CZ347196A3 - Method of detecting evanescently excited luminescence - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu stanovení luminiscence za použití planární dielektrické optické senzorové báze, která je tvořena transparentní podložkou (a). na kterou je nanesena tenká vlnovodivá vrstva (b), přičemž senzorová báze je opatřena mřížkou pro ' vstupní excitační světlo a index lomu uvedené podložky (a) je nižší než index lomu vlnovodivé CO vrstvy (b), uvedením kapalného vzorku do styku s vlnovodlvou vrstvou (b) ve formě vrchní vrstvy a měřením luminiscence, produkované látkami majícími luminiscenční vlastností a obsaženými ve vzorku nebo látkami mající luminiscenční vlastnosti a imobilizovanými na vlnovodivé vrstvě (b), optoelektronicky. Vynález se rovněž týká použití tohoto způsobu pro kvantitativní snímáni afinity a pro kvantitativní stanovení luminiscenčních složek v opticky kalných roztocích, jakož i senzorové báze pro provádění uvedeného způsobu.

CZ 3471-96 * -M i - «τ·-ι· · - # '

174480/KB

Ό

Λ!

< ~

C Ξ 'Λ s c

Ξ > n c O |

NJ σι σ

o

ÍK ίθ· en

ÍK o

Způsob detekce evanescentne excitovené-J.umi'aiscaflCa cc

I * * in

-J re r,<

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu detekce evanescentne excitované -lumin i scence za použití planární dielektrické optické senzorové báze založené na vlnovodu. Vynález se rovněž týká použití uvedeného způsobu pro kvalitativní snímání afinity a jeho Dou-žití oro selektivní kvantitativní stanovení luminlscenčních' složek v. opticky- zakalených roztocích. Vynález ’ se dále týká senzorové báze vhodné pro provádění uvedeného způsobu.

Dosavadní stav techniky

Jestliže se světlo šíří vlnovodem, potom šíření světelné vlny není zcela omezenou pouze na daný skutečný vlnovod. Ve skutečnosti se určitá frakce světelné vlny šíří y_ sousedním opticky, řidčím,prostředí,. _;T’ato „frakce .se., označuje jako evanescentní pole a je základem pro různé aplikace _ - _ . v . ·. _ iV ^,fA -Ϊ , -tií-M*·· * ». ,+· - - .- · i- , l-_- , · . J optických vlnovodů v technologii senzorů.

Za použití evanesceňtního pole je zejména možn.é excitovat luminiscenci v- opticky řidčím prostředí. Tato excitace je omezena na bezprostřední okolí mezifázového rozhraní vlnovodu. Evanescentne excitovaná luminiscence má proto velký význam pro analytické účely.

Planární senzor je v nejjednodušším případě tvořen systémem tří vrstev, kterými jsou podložka, vlnovodivá vrstva a vrchní vrstva, která je obvykle tvořena vzorkem určeným >

pro stanovení. Obzvláště v případě tenkých vlnovodů, ve kterých je tloušťka vlnovodivá vrstvy menší než délka světelné vlny je počet difundovatelných ,πιοάύ světelného pole schopných

Šíření ‘omezen- pouze na--několik málo--diskrétních vlnovode-. .

výcii modu.---1---v případe silných vlnovodů může být vlnovodem veden velkv počet uvedených medů. V tomto případě se nepovažuje za nutné v mnohých případech omezovat se u tlouštky podložky na hodnoty v rozmezí několika desetin milimetru a více.

Dosavadní způsoby detekce evanescentně excitované luminiscence mohou být rozděleny podle výběru radiačních frakcí, které mohou být detekovány:

-....... detekce ‘objemové -l'umi-rLÍscence^,,:---fra-k-ce--f-l-uorescenice excitované vedenou vlnou je emitována pod plným prostorovým úhlem, přičemž.tato frakce může být opticky zaznamenána a zavedena do detečního systému , detekce evanescentní luminiscence: komplementárně k luminiscenci emitované do prostoru je tato evanes centní luminiscence zpětně vázána jako vedená vlna do vlnovodu, transportována vlnovodem a uvolněna až v koncové rovině vlnovodu.

Způsoby a zařízení pro detekci evanescentně excitované luminiscence protilátek nebo antigenů značených luminiscenčními barvivý jsou známé a popsané například mezi jinými patentovém dokumentu US-A-4532809. Uspořádání nárokované v tomto patentovém dokumentu využívá pro excitaci evanescentní luminiscence optické vlákno a čelní kopulační přípoj. Taková optická vlákna mají typicky průměr až 1 milimetru a vedou velký počet modů v případě, Že je k vláknu připojen zdroj laserového záření. Evanescentně excitovaná luminiscence může být měřena jednoduchým způsobem s využitím pouze frakce světla tunelované zpět do vlákna. Další nedostatky tohoto uspořádání spočívají v tom, že detekční zařízení má velké rozměry a že je zde nezbytné provádět stanovení za použití poměrně velkých objemů vzorků. Toto zařízení .již nemůže být .pod stát nou„měrou zmenšeno, nebo. dokonce miniaturizováno, do Γ ' , rozměrů integrovaných optických senzorůZlepšení citlivosti zařízení je zpravidla spojeno se.zvětšením jeho rozměrů.

Dalším nedostatkem je nízká citlivost, která je limitována výstupní, čelní kopulační přípoji: poněvadž excitace a luminiscenční záření probíhají kolineárně a musí být proto .rozděleny děliči a filtry (například prahovými filtry nebo pásmovými propustmi),' omezují diskriminační charakteris„tiky filtrační jednotky citlivost detekce./,·'.

POužití”silných,plánárníčh multimbdovýčh vlnóvodičů je popsáno D.Christanse-nem, D.Deyerem, .D.Fowersem a J.Herro. Jiv nem v Analysis of Excitation and . Collection .Geometries ;for Planar Waveguide Immunosensors, SPIE .1336,- 2 ( 1993 ) (Fibre Optic Se.nsors in Medical Diagnostice) ·. Zde popsaná excitačp · ní radiace je, seřazena s' vlnovodem čelní připojí a měří se prostorový úhel emitovaného luminíscenčního světla. Alteřnativně^j.e-r.ovn.ě.ž_Jimo.ž.né-,.po.u_;ž.í.t-Jz.ýs.tup,n.ÍLič.e-lní^k.op.ul.a.ční p.ř.íp.ojj,._i. V tomto případě představuje omezení citlivosti způsobené . . n.;. > — i v· i f^r- -:,4.. ,·,»·» -o. -ks-r-j-i- . -i». _A - <r-n -λ t... v*:-» t ¹ f ^M '** - v*’¹ -* · -,*+qí-·. · * w · ·* ^ hutností použitíděličů a filtrů stejný.nedostatek,₍ jaký již byl -uveden v souvislostí .s výše popsaným uspořádáním. Dalšími nedostatky.jsou i v tomto případě velké rozměry -senzorua- nuthost-použití - velkých ob jemu· vzorků. ·· ·

V patentovém dokumentu WO 90/06503,je popsán způsob excitace luminiscence celkovou interní’reflekční fluorescencí (TIRF - Total Internal Reflection'Fluorescence), při ·kterém se používá tenký plariární, výhodně monomodový, vlnovod. Vlnovod je při tomto způsobu použit za účelem zvýšení intenzity světelného póle na povrchu senzoru, přičemž excitační radiace je vyzařována ze spodní strany, a zcela reflektována v senzoru...Měří. se objem,.luminiscence .emitované do prostoru. Při tomto způsobu je interakční zóna mezi excitačním světlem

a..molskulami majícími luminiscenční vlastnosti limitována na senzor, poněvadž excitace probíhá pouze v oblasti průměru paprsku. Jsou zda proto pouze omezené možnosti dimenzování senzoru na bázi průměru paprsku při restrikcích v průměru v divergenci vzhledem k velmi úzce vymezenému rezonančnímu úhlu.

Dosud známé použití jedné nebo více než jedné kopulační mřížky pro vstupní nebo výstupní připojení vedených vln je popsáno K.Tieřenthalerem a W.Lukoszem v Sensitivity oř grating couplers as integrated-optical Chemical sensors, J. 0pt.Am.B6,209 (1989), W.Lukoszem, PhM.Nellenem, Ch-Stammem a_.P_._W.ei.s.sem._ v_J.’0utput jGrating Couplers on Planar Waveguides as Integrated Optical Chemical Sensors, Sensors and Actuators B1, 585 (1990) a T.Tamirem a S.T.Pengem v Analysis and Design of Grating Couplers, Appl.Phys.14,235-254(1977). Způsoby popsané Tiefenthalerem-a kol. jsou vhodné.pro snímání afinity přímou detekční metodou (mechanismem změny indexu lomu). Stanoví se posun rezonance kopulačního úhlu, který je závislý na adsor.pci nebo' vazbě molekul, způsobující změnu indexu lomu prostředí.

V minulosti byly učiněny četné pokusy zlepšit citli^zvošt⁼ěva7TěšY:^-en^n'ě=exci'tované~l-umi-n.-|-s-.e.ene.e-a—v-yrpbi.t-jinte.g_;r_;ox_;____ váné optické senzory. Tak například v publikaci Biosensots and Bioelectronic 6(1991), 595-607 se popisují planární monomodové nebo nízkomodové vlnovody, které jsou získány dvoustupňovým iontoměničovým postupem a ve kterých je kopulace světla do excitační vlny provedena hranoly. Použitým afinitním systémem je lidský imunoglobin G/fluoresceinem značený protein A, přičemž protilátka je imobilizována na vlnovodu.

fluoresceinen značený protein A, který má být stanoven, je ve fosfátovém pufru přidán do polyvinylalkoholového filmu, kterým se pokryje měřící oblast vlnovodu. Základní nedostatek tohoto způsobu spočívá v tom, že je možné dosáhnout pouze malých rozdílů v indexech lomů vlnovodivé vrstvy a podložko- 5 - . , vé vrstvy, což má za následek poměrně nízkou.citlivost sta‘ . I’ novení. Pro fluorescein-isothiókyanát/vázaný k proteinu A je • ;.uváděna citlivost' 20 nm. To''jé stále ještěnedostačující k tomu, aby mohla být. detekována stopová.· množství detekované látky a je tedy nezbytné'ještě další, zlepšení citliyosti.

' ·«* , Kromě toho se zde jeví jako obtížná reprodukovatelncst a ,S a praktická realizovatelnost.světla kopulovaného do .excitač. ní .vlny pomocí., hranolů vzhledem·.., ke značné; závislosti- -účinnosti

J-I, . ý ', ·,·.. .,'·· ♦ i ' * -» ·'’ ' uvedené kopulace ná velikosti a kvalitě oblasti styku mezi ’ i * · * - _t ^: ‘ (

J l - K hranolem a vlnovodem. > ¹ · . ^J : ' í . '·.

