SK151296A3 - Process for detecting evanescently excited luminescence - Google Patents

Description

Spôsob detekcie evanescenčne excitovanej luminiscencie

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu detekcie evanescenčne excitovanej luminiscencie za použitia rovinnej dielektrickej optickej senzorovej základne založenej na vlnovode. Vynález sa tiež týka použitia uvedeného spôsobu na kvalitatívne snímanie afinity a jeho použitia na selektívne kvantitatívne stanovenie luminiscenčných zložiek v opticky zakalených roztokoch. Vynález sa ďalej týka senzorovej základne vhodnej na uskutočňovanie uvedeného spôsobu.

Doterajší stav techniky

Ak sa svetlo šíri vlnovodom, potom šírenie svetelnej vlny nie je úplne obmedzené len na daný skutočný vlnovod. V skutočnosti sa určitá frakcia svetelnej vlny šíri v susednom opticky redšom prostredí. Táto frakcia sa označuje ako evanescenčné pole a je základom na rôzne aplikácie optických vlnovodov v technológii senzorov.

Za použitia evanescenčného poľa sa predovšetkým môže excitovať luminiscencia v opticky redšom prostredí. Táto excitácia je obmedzená na bezprostredné okolie medzifázového rozhrania vlnovodu. Evanescenčne excitovaná luminiscencia má preto veľký význam pre analytické účely.

Rovinný senzor je v najjednoduchšom prípade tvorený systémom troch vrstiev, ktorými sú podložka, vlnovodivá vrstva a vrchná vrstva, ktorá je obvykle tvorená vzorkou určenou na stanovenie. Obzvlášť v prípade tenkých vlnovodov, v ktorých je hrúbka vlnovodivej vrstvy menšia ako dĺžka svetelnej vlny je počet difundovateľných módov poľa schopných šírenia obmedzený len na niekoľko málo diskrétnych vlnovodových módov.

V prípade silných vlnovodov sa môže vlnovodom viesť veľký počet uvedených módov. V tomto prípade sa nepovažuje za nutné v mnohých prípadoch obmedzovať sa u hrúbky podložky na hodnoty v rozsahu niekoľkých desatín milimetra a viac.

Doterajšie spôsoby detekcie evanescenčne excitovanej luminiscencie sa môžu rozdeliť podľa výberu radiačných frakcií, ktoré sa môžu detegovať:

- detekcia objemovej luminiscencie: frakcia fluorescencie excitovanej vedenou vlnou je emitovaná pod plným priestorovým uhlom, pričom táto frakcia sa môže opticky zaznamenať a zaviesť do detekčného systému,

- detekcia evanescenčnej luminiscencie: komplementárne k luminiscencii emitovanej do priestoru je táto evanescenčná luminiscencia spätne viazaná ako vedená vlna do vlnovodu, transportovaná vlnovodom a uvoľnená až v koncovej rovine vlnovodu .

Spôsoby a zariadenie na detekciu evanescenčne excitovanej luminiscencie protilátok alebo antigénov značených luminiscenčnými farbivami sú známe a opísané napríklad okrem iného v patentovom dokumente US-A-4 582 809. Usporiadanie nárokované v tomto patentovom dokumente využíva na excitáciu evanescenčne j luminiscencie optické vlákno a čelný kopulačný prípoj. Také optické vlákna majú typicky priemer až 1 milimeter a vedú veľký počet módov v prípade, že je na vlákno pripojený zdroj laserového žiarenia. Evanescenčne excitovaná luminiscencia sa môže merať jednoduchým spôsobom s využitím len frakcie svetla tunelovanej späť do vlákna. Ďalšie nedostatky tohto usporiadania spočívajú v tom, že detekčné zariadenie má veľké rozmery a že je tu nevyhnutné uskutočňovať stanovenie za použitia pomerne veľkých objemov vzoriek. Toto zariadenie sa už nemôže podstatnou mierou zmenšiť alebo dokonca miniaturizovať do rozmerov integrovaných optických senzorov. Zlepšenie citlivosti zariadenia je spravidla spojené so zväčšením jeho rozmerov.

