CZ347296A3

CZ347296A3 - Detection method of evanescently excited luminescence

Info

Publication number: CZ347296A3
Application number: CZ963472A
Authority: CZ
Inventors: Gert L Duveneck; Dieter Neuschafer; Markus Ehrat
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1994-05-27
Filing date: 1995-05-17
Publication date: 1997-03-12
Also published as: IL113849A0; ZA954325B; TW295624B; DE69526438D1; US5822472A; FI964664A7; ATE216491T1; AU689604B2; DE69526438T2; PL317402A1; CZ347196A3; CN1149336A; JP3645907B2; HU9603260D0; IL113854A0; DE69505370T2; ATE172300T1; DE69505370D1; FI964684A7; JPH10501616A

Description

Oblast techniky

·.*

Vynález se týká způsobu detekce evanescentně excitované luminiscence rovinou dielektrickou optickou senzorovou základnou založenou na vlnovodu. Vynález se rovněž týká použiti uvedeného způsobu při kvalitativním afinitním snímání a použití uvedeného způsobu pro selektivní kvantitativní stanovení luminiscenčních komponent v opticky zakalených roztocích.

Dosavadní stav techniky

V případě, že světelná vlna je seřazena do rovinného vlnovodu, který je obklopen opticky řidčírn médiem, potom je vedena úplnou odrazivostí ke styčné ploše vlnovodové vrstvy. Rovinný vlnovod zahrnuje v nejjednoduším případě tři vrtsvy: podkladovou vrstvu, vlnovodovou vrstvu a vrchní vrstvu (např. vzorek pro rozbor}, přičemž vlnovodová vrstva má nejvyšší index lomu. Dodatečné vrstvy mohou ještě více zvýšit aktivitu rovinného vlnovodu.

Část světelné energie proniká opticky slabším médiem. Tato část je označována jako evanescentní (= znášivé) pole. Intenzita evanescentního pole je silně závislá na tloušťce samotné vlnovodové vrstvy jakož i na poměru indexů lomu vlnovodové vrstvy a obklopujícího média. V případě tenkých vlnovodů, např. vlnovodů, jejichž tloušťka vlnovodové vrstvy je stejná jako vlnová délka, která má být vedena, nebo menší než vlnová délka, která má být vedena, je možné rozeznat diskrétní vidy vedeného světla. Evanescentnim polem je možné, např. excitovat luminiscenci v opticky řidčírn médiu, avšak pouze v bezprostřední vzdálenosti od vedené světelné vlny. tento princip je označován jako evanescentní luminiscenční excitace.

} ?

Evanescentni luminiscenční excitace je velmi zajímavá v analytické oblasti, poněvadž tato excitace je omezena na bezprostřední okolí vlnovodové vrstvy.

Způsob detekce evanescsntně excitované luminiscence protilátek a antigenu značených luminiscenčními barvivý a zařízení k provádění tohoto způsobu jsou známé a jsou popsány, mimo jiné, v patentovém dokumentu rjS-A-4 592 909. Sestava nárokovaná v tomto dokumentu používá pro evanescentni luminiscenční excitací optická vlákna. Tato optická vlákna mají typicky průměr až do 1 milimetru a jsou schopné vést velké množství vidů v případě, že je světlo spřaženo do těchto optických vláken. Evanescentně excitovaná luminiscence může být měřena ' jednoduchým způsobem pouze zpětným tunelováním části luminiscence do otického vlákna. Nevýhodu, uvedeného způsobu jsou poměrně velké rozměry zařízení a. skutečnost, Že jsou žádoucí srovnatelně, velká objemová množství vzorku. Velikost zařízení nemůže být podstatně snížena a zařízení nemůže být miniaturizováno do integrovaných optických senzorů. Zvýšení citlivosti je/ obvykle spojené se zvýšením velikosti zařízení.

Fotometrické přístroje pro detekci luminiscence biosenzorů za podmínek evanescentni excitace rovinnými optickými vlnovody jsou rovněž známé a jsou popsány, mezi jinými, v dokumentu ^γλΌ 90/06503. Vlnovodové vrstvy použité v těchto vlnovodech mají tloušťku 160-1000 nm a spřažení světla do excitační vlny je provedeno bez kopulačnícn mřížek.

Za účelem zvýšení citlivosti evanescentně excitované luminiscence a výroby integrovaných optických senzorů byl proveden rozsáhlý výzkum. Např. ve zprávě Biosensors & Bioelecťronic 6(1991), str.595-507 jsou popsány rovinné jednovidové nebo nízko-vidové vlnovody, které jsou vyrobeny dvoustupňovou iontoměničovou metodou a v kterých je spřažení světla do excitační vlny provedeno hranolem. Použitým ařínitním systémem je systém lidský imunoglobulin ·-· - G/řluores.cein.em, značený protein A, ve kterém je na vlnovodu __i mnh-i li zována protilátka a fluoresceinem značený protein A, který má být detekován, ve' fosfátovém pufru je přidán .· do tenké vrstvy polyvinylalkoholu, kterou je, pokryta měřící oblast vlnovodu. Podstatná nevýhoda tohoto způsobu spočívá v tom, že tímto způsobem lze dosáhnout pouze' malých rozdílů v indexech lomu mezí vlnovodovou vrstvou a podkladovou vrstvou, což vede k relativně nízké citlivosti.

Uváděná citlivost je 20 nm v fluorescein-isothiokyanátu vázaném k proteinu A. Tato citlivost je dosud nedostatečná pro detekci mikrostopových množstvích, a tudíž je nutné další zvýšení citlivosti. Kromě toho zajistit reprodukovatelnost a praktickou realizovatelnost spřažení světla do excitační vlny hranolem je obtížné kvůli .závislosti účinnosti spřažení na kvalitě a velikosti kontaktní plochy mezi hranolem, a vlnovodem.

Další způsob je popsán v patentovém dokumentu US-A-5 031 012. Rovinná vlnovodová vrstva má tloušťku od 200 nm -do 1000 nm a obsahuje dvě mřížkové struktury, přičemž, jedna z nich je označena jako reflexní . mřížka', takže, světelná, vlna spřažená s vlnovodem musí projít senzorovou oblastí mezi ___mřížkovými strukturami alespoň dvakrát. Má se za to, že se tímto způsobem dosáhne zvýšené . citlivosti. Nevýhoda tohoto způsobu spočívá v tom, že odražené záření může vést k nežádoucí zvýšené intenzitě záření pozadí.

V případě, že je žádoucí použít uvedené rovinné vlnovody se začleněnými kopulačními mřížkami přo luminiscenční měření, potom podstatnými znaky pro dosažení jejich vysoké citlivosti jsou velká účinnost vstupního spřažení, pokud možno intenzivní evanescentní pole, a nízký útlum vedené vlny. Tyto znaky jsou hlavně závislé '· na .kombinaci indexu lomu vlnovodivé vrstvy a podkladového materiálu a libovolných mezivrstev, tloušťce vrstvy vlnovodu, struktuře, modulační hloubce a mřížkové periodě kopulační mřížky. Kromě toho je žádoucí optická kvalita povrchů a jejich rovinná struktura a drsnost.