... ' Λ/ ⁴·:·' : . ' > · ·; , τ . ,.. ’»· .·

Použití mřížek pro detekci ·luminiscence,,· jak ’ je to, .' ^! · ' '^c · - -' * y nárokováno v rámci vynálezu, je popsáno.v patentovém dokumentu ··<· US-A:-5' 08 1 0.12. ’V tomto patentovém dokumentu·'se'popisují mřížkově .struktury pro kopulaci'excitačního- -světla'·do vlnovo' ' i* “ . .>*-· .í- .. * ,^v * du,; jakož i ’ reflekční mřížky/ které; umožňují,/že-exci_v · * ► ¹ ; ⁷ ' ¹ , _Λ tační vlna může procházet' .vlnovodem několikrát, tvácí se. zdě., ’ . že tímto.opatřením se dosáhne zlepšení citlivosti. .Objemová >luminiscence je „emitována jpód prostorovým úhlem. Kromě toho ^ř' ·' · ‘ ’· · ¹ , .r_r<i může«být .excitační radiace uvolněná vstupní kopulační mřížkou ^p_O“d vo-j-rm^pruchOdu^'Vlňndvddém^vyuz'iťa^jákdr^řéděTěňdn r š ignál-.

........ ..N.e.výhado.u..-tohoto—způsobu ujedšiIné^z-v-ýšení^intenž-i-t-y·.-radiačníhopozadí ^:zpús.'obené reflekční mřížkou a emitované .společně s- _t ... .,.· .luminiscenčním signálem pod-prostorovým.úhlem. Čharaktěristi;·^; . · ‘••y·^:!- i. '- ' “ . -¹'· - »„'· < 7 ’ ky nezbytných filtrů i v tomto případě opět-omezují citli-l.,.

s · ; ·. . 5 · . .í4.

^rvpst stanoveni. .

’ ^{4 n} J t ’ J ·

Cílem vynálezu je poskytnout způsob stanovení lu-y ’ I jj ''· ' ' ' . ··* j , miiuscence zá použití.planárního optického vlnovodu, který by i byl jednoduchý a ekonomicky realizovatelný a při kterém by -by-.

lo možné'používat malé objemy stanovovaných vzorků. Dalším cí-. lem,vynálezu je poskytnout miniatuřizovatelnou senzorovou bá-. zi na základe planárního optického vlnovodu, která by byla použitelná pro provádění výše uvedeného způsobu.

Podstata vynalezu ' ^{u J;}-----------· ~—-- ---- ----------.-----Výše uvedeného cíle je dosaženo způsobem stanovení luminiscence za použití- planární'dielektrické optické senzorové báze, která je tvořena transparentní podložkou (a), 'na kterou je nanesena tenká vlnovodivá vrstva (b), přičemž senzorová báze je opatřena kopulační mřížkou pro vstupní kopulaci excitačního světla a index lomu uvedené podložky (a) je nižší než index lomu vlnovodivé vrstvy (b), uvedením kapalného vzorku do styku s vlnovodivou vrstvou (b) ve formě vrchní vrstvy a měřením luminiscence,produkované látkami majícími luminiscenční vlastnosti a obsaženými ve vzorku nebo látkami

- L j ma jíčíinr^umin’rščeňčň'í^v'l'ašť'nó'š¹'ť'i'^-a'^_'imů’b'ili-zova-nými---na-^jv-l-íi©vo divé vrstvě (b), optoelektronicky kopulací excitačního světla kopulační mřížkou do planárního. vlnovodu, tak; aby toto excitační světlo prošlo vlnovodivou vrstvou, přičemž látky ma jící luminiscenční vlastnosti jsou excitovány k luminiscenci v ev.anescetním poli vlnovodivé vrstvy, jehož podstata spočívá v tom, že se použije vlnovodivá vrstva mající tloustku menší než vlnová délka lambda excitačního světla a tvořená materiálem, jehož index lomu při uvedené- vlnové délce excitač ního světla je vyšší nebo roven 1,8, přičemž se lumimscenčhi_r.ad.ia.cg.,zpětné kopulovaná do vlnovodivé vrstvy (b), dekopuluje z vlnovodivé vrstvy druhou kopulační mřížkou,prostoro^ vě odsazenou od uvedené prvně uvedené kopulační mřížky, a detekuje.

Výhodné aplikace způsobu podle vynálezu tvoří před mety patentových nároků 20 až 23. Senzorová báze a její výhodná provedení, která jsou obzvláště vhodná pro provádění, způsobu podle vynálezu,. jsou popsané v nárocích 24 až 38. Výhodné formy provedení způsobu podle vynálezu jsou popsané v nárocích 2 až 19. ¹

Při praktické realizaci vynálezu je excitační záření kopulováno do vlnovodu kopulační mřížkou a Šíří se vlno7 řT '4 vodivou vrstvou ve‘formě vedené vlny.’' Za účelem účinné evanescentní excitace lumin i-scence je možné dosáhnout vysoké' •••intenzity pole na povrchu- senzoru nebo v jeho blízkosti volbou .parametrů vlnové délky (index lomu, tlouštka vrstvy).

S překvapením bylo nyní zjištěno, že výše uvedeným dimenzováním vlnovodu se dosáhne’toho, že podstatná frakce ' luminiscenčního záření se evane.scént.ňě zpětně kopuluje do vlnovodu a je transportována vlnovodem společně s excitační r<f· vlnou.. Tato luminiscenční radiace může být potom i.dekopulová4·. ' ^J' +· . . , na z vlnovodu: druhou kopulční· mřížkou, která je prostorově

Odsazena' od orvní kopulační. mřížky, a zavedena do detekčního ' ' 1 ' Λ-, ' ' systému. Výhoda* této mřížkové detekční evariescentní lumin!scence oproti objemové detekci spočívá v tom, že-je zde možná miniaturizace^senzorové báze a detekčního systému Doužité- ' η 1 ’ ‘ f ho soolečně s·.touto bází.

* . ‘ ‘ ·- >·’.

-v .·

Dimenzování planárních vlnovodů pro'dosažení pokud možno, co nejuČinnějsí excitaci luminiscence může být provedeno. na bázi teorie Dlanárních vlnovodů. V této 'souvislosti ^: * . - - ' r

-musíťbý tv-slad o vény “ná-sie du j-ícípr oz měr y^f ktfsz-^-Prrncipl· és“

..andps.anšlvi.ties ..ot-integ.rated^o.p.t.ica.l..,and».s.urfac.e,.plasm'on _v sensors'for direct affinity, sensins and' immunqSensing, Biosénsors and Šioelěctronics 6, 2 15-255 (Γ99 1), D.G.Halí’, ' Opti·,< · „ . ^: Λ , ’ ’ '' cal waveguide diffraction gratiňgš: coupling between guided moďéš”, v Progešs in Optics XXIX, nakl.E~.Wolf, Elséviér, New York (1991): . ’ ' , Penetrační. hloubka evanescentního pole planárního vlnovodu do vrchní vrstvy je, vyjádřena rovnicí •z#

2π

Z*-· . lUpíl· pro účinný modální index lomu , index lomu vrchní vrstvy ·< ' b 0

......- ------- - n_u- θ---a—pro-pracovní uvlnovou-.délku....lambdá. .Ve výše. uvedené

-rovnicí ⁷ vertikální koordináty k povrchu vlnovodu, zatímco x znamená koordináty k šíření světla ve vlnovodu. 3era-ii se v úvahu standardizační faktor f pro intenzitu, elektrického pole na povrchu vlnovodu kde n-·, znamená index lomu vlnovodu a n„ . znamená index lorilm sud mu podložky, potom se získá intenzitní křivka evanescent------ τΐ'ίΗ·ο··ρο1β·-νγ5·β-uvedeného - v-lňo-v-ódu-,^·která--je-úměrná.:.... ________f.____ !=-/·£

Tato intenzitní křivka excitačních evanescetních polí verikálních k povrchu vlnovodu představuje rozhodující činitel pro demenzo.vání tlouštky vrstvy a indexu .lomu. vlnovodu. U analytických zařízení pro detekci luminiscenčních molekul v blízkosti vlnovoaivé vrstvy je nezbytné při dimenzování vlnovodu vzít v úváhu-ú/ždáTě^ošt-moTekuúy^od^povrchú^vluibvbdůF^

Pro-detekci luminiscence bylo nyní zjištěno, že evanescentní 2pětná kopulace luminiscence' je účinným procesem pro tenké planární vlnovody s vysokým indexem lomu. Volba tlouštky vrstvy a indexu lomu má vliv jak na excitační účinnost, tak i na zpětnou evanescentní kopulaci. V posledně uvedeném případu zde existuje konkureční efekt mezi vstupní kopulací radiačních frakcí molekul vázaných v blízkosti povrchu vlnovodu a vstupní kopulací nevázaných molekul z objemu vzorku. '

Bylo zjištěno, že pro účinnou detekci molekul majících ' lumin, scenční vlastnosti a nacházejících se v blízkosti, povrchu vlnovodu při způsobu podle vynálezu -musí být parametryvlnovoduv následujících rozmezích:

index lomu vyšší nebo;rovný 1 ,8 pro-.excitační vlnovou délku lambda, .tlouštka vrstvy·t-.. menší nebo-rovna excitační ~ rlim .

. vlnové, délce. lambda, výhodně menší .nebo .rovna, hodnotě lambda/2. , ; . Obzvláště výhodné provedení způsobů,.podle, vynálezu

..spočívá v-tom,. že tlouštka'vrstvy je zvolena z rozmezí óď 40· do- 160 nm· a. současně hloubková ‘modulace.,mřížek, leží 'v rozmezí 'od· 3 do 60 nm„ ořičemž poměr'hloubkové'modulace k'tlóuštce^: í vrstvy. je menší než ,0,5.' ' ř-‘ , f y f r . ’ 2 ' . >' ‘f. ' , . . ' · ' · , _v ‘ .

\ Takové vlnovody mohou být rovněž charakterizovány, tím, že umožňuj,v pouze, šíření' vlnovodových.'.modů nižšího' řádu, , ' V, ' '

F .· - ¹¹ - i ^- ' · · kdy'počet modů m je nižší .'nebo rovný 3. ‘ ' ' ·. · ' ' .: * u' fí? .

* . .. ... ........