Ďalším nedostatkom je nízka citlivosť, ktorá je limitovaná výstupným čelným kopulačným prípojom: pretože excitácia a luminiscenčné žiarenie prebiehajú kolineárne a musia byť preto rozdelené deličmi a filtrami (napríklad prahovými filtrami alebo pásmovými priepusťami), obmedzujú diskriminačné charakteristiky filtračnej jednotky citlivosť detekcie.

Použitie silných rovinných multimódových vlnovodičov je opísané D. Christensenom, D. Deyerom, D. Fowerom a J. Herronom v Analysis of Excitation and Collection Geometries for Planar Waveguige Immunosensors, SPIE 1886, 2(1993) (Fibre Optic Sensors in Medical Diagnostics). Tu opísaná excitačná radiácia je spriahnutá s vlnovodom čelným prípojom a meria sa priestorový uhol emitovaného luminiscenčného svetla. Alternatívne sa tiež môže použiť výstupný čelný kopulačný prípoj. V tomto prípade predstavuje obmedzenie citlivosti spôsobené nutnosťou použitia deličov a filtrov rovnaký nedostatok, aký sa už uviedol v súvislosti s vyššie opísaným usporiadaním. Ďalšími nedostatkami sú aj v tomto prípade veľké rozmery senzorov a nutnosť použitia veľkých objemov vzoriek.

V patentovom dokumente WO 90/065030 je opísaný spôsob excitácie luminiscencie celkovou internou reflexnou fluorescenciou (TIRF - Total Internal Reflection Fluorescence), pri ktorom sa používa tenký rovinný, s výhodou monomódový, vlnovod. Vlnovod sa pri tomto spôsobe používa za účelom zvýšenia intenzity svetelného poľa na povrchu senzora, pričom excitačná radiácia je vyžarovaná zo spodnej strany a úplne reflektovaná v senzore. Meria sa objem luminiscencie emitovanej do priestoru. Pri tomto spôsobe je interakčná zóna medzi excitačným svetlom a molekulami, ktoré majú luminiscenčné vlastnosti, limitovaná na senzor, pretože excitácia prebieha len v oblasti priemeru lúča. Sú tu preto len obmedzené možnosti dimenzovania senzora na báze priemeru lúča pri reštrikciách v priemere a v divergencii vzhľadom na veľmi úzko vymedzený rezonančný uhol.

Dosiaľ známe použitie jednej alebo viac ako jednej kopu4 lačnej mriežky pre vstupné alebo výstupné pripojenie vedených vln je opísané K. Tiefenthalerom a W. Lukoszom v Sensitivity of grating couplers as integrated-optical Chemical senzors, J. Opt. Am. B6, 209 (1989), W. Lukoszom, PhM. Nellenom, Ch-Stammom a P. Weissom v Output Grating Couplers on Planar Waveguides as Integrated Optical Chemical Sensors, Sensors and Actuators BI, 585 (1990) a T. Tamirom a S. T. Pengom v Analysis and Design of Grating Couplers, Appl. Phys. 14, 235-254 (1977). Spôsoby opísané Tiefenthalerom a kol. sú vhodné na snímanie afinity priamou detekčnou metódou (mechanizmom zmeny indexu lomu). Stanoví sa posun rezonancie kopulačného uhla, ktorý je závislý na adsorpcii alebo väzbe molekúl, ktoré spôsobujú zmenu indexu lomu v prostredí.