V současné době bylo zjištěno, že je možné jednoduchým způsobem a bez použití reflexní mřížky provést způsob evanescentní excitace a detekce luminiscence s vysokou citlivostí kombinací výše uvedených podstatných znaků, např. indexu lomu, tloušťky vrstvy a modulační hloubky. Útlum vedené vlny je potom typicky nižší mež 3 dB/cm, což má za následek vysoký dosah vedené vlny a nízký rozptyl vedené vlny do média obklopující vlnovod. Za těchto podmínek je zejména výhodné vést TEO a TMO vid. Rozsah vedení postačuje nejen k měření luminiscence nýbrž i k vysoce přesnému měření absorpce excitačního světla za přítomnosti absorpčního vzorku.

Tyto rovinné vlnovody, v kterých je veden pouze jedéh vid nebo r.ěkoli vidů, se vyznačují zejména vysokou citlivostí a miniaturní -konstrukcí. Tuto citlivost obvykle nelze dosáhnout vícevidovými vlnovody planární nebo vláknové konstrukce. V případě, že je žádoucí taková citlivost, potom ji lze dcsáhout pouze podstatným zvětšením geometrických ro zrně rů. *

Vstupní účinnost spřažení kopulační mřížky je vysoká, takže intenzita vlny spřažené do vlnovodu je rovněž vysoká, což vede ve spojení s nízkým útlumem k již dobré citlivosti.

Tato citlivost je dále zvýšena evanescentním polem, které je překvapivě silné, a vysokou intenzitou elektromagnetického pole, čímž se dosáhne ještě dalšího zvýšení citlivosti. Tímto je poskytnuta možnost detekce dokonce i minimálního množství luminiscenčního materiálu při povrchu vlnovodové vrstvy.

Podstata vynálezu

Podle jednoho z hledisek se vynález týká způsobu detekce luminiscence pomocí rovinné dielektrické optické senzoro-vé..--základny. .. obsahující,, .transparentní podkladovou vrstvu ke které ~ie přiložena tenká transparentní_ vlnovodová vrstva (b)'., přičemž senzorová základna je opatřena mřížkou pro vstupní spřažení excitačního světla a index lomu uvedené pokladové vrstvy (a) je nižší než index lomu vlnovodové vrstvy (b), spočívající v uvedení kapalného vzorku do kontaktu s vrstvou (b) a měření luminiscence produkované látkami, které mají ve vzorku luminiscenční vlastnosti nebo látkami, které mají luminiscenční vlastnosti, zmobilizovanými na vrstvě (b), optoelektronicky, přičemž (A) excitační světlo ’ je spřaženo s rovinným vlnovodem a prochází vlnovodovou vrstvou, v důsledku čehož látky, které mají luminisceční vÍLasthosťi’,^- ' ’ j sou' ' 'excitovány.....za -vzniku·- luminiscence- v--ⁱ------evanescentnim poli vlnovodové vrstvy, (B) uvedená mřížka má modulační hloubku- od- 3. do 60' nm, (C) tloušťka- vrstvy ' (b) je od 40 do- 160 nm, a (D) poměr modulační hloubky ketloušťce . vrstvy (b) je menši než 0,5.

V rámci vynálezu se rovinnou dilektrickou optickou senzorovou základnou rozumí, že tato základna-má. formu ..pásu, desky, kruhového disku nebo má libovolně .jinou, geometrickou formu za podmínky, že se tato forma jeví pouhým okem jako rovinná. Zvolená geometrická forma není skutečně rozhodující a' může^- být určena^- celčko vou^_ -konsťřukčí^dří'z en'íT^d'o''k-ťeré-ho~'j'e~^:—- -.....

senzorová základna vestavěna. Avšak tato základna může být rovněž použita jako nezávislý člen prostorově odsazený od zdroje excitačního viditelného zářemi a optoelektronického detekčního systému. Výhodné sestavy jsou ty, které umožňují podstatnou miniaturizaci.

Vhodná podkladová vrstva je typicky tvořena libovolným druhem skla nebo křemenem. Je výhodné použít skla, které má pokud možno nízký optický index lomu a pokud možno nízkou vlastní luminiscenci, a které může být pokud možno jednoduchým způsobem opticky upraveno, např. leptáno, řezáno a broušeno. Podkladová vrstva musí být transparentní alespoň pro excitační a emisní vlnové délky.

Podkladová vrstva může být tvořena rovněž plastický materiálem, jak je to popsáno např. v patentovém dokumentu EP-A-C533074.

Podkladová vrstva může být rovněž opatřena tenkou vrstvou, která má index lomu nižší než index lomu podkladové vrstvy nebo identický s indexem lomu podkladové vrstvy, a která má tloušťku 10pm nebo menší než ΙΟμζη. Tato vrstva může sloužíc pro omezení povrchové nerovnosti pokladové vrstvy a může být tvořena termoplastem, termosetem nebo zesíťěnou plastickou hmotou, nebo také anorganickým materiálem, jako např. SiOj.

Pro luminiscenční excitaci je vhodně použít pouze v podstatě paralelní světlo. V rámci vynálezu se výrazem v. podstatě paralelní rozumí divergence menší než 5°. To znamená, že světlo může slabě divergovat nebo slabě konvergovat.

Pro luminiscenční excitaci je výhodně použít koherentní.,, světlo, obzvláště viditelné laserové záření o vlnové délce od. 300 do 1100 nm, zejména 450 nm do 350 nm, a nejvýhodněji od 430 do 700 nm.

Mezi lasery, které mohou být použity, patří Lasery na. bázi barviva, plynové lasery, pevné lasery a polovodičové lasery. V případě, že je to nutné, emisní vlnové délky mohou být rovněž zdvojeny nelineární krystalovou optikou. Svazek paprsků může být rovněž zaostřen optickými členy, polarizován nebo zeslaben šedivými filtry. Zejména vhodnými lasery jsou argon-iontové lasery a helium-neonové lasery, které emitují při vlnových délkách mezi 457 nm a 514 nm resp. mezi 543 nm a 633 nm. Zejména vhodnými lasery jsou injekční lasery tvořené polovodičovými materiály, které emitují při základních vlnových délkách mezi 530 nm a 1100 nm, poněvadž umožňují podstatnou miniaturizaci celkového senzorového svstému oro

Ί

- - - malé rozměry- těchto laserů_a jejich nízkou, spotřebu energie.

V rozsahu vynálezu je třeba teiiLLÍiL vzorek¹' chápat jakocelkový roztok, který má být analyzován a který může obsahovat látku, která má být detekována, tzv. analyt.

Detekce může být provedena . jako jednostupňová . nebo vícestupňová zkouška, při které je povrch senzorové .základny kontaktován s jedním roztokem nebo více roztoky. Alespoň jeden z použitých, roztoků může obsahovat látku, která má luminiscenční vlastnosti a která může být detekována při aplikaci vynálezu.

V případě, že látka, která má luminiscenční vlastnosti, · se 'jižadsorbovala na vlnovodové-·-vrstvě -(b)·,- potom ,vzo.re.k_. _______ .

může být rovněž prostý luminiscenčních komponent. Vzorek můžeobsahovat další složky, typicky pH- tlumící, .roztok, solí/' kyseliny, zásady, povrchově aktivní látky, viskozitu- ovlivňující modiřikátory nebo barviva. Jako rozpouštědlo může být zéjména použit fyziologický solný roztok. V- případě, že . samotné- luminiscenční složky jsou kapaliny, potom se přidání rozpouštědla může vynechat. V tomto případě může vzorek obsahovat a.ž 100 % složek, které mají luminiscenční, vlastnosti.