, * áÝví ;·&

.......;.......... ’ η;⁷.......’Sum±rťr.a'cehce7^k'terá^je'^V'ďh'erg'č''éht'n^,ě^ž''p'e^,'ehěť'kpⁱŽy)il'g^ižL^ r ' ^:>^r i- ’ ' ^Λ ’_s ·^Μ ’ „ „...vána^do, .vlnovodu..,..^e,tímto... vlnavadenutransportována ...... Pro . ' ·. ' , · ··,-··.» ·· ’ · > tento-transport'zde platí útlumový součinitel F,vedené vlny, ' ^r. i ¹ . ^J *· #'

Při nízkém .Stůkešově posúnu· niohóu být;přědpóklány stejné ,.· .‘Útlumové' hodnoty jak pro excitační, tak i ,pro .lumini scenční záření “(možnými příčinami útlumu ve vlnovodu . jsou rozptylové; ; ztráný na rozhraní vlnovodu s okolním'prostředím, jakož i . absorpce ve vlnovodivé vrstvě nebo'v podložce nebo vrchní _k., vrstvě, ,V případě, žé nejde o vysloveně úzké absorpční„pásy,' potom lze očekávat pro rozptyl a absorpci nevýznamnou změnu .'v-útlumu zbůsobenou Š.tokesoyým posunem, která typicky činí ₍ „ ' ·'' 't , „ ', ^ή|: „ az 50 nm. Takovým spektrálně úzkopásmovým absorpčním účin-.

kům lze zabránit vhodnou volbou materiálu, ze kterého bude zhotovena senzorová báze).,

Uvedená luminiscenční radiace transportovaná vlnovo-j.

dem-musí být-potom-dekopul-ována^-z-^vlnovodu -a- zavedena- -do-----dotokčniho systému. Výstupní kopulace v koncové rovině vlno· vodu ne<í vhodná. Taková kopulace jednak vyžaduje vysokou kvalitu okrajů vlnovodu a v některých případech i uvedení do styku okrajů vlnovodu s optickými detekčními prostředky pomocí zalití kapalným nebo gelovým médiem, a jednak zabraňuje integraci senzorových prvků s komůrkou pro kapalné vzorky.

Použití druhé kopulační mřížky, která je prostorově odsazena od kopulační mřížky pro vstupní kopulaci-excitačního záření, pro dekopulaci luminiscenčního záření z vlnovodu zcéTa“erimi;n'uj'ě^výšěⁱ'uvéďehěpotí’žě“p'řa'm'eri'íci-'’z^_1děkopulacě v koncové rovině vlnovodu. Další výhoda spočívá v tom, že vzdálenost obou uvedených kopulační.ch mřížek A ve směru· x (tj. ve směru vedené vlny) může být zvolena volně. Takto je zde poskytnuta možnost optimálního nastavení vzdálenosti A pro útlum každé vlnové délky a to aniž by bylo nezbytné měnit vnější rozměry senzoru, a. uvedené, komůrky. Kromě toho je také výhodou to, že vnějšístrany senzoro.véhoprvku nemusí /splňovat, žádné, požadavky optické,, kvality, takže; je jich konfigurace·? může být přizpůsobena kapalinové komůrce a zejména konfiguraci použitého těsnění.

_ř Bylo zjištěno že optimální vzdálenost mezi mřížkami B je rovna B = ^s možností variace v rozmezí B = (0.2 - 3) x_I/t (χ^/θ: 1/e délka pro pokles intenzity vedené excitační vlny ve směru x).

(Konverze . Γ[dB/cm] -> x_ve [1/mm]: χ,_Λ=100/(Ιπ10Τ)).

Při.větších vzdálenostech jsou jak excitační světlo, tak i vedené luminiscenční světlo silně zeslabeny, což vede k silné redukci signálu. Omezení ve směru pod uvedené optimální rozmezí se neprojevuje ve zhoršené kvalitě excitační a zpětněvazebné kopulace , nýbrž v rostoucích problémech spojených s polohování obou kopulačních mřížek. Vzdálenost obou mřížek

- 11,menší než 10 mikrometrů zde není vhodná a to také vzhledem k dimenzování šířky vstupní kopulační mřížky, které bude popsáno dále,-a-k průměru· světelného parsku excitačního zářen·! na. straně vstupní kopulační mřížky.

, V následující části popisu bude vynález detailněji •popsán pomocí připojených výkresů.

Stručný popis obrázků

Na připojených výkresech

- obr.l Znázorňuje Schematický bokorýsný pohled ' na bázi¹ optického senzoru, který je obzvláště vhodný pro provádění způsobu podle vynálezu s možnou . radiační křivkou * -í ' ‘ a ' ’ ’ obr.2 znázorňuje půdorysný pohled na senzorovou bází z obrúl'. ' / ,, _TH. Podle...obr... V. je..senzorová, báže-^1. -je-tvořena-kopulační mřížkou 2 pro kopulaci¹ excitačního záření,, kopulační mříž’kou 3 pro dekopuláci'luminiscence, vlnovodivou · vrstvou ,4. a. podložkou 5. *' .. .

Na obr.1.je zobrazena možná dráha paprsků excitačního a luminiscenčního záření, které jsou vstupně kopulovány do senzorové báze a výstupně dekopulovány z této senzorové' báze. Kopulační mřížkou 2 je v úrovni senzoru excitována ' , vedená vlna se směrem ,£<Xení x v případě, kdy je splněna rezonanční podmínka vzhledem ke komponentám x vlnových vektorů:

ti =

k.j. = k . ±m*k~=k ±m*^^K/ «Λ o «rt — kde m znamená celé číslo a k^ znamená reciproční mřížkový vektor ^: vlnový vektor-vedená vlna s účinným modálním indexem lomu N_n,_P.

ef f

Na obr.l je zobrazen negativní úhel pro vstupní kopulaci $ s ’cos$ (kde k je řád vlnového vektoru v rovině výkresu), takže vedená vlna probíhá v opačném směru k excitaci (tak zvaná zpětná kopulace). Pro dekopulaci excitační vlny (s k . ) a luminiscenčního záření (s k _t) ^J OUt OQl jsou zvoleny pozitivní úhly.

Takovou vstupní a výstupní kopulační konfigurací s jednoznačně odlišnými směry pro dopadající světlo a pro. světlo, které je dekopulováno z vlnovodu.se dosáhne vysoké míry volnosti pozadí. Prostorová separace různých radiačních frakcí zajištuje optimální poměr signál-šum při'detekci luminiscence: excitační záření, které je dekopulováno. z vlnovodu, a luminiscenční záření nejsou vedeny po společné dráze, takže filtry (prahové.nebo pásmové filtry nejsou na obr.l zobrazeny) jsou použity pouze pro potlačení rozptýleného světla, avšak nikoliv pro veškerou intenzitu excitačního záření, které je dekopulováno .z vlnovodu.

Další výhoda použití výstupní kopulační mřížky spo______—ě-í-vá—v—tem-.—ž-e—rú-zné—s-pektr-álni—komponen.t.y_lnmin.í.s.c.enčního__

2áření jsou dekopulovány v různých směrech. Pomocí vynálezu je proto možné detekovat rovněž molekuly ve slabě luminiscenčních testovaných prostředích a to dokonce bez dodatečných filtrů v případě, že luminiscence molekul, které mají být detekovány a luminiscence prostředí vzorku jsou spektrálně odlišné.

.Nastavení uhlů pro vstupní a výstupní kopulaci je možné provést volbou mřížkových konstant Aj aA^· Pro výhodné provedení zobrazené na obr.1 se směrovou separací vstupní a výstupní kopulace musí být uvedené mřížkové konstanty zvoleny výrazně odlišně.

-η

Alternativně mohou být zvoleny stejné mřížkové konstanty pro kopulační mřížku 2_ a pro kopulační mřížku _3 a- to za’účelem zjednodušení výroby senzoru. To může být důležité pro pokud možno co nejhospodárnější výrobu senzoru, poněvadž při použití holografické tvorby struktury produkovaných mřížek lze vypustit určitý počet produkčních stupňů.

V případě použití stejných mřížkových konstant je ještě více zajištěna prostorová .separace směru dekopulovaného excitačního záření a luminiscenčního záření. Pouze v případě, kdy není zajištěna separace reflektovaného vstupně-kopulovaného záření, jsou nezbytné dodatečné prvky pro reflekční plošnou detekci, například clony a světelné propusti.

Kopulační úhly mohou být výhodně nastaveny volbcu mřížkových konstant v rozmezí od |d’=i^a do 50° (pro velikcs.t úhlu) . Neměly by být použity nižší hodnoty _; kvůli, Braggovu .y odrazu, nebot.jinak k tomuto odrazu dojde dokonce .i při nízkých tolerancích nastavení senzoru ve spojení s neexistencí vstupní nebo výstupní kopulace. Rovněž jsou možné i vě/ší úhly až do skoro 90°. Avšak neměly by být použity úhly hodně přesahují-cí^p-rav-ý-iúhe-P-a—feo-z-a^účel-em—rea-l-i-z-ace^dOb-ře^de-f-i-nova-né-d-rá·—<— hy záření. _

Dimenzování mřížkové hloubky může být provedeno v souladu-s dosavadním stavem techniky (T.Tamir, S.T. Peng. Analysis and Design ’of grating Cčuplers, Appl.Phyš. 1 4,. 235-254 (1979), T.Tamir, Beam and waveguide couplers in integrated Optics, nakl. T.Tamir, Springer, Berlín (1979). Jako charakteristický znak je zde použit tak„zvaný rozptylový parametr alfa: alfa popisuje 1/e-pokles intenzity vedené vlny ve vlnovodu, jehož rozmezí je opatřeno kopulační mřížkou hloubky Hodnota.1/alfa je tudíž charakteristickou délkou pro přenos radiační energie z vedené vlny do vlny, která se šíří volně, a naopak.

Pro volbu hloubky vstupní kopulační mřížky není nejdů-l-ežitě jší -absolutní hodnota- rozptylového parametru, nvhr? nAMt-Avpní rozptylového parametru a radiačního parametru dopadajícího světla (průmě/ta divergence paprsku).

Za účelem dosažení optimální vstupní kopulace lafetového paprsku s Gaussovým profilem (Gaussův parametr w ) přes prostorově limitovanou mřížku je nezbytné sledovat následující podmínky pro rozptylové parametry, průměr pap/tsku a polohování paprsku vzhledem k okraji mřížky:

.. a*w₀= '1.36 * 0.733.

------------------Hodnota^-χ·—popi-suje -posun - středu—světelné- ‘skvrny-vzhledem·-k-------------poloze okraje mřížky. Tento posun musí probíhat mimo okraj strukturované oblasti. Sledováním- této .podmínky je. možné, dosáhnout vstupních účinností dokonce vyšších než 80 %.

Analogické sledování výstupní kopulace má za následek dosažení velmi vysoké kopulační účinnosti rovné 80 % nebo hodnotám ještě vyšším. Vychází se z toho, že later.ální. expanze mřížky ve směru x je- výrazně-vyšší . než rozptylový-parametr. Intenzitní profil volně se šířícího světelného paprsku, který byl dekopulován z vlnovodu je však asymetrický mezi jiným vzhledem k útlumu vedené víny procházející mřížkou.

Při nastavování rozptylového parametru pro vstupní kopulaci musí být sledovány následující aspekty:

polohování světelné skvrny vzhledem k okraji mřížky a miniaturizace senzorového prvku.

I když malé rozptylové parametry (alfa je značně menší než 1/mm) a odpovídající velké průměry paprsku (w je znatše větší než 1 mm) usnadňují polohování, je možnost miniaturizace senzoru značně omezena v případě šířek mřížky, které jsou podstatně větší než A = 3 mm. Mřížková šířka by měla být

A>3'w, k dosažení úplné kopulace. Kromě toho mají na kopulační účinnost negativní účinek nehomogenity mřížky a- vlnovodu. Zatímco vysoké rozptylové-parametry (alfa je vyšší než 10/mm) oři průměrech paprsků w_q menší-než. 10 mikrometrů umožňují velmi malé rozměry mřížek, umožňují tyto vysoké rozptylevé’parametry také přesnost polohováníznačně nižší než 100 mikrometrů. Kromě toho je kopulační účinnost v tomto případě limitována mezi jiným skutečností,„...že divergence- oaprsku.je značně větší než úhlové rozmezí kopulační rezonance.

, I, dS_

Bylo z jištěno,, že rozmezí rozptylových parametru alfa .= (0/2 až 5)/1 mm představuje dobrý kompromis mezi adjustážními požadavky, polohovacími tolerancemi a miniaturizací. Pro' y.ýše. popsanou tlouštku vlnovodivé vrstvy odpovídá typicky tomuto rozmezí rozmezí -t =3 až 60 nm, ze jména·- 3 — 40 nm,· pro mřížkovou- hloubku v případě použití sinuové modulace na rdimezí podložka vlnovod. Poněvadž rozptylový parametr je výrazně závislý na profilové -formě mřížky, je pro funkci senzoru důležitým,, ukazatelem nikoliv geometrická hloubka, nýbržrozptylový, ..parametr. .

...../,Ppdložka^s.en.z.oro.vé\..bá-ze^mus.í..být..transparentní·· pro-*excitační a emisní vlnovou délku. Tato podložka může být také vytvořena z plastické hmoty., jak je to popsáno například v patentovém dokumentu EP-A-0533Q74. - Podložka může být rovněž tvořena kompozitním systémem různých materiálů, například systémem vrstev na nosné destičce a podobně. V tomto případě je pouze nutné, aby index lomu materiálu, který je přímo přilehlý k vlnovodu,byl menší než'index lomu vlnovodivé vrstvy.

Hospodárná .'výroba senzorové baze je možná zejména, v případě, kdy mohou být jako podložka pro vlnovodivý povlak použity.mikrostrukturované polymery. V tomto-případě může být citlivost detekce omezena excitací podložce-vlastní lumi- 16 -----------.,-----nýscence-. -K-excitaci-této—vlastní-lumin.i.scenc.e_ai k.. .její.________

-;-svanaspantní zpětné kopulaci dochází na rozhraní materiálů vlnovodu a podložky mechanismem, který je analogicky š výše popsaným mechanismem uvedených jevů na rozhraní mezi vlnovodem a vrchní vrstvou; Tato podložková luminiscence může být eliminována použitím neluminiscenční mezivrstvy s nízkým indexem lomu (tj. s indexem lomu nižším nebo stejným s indexem lomu vlnovodu), která se na podložku nanese ještě před ovrstvením podložky vlnovodivým povlakem. Obzvláště vhodným materiálem této mezivrstvy je oxid křemičitý nebo je tento materiál v podstatě tvořen materiálem'na' bázi oxidu křemičité' ho majícím složení SiO H C , do kterého mohou být dodatečX Z ^v to mezivrstvy by mela být zvolena tak, aby došlo k lokalizaci energie transportovaná evanescentnírrv .polem vedené-vlny na podložkové straně do uvedené mezivrstvy. Tato podmínka je prakticky splněna v případě, kdy ^_οα££_β1- j^e větší než šestinásobek hodnoty penetrační hloubky z_eva evanescentního pole. Pětinásobná hodnota je vhodná pro dosažení optimálního poměru signál-šum pro detekci evanescentně excitované luminiscence. . Tato podmínka, je bezpečně splněna pro menŠí.=,nebo rovnou 2000 nm. '

Daíší “vy Hod o u p o u žTťínměTTvřšl: vý^—muž e^_b'ý t^_ -r o v něž“ ^_ snížení povrchové hrubosti (drsnosti) podložky. Tím se sníží útlum vlnovodu F, což má pozitivní vliv na poměr signál-šum při detekci evanescentně excitované luminiscence.

Pro excitaci luminiscence je vhodné pouze v podstatě paralelní světlo; V rámci tohoto vynálezu je třeba pod pojmem v podstatě paralelní rozumětdivergenci menší než 5°. To znamená, že použité světlo může být mírně divergentní nebo mírně konvergentní. Vetší divergence zjednodušuje nastavení vstupního kopulačního úhlu, avšak snižuje luminiscenční signály, poněvadž šířka vstupní kopulační rezonance je potom značně menší než úhel divergence a takto je pro excitaci luminiscence dostupná pouze malá frakce dopadající energie. '

V rámci'tohoto vynálezu výraz planární dielektřická optická senzorová báze znamená, ze uvedená báze má formu pásu, destičky, kruhového disku nebo má libovolnou jinou geometrickou formu za předpokladu, že může být při pozorování pouhým okem považována za planární. Odchylky od takového plenárního provedení nemají rozhodující, význam.v případě, že vedená.vlna je schopna šíření .ve vlnovcdivé vrstvě a že může .být,realizováno vstupní a výstupní kopulační schéma, které je analogické se schématem podle obr.'1-, Zvolená geometrická forma.může být diktována konstrukcí celénó-zařízení,.. do kterého je senzorová báze zabudována. Výhodnými provedeními, jsou ta provedení,, která umožňují podstatnou miniaturizaci. ₍ , ' 4 v; 1;-··«,.

·· ^Λ

Kromě výše popsaného použití organických mikrostrukturováných.podložek je rovněž možné použít anorganické;poďloš.ky, které- jsou..například tvořeny sklem nebo křemenem. Takové podložky mají oproti polymerním podložkám výhodu v tom, že,.

i- ' . ' mají-nizkou vlastní luminiscenci. Pro. hospodárnou-výrobu Sen-zorov-ýc-h-^bá-z-í—je-^vš-a-k—vhodnéxopatřit~tyť'o^pód±ó'ž'ký^povTa'k‘ém'^iiL^~ .s„ nízkým^ indexsm.^lomu, -...do. kterého,.„..j.el₁zabudována--mřížková struktura.pro kopulační mřížky, jak je to' popsáno v patentovém'dokumentu EP-A-053'30074'. '

Kromě„toho mohou být kopulační mřížky/umístěny na rozmezí vlnovodu a vrchní vrstvy. ·

I · a , u . Způsoby výroby, takových mřížek jsou známé. Pro výro^{ř -!fc} ' ’ bu .mřížek jsou takto používány převážně^fotdlitografické nebo holografické metody á leptací techniky, které..jsou mimo . ' . . / , * jiné popsány v Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors V. Proč.SPIE, sv. 2063, 1 -1 3, 1 994..

' > Mřížková struktura'muže být realizována na podlož---če a- potom převedena na vlnovodivou vrstvu, ve které se potom_;

---------------mřížková - struktura -.zobrazí. .ne.b.o... se. mřížka . produkuje přímo

V samotné vlnovodivé vrstvě.'

Mřížková perioda může být 200 až 1000 nm, přičemž mřížka má výhodně pouze jedinou periodicitu, což znamená, že je monodifrakční.

V rámci tohoto vynálezu se pod pojmem.vzorek rozumí celý roztok, který má být testován a který může obsahovat látku, která má být detekována, tj. analyt. Tato detekce' může být provedena jednostupňovým nebo vícestupňovým stanovením, v průběhu kterého se povrch senzorové báze uvede do

--------styku- -s- jjed-h-ím- -nebo —v-í če -r-oz-toky··. - AIespon-..j.eden ..z·.. použ itý.ch______ roztoků může obsahovat látku mající která-může být detekována. při... orakí luminiscenční vlastnosti, ckém. provádění tohoto vynálezu .

V případe, že látka mající luminiscenční .vlastnosti je již adsorbována na vlnovodivé vrstvě (b), potom může být vzorek prost luminiscenčních složek. Vzorek může obsahovat další složky, typicky pufr.y pK, soli, kyseliny, báze, povrchově aktivní látky, modifikátory viskozitv nebo barvivá.

Jako rozpouštědlo může být ze jímána použit fyziologický roztok.

'JěsYrižě^-jě~samotná^-I'um'irii'scen'č'n'í's'lOŽka' 'Iča^ITňoir^pdTfoin^-s^re^T---------lze Obejít bez přidání rozpouštědla. V tomto případě může vzorek obsahovat až 100 % složky mající limin ί-scenční vlastnosti .

Vzorek může dále obsahovat biologické prostředí, například vaječný žloutek, tělesnou tekulinu nebo její složku, zejména krev, sérum,· plasmu nebo moč. Dále může být vzorek tvořen povrchovou vodou, roztoky nebo extrakty přírodních nebo syntetických prostředí, jakými jsou půda nebo části rostlin a bioprocesní nebo syntézní břeČky.

Vzorek může být bud neředěn nebo v něm může být po- 19 užito dodatečné rozpouštědlo. ' ·,· ’ . _ .

‘V *'......''Vhodnýmirozpouštědly jsou’ voda; 'vodné ''pufřyá roztoky proteinů v organických: rozpouštědlech·. Vhodnými organickými·, rozpouštědly jsou alkoholy, ketony, estery a alifatické· ¹uhlovodíky; Výhodně se používá voda, vodné pufry.neho směs vody a s vodou mísitelného organického rozpouštědla/' . *' , _ ; ··. }; .... _ _r?c ..... ’ _ ¹ .... /...... . ' .· v ^,r : ''.*!· - ⁴ ' i ' ' L ' Vzorek však může rovněž obsahovat složky, které

.. / J ' , ' ^{1 1} ; ' „ _w jsou nerozpustné v rozpouštědle, riapříklad částice pigmentů, • . * . dispergační’ činidla,, přírodní a syntetické oligómery .nebo po•' · ·' ' '-' '¹ „ , · * ” * ·./'* ' - - ·.' . lymeřy. V; tomto’případě .má:„vzorek formu opticky kalné'disper(Λ . J . ·, ,,·· ' ' '· £ . , , ' i,. k.

ze nebo. emulze... ¹ _Λ .

¹ -’ ,rt , t / ·« > · : * .I ‘ / , * . 4

... · .Vhodnými-luminiscenčními sloučeninami jsou lumlbis* cenění barvivá vykazující , luminiscenci v rozmezí. .vlnó.vých <dé/ ’ ' /'lekod 330 nm.do 1000.-nm a zahrnu jící¹' typicky • rhódaminy,, ' t \ ' ' · ’ t 'V^{- ,j} ; -i * deriváty i flúpres.ceirtu·, .kumarinové deriváty, distyrylbifenyly,

- · /» * *·.ϊ ’ ''' ·.· ’deriváty: štilbenu, ^:£talocyaninv, naftalocyaniny,, p.olypyridyl¹ .. . . ···: '.

'i · rutheniové komplexy, jakými' jsbu tris {.2.,2/ -bipyridyUruthe' ·**’ nřumchřoř-rdTvtřί·'5ί’1ΤΐΟ“ί''έη^η;έΗ’Γ·όΉη)'Υ'ύΡΚ^ύΥύθΐθΈΐνί;47/ΐ'ΓΏ5 7 ’

-.-.-.(-4-,7-di.fenylrJ> j 0--fenanthrólin.).ř-u.theniůmchlor-id«a^ polypyrid-y-L-—.. fenazin-rutheniové komplexy, komplexy „platiny a'porfýrinu, ^:jako > · · ·· ' ' ·.·.* ·.£ '1 ₍ oktaethýl-platina-porfyřin,' dlouhodobé-·komplexy euřopiá á

Λ . . V ¹ ' ' * . ? J?

terbia.;,riebo..cyaňinová. barviva...Pro áhalýzu krve- nebo krevní- ’ X _ · ’ * X -- L ' — 2 ^;l XJ_ **** ‘ho séra, jsou obzvláště vhodnými-barvivý barviva vykazující absorpční a emisní vlnové délky v rozmezí 600 až 9Ó0^řnm.

. . ' · ϊ·. ’ i ; · '- ··' .·.-’ \ , . ' **! '' ’ . v . λ Obzvláště vhodnými lumiru scenčními sloučeninami, ' ‘ ^T ' .í- .

jsou barviva jako fluoresceinové deriváty obsahující funkční skupiny, které mohou být .koválentně vázány, například .

fluorescein-isokyanát.

Rovněž velmi vhodná, jsou fluorescenční barviva, která jsou dostupná u firmy Biological Detection Systems lne.,·' například mono- a bif.unkční barviva Cy5,5 , která jsou mezi w ' . -rwA hn— - Ή 1“·-- -**f— -ari- ·· - át“ J^ila · ι· ιΆ · -Η- 4β-·Μ '^ΙΜΜίή''·!Ι>ι #-H- w -+ w <ii^h -*«h· n* --hv * ·ι»Λ WÉ.friW *fí- r·. ·· - 20 “jiným-popsána—v-G-l-i-n-i-ca-l--Ghem-i-stry -40--(-9)-1-8-1-9^18 22,1-9-94—

Výhodnou luminiscencí je fluořescence. Pro excitaci je výhodné použít koherentní světlo, poněvadž takto může být splněna s vysokou účinností rezonanční podmínka ve vstupní kopulační mřížce. Laserové světelné zdroje použité v rámci vynálezu budou potom zvoleny podle.absorpční vlnové délky luminiscenčních nebo fluorescentních molekul. Obzvláštní význam mají v této souvislosti laserové diody nebo superiumin!-scenční diody, poněvadž takové světelné zdroje umožňují vysokou miniaturizaci detekčního systému .přiřazeného k senzorové bázi.

Luminiscenční barviva přicházející v úvahu pro použití v rámci vynálezu mohou být chemicky vázaná k polymerům nebo k jednomu z vazebných partnerů biochemických afinitních systémů, jakými jsou například protilátky nebo fragmenty protilátek, antigeny, proteiny, peptidy, receptory nebo jejich ligandy, hormony nebo hormonové receptory, oligonuklsotidy, řetězce DNA a řetězce DNK,' RNK nebo RNK analoga, vazebné proteiny, jako protein A a G, avidin nebo biotin, enzymy, enzymové kofaktory nebo inhibitory, lektinv .nebo _uhlohydráty. Posledně uvedené kovalentní luminiscenční značení představuje výhodné provedení pro Teverši'oflhi’hebo ireversibilní (bi.o)chemická afinitní stanovení. Dále je' možné použít luminiscenčně značené steroidy, lipidy a chelátory. Rovněž zajímavá jsou interkalační luminiscenční barviva pro hybridizační stanovení za použití řetězců DNK nebo oligonukleotidů, zejména v případě, kdy tato barviva, podobně jako různé rutheniové komplexy/ vykazují zlepšenou luminiscenci v .·. rámci interkalace. V případě, že se tyto luminiscenčně značené sloučeniny uvedou do styku s jejich afinitními partnery imobilizovanými na povrchu senzorové báze, potom může být vazba.stanovena kvantitativně ze změřené intenzity luminiscence. Analyt může být také kvantitativně stanoven změřením změny v luminiscenci v případě, kdy vzorek vstoupí v inter21 akci s luminofory, například ve formě luminiscenčního zhášení kyslíkem nebo luminiscenčního zesílení konformačními modifikacemi proteinů.

• *

Vhodnými materiály pro vytvoření vlnovodive vrstvy jsou.typicky anorganické látky, výhodně anorganické oxidy kovů, jako TiO₂, ZnO,'Nb₂O<-, Ta₂O₅, HfO₂ nebo ZrO₂,.·,·· ·τ* ·

Výhodnými anorganickými oxidy jsou Ta₂OV- rámci ..způsobu podle vynálezu může být uveden vzorek do styku s vlnovodivou vrstvou v imobilním¹stavu nebo může být okolo vlnovodive vrstvy kontinuálně veden , přičemž'může být použit otevřený'nebo uzavřený cyklus.

Specifické provedení způsobu podlé,vynálezu, spočí-’vá. v tom, že se látky mající luminiscenční vlastnosti a urče·-* . ..né pro stanovení analytu··. imobilizují přímo na povrchu vlnovodivé vrstvy (b). Touto látkou mající luminiscenční vlastnosti.

může být například luminofor, který je vázán k proteinu .a ,ktsu*—,rý—mů-ž- e t o*-zp ůs ob em^ ě xéiťov*ářfza’ v žni' ku ϊώηχηΠi scence » n_a/p_ovrchu.^vlno.v.odivé .vrstvy případě, že je okolo-této'·· vrstvy veden partner, který má afinitu-k uvedenému proteinu/ potom může dojít k modifikaci luminiscence' a množství uvedeil· . ^s ného partnera může být tímto způsobem stanoveno na základě míry modifikace luminiscence. Zejména mohou být'luminofory značeni oba' partneři afinitního komplexu tak, aby bylo možné provést stanovení koncentrací z přenosu energie _:mez.i, oběma., partnery, například ve formě luminiscenčního zhášení.

Další výhodné provedení způsobu provádění chemických nebo biochemických afinitních stanovení spočívá v tom, že se na povrchu senzorové báze imubilizuje specifický vazebný partner, jakým je chemická nebo biochemická detekční látka pro.. samotný-analyt nebo pro jednoho z vazebných partnerů.

. Tímto stanovením může být jednoštupňové nebo vícestupňové stanoveníV průběhu kterého -se- v- následných-s-tupn-í-eh-uvádí--dt¹ styku s povrchem ? o morové báze n^hn vír·** πρ? jpHpn roztok obsahující vazebného partnera pro detekční látky zmobilizované na povrchu senzorové báze, přičemž k vazbě analytu dochází v některém z parciálních stupňů. Detekce analytu se provádí vazebnými luminiscenčně značenými účastníky afinitního stanovení. Uvedenými luminiscenčně značenými látkami mohou být jeden nebo více než jeden vazebný partner afinitního testu nebo analog analytu opatřený luminofořem. Jediným kritériem přitom je to, že přítomnost analytu vede k luminiscenčnímu signálu nebo ke změně luminiscenčního signálu, přičemž tento luminiscenční signál nebo tato změna luminiscenčního ' sigňálu' 'j sou selékťivhí'^-pro 'daný analytv ............— - -¹ Imobilizace detekčních látek muže být typicky provedena hydrofobní absorpcí nebo kovalentní vazbou přímo na vlnovodivou vrstvu nebo až po úpravě jejího povrchu, například silanizací nebo nanesením polymerní vrstvy. Kromě toho muže být přímo na vlnovodivou vrstvu nansena tenká mezivrstva, například tvořená oxidem křemičitým, která plní funkci vrstvy podporující adhezi a která usnadňuje imobilizaci. detekčních látek přímo na vlnovodu. Tlouštka této mezivrstvy by neměla přesahovat 50 nm, výhodně 20 nm.

Vhodnými detekčními látkami jsou typicky protilátky pro antigeny, vazebné proteiny, jakými jsou protein A a B pro imunoglobulin, receptory pro ligandy, oligonukleotidv a řetězce RNK a DNK pro jejich komplementární řetězce, avidin pro biotin, enzymy pro enzymové substráty, enzymové kofaktory nebo inhibitory, lectiny pro uhlohydráty. To, který z vazebných partnerů se při afinitním stanovení imobilizuje na povrch senzorové báze, bude záviset na zkušenosti.odborníka, který stanovení provádí.

Samotné stanovení může být jednostupňovým komplexujícím procesem, který má formu konkurenčního testu, nebo také vícestupňovým procesem, který má formu například sendvičového testu.

V nejjednodušším případe konkurenčního' testu se vzorek, který obsahuje analyt neznámé koncentrace-a známé množství sloučeniny, která je stejná jako analyt. s výjimkou luminiscenčního značení, uvede do -styku s povrchem senzorové platformy,kde si lumin i sdenčně. .značené' molekuly a neznačené molekuly vzájemně konkurují při. obsazování vazebných míst na ¹ '* ’ jejich detekčních látkách, které jsou zde zmobilizovány'.. Ma* .· ... , J . . , ximální luminiscenční signál se při této konfiguraci testu získá v případě, kdy vzorek neobsahuje žádný analyt. S rosr ₍toucí koncentrací látky, která-má být detekována, ve vzorku dochází ke zmenšování luminiscenčního signálu.¹

Při konkurenčním_ximunologickém stanovení to. nemusí ·' _w . .i· . 'r nezbytně být protilátka, která -je zmobilizována. Na povrchu ·* ·' 4 senzorové báze může být jako detekční látka zmobilizován také antigen.. Obvykle je nepodstatné, který z obou partnerů je při chemickém nebo biochemickém- testu zmobilizován na povrchu

-s e n-z- g-r-o-vé Hjáze-r^T o·“ je-pod š tatnoů^výhodo u sta hověn z' ža lo zených na , lumin.: s c.en.c,L oproti metodám,.-jakými* jsou- povrchová· plasmonová rezonanční'metoda nebo interferometrie, které jsou založeny na změně adsorbované hmoty v evanešentním poli'vlnovodivé vrstvy. . . _t

Kromě toho v případě konkuréčních stanovení nemusí být omezena na konkurenci látek při obsazování vazebných, míst na povrchu - senzorové báze.. Tak například na povrchu senzorové báze může být zmobilizováno známé množství antigenu a tento povrch může být potom uveden do styku-se vzorkem, který obsahuje neznámé množství určené ke stanovení stejného antigenu jako analyt a luminiscenčně značené protilátky.- V tomto případě dochází mezi antigeny, které jsou zmobilizovány na /povrchu senzorové báze a které jsou přítomné v,roztoků,' fcě vzájemné konkurenci při vázání protilátek.,.

—....... ........... -Ne j jednodušš-í-m-pří-padem vícestupňového testuje

--sendvičový imunologický testi—při kterém ao nejdříve protilátka imobilizuje na povrchu senzorové báze. Vázání antigenu, který ma být stanoven a luminiscenčně značené sekundární protilátky použité pro provedení stanovení ke druhému epi,tepu antigenu může být provedeno buč postupným uvedením do styku s roztokem obsahujícím antigen a druhým roztokem obsahujícím luminiscenčně značenou protilátku nebo předběžným slou cením obou těchto roztoků tak, aby se nakonec dosáhlo vázání parciálního komplexu tvořeného antigenem a luminiscenčně značenou protilátkou.

Afinitrii'stánůvehí'’mohou’tákě''žáhrnbvatdalší ‘dodá⁷¹' tečné vazebné stupně. Tak například v případě sendvičového imunologického stanovení může být v prvním s,tupni zmobilizován na povrchu senzorové báze protein A, který specificky váže imunoglobuliny, které potom působí jako primární protilátky při následném sendvičovém testu, který se provádí výše popsaným způsobem, v jejich tak zvané části F .

Existuje celá řada dalších typů afinitních stanovení, která obvykle využívají známý afinitní systém avidin-biotin.

Příklady typů afinitních stanovení lze najít v J.H. Rittenburg, Fundamentals of Immunoassay, v Developraent and Application of Immunoassay for Food Analysis, J.H. Rittenburg (nakl.), Elsevier, Essex 19990 nebo v P.Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, R.H.Burdon, P.H.van Knippenberg (nakl.),Elsevier, Amsterdam 1985.

Povrch senzorové báze nemusí být kromě toho použit pouze jednou, nýbrž může být regenerován pro opětovné použití. Za vhodných podmínek, kterými jsou například nízká hodnota pH, zvýšená teplota, použití organických rozpouštědel nebo tak zvaných chaotripních činidel (solí), je možné selektivně rozložit afinitní komplexy a to bez podstatného zhoršeni vazebné kapacity zmobilizovaných detekčních látek. Přesné podmínky, které by měly být použitý vkonkréthích případech, budou do značné míry záviset na specificky použitém afinitním svátému.

Další základní provedení způsobu podle vynálezu spočívá jednak v omezení produkce „signálu - v .případě. z-pětné kopulace to růvněž platí pro signálovou detekci -na evanescenční pole vlnovodu a jednak v rever.sibilitě tvorby afinitnxho komplexu ve funkci, rovnovážného procesu. Za použití vhodných průtokových rychlostí v kontinuálním, průtokovém sys tému je možné monitorovat v reálném- čase , vázání'nebo desorpci nebo-cisociaci vázaných luminiscenčně značených-afinitních partnerů v evanescentním poli i. ,, Tento způsob jě proto-vhodný % ,.pro?kinetické studiu, při kterých-se stanovují různé asociační nebo disociační konstanty, nebo také pro vyt-ěsňovací tes-ty. <

Detekce evanescentně excitované luminiscence může . -bý-ě^proveden-a^známými—metóčěmltXPříťbrn jmóhoú SytXzSodně použity. íotodiody,fotobuňky, -£otonásobiče,CCD-kamery· -a* detektorové soubory, například CCD-články. Luminiscence může být zobrazena optickými prvky, jakými jsou zrcadla, hranoly, čočky, Presnelovy čočky a čočky s gradientem indexu lomu. Za účelem výběru emisní vlnové délky je možné použít známé prostředky, jakými jsou filtry, hranoly, monochromatické filtry, dichromatická zrcadla a ohybové mřížky. ; ,_a ; , . \

Jednou z výhod způsobu podle vynálezu je to, že vedle detekce luminiscence může být také stanovena absorpce ozarovacího excitačního světla.. Ve srovnání s-multimodálními vlnovody ve tvaru optického vlákna nebo s planární konstrukcí se v tomto případě získá podstatně lepší poměr signál-šum. Současné měření luminiscence a. absorpce umožňuje stanovit efekt luminiscenčního zhášení s vysokou citlivostí.

— --------V--rámci - jednoduchého-proveden-í vyná-l-ezu-může- být — ——------způsob podle vynálezu proveden ozářením excitačním světlem ·v kontinuálním vlnovém modu (mod cv), což znamená, že se excitace provádí za použití intenzity světla, která je konstantní v čase.

Způsob podle' vynálezu však může být rovněž proveden ozářením excitačním světlem ve formě časovaných pulzů s délkou pulzu například od jedné pikosekundy až do 100 sekund, a časově rozloženou detekcí luminesčence - v případě krátkých delek pulzů- nebo v intervalech sekund až minut. Tato metoda je obzvláště výhodná v případě, že je žádoucí napří~kl ád^monTtdr o' vat^ariaTy trcky Ť y cnlo st^-itvóřb y vaz b y ‘-neb o-·-z abr á—- nit zmenšení luminiscenčního signálu v důsledku 'zhášení luminiscenčního. signálu při použití krátkých, expozičních časů. Použitím příslušně krátké délky pulzu a' vhodné časově rozložené detekce je rovněž možné odlišit rozptýlené světlo, Ramanovu emisi a krátkodovou luminiscenci každé nežádoucí luminiscenční složky přítomné ve vzorku nebo v materiálu senzoru od luminiscence značící; molekuly, která-je v tomto případě výhodně dlouhodobá.,detekcí, emi.se. analytu potom,co doš.l.o ke zhasnu-. t£ uvedeného krátkodobého záření. Kromě toho umožňuje časově rozložená detekce luminiscence po pulzní excitaci stejně jako modulovaná excitace a detekce výzkum vlivu vázání analytu na rozpad molekulové luminiscence. Vedle specifického rozpoznání analytu imobilizovanými detekčními látkami a prostorového omezení tvorby signálu na evanescentní pole vlnovodu může být doba'rozpadu molekulové luminiscence použita jako další kritérium selektivity.

Způsob podle vynálezu může být také prováděn vstupní kopulací exitačního světla mající jednu nebo více než jednu frekvenci s modulovanou intenzitou a detekcí rezultujícího fázového posunu a modulace luminscence vzorků.

Vynález se dále týká použití způsobu podle vynálezu pro kvantitativní stanovení analytů při chemických nebo biochemických afinitních stanoveních se známými afinitními partnery a metodikami-testů detekováním,emise značených vazebných partnerů schopných luminiscence nebo detekováním změn luminiscenčních vlastností zmobilizovaných luminiscenčně značeΛ· ných afinitních partnerů interakcí s anai-ytem.

Poněvadž tvorba a detekce signálů jsou omezeny na povrch vlnovodu a vzhledem-k tomu, že jsou diskriminovány interferenční signály z prostředí, může být monitorována v reálném Čase vazba látek, k imibilizovaných detekčním prvkům. Způsob podle vynálezu může být proto také použit .třídící áfinitní testy nebo vytěsňovací testy,'zejména pro vývoj..farmaceutic kých' produktů,· a to přímou detekcí asociačních a disociač-; nich rychlostí v průtokových kontinuálních systémech s vhodnými průtokovými rychlostmi. _; /

Vynález se dále týká použití způsobupodle vynálezu pro kvantitativní stanovení protilátek nebo antigenů.

....... .·. -Způsob-pod-1 e-·vy náí-ezu—mů žé^—bý ť _ ^kvantitatiyni^stanovení ,,receptorů. ligand ma'ké použit , pro ;; .-, oligonukleotidů,řetězců DNK nebo RNK, analogů DNK nebo PNA, enzymu, enzymových substrátů, enzymových kofaktorů nebo inhibitorů, lektínů a karbohydrátů.

Vynález' se dále týká -.použití způsobu podle vynále zu pro selektivní kvantitativní stanovení-luminí scenčních složek v , opticky ..kalných tekutinách.-. '

Ir

Ιλ- · ' - - - ’ · ·

- Opticky, kalnými kapalinami mohou být-typicky biolo-_; gické tekutiny, jakými jsou vaječný žloutek, tělesné tekuti-, ny, jakými.jsou krav, sérum nebo plasma a také vzorky týkající se analýzy životního prostředí, zahrnující povrchovou vo• , jh ' 4 j _du,. rozpuštěné -půdní extrakty a- rozpuštěné rostlinné -ěxťrak·. ty. Vhodnými tekutinami jsou'rovněž reakční roztoky 2Ískané —-—v -chemické výrobě, -zejména^ roztoky- barviv nebo -reakční--roz------—-fr^ky ⁷ výrnhy fbinrp^rgnřnfrb hělirírh řiniHal

Rovněž vhodné jsou všechny typy disperzí a formulací,' které se obvykle používají v textilním průmyslu, za předpokladu, že obsahují'jednu nebo více než jednu luminiscenční komponentu. Tento způsob může být takto použit pro kontrolu dodžení kvality výrobků.

V následující Části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí příkladu konkrétního provedení vynálezu, přičemž tento příklad má pouze ilustrační charakter a nikterak neomezuje rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací ''patentových’'nároků.-------—.....- ......-- ------------------— — ' —-----Příklad provedení vynálezu

Optický systém

Použitým světelným zdrojem- je laserová dioda.vyzařující světlo s vlnovou délkou lambda = 670 nm (firma Oz Optics). Nastavení na světelnou stopu mající průměr v rovině senzoru 0,4 nm vertikálně k čarám kopulační mřížky a 2,5 mm paralelně k čarám mřížky se provede pomocí zobrazovacího systému.

Nastavení vstupního kopulačního úhlu a polohování světelné stopy vzhledem k okraji mřížky se provádí pomocí mechanických adjustážních jednotek. Výkon laseru na senzorovém čipu může být zvolen v rozmezí P = 0....3 mW, zatímco P=

1,2 se zvolí pro následující pokusy prováděné za účelem charakterizace mřížek a P = 0,2 mW se zvolí pro měření fluorescence. Lineárně polarizované světlo s orientací ΤΞ nebo TM může být vstupně kopulováno za použití otočných polarizujících prvků.

- 29 Λ,.

Průtokový komůrka utěsněná vzhledem k senzoru kru.-, hovým těsněním je lokalizována na horní straně·.senzorové báč ze. Objem komůrky určený pro vzorek jé roven asi’3 mikřolitrům. Do vzorkové komůrky mohou být zaváděny- rŮ2né roztoky za· použití proudových čerpadel a přeřazovac.ích ventilů. ' y

Excitace a detekce jsou .prováděny ze spodní strany senzorové báze, ..jak ·. jě* to' patrné z obr.1¹.’. . .. _____ t · - , - · -7 .-i · ¹ ? -· h, «· J :

·>'· V. rámci uvedeného příkladného uspořádání. jšoVk'..

dispozici, tři měřící kanály pro, detekci: pro iflůó.rescenční., ) *,* f ' _(V> * .··''* ♦, · V’ a; excitační.'světlo dekopulované z. vlnóvódu*vvstuDnř kooulačy, · . , y \ · ‘ y . , . ..... - * .· * ní mřížkou/ve směrech K' . ’ák'Í '1 .oodle -obr. 1). a- dcoadá-pcí . ' OUO- . ouo - · . . <. ^J · ..

excitační, světlo přes· .dělič paprsku (není znázorněn.),.? <· l· .<^f'· . , -y Pro* detekci- fluorescenčního.,...záření, jejako detek₊ tor použití.,násobič v monofotonověm počítacím modu (Hamamatsu

R. 4632 SEL)· s-impulzotvornou elektronikou (Hamamatsu'.Č3 366 ).

, Jeho TT1 výstupní signál je spojen S‘‘ konvenčním.'impulzovým počítačem (Hewlett-Packard 53.131 A) .'-..Fluorescenční ^záření ž, ‘uhlových sektorů může být zaostřeno* naΐdetektor, přes fokuzačZ wí M· 't J L ''1,4 _{Λ v} '' /. ' . „PJpckóvý jsystém.,~.P,řed^čelo .;d.^.tektoř.u^j.soulumís.těhy-'’interŤíř* ferenční filtry pro potlačená rozptýleného' světla (pásmový'?

* - · ‘ ‘í-. . - ¹ W . ' ‘ J w Z*’ ^J filtr·: lambda = 725 nm pr-l polovině ' šířky 25 nm, firma-Omega.) .

··· . R ' ‘ ,ť

Z .. - - jako i-ěfěřencni'dě.téktorý pro . dopadající radiaci a excitační radiaci, která je dekopulóvánaz vlnovodu, jsou použity Si-diody (UDT,PIN 1QD) s měřícím zesilovačem (UDU \ 101 C) 'zapojené' do série, < ¹ ; . .· „ • .. ,· V'průběhu provádění,, níže‘popsaného testu jsou si.multánně vyhodnocovány, všechny tři měřící kanály za použití konvenčního systému pro příjem dat. “'.··

Senzorová báze

- 30 ,___Jako. podložka . se použije polykarbonát, který .jě _ mikrostrukturován dále uvedeným- způsobem dvěma mřížkami pro vstupní a výstupní kopulaci.

Vstupní kopulační mřížka s periodou Λj=(299,5+0,7 nm), hloubkou t^ = 6,9 nm až 12,3 .nm a výstupní kopulační mřížka s periodou A₂=(489,5+0,7 nm), hloubkou t_] = 8,2 nm až 12,8 nm, které jsou použity, mají přibližně profil sin⁴.'

Uspořádání mřížek na senzoru je patrné z obr..2 a má následující geometrické charakteristiky: vzdálenost mřížek A = 4 mm, šířka mřížek (kolmo k čarám) = B^ = 2 mm, ._=—^₇;_=_._:-výška-mř-í.žek_{-pařa.lelní._s--čarami-)—=-á.-mm-,-ipř-i.čemž-ro.změr.y_,— senzorové báze jsou 12 x 20 mm .

Za účelem potlačení auto-fluorescence (vlastní fluorescence) polykarbonátu je uvedená podložka ovrstvena mezivrstvou z oxidu křemičitého mající index lomu n = 1,46 a tloušťku t^uffer ^{= nm}^ ^a P°^tom vlnovodivou vrstvou z oxidu titaničitého .mající vysoký index lomu ⁿfj_Lj__in ⁼ 2,35 při vlnové délce lambda = 6.70 nm a tloušťku vrstvy= (.170+5 nm) .

-----—Pomoc í^—ex c ftačiří-ho^s větla-mo řfčir'5y t^áxčrtč vany-------------ve vlnovodu pro tuto kombinaci mřížka-vlnovod mody řádu m =

0: pro TE se vstupní kopulace provádí pod úhlem θ = (-10 ± 1.6)’, pro TM_q pod úhlem θ = (-22.7 ±3.7)°.

Fluorescenční záření se dekopulije z vlnovodu s polarizací TE v úhlovém rozmezí Θ = 31°....40°, zatímco excitační světlo se dekopuluje z vlnovodu pod úhlem g>42’

Jde o spektrální oblast lambda asi 685 nm.....715 nm. Pro

TM polarizaci je výstupní kopulační úhel v rozmezí g = 17’...25° pro fluorescenci a e>27° pro excitační záření. Pro TE-polarizaci se detekuje za výstupní kopulační mřížkou světelná úČinnoss P=30...50/UW při dopadajícím výkonu laseru P =1,2 mW.

TM *

Detekce Cy5,5 -značeného imunoglobulinu _M λ ’ŤM •Značeni imunoglobulinu barvivém Cy 5.5 :

Králičí imunoglobulin (králičí IgG, Sigma Chemicals) byl označen stejně·,· jak je to doporučeno producentem barviva, bifunkčním cyaninovým barvivém FluoroLink™ Cy 5,5™ (3iolójgical Détection SystemsPiť.tsburgh PA' 1 5238, USA):

1) - roztok 2,5 mg králičího IgG v ,1 ml barviva, inkubační doba 45“ minut, roztok se protřepe každých 10 . minut, '^!‘ . · ’ l· I .

2) ' přidání tohoto .roztoku’k 1 ml· barviva, inkubační ^; doba 45 minut, roztok se protřepe-každých 10 minut, * .· 1

3) . oddělení barvina vázaného k proteinu od nevázaného barviva na sloupci produktu Sephadex R G25 (Pharmacia LKB, Biotechnology AB, Uppsala, Švédsko), který byl předběžně uveden do. rovnovážného · stavu s ”· • ‘i ml fosfátového pufru s pil 7: ’ ί*,X.·o.d.liti ml _a · ...· ή»™.· - -- - ·*·”< -r “ . - jímání daného počtu frakcí, • - ' · - '

4) ' ‘stanovení poměru barvivo/protein na základě optické ' ' hustoty při vlnové délce 678 nm (absorpční pásmo i . barviva) a při’vlnové délce 280 nm*_ (absorpční, pásmo proteinu), přičemžýze z jištěných', výsledků se stanoví poměr 1 molekuly barviva ke dvěma molekulám pro- , teinu. .

f - í .

Použité roztoky

1.) Pufrový roztok tvořený (0,041 M Na₂HPO₄_ + 0,,028 M

- - KH.jPO^Ό, 151 'M NaCl,‘ 200' mg/1 ázidu sodného a 50 ml methanolu, přičemž zbytek do jednoho litru je · * ti · 32 tvořen deštilo váhou vódó'u,~

2) roztok imobilizujícího proteinu A (Sigma Chemicals): 1 mg/ml destilované vody,

3) neutralizační roztok: pufrový roztok 1+10 mg/ml albuminu z bovinního séra (BSA, Sigma Chemicals),

4) oplachovací roztok:(je rovněž použit pro stanovení signálu pozadí) pufrový roztok 1) + 1 mg/ml albuminu z bovinního séra,

5) roztoky vzorku: Cy 5,5™-značený imunoglobulin v různých koncentracích 10 θΜ, 10 ^M, 3.10 ^M,

1.10 θΜ v pufrovém roztoku 1) s '1 mg/ml albuminu z bovinního séra,

6) regenerační roztok: glycinový pufr s pH 2,5.

Aplikace biochemické indikátorové vrstvy proteinu A

Qp.ti.cká_s.enz.o.r.Q-V.á_b.á.Z-e_s.e_inkub_u.j.e_p_o_do_bu J_Q hodin_ _ s roztokem 2) za účelem imobilizace proteinu A. Za účelem neutralizace všech ještě volných adsorpČních míst se senzorová báze promyje destilovanou vodou a potom opět inkubuje po dobu jedné hodiny v neutralizačním roztoku, který obsahuje 10 h/1 albuminu z bovinního séra.

Měřicí postup/stanovení

V průběhu celého stanovení se udržuje okolo účinného senzorového povrchu průtok 0,25 ml/min.

Proces stanovení zahrnuje následující individuální stupně:

promývání po dobu 4 minut oplachovacím roztokem 4), přičemž se'zaznamenává signál pozadí, přidání roztoku vzorcku 5) v průběhu 4 minut, promývání po dobu 4 minut oplachovacím roztokem., ·» .

přidání regeneračního roztoku 6) v průběhu 4, minut *·' promývání -po dobu 4 minut oplachovacím -roztokem ^;4) .. ' · . *.

! ’

J

z. V průběhu celého postupu se měří'fluorescenční signál dekopul.ovaný z. vlnovodu druhou kopulační mřížkou.

Při různých koncentrácích byly zaznamenány po ukončení přidání vzorku následující změny signálu oproti původnímu s.ig < nálu pozadí (poměr signál-šum mezi 50-a 100 impulsy za sěkun du): ' - '· /Cy 5.5-IgG/ . fluorescenční'signál /impulsy.s ^/ .V-Λ ¹ °~^3m

70001

10⁹m

3.10 ¹⁰M

850

30Ů

Detekční i mez pro detekci,fluorescence dekopulovane výstupní kopulační'mřižkou je jednoznačně pod 3.10~¹⁰M, což odpovídá analytové koncentraci 3.10~¹³ molu Cy5,5-značeného IgG.

Claims (37)

1. Způsob stanovení.luminiscence planární dielektrickou optickou senzorovou bází, která je tvořena transparentní podložkou (a),na kterou jě nanesena tenká vlnovodivá vrstva (b),přičemž senzorová báze je opatřena kopulační mřížkou pro vstupní kopulaci ^exc^itační ho s-větla -a index lomu uvedené podložky (a) je nižší než index lomu vlnovodivé vrstvy (b), uvedením kapalného vzorku do styku s vlnovodův.ou vrstvou (b) ve formě vrchní vrstvy a měřením lumin í.scence, produkované látkami .majícími luminiscenční vlastnosti a obsaženými ve vzorku nebo látkami majícími luminiscenční vlastnosti a imobilizovanými na vlnovodivé vrstvě (b), optoelektronicky kopulací excitačního světla kopulační mřížkou do planárního vlnovodu tak, aby toto excitační světlo prošlo vlnovodivou vrstvou, přičemž látky mající luminiscenční vlastnosti jsou excitovány k luminiscenci v evar.escetním poli vlnovodivé vrstvy, vyznačený t_yL;_-_ž-e=s-e-p.Q.u-ž-i-^e=Vrl-novo_divá —vr-.stya..mat.jxcí. Joloušt_ku.-. ......

menší než vlnová délka lambda excitačního světla a- tvořená materiálem, jehož index lomu při uvedené vlnové délce excitačního světla je vyšší nebo roven 1,8, přičemž se luminiscenční radiace,zpětně kopulovaná do vlnovodivé vrstvy íb), dekopuluje z vlnovodivé vrstvy druhou kopulační mřížkou,prostorově odsazenou od uvedené prvně uvedené kopulační mřížky, a detekuje.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se použije vlnovodivá vrstva mající tlouštku menší než lambda/2.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že tlouštka vlnovodivé vrstvy je rovna 40 až 160 nm.

4. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že modulační hloubka mřížky je rovna 3 až 60 nm.

5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, v y z n ač e n ý tím; žé.excitační záření je‘dekopulováno⁷pod jiným úhlem, než pod kterým je dekopulováno' luminiscenční zářeni *

6. Způsob podle některého· z. nároků 1 až 5, v y z n ai. , čený tím, že excitační záření je kopulováno do vlno*· . vodu směrem dozadu a jak·excitační světlo přenášené vlnovo- dem, tak i luminiscence transportována ve-vlnovodu,jsou z vlnovodu dekopulovány směrem¹'dopředu.

7. Způsob podle některého' z nároků 1 až 6, v y z n ač e.n ý t í.m že excitační záření je kopulováno do vlnovodu-pod úhlem v rozmezí od .asi 1 do -50°. '

Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznátím; že luminiscenční záření.zpětně kopulované

8.

čený do vlnovodu je z vlnovodu dekopulováno pod úhlem v rozmezí od asi 1 do 50°. . ,

9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, v y z n ačený tím, že se potlačí luminíácence podložky.

10.

Způsob podle některého z nároků 1 až 9, v y z n a 36 č -.e..n..ý,„..t..í. .m. ,....ž.e_p.r.o.. .excitaci _.lum.ini scence..se. použije v podstatě paralelní světlo. , .

11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, v y z n a č e n ý tím, ze látky schopné luminiscence a použité pr detekci analytu jsou imobilizovány přímo na povrchu vlnovodivé vrstvy.

.

12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, v y z n a č e n ý t i m, že zahrnuje imobilizaci specifického vazeb------..^---aého-parfenera-ve,-funkci---cftem-ické,Inebo-hÍOchem'ické=u3.e-te'k.čhí.-=.-llátky pro samotný analyt nebo pro jednoho z vazebných partne rů na povrchu, senzorové báze při vícestupňovém stanovení', v průběhu kterého se analyt stane vázaným při jednom z parciálních stupňů.

13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12, vyzná <r e n ý t í m, že se- současně stanoví absorpce ozařujícího, excitačního světla.

14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, vyzná č e n ý. t i m , že excitační světlo je kopulováno do vlnovodu v kontinuálním vlnovém modu (cw-mod).

15. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, vyzná č e n ý t í m, že zahrnuje vstupní kopulaci excitačního světla ve formě časovaného pulzu a časově .rozloženou detekci luminiscence.

16.

Způsob podle nároku 15, vyznačený tím, že délka pulzu se nastaví v intervalu od jedné pikosekundy' „ ¹ az, do 100 sekund. , Τ' ; '

17. Způsob podle některého z nároků Važ '16, v y z n a,č 'e n ý t i m, že zahrnuje //stupni 'kopulaci excitačního .světla s modulovanou intentitou při ''jedné nebo více než jedné frekvenci a detekci réžultujícího fázového posunu a modu.·'·· ' v* > láce luminiscence vzorku.· , '7 *' *· *

18. Způsob podle některého z nároků 1 až Ϊ7, vy z. n ač e ,n ý t i m, že detekovaným vzorkem je vaječný žloutek,

.·» ' V lí .krev, sérum/ plasma.' nebo močí.. ' '· , Λ ' ' '· ' ' · ' ^T i i s/lřl . ¹ + ' · · · · . ·,·> ' . _r . ¹ * í .

19. , Způsob podle některého z nároků 1 až 18, v y z n ačený tím, že detekovaným vzorkem jé.povrchová voda, půdní nebo rostlinný extrakt nebo bioprocesní nebo syntézní břečka. · '

- > „ -lib-. 'MW ' M+-. w-V-Wi ΜΠ,.'Α*-*·' ·*Γ'

20'.· ; Použití .pro.kvantitativní .'afinity.

21 . V. .Použití pro kvantitativní způsobu podle některého- ž nároků 1- až 19 >

V'. · stanovení biochemických 'látek'při snímání způsobu podle některého,z .nároků 1 až stanovení, protiláteknebo antigenů.

22. Použití způsobu podle některého z nároků Važ 19 pro kvantitativní stanovení receptorů nebo ligandů, oligo< . v nukleotidů, řetězců DNK nebo RNK/ analogů DNK nebo RNA, enzymů, enzymových substrátů,., enzymových kofaktorů nebo inhibitorů, lektinů a uhlohydřátů.

- 38 .2.3..............Použití, způsobu podle některého z nároků 1 až 19 pro selektivní kvantitativní stanovení lumin·scenčních složek v opticky kalných tekutinách.

24. Optická senzorová báze (1) pro stanovení luminiscenčního záření způsobem podle některého z nároků 1 až 23, v podstatě obsahující planární opticky transparentní podložku (5), na které je nanesena tenká vlnovodivá vrstva (4), přičemž senzorová báze je opatřena kopulační mřížkou (2) pro vstupní kopulaci excitačního záření a index lomu podložky je menší než index lomu vlnovodive vrstvy (4), vy z nače-n- á --t í-m že-tlouštka---vlno.vodiv.é-.vrstvy .(A.) je.menší..než _ vlnová délka lambda excitačního záření a vlnovodivá vrstva je vytvořena z materiálu., jehož index lomu při vlnové délce excitačního světla je vyšší než 1,8, přičemž senzorová báze obsahuje druhou kopulační mřížku (3), která je prostorově odsazena od první kopulační mřížky, (2), proelekopulaci luminiscenčního záření, které bylo zpětně kopulováno do vlnovodu, z vlnovodu.

25. Optická senzorová báze podle nároku 24, vyznácě”'n''a'*~ť í^_:ftf^_j~ž'ě'”tióu^:š'tkávlhóvódivé vrstvy · (-4) '-je -men^:-' -ší než lambda/2.

26. Optická senzorová báze podle nároku 24, vyznáč e n ;á t £ m , že tlouštka vlnovodivé vrstvy (4) je rovna 40 až 160 nm.

27. Optická senzorová báze podle nároku 24, vyznačená tím, že modulační hloubka mřížky je 3 až 60 nm.

28. Optická senzorová báze podle některého z nároků

- 39 24 až 27, v y z n a č e n á t ím , že mřížková konstanta ·'

1 '< ¹ první kopulační mřížky' (2) pro vstupní koDulaciexcitačního záření-je odlišná .od- mřížkové, konstanty druhé kopulační’mřiž· ky (3) pro dekopulaci luminiscenčního záření.

29. . '.Optická senzorová báze'podle některého z nároků λ í .

22 až. 24,. v y 2 n a č e n.,á>. ..tím ža vzdálenost, mřížek je 8<·Χ_1/β < kde znamená délku,. .vě. které intenzita do^ padajícího záření poklesla ná I /e.

30.. ¹ ý ·, Optická -senzorová báze podle'nároku ,29,·. v y z ,n aj ‘ ^;~ y' j r ’ .- Č, ·· ’·. : . v č ě n á t· í m ;'že vzdálenost mřížek je:·'5 > 0.2 · X„«. .. ' čé.

Viř

- Optická senzorová platforma..podlé některého z^; náI ' * roků 24. až; 30, _j vyznačená .'tím, že,mezi podložkou (5) a vlnovódivou.vrstvou (4hobsahujemezivrstvu s nízkým ·,indexem ýomu;pro'.potlačení luminíseance podložky. . ·'

31.

Optická senzorová,.báze· podle nároku 31, vyznát.í m, že mezivrstva s nízkým indexem Lomu’je v.'pódstátě vytvořena z SiO- nebo SiO C H'..

j 2 · + b, 2 , ¹ j

32.

c e n, a ^-. *·»

33, Optická senzorová báze podle*nároku 31 nebo nároku ,3.2,.'vyy. ,ž n-a/č'e n,.á t ým, že tloušťka’ mez i vrstvy je menší -nebo rovná 1000 nm. ·, ,

34.

Opti-č-ká-sen-zorov-á—bá-z-e—podi-e—něk-te-rého—z—ná-rok-ů’24 až 33, v y z n a č e n, á- , .t í m. , . že se použije organická •mikrostrukturovaná podložka... · · ' ^J u *+ -w »>ll

Τ'·'¹

4 0 _

35.-- -----—Qpt-i-cká- -senzorová- báze -podle..některého z. nároků —34 ?4, v y-7 Π A ř Ρ n á t í m . že ie použita organic ká podložka s mikrostrukturovaným organickým povlakem..

36. Optická senzorová báze podle některého z nároků 22 až 35,vyznačená tím, že planární transparentní vlnovodivá vrstva (4) je vytvořena z Ta^O- nebo TiO^

37. Optická senzorová báze podle některého z nároků 24 až 36,vyznačená tím, že mezi vlnovodivou

-^L-^vrstvoú a^vzOrkem^-je^přítOmna-^vrstva·· podporujíc-í- -adhezi

38. Optická senzorová báze podle nároku 37, v y z n a cena tím, že vrstva podporující adhezi má tlouštku menší nebo rovnou 50 nm.