V minulosti sa urobili mnohé pokusy zlepšiť citlivosť evanescenčne excitovanej luminiscencie a vyrobiť integrované optické senzory. Tak napríklad v publikácii Biosensors and Bioelectronic 6 (1991), 595-607 sa opisujú rovinné monomódové alebo nízkomódové vlnovody, ktoré sú získané dvojstupňovým iónomeničovým postupom a v ktorých sa kopulácia svetla do excitačnej vlny uskutočňuje hranolmi. Použitým afinitným systémom je ľudský imunoglobín G/fluoresceínom značený proteín A, pričom protilátka je imobilizovaná na vlnovode a fluoresceínom značený proteín A, ktorý má byť stanovený, sa vo fosfátovom pufri pridá do polyvinylalkoholového filmu, ktorým sa pokryje meracia oblasť vlnovodu. Základný nedostatok tohto spôsobu spočíva v tom, že sa môžu dosiahnuť len malé rozdiely v indexoch lomu vlnovodivej vrstvy a podložkovej vrstvy, čo má za následok pomerne nízku citlivosť stanovenia. Pre fluoresceín-izotiokyanát viazaný na proteín A sa uvádza citlivosť 20 nm. To stále ešte nepostačuje na to, aby sa mohli detegovať stopové množstvá detegovanej látky a je teda nevyhnutné ešte ďalšie zlepšenie citlivosti. Okrem toho sa tu javí ako obtiažna reprodukovateľnosť a praktická realizovateľnosť svetla kopulovaného do excitačnej vlny pomocou hranolov vzhľadom na značnú závislosť účinnosti uvedenej kopulácie na veľkosti a kvalite oblasti styku medzi hranolom a vlnovodom.

Použitie mriežok na detekciu luminiscencie, ako sa to nárokuje v rámci vynálezu, je opísané v patentovom dokumente US-A-5 081 012. V tomto patentovom dokumente sa opisujú mriežkové štruktúry na kopuláciu excitačného svetla do vlnovodu, ako aj reflexné mriežky, ktoré umožňujú, že excitačná vlna môže prechádzať vlnovodom niekoľkokrát. Uvádza sa tu, že týmto opatrením sa dosiahne zlepšenie citlivosti. Objemová luminiscencia je emitovaná pod priestorovým uhlom. Okrem toho môže byť excitačná radiácia uvoľnená vstupnou kopulačnou mriežkou po dvojitom prechode vlnovodom využitá ako referenčný signál. Nevýhodou tohto spôsobu je silné zvýšenie intenzity radiačného pozadia spôsobené reflexnou mriežkou a emitované spoločne s luminiscenčným signálom pod priestorovým uhlom. Charakteristiky nevyhnutných filtrov aj v tomto prípade opäť obmedzujú citlivosť zariadenia.

Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsob stanovenia luminiscencie za použitia rovinného optického vlnovodu, ktorý by bol jednoduchý a ekonomicky realizovateľný a pri ktorom by sa mohli používať malé objemy stanovovaných vzoriek. Ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť miniaturizovateľnú senzorovú základňu na základe rovinného optického vlnovodu, ktorá by bola použiteľná na uskutočňovanie vyššie uvedeného spôsobu.

Podstata vynálezu

Vyššie uvedený cieľ sa dosiahne spôsobom stanovenia luminiscencie za použitia rovinnej dielektrickej optickej senzorovej základne, ktorá je tvorená transparentnou podložkou (a), na ktorú je nanesená tenká vlnovodivá vrstva (b), pričom senzorová základňa je vybavená kopulačnou mriežkou na vstupnú kopuláciu excitačného svetla a index lomu uvedenej podložky (a) je nižší ako index lomu vlnovodivej vrstvy (b), uvedením kvapalnej vzorky do styku s vlnovodivou vrstvou (b) vo forme vrchnej vrstvy a meraním luminiscencie, produkovanej látkami s luminiscenčnými vlastnosťami a obsiahnutými vo vzorke alebo látkami s luminiscenčnými vlastnosťami a imobilizovanými na vlnovodivej vrstve (b), optoelektronický kopuláciou excitačného svetla kopulačnou mriežkou do rovinného vlnovodu tak, aby toto excitačné svetlo prešlo vlnovodivou vrstvou, pričom látky, ktoré majú luminiscenčné vlastnosti, sú excitované k luminiscencii v evanescenčnom poli vlnovodivej vrstvy, ktorého podstata spočíva v tom, že sa použije vlnovodivá vrstva s hrúbkou menšou ako vlnová dĺžka lambda excitačného svetla a tvorená materiálom, ktorého index lomu pri uvedenej vlnovej dĺžke excitačného svetla je vyšší alebo rovný 1,8, pričom sa luminiscenčná radiácia, spätne kopulovaná do vlnovodivej vrstvy (b), dekopuluje z vlnovodivej vrstvy druhou kopulačnou mriežkou, priestorovo odsadenou od prvej uvedenej kopulačnej mriežky, a deteguje.

Výhodné aplikácie spôsobu podľa vynálezu tvoria predmet patentových nárokov 20 až 23. Senzorová základňa a jej výhodné uskutočnenia, ktoré sú obzvlášť vhodné na uskutočňovanie vynálezu sú opísané v nárokoch 2 až 19.

Pri praktickej realizácii vynálezu je excitačné žiarenie kopulované do vlnovodu kopulačnou mriežkou a šíri sa vlnovodivou vrstvou vo forme vedenej vlny. Za účelom účinnej evanescenčnej excitácie luminiscencie sa môže dosiahnuť vysoká intenzita poľa na povrchu senzora alebo v jeho blízkosti voľbou parametrov vlnovej dĺžky (index lomu, hrúbka vrstvy).

S prekvapením sa teraz zistilo, že vyššie uvedeným dimenzovaním vlnovodu sa dosiahne to, že podstatná frakcia luminiscenčného žiarenia sa evanescenčne spätne kopuluje do vlnovodu a transportuje sa vlnovodom spoločne s excitačnou vlnou. Táto luminiscenčná radiácia sa môže potom dekopulovať z vlnovodu druhou kopulačnou mriežkou, ktorá je priestorovo odsadená od prvej kopulačnej mriežky, a zavedená do detekčného systému. Výhoda tejto mriežkovej detekčnej evanescenčnej luminiscencie v porovnaní s objemovou detekciou spočíva v tom, že je tu možná miniaturizácia senzorovej základne a detekčného systému použitého spoločne s touto základňou.

Dimenzovanie rovinných vlnovodov na dosiahnutie pokial možno čo najúčinnejšej excitácie luminiscencie sa môže uskutočňovať na základe teórie rovinných vlnovodov. V tejto súvislosti sa musia sledovať nasledujúce rozmery (W. Lukosz Principles and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors for direct affinity sensins and immunosensing, Biosensors and Bioelectronics 6, 215-255 (1991), D. G. Halí, Optical waveguide diffraction gratings: coupling between guided modes, v Progres in Optics XXIX, vyd. E. Wolf, Elsevier, New York (1991)):

Penetračná hĺbka evanescenčného poľa rovinného vlnovodu do vrchnej vrstvy je vyjadrená rovnicou 1

-λ.

^ζ2π ~^η· tup tr pre účinný index lomu N , index lomu vrchnej vrstvy n a pre pracovnú vlnovú dĺžku lambda. Vo vyššie uvedenej rovnici z znamená vertikálne koordináty na povrch vlnovodu, zatiaľ čo x znamená koordináty k šíreniu svetla vo vlnovode. Ak sa berie do úvahy štandardizačný faktor f pre intenzitu elektrického poľa na povrchu vlnovodu n² - N² ~ f±Xxn &££ f =-/ n² - n² film sxit» kde n znamená index lomu vlnovodu a n znamená index £ i. Im sub lomu podložky, potom sa získa intenzitná krivka I evanescenčného poľa vyššie uvedeného vlnovodu, ktorá je úmerná:

-2z/tz f .e *

Táto intenzitná krivka excitačných evanescenčných polí vertikálnych na povrch vlnovodu predstavuje rozhodujúci činiteľ pre dimenzovanie hrúbky vrstvy a indexu lomu vlnovodu. U analytic8 kých zariadení na detekciu luminiscenčných molekúl v blízkosti vlnovodivej vrstvy je nevyhnutné pri dimenzovaní vlnovodu vziať do