...........t~' ⁷Vzo'rek~da~iě~můž'ě^Qá-Íe~ob~5-a'h-ovat~bl-oiogické-.méd-i-a>-:-nap.ř-·—-— _ vaječný žloutek,· tělesnou tekutinu nebo její složky, zejména krev, sérum, plazmu, nebo moč. Vzorek dále může. obsahovat povrchovou vodu, roztoky extraktů z přírodních a syntetických mediích, jako jsou např. půda-nebo části rostlin, bioprocesní nebo syntézní živné substráty.

Vzorek může být buď neředěn nebo použit dodatečně s rozpouštědlem. .

Vhodnými . rozpouštědly jsou voda, vodné pufrové. . a proteinové roztoky a organická rozpouštědla. Vhodnými organickými rozpouštědly jsou alkoholy, ketony, estery, a alifatická uhlovodíky. Je výhodné použít vodu, vodné pufry nebo směsi vody a s vodou mísízelného organického rozpouštědla.

Vzorek může však , rovněž obsahové: složky, které jsou nerozpustné v rozpouštědle, např. pigmentové částice, dispergačni činidlo, přírodní a syntetické oligomery nebo polymery. V tomto případě je vzorek ve formě opticky zakalené disperze nebo emulze.

Vhodnými luminiscenčními sloučeninami jsou luminiscenční barviva vykazující luminiscenci v rozmezí vlnových délek od 330 nm do 1000 nm a zahrnující typicky rhodaminy, deriváty fluoresceinu, kumarinové deriváty, distyrylbifenily, deriváty stilbenu, ftalocyaniny, naftalocvaniny, polypyridylrutheniové komplexy, jakými jsou tris(2,2'-bipyridyl)rutheniumchlorid, tris (1, lO-íenanthroíinj* _p· rutheniumchlorid, tris (4,7-difehyi-l, 10-fenanthroíin)ř . á rutheniumchlorid a polypyridylfenazin-rutheniové komplexy,* .

komplexy platiny a pcrfyrinu, jako oktaethyl-platina-porfyrin, dlouhodobé komplexy suropia a· 4 terbia nebo cyanincvá barviva. Pro analýzu krve nebe krevního' , $ séra jsou zejména vhodnými barvivý barviva vykazuj ící* absorpční a emisní vlnové délky v r.ozmezí od 600 do 900 nm. '™

Zejména vhodnými luminiscenčními sloučeninami jsou barviva, např. fluorescenční deriváty, které obsahují funkční skupiny, kterými mohou být kovalentně spojeny, např.

fluorescein-isokyanát.

Rovněž velmi vhodná jsou fluorescenční barviva, která jsou dostupná u firmy Biological Detection Systems Inc., např. mono- a bufunkční barviva Gy, 5™, která jsou mezí jiným popsána v Clinicai Chemistry 40 (9): 1319-1822, 1994.

Výhodnou luminiscencí je fluorescence.

Luminiscenční barviva přicházející v úvahu pro použití v rámci vynálezu mohou být chemicky vázaná k polvmerúm nebo k jednomu - z---vazebných .partnerů biochemických afinitních

-OYQtómú,-j3’-'ýHí jsou například protilátky nebo f r a ume n t y protilátek, antigeny, proteiny, peptidy, receptory nebo jejich ligandy, hormony nebo hormonové receptory, oligonuklsotidy, řetězce DNA a řetězce DNK, RNK nebo RNK analoga, vazebné proteiny, jako protein A a G, avidin nebo biotin, enzymi, enzymové korektory nebo inhibitory, lektány nebo uhlohydráty. Posledně uvedené kovaientní luminiscenční značení představuje výhodné provedení pro reversibilní nebo íreversibilní (bio)chemické afinitní stanovení. Dále je možné použit luminiscenčně značené steroidy, lipidy a cheiázory. Rovněž zajímavá jsou interkalační luminiscenční barviva pr₀hybrídízáční stanovení Z'a použitá—řetězců'--DNK- nebooligonukleotidů, zejména v případě, kdy tato barviva, podobně jako různé ruzheniove komplexy vykazují - zlepšenou luminiscenci v rámci ánterkalace. V případě, ěe se tvto luminiscenčně značené siučeniny uvedou . do styku s jejich afinitními partnery imobilizovanými na povrchu senzorové báze, potom může být vazba stanovena kvantitativně ze změřené luminiscence. Analyt může být také. kvantitativně.

intenzi“v stanoven 'změřením vstoucí ' v inter luminiscenci v kov iuminoforv, naořiklad v;

zořme

-i-um-iniscenčního—z.e.s.í.lení kontormaČními modifikacemi proteinů.

Index lomu vlnovodové vrstvy musí být větší než index lomu podkladové vrstvy a použitých libovolných mezivrstev. Výhodně rovinná transparentní vlnovodová vrstva obsahuje materiál, který má index lomu větší než 2. .

Vhodnými materiály pro' vytvořeni vlnovodové vrstvy jsou typicky anorganické materiály, výhodně' anorganické c-xidy kovů, např. T10-, Zz.O, Nb₅G₅, Ta_;O_s, EfO_;, nebo ZrO..

Ta.O_s a TiO. jsou výhodné.

Tloušťka transparentní vlnovodové vrstvy je výhodné 60 až 160 nm.

Modulační hloubka- mřížky pro spřažení excitačního světla s vlnovodovou vrstvou je výhodně 5 až 30 nm.

Mřížkováni má výhodně poměr čára-rozestup 0,5 až 2.

Poměrem čára-rozesoup se v pravoúhlém mřížkování rozumí poměr šířky čáry k šířce mezery mezi čárami.

Mřížka pro spřažení excitačního světla má konfiguraci optické dífrakční mřížky, výhodně reliéfní mřížky. Reliéfní struktura může mít rozličnou, formu. Jsou vhodné např. sinusíové, odélhíkové nebo zubové struktury. Způsoby výroby uvedených mřížek jsou známé. Pro výrobu těchto mřížek se zejména používají fotolitografické nebo holografické metody a leptací techniky, např. metody popsané v dokumentu Chemical,

Biochemical and Snvironmental Piber Senzorš V. Proč SPIS, Vol'

2063, 1-13 1994. ΛMřížková struktura může být vytvořena na podkladové ivrstvě a potom převedena do vlnovodové vrstvy, ve které se potom mřížková struktura zobrazí, nebo mřížka je vytvořena v samotné vlnovodové vrstvě.

X ji.

Mřížková perioda může být od 200 do 100Ό nm a mřížkaá- $ vhodně vykazuje jedinou periodicitu, to znamená, že je monodicrakční.<

Při způsobu podle vynálezu může být vzorek uveden do kontaktu s vlnovodovou vrstvou v imobilním stavu a také kontinuálně veden přes tuto vrstvu, přičemž cyklus může být otevřený nebo uzavřený.

Konkrétní provedení . způsobu spočívá v zmobilizování J látek, které mají luminiscenční vlastnosti použité pro detekci analytu přímo při povrchu vlnovodové vrstvy(b).

Látkou, která má luminiscenční vlastnosti může být, např.

luminofor, který je vázán na protein a který může být uvedeným způsobem excitován k luminiscenci při povrchu vlnovodové vrstvy. V případě, že vazebný partner, který má afinitu vůči'·' proteinu,' -je--veden -'-přes -t-uto zmobilizovanou vrgt-tfn. pn^OW rmV- ilujj)· 1f mndi ťílrnrí lnminisrpnrp a množství uvedeného vazebného partnera může být tímto způsobem stanoveno na základě míry modifikace luminiscence. Zejména mohou být luminofory značeni oba partneři afinitního komplexu tak, aby bylo možné provést stanovení koncentrací z přenosu energie mezi oběma partnery, například ve formě. luminiscenčního zhášení.

Další výhodné provedení způsobu provedení chemických nebo biochemických afinitních zkoušek spočívá v imobilizaci vazebných partnerů jako chemických nebo biochemických

..................-detekčních- látek—pro - samotný.. analyt.. nebo, .pro_ jeden z vazebných partnerů na povrchu senzorové základny. Zkouška může být tvořena jednostupňovou nebo vícestupňovou, zkouškou, v průběhu které postupně jeden nebo více než jeden roztok, obsahující vazebné, partnery pro detekci látek zmobilizovaných na povrchu senzorové základny je veden přes povrch senzorové základny, přičemž se analyt v jednom, z dílčích stupňů zkoušky stává vázaným. Detekce analýzu je provedena· vázáním luminiscenčně- označených, složek v afinitní zkoužce. Uvedenými·, luminiscenčně značenými látkami mohou být jeden nebo více než _jeden vazebný partner afinitního testu nebo analog analytu opatřený luminoforem. Jediným kritériem’3é~'to, aby p'řítomnďš~ analytu vedla selektivně k luminiscenčnímu signálu nebo selektivně ke změně luminiscenčního signálu.

Imobiíizace detekčních látek může být typicky provedena hvdrofobní absorpcí nebo kovaletním vázáním přímo na vlnovodovou vrstvu nebo na tuto vrstvu po chemické modifikaci jejího povrchu, např. silanizací nebo aplikací polymerní vrstvy. Kromě toho může být na vlnovodovou vrstvu přímo přiložena tenká mezivrstva obsahující, např. SiO₂, jako adhezi-podporující vrstva za účelem umožnění imobiíizace detekčních látek přímo na vlnovodu. Tloušťka této mezivrstvy by neměla přesáhnou 50 nm, výhodně 20 nm.

Vhodnými detekčními látkami jsou typicky protilátky pro pro antigeny, vazebné proteiny, jakými jsou protein A a B pro imunoglobulin, receptory pro ligandy, oligonukleotidy- a řetězce RNK a DNK pro jejich komplementární řetězce, avidin pro biotin, enzymy pro enzymové substráty, enzymové kofaktory nebo inhibitory, lectiny pro uhlohydráty. To, který z vazebných partnerů se při afinitním stanovení imobilizuje na povrch senzorové báze, bude záviset na zkušenosti odborníka, který stanovení provádí.

Samotná zkouška může být tvořena jedno-stupňovým komplexujícím .procesem, např.· kompetitivní zkouškou, nebo více-stupňovým procesem, např. sendvičovou zkouškou.

V nějjednoduším případe kompetitivní zkoušky je vzorek, který obsahuje analyt o neznáme koncentraci a také známé

A ·> · množství sloučeniny, která je stejná s výjimkou /' v, luminiscenčního značení, je uveden do kontaktu s povrchem senzorové základny, přičemž luminiscentně značené a neznačené molekuly se ucházejí o vazebná místa v jejich imobilizovaných *¹ detekčních látkách. Maximálního luminiscenčního sicnálu je při této zkouškové konfiguraci dosaženo v případě, že vzorek;

W» I··» neobsahuje žádný analyt. Se zvyšující koncentrací látek, které mají být detekovány, se při pozorování stává luminiscenční signál slabším.

Při konkurenčním imunologickém, stanovení nemusí být nutně látkou, která je imobilizována, protilátka, poněvadž na povrchu senzorové základny může být rovněž imobilizován i antigen jako detekční látka. Obvykle je nepodstatné to, který z vazebných partnerů je imobilizován při chemických nebo biochemických afinitních zkouškách. To je'podstatnou výhodou stanovení založených na luminiscencí oproti metodám, jakými jsou povrchová plasmonová rezonanční metoda nebo interferometrie, které jsou založeny na změně adsorbované hmoty v evanesentním poli vlnovodové vrstvy.

“·· -v--pfípadě· kompetitivních zkoušek.nemusí být konkurence

-i-_tw_cτ·ηn nj, τγ_?.7γ>Κρ? mísLa na povrchu senzorové základny. Např.

známé množství antigenu může být rovněž imobílizováno .na povrchu senzorové základny a potom uvedeno do kontaktu se vzorkem, který obsahuje neznámé množství, které- má být detekováno, stejného antigenu jako analytu a také luminiscenčně označených protilátek. V tomto případě dochází mei antigeny, které jsou zmobilizovány ha povrchu senzorové základny a která jsou přítomné v roztoku, ke vzájemné konkurenci při vázání protilátek.

Nejjednoduším případem vícestupňové těstu je sendvičový

......imunologický.;. .t.est,. p.ři _které je primární protilátka imobilizová.ua na povrchu senzorové základny. Vázáni antigenu, který má být detekován,, a. luminiscenčně, značené sekundární protilátky použité pro provedení, detekce na druhý epitop antigenu může být proveden buď postupným- uvedením do kontaktu s roztokem obsahujícím antigen a druhým roztokem obsahujícím luminiscenčně značenou protilátku nebo předem uskutečněným sloučením těchto dvou roztoků, takže nakonec je vytvořena vazba oarciálního komolaxu oosahujzcino antigen luminiscenčně značenou protilátku.

-^Af.in_í.tnl—stanoyenz mohou rovněž obsahovat dodatečné vazeone imunologického

Tak stanovení případě sendvičového být v prvním stupni naor. v * může zmobilizován na povrhcu senzorové báze protein A, který specificky váže imunoglobuliny, které potom působí jako primární protilátky při následném sendvičovém testu, který se provádí výše popsaným způsobem, v jejich tak zvané části F_c.

Existuje velké množství dalších typů afinitních stanovení, které obvykle využívají známý afinitní systém avidin-biotin.

Příklady typů afinitních stanovení lze najít J.H. Rittenburg, Eundamentals pf Immunoass.ay, v Development and

Application of Immunoassay for Food Analysis, J.H. Rittenburg (nakl.}, Elsevier, Essex 1990 nebo v P.Tijssen, Practice and Theorv of Enzyme Immunoassays, R.H.Burdon, P.H. van Knippenberg (nakl.), Elsevier, Amsterdam 1995.

Kromě toho je možné povrch senzorové základny regenerovat a tudíž ho použít více než jednou. Při vhodných podmínkách, např. nízkém pří, zvýšené teplotě, a za použití organických rozpouštědel nebo tzv. chaótropních čididel (solí) je možné selektivně disociovat afinitní komplexy bez podstatného zhoršení vazebné kapacity imobilizovaných detekčních látek. Přesné podmínky jsou silně závislé na konkrétním afinitním Systému.

Další základní provedení způsobu podle vynálezu spočívá jednak v omezení produkce' signálu- v případe zpětné kopulace.⁷to rovněž platí pro signálovou detekci- na evanescenční pole. vlnovodu a jednak v reversibilitě tvorby afinitního komplexu ve funkci rovnovážného komplexu. Při vhodných rychlostech proudu v kontinuálním proudovém systému je možné monitorovat v reálném čase vázání, desorpci nebo disociaci vázaných iuninescenčne značených afinitních partnerů v evanescentním poli. Tento způsob je tudíž vhodný pro kinetické studie pro určení rozdílných asociačních nebo disociačních_}konstant nebo rovněž pro vytěsňovací testy.

Detekce evanescentně excitované luminiscence může být provedena dosud známými metodami. Mohou být vhodně použity např. fotodiody, fotočlánky, fotonásobiče, CCD kamery a detektorové řady, např. CCD články. Luminiscence může být zobrazena optickými členy, jakými, jsou např. zrcadla,' hranoly, čočky, Presnelovy čočky a čočky s gradientem indexu lomu. Za účelem selekce emise vlnových délek je možné použít dosud známé členy, jakými jsou např. filtry, hranoly monochromatické filtry, dichromatické zrcadla a ohybové mřížky. ...

•••Jedno— provedení •••způsobu podle ••'-.vynálezu . spočívá ..v detekcí-i-ootropno-emitované,—: evan.es cent ně excitované luminiscence.

Další provedení způsobu podle vynálezu spočívá v detekci evanescentně excitované luminiscence při okrajích senzorové základny, přičemž tato luminiscence je seřazena zpět do uvedené senzorové základny.. Poněvadž intenciza této zpětně spřažené fluorescence je překvapivě vysoká, může být tímto způsobem dosažena velmi dobrá citlivost;.

Další provedení způsobu podle vynálezu spočívá v detekcí isotropně emitované, evanescentně excitované luminiscence jakoži luminiscence spřažené zpět’ do vlnovodu, a to vzájemně nezávisle, avšak současně. Kvůli rozdílné selektivitě dvou luminiscenčních detekčních, metod; . kzer.á, je závislá na vzdálenosti iuminoforů cd vlnovodové vrstvy,·' může být tímto provedením způsobu dosažena dodazečná -informace o prostorové distribuci Iuminoforů. Proto toto provedení způsobu umožňuje rozlišení, mezí fotochemickým zhášením Iuminoforů a disociací afinitních komplexů nesoucích luminofory.

Jedna výhoda způsobu podle vynálezu, kromě iumihiščěhčě' spočívá v tom,'· 'že' kmůž’e—bým~řovně'žy absorpce vyzářeného excitačního světla. Při porc mnohavidovými vlnovody z optických vláken nebo c konstrukcije v tomto případě dosažen podstatně lep; signálu od šumu. Simultánní měření luminiscence a umožňuje určení luminiscenčního zhášeciho účinku s citlivostí.

detekce anovena- nání s rovinné odstup bsorpče vvsokou

Tento způsob může být proveden ozářením excitačním světlem s kontinuálním videm vlny, to znamená, že excicace je provedena- světlem, jehož intenzita má v čase konstantní hodnotu.

Avšak tento způsob může' být rovněž proveden ozářením excitačním světlem ve formě časových impulsů s délkou impulsu, např. od 1 píkosekundy do 100 s, a časově-rozloženou detekcí luminiscence-v případě krátkých délek impulsů-uebo v intervalech sekund až minut. Tento způsob je zejména výhodný, kdykoliv je to žádoucí, např. pro analytické monitorování rychlosti tvorby vazby nebo pro zamezení zeslabení luminiscenčního signálu v důsledku fotochemického slábnutí využívající krátké expoziční časy·. Použitím vhodné krátké délky impulsu a vhodné časově rozložené detekce je dále možné rozlišit rozptýlené světlo, Ramanovu emisi a krátkodobou luminiscenci libovolných nežádoucích luminiscenčních složek vzorku a senzorového materiálu od luminiscence označené molekuly, která je v tomto případě dlouhodobá, detekci emise analytu pouze potom, co doznělo uvedené krátkodobé zářeni. Kromě toho časově rozložená Luminiscenční detekce umožňuje pb impulsové excitaci-rovněž tak modulované excitaci a detekci-zkoumat vliv vázání analytu na doznívání molekulární luminiscencí

Kromě specifického zmobilizovanými detekčními látkami a tvorby signálu na evanescentní pole vlnovodu může být doba rozpadu molekulární luminiscence použita jako další kriterium' zjištěni analytu prostorového omezení seiektivitv.

Tento způsob může být rovněž proveden vstupním spřažením excitačního světla při jedné frekvenci nebo při více než jedné frekvenci a s modulovanou intenzitou, a detekcí výsledného fázového posuvu a modulace luminiscence vzorku.

Vynález se dále týká použití způsobu podle vynálezu pro kvantitativní stanovení analytů při chemických nebo biochenických afinitních testech se známými afinitními partnery a metodikou testu detekcí emise značených vazebných partnerů schopných luminiscence, nebo detekcí změn v luminiscenčních vlastnostech imobilizovaných. luminiscentně značených afinitních partnerů interakcí s analytem.

· Poněvadž produkce- .signálu, .a. detekce' jsou _ omezeny na Chemickou—a—h-i nrhpmí rkou detekci povrchu na vlnovodu, a inteferenční signály jsou odlišeny od média, může být vázání, látek s zmobilizovanými detekčními složkami monitorováno v reálném čase. Je tudíž rovněž možné použít způsob podle vynálezu pro plošné stanovení afinit nebo pro vytěsňovací testy,' zejména pro vývoj farmaceutických produktů,, přímou detekcí asociačních a disocíačních rychlostí v kontinuálním proudovém systému s vhodnými proudovými rychlostmi.

Podle jiného aspektu se vynález týká použití způsobu podle vynálezu pro kvantitativní stanovení protilátek a antigenů...... . ....... .. ...

vynálezu je pro , .oligo nukleotidů,, enzymů, enzymových .bítorú, lektinů a

Ještě další použití způsobu podle kvantitativní stanovení receptorů ligandů řetězců DNK nebo RNK, analogů DNK, PNA, substrátů, enzymových kofaktorů nebo inhi uhlohydřátů.

Podle dalšího aspektu se vynález týká použití způsobu podle vynálezu pro selektivní kvantitativní stanovení luminiscenčních složek v opticky zakalených tekutinách.

Opticky^ zakalenými tekutinami mohou být typicky biologické tekutiny, jakými jsou např. vaječný žloutek, tělní tekutiny,' např. krev, sérum -nebo plasma, a rovněž vzorky pocházející z analýz životního postředí, které zahrnují povrchovou vodu, rozpuštěné půdní extrakty a rozpuštěné rostliné extrakty. Vhodnými tekutinami jsou rovněž reakční roztoky získané při chemické výrobě, zejména roztoky barev nebo reakční roztokyvznikajících při produkci bělících fluorescenčních činidel. Jsou také vhodné všechny typy disperzí a formulací typycky používaných v textilním průmyslu za předpokladu, že obsahují jednu luminiscenční komponentu nebo více než jednu luminiscenční komponentu. Tento způsob tak může být rovněž použit pro zabezpečení kontroly kvality výrobků.

Stručný popis obrázků

Vynález bude nyní popsán pomocí přiložených výkresů, na kterých:

obr. 1 schématicky zobrazuje průřez sestavou zařízení pro provedení způsobu podle vynálezu, obr. 2 schématicky zobrazuje zvětšenou část optického vlnovodu.

Sestava zařízení pro provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje:

excitační optiku a vlnovod:

excitační laserový svazek

- vedevý vid mřížka (hloubka 4-5 nm, perioda 750 nm, obdélníkový tvar) _4 optická senzorová základna zahrnující 4a a 4b

4a vlnovodová vrstva (Ta_;O₅, n=2,317 při 433 nm)

4b podkladová vrstva (Cornig glass,n=l,533 při 433 nm) detekční optiku pro izotropně emitovanou luminiscenci _ zaostřovací čočka o vhodné ohniskové vzdálenosti interferenční filtr pro maximum luminiscence s polovinou šířky intenzitního.pásma, např. 30 nm zaostřovací čočka o vhodné ohniskové vzdálenosti detektor (fotodioaa) detekční optixu. pro luminiscenci zpětně spřaženou do senzorové základny svazek skleněných vláken o obdélníkovém průřezu interferenční filtr vhodný pro maximum luminiscence s polovinou šířky intenzitního pásma, napři·30 nm .11. . .. fotodioda _......

detekci přeneseného světla___ svazek skleněných vláken o obdélníkovém průřezu interferenční filtr vhodný pro maximum luminiscence s polovinou šířky intenzitního pásma, např. 30 nm fotodioda vzorková komůrka (otočná) horní část, která spolu se senzorovou základnou, na kterou je tlačena, tvoří proudovou komůrku těsnící kroužek vstupní otvor pro tekutinu výstupní otvor pro tekutinu vstupní otvor pro termostatickou regulací výstupní otvor pro termostatickou regulaci

Individuální členy použité pro tuto sestavu jsou známé a komerkčně dostupné.

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude nyní popsán podle následujících příkladných provedeních. Ve všech příkladných provedeních je koncentrace M vyjádřená v mol/1.

:— _a —-—-— -——« _

Příklad 1

1.1 Optická konstrukce

Exitační světlo argon-iontového laseru (excitační vlnová délka 438 nm) je směrována na mřížku vlnovodové vrstvy prostřednictvím otočného zrcadla ze zadní části podkladové vrstvy. Termostaticky regulovaná proudová komůrka utěsněná těsnícími kroužkami je tlačena ze zhora proti čelní ploše vlnovodové vrtsvy. Komůrka má objem asi 0,07 ml. Luminiscence vzorku excitovaná v evanescentním poli a přenos excitačního světla jsou zaznamenány současně třemi detektorami v rozdílném prostorovém uspořádání. Tcoo uspořádání je zobrazeno na obr. 1. Detektor .3 zahrnuje fotodiodu (UDT UV-50, United Detector Technology, Kawthorne, CA, USA), na kterou je interferenčními filtry a zaostřovacími čočkami zaostřena izotropně emitovaná luminiscence. Detektor 14 zahrnuje fotodiodu (SR orostřednictvím ootickvch

113 3, Kamamatsu), na ' kterou skleněných vláken je přes interferenční filor vedena luminiscence zpětně spřažená do vlnovodová vrstvy a pozorovaná pod úhlem 90 směru šíření kontinuálního vidu. Signál prostřednictvím transimpedančního zesilovač světlo je analogovým způsobem detektorem 11 vedena ve směru šíření vidu přes interferenční filtr na fotodiodu (UDT UV-50, United Detector Technology, Hawthorne, CA, USA.) , a potom zesíleno.

vzhledem ke je zesílen Přenosové

1.2. Charakteristiky senzorových materiálů a výsledná data spřažení

1.2.1. Optická senzorová základna geometrie: ISmm x 43mm x 0,5mm vlnovodová vrstva: Ta.O_s, n=2,3l7 při 433 nm, . tloušťka 10G+5nm podkladová vrstva: Corning glass C7059, n=í,533 při 433 nm mřížka: obdélníková mřížka s modulační hloubkou 4-5 nm, mřížková perioda 750nm

1.2.2 Výsledná data spřažení s exitací při 633 nm úhel spřažení: 4-5 (druhý refrakční řád) účinnost spřažení: 7 % v místě mřížky útlum: 2,5 dB/cm.

1.3. Detekce fluoresceinem-značeného imunoglobulinu ·. na mobilizovaném proteinu A. vzorkový roztok:

x- 10-3··- Μ-. fluoresceinem-značený .imundglobulin ' (Sigma—— Chomica.) , F-TgfŤ), \___

0-5' i fosfátový pufr obsahující 0,041 M Na₂HPO₄ a 0,028 M KH_;P0,, ml POE-(20)-sorbitol monolaurát (Tween 20, ICI),

200 mg azict sodný, 50 ml metanolu, přičemž zbytek do 1 litru ja doplněn destilovanou vodou.

Uvedený senzor je inkubován po dobu 10 hodin ve vodném roztoku proteinu A (Sigma Chemicals, 1 mg/ml). Za účelem neutralizace dosud volných adsorpčních míst je senzor promíván destilovanou vodou a potom znovu inkubován po dobu- 1

............. hodiny.. v. roztoku fosfátového pufru, ktreý obsahuje 10 g/l albuminu z bovinního séra (Sigma Chemicals).

Vzorkový-roztok po dobu 9 minut -kontinuálně proudí- přes senzorový povrch, na kterém je adsorbován, protein A.

Izotropně emitovaná fluorescence, evanescentně zpětně spřažená fluorescence a přenos jsou měřeny po dobu přes 9 minut podle popisu uvedeném, v kapitole 1.1. Při tomto měřeni byla dosažena citlivost asi 1 x 10'^lQ M, založená na F-IgG.

Ve všech následujících příkladech provedení vynálezu je __ použita senzorová základna' popsaná v příkladu 1 a optická sestava popsaná rovněž v příkladu 1. ’

Příklad 2

Detekce fluoresceinem značeného imunoglobulinu na imobilizovaném proteinu A

Použité roztoky:

1) pufrový roztok obsahující 0,5 1 fosfátového pufru (0,041 M Na_;H'PO₄ + 0,028 M KH.POJ, 0,151 M NaCl, 250 mg/1 azidu sodného, 50 ml methanolu, 1 g/l albuminu z bovinníhc séra (BSA), 0,5 ml POE-(20)-sorbitol-monolaurát (Tween. '20,

ICI),přičemž zbytek je^r doplněn do 1 litru destilovanou vodou,

2) roztok pro imobilizaci proteinu A (Sigma Chemicals) lmg/ml destilované vody,

3) neutralizační roztok: pufrový rozzck 1) + 10 mg/ml albuminu z bovinního séra (3SA Sigma Chemicals),

4) oplachový roztok: pufrový roztok 1),

5) vzorkový roztok: fluoresceinem imunoglobulin 10-3 M .v pufrovém roztoku 1),

6) regenerační roztok: glycinový pufr, pH 2.

účelem imooilizace proteinu A. Za účelem volných absorpčních míst je senzorová •JK destilovanou vodou a potom znovuů . hodiny v neutralizačním roztoku, který’ e následující inviduální stucně, které

Způsob:

Optická senzorová základna je inkubována po dobu 10 hodin roztokem 2) za neutralizace dosud základna promívá.na inkubována po dobu ] obsahuje 10 g/1 BSA.

Způsob zahrnuj jsou provedeny v proudové komůrce (proudová rychlost'

Iml/min):

promívání po dobu 5 minut pufrovým roztokem- 1) následované záznamem signálu pozadí, přidávání vzorkového roztoku 5) v průběhu 9 minut, vymívání po dobu 5 minut pufrovým roztokem 1), přidávání regeneračního roztoku 6) v průběhu 5 minut, propírání pufrovým roztokem 1) po dobu 5 minut.

Izotropně emitovaná fluorescence a fluorescence zpětně spřažená do senzorové základny jakož i přenos jsou měřeny v průběhu celého způsobu podle příkladu i.

Kromě silného signálu izotropně emitované fluorescence jsou měřeny za přítomnosti analytu silné signály ze zpětně spřažené fluorescence .jakož i výrazně snížený přenos. V průběhu přidávání .fluorescenčního analytu se fluorescenční signály zesilují a vykazují .typický tvar adsorpční křivky.

Signál zpětně-spřažen-é fluorescence -j.e, - při. stejném...zesílení, _______ . .· .

nižší než izotropně emitovaná fluorescence pouze o faktor 2.

Přenosový signál má tvar, který je ve skutečností zrcadlově převrácený k fluorescenčnímu signálům. Dokud není dosaženo , maximum fluorescence, přenosový signál se zeslabuje o 25 %.

Přenosový signál se opět zvýší o stejnou velikost, když se .' fluorescence po regeneračním stupni sníží.

Příklad 3

Detekce fluoresceinem značeného imunoglobulinu na zmobilizovaném proteinu A

Použité roztoky:

1) pufrový roztok: obsahující 1/3 fosfátového pufru (0,041 M

Na-H?0₄ + 0,023 M KH,POJ, 0,151 M NaCl, 200 mg/1 azidu sodného, 50 ml methanolu, přičemž se zbytek do 1 litru doplní destilovanou vodou,

2) roztok pro imobilizaci proteinu A (Sigma Chemical): img/ml pufrového roztoku i),

3) neutralizační roztok: pufrový roztok 1) +10 mg/ml albumin.

z bovinního séra (BSA, Sigma Chemicals),

-4j—opl-acho^ý—ro.z-tck-:_-^-e_ro.v.ně.ž_p.ou.ži.t_p.ro... detekci s.i.gnálu________ pozadí, pufrový roztok 1) + 1 mg/ml BSA,

5) vzorkový roztok: fluoresceinem značený imunoglobulin M 'v rozdílných koncentracích (10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M) v pufrovém roztoku 1) s 1 mg/ml BSA,

6) regenerační roztok: glvcinový pufr, pH 2,5.

Způsob:

Gotická senzorová základna je inkubována ' po dobu 2 hodin roztokem pro imobilizaci proteinu A. Za účelem neutralizace dosud volných adsorpčnícn center je senzor propírán destilovanou vodou a potom po dobu 1 hodiny znovu inkubován v roztoku fosfátového pufru , .který obsahuje 10 g/1 BSA

Způsob zahrnuje následující stupně:

-propíráni po dobu 2 minut oplachovým roztokem 4) (0,1 ml/min), záznam signálu pozadí,

-současné nasátí vzorku (lml) do smyčky automatickým vzorkovačem,

-průchod vzorku v průběhu asi 7 minut přes senzorovou základnu vypouštěním smyčky (0,1 ml/min, mezi počátečním a koncovým impulsem),

-opláchnutí roztokem 4),

-po. aplikaci regeneračního roztoku opět opláchnutí roztokem

4),

Během celého způsobu je podle příkladu 1 měřena izotropně emitovaná fluorescence a přenos.

Při koncentraci 10'ⁱ⁰ M fii imunoglobulinu A je pozorována další Při koncentracích až 10*³ M jsou stanové

Po zprůměrování dat (průměry z ještě zjištěna koncentrace analytu 10'

Následující změny signálů j koncentracích zaznamenány na konci přijsou vztaženy k počátečnímu signálu po mezi 1 a 4 mV):

zcresceinem značeného zřetelná luminiscence. my změny v přenosu, devíti bcdů) může být sou při rozdílných dávání vzorku, přičemž zádí (poměr signái/šum [F-IgG] Flurescenční signál (V)

10'⁸	1,0
10'⁹	0,2
IQ'¹⁰	0,039
IQ-u	0, 008
(po	zprůměrování)

Změna přenosového signálu -10% nestanovena nestanovena nestanovena

Příklad 4

1.4. -Detekce fluoresceinem značených oligonucleotidů s imobilizovanými komplementárními řetězci

1) hybridizační cu.fr (ph 7,75) obsahující 0,069 M fosfátového.

pufru (0,041 M NaH_;P0₄+0, 023 M NaH-POJ , 0,176 M KCl, 1 ml

POE-(20)-sorbitoí-monolaurátu (Tween 20, ICI), 1 g polyakrylová kyselina PAA 5100, 500 mg/1 azidu sodného, zbytek do litru doplněný destilovanou vodou,

2) vzorkový roztok: fluoresceinem-značený oligomer k oligomeru zmobilizovanému na senzorové obsahující 16 základních dvojic (řluoresceín-5'-GTTGTGTGGAATTGTG-3' (10-12 M/l) -v hybridizačním pufru 1), '3) ' regenerační·'roztok.-; 50-·%· (G/G) močoviny ..ve .vodném..roztoku..

komplementární základně a

Způsob: _x

Záchytová sonda je syntetizována za použití oligonukleotidovéno syntetizátoru. (Applied Biosystems 3943) 3'CAACACACCTTAACAC-5' přímo na senzorové základně siianizované 3-glycidiloxipropyltrimethoxysilanem standartním způsobem, jaký je používán pro syntézu oligonukleotidů na částicích (např. M.J.Gait, Oligonucleotide Synthesis. A practícal approach Oxford University Press, NY 1990). Avšak .na__rozdíl cd standartnz syntézy se, zde používá kyselina 4-(4,4-dimethoxytrityl)hvdroxymáselná jako stabilní vazebná' skupina pro ukotvení na povrchu konce 3', tak aby se zabránilo pozdějšímu odštěpení s povrchu senzoru. Po proprání vodou jsou senzorové základny použity s imobilizovanými detekčními řetězci při.detekčním způsobu.

Způsob zahrnuje následující individuální stupně: -proprání po dobu 3 minut hybridizačním pufrem 1) (0,5 ml/min), zaznamenání signálu pozadí,

-přidávání vzorkového roztoku 2) (0,05 ml/min) v průběhu doby minut (po 5 sec propláchnutí 5 ml/min),

-opláchnutí co dobu 4 minut hybridizačním pufrem 1) (0,5 ml/min),

-přidávání regeneračního roztoku 3) v průběhu doby 4 minut (0,5 ml/min),

-opláchnutí po dobu 4 minut hybridizačním puřrem 1) (0,5 mi/min),

Během způsobu 'podle příkladu 1) byla .měřena izotropně emitovaná fluorescence a přenos. Po přidání vzorku v průběhu.

I minut odpovídajícím množství 500 at.mol fluoresceinem značeného indikátoru DNK je pozorován fluorescenční signál 20 mV při signálu šumu asi lmV.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob detekce luminiscence rovinnou dielektrickou cotickou senzorovou, základnou obsahující transparentní podkladovou vrstvu (a); ke které je přiložena tenká transparentní vlnovodová vrstva (b), přičemž senzorová základna je opatřena mřížkou pro vstupní spřažení excitačního světla a index lomu uvedené pokladové vrstvy (a) je nižší než index lomu vlnovodové vrstvy (b), uvedením kapalného vzorku do kontaktu s vrstvou (b) a měřením luminiscence produkované látkami, které mají ve vzorku luminiscenční vlastnosti nebo

-----látkami,-· -které- -ma-jí luminiscenční, vlastnosti imo.bilizovanými na vrstvě (b), ootoalektronicky, vyznačený t í m, že excitační světlo je seřazeno. s rovinným. . vlnovodem a orochází vlnovodovou vrstvou, v důsledku čehož látky, které mají luminisceční vlastnosti jsou excitovány za vzniku luminiscence v evanescentním poli vlnovodové vrstvy, (B) uvedená mřížka má modulační, hloubku od 3 do 60 nm, (C) tloušťka vrstvy (bi je od 40 do 160 nm, a (D) poměr modulační hloubky ke tloušťce vrstvy (b) je menší než 0,5.
2. Způsob podle nároku 1,. vyznačený tím, že podkladová vrstva je tvořena .kře’meněm, anorganickým sklem nebo plastickým materiálem.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že podkladová vrstva je tvořena anorganickým sklem.
4. Způsob· podle' nároku 1, vyznačený t í m, že podkladová vrstva je tvořena polykarbonátem nebo polymethylmetnakrylátem.
5. Způsob podle nároku 1, v y z n .a č e n ý t i m, že' mezi· podkladovou vrstvou a vlnovodovou vrstvou je provedena mezivrstva tvořená SiO., termoplastem, termosetem nebo strukturálně zesítěným plastem, přičemž tato mezivrstva má index lomu, který je menší než index lomu podkladové vrstvy nebo identický s indexem lomu podkladové vrstvy.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačený t i m, že mezivrstva má tloušťku 10 pm nebo menší než 10 pm.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že pro excitaci luminiscence je použito v podstatě paralelní světlo.

8.· Způsob podle nároku excitaci luminiscence je délce 300 až 1100 nm. 1, vyznačen použito laserové ý tím, že pro vlnové s-iV světlo 0 9. Způsob podle nároku 1, vyznačen ý t i iLL, ze pro excitaci luminiscence je použito laserové světíc 0 vlnové délce 450 až 850 nm. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačen ý t í m, že pro excitaci luminiscence je použito laserové světlo 0 vlnové délce 430 až 700 nm. 11. Způsob podle nároku 1, vyznače n ý Γ 1 m, . že

rovinná transparentní vlnovodová vrstva je tvořena materiálem, který má index lomu větší než 2.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačený t i m, že rovinná transparentní .vlnovodová vrstva je tvořena Ta_;O₅ nebo

TiO..

fa
13. Způsob podle nároku 1, vyzna-čený t i m, že rovinná transparentní vlnovodová vrstva má tloušťku 30 nm až 160 nm.
14. Způsob podle nároku 1, ¹ v y z n a č e n ý tím, že mřížka pro vstupní ' spřažení excitačního světla je tvořena ootickou refrakční mřížkou.
15. Způsob podle nároku 14, v, y z n a č e n ý t í m, že optická refrakční mřížka je tvořena reliéfní mřížkou.
16. Způsob podle nároku 14, vyznačen, ý t í ra, že mřížka má tvar pilového zubu, sinusové křivky nebo obdélníku.
17. Způsob podle nároku 14, vyznačený tím, že mřížka má mřížkovou periodu 200 až 1000 nm.

13,- Způsob podle nároku 14, vyznačen mřížka má modulační hloubku od’5 do. 30 nm...

y t i m, ze
19. Způsob podle nároku 14, vyznačený t í ra, že mřížka má poměr čára-rozestup od 0,5 do 2.
20. Způsob, podle nároku 1, vyznačený t í ra, že mezi vlnovodovou vrstvou a vzorkem je přítomna adhézipodporující vrstva.
21. Způsob podle nároku 21, vyznačený t í'ra, že' adhézi-podporující vrstva má tloušťku 50 nm nebo menší než 50 nm.
22. Způsob podle nároku 1, vyznačený t i m, že přímo na povrchu vlnovodové vrstvy jsou imobilizovány látky schopné luminiscence použité pro detekci analytu.
23. Způsob podle nároku 1, vyznačený t i m, že zahrnuje imobilizaci. specifického vazebného partnera jako chemická nebe biochemické detekční látky pro samotný analyt nebo pro. jeden z vazebných partnerů na povrchu senzorové základny při vícestupňovém testu, v průběhu kterého při jednom z dílčích stupňů dojde k vázání analytu.
24. Způsob podle nároku 1, vyznačený t i m, že senzorová základna je schopná regenerace a může být opakovaně použita.

m,
25. Způsob podle nároku' 1, vyznačený t zahrnuje detekci isotropně emitované evanescentně excitované luminiscence.
26. Způsob podle nároku 1, vyznačený t í m, že zahrnuje detekci při okrajích senzorové základny evanescentně excitovaná luminiscence zpětně ' spřažené do senzorové základnv.

t i m,
27. ' Způsob podle nároku 1, v y z zahrnuje detekci izotropně emitované luminiscence jakož i evanescentně excitovaného světla, které je zpětně spřaženo do vlnovodu, přičemž tyto detekce jsou provedeny vzájemně -n^-zěvřs±e“a'věd'k^_scůč'ašně.
29. Způsob podle nároku 1, v y z n a č e n ý t i m, že zahrnuje současně probíhající stanovení absorpce excitačního světla sořaženého do vlnovodu.

29. Způsob podle nároku 1, vy z n a č e ' n ý t i m, že excitační .světlo j.e spřaženo do· vlnovodu ve formě kontinuálního vidu vlny. * 30. Způsob podle nároku 1, v y z n a č e n ý t i m, že

zahrnuje vstupní spřažení excitačního světla ve formě časového impulsu a časově rozloženou detekci luminiscence.

31.

Způsob podle nároku 30, vyznačen t i m, délka impulsu je nastavena od 1 píkosekundy do 100 s.
32. Způsob podle nároku 1, v y z n a Č e n ý t í m, .ze zahrnuje vstupní spřažení excitačního světla s modulovanou intenzitou oři jedné frekvenci nebo více než jedné frekvenci a detekci vvsiedného fázového posuvu a modulace luminiscence vzorku.
33. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, vzorkem, který.má být detekován, je vaječný žloutek, krev, sérum, plazma nebo moč.
34 f ’ -Způsob- podle—náro ku- 1, v.y z .n .a č. e . n ý....t i m., že vzorkem, který má být. detekován, je povrchová voda, půdní nebo rostlinný extrakt, bioprocesní nebo syntézní. břečka.
35. Použití způsobu podle nároku 1 pro kvantitativní stanovení biochemických látek při snímání afinity.

76. Použití zoůsobu codle nároku 1 cro kvantitativní stanovení crotilápek a antigenů.
37. Použití způsobu podle nároku 1 pro kvantitativní stanovení receptoru nebo liganďů, oiigonukleotiďů, ' řetězců DNK nebo RNK, analogů DNA nebo RNK, enzymů, enzymových substrátů, enzymových korektorů nebo inhibitorů, lektinú' a uhlohvdrátu.

33. Použití způsobu podle nároku 1 pro kvantitativní stanovení luminiscenčních komponent v opticky zakalených tekutinách)

Zastupuje: