである
   ことを特徴とする請求項７に記載のレシオイメージング装置。
9. 前記検出開閉手段は、各々が傾斜角が２通りに設定可能な微小ミラーを多数配列してなるマイクロミラーアレイを有し、前記マイクロミラーアレイは、前記第１信号光及び前記第２信号光の光線を前記第１検出手段及び前記第２検出手段の各々に振り分けるように反射させる
   ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
10. 前記第１照射手段及び前記第２照射手段の照射光の光路上に配設された複数の微小開口が形成されてなる回転板と、前記試料の面に前記照射光を照射する対物レンズと、前記第１信号光及び前記第２信号光の各々を前記第１検出手段及び前記第２検出手段の各々の結像面に結像させる結像レンズを備え、前記微小開口は、前記対物レンズに対し前記試料の面と共役位置にあるとともに前記結像レンズに対し前記結像面と共役位置にある
    ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
11. 前記第１照射手段及び前記第２照射手段による照射光を伝送する光ファイバーと、前記光ファイバーの出射端から出射する光線を平行化して前記回転板へ送る投影レンズを備える
    ことを特徴とする請求項１０に記載のレシオイメージング装置。
12. 前記第１照射手段及び前記第２照射手段による照射光の一部を通過可能な開口が形成された照射面を有しこの照射面に垂直に移動可能な移動開口部と、前記試料の面に前記照射光を照射する対物レンズと、前記移動開口部の前記開口を前記対物レンズの後側焦点面上に結像可能な投影レンズとを備え、
    前記対物レンズを出射して前記試料に照射される照射光が前記試料の面で全反射するように、前記移動開口部の前記開口を移動させて前記照射光の前記試料の面への入射角を設定する
    ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
13. 前記第１照射手段及び前記第２照射手段の照射光を伝送する光ファイバーと、前記光ファイバーの出射端を出射面に垂直に移動可能な移動手段と、前記試料の面に前記照射光を照射する対物レンズと、前記光ファイバーの前記出射端を前記対物レンズの後側焦点面上に結像可能な投影レンズとを備え、
    前記対物レンズを出射して前記試料に照射される照射光が前記試料の面で全反射するように、前記光ファイバーの前記出射端を移動させて前記照射光の前記試料の面への入射角を設定する
    ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。
14. 前記第１照射手段と前記第２照射手段とによる前記試料への照射は、前記第１検出手段
    及び前記第２検出手段が一つの画像を形成するに要する時間である１フレーム時間の間に、複数回に渡って繰り返される
    ことを特徴とする請求項１に記載のレシオイメージング装置。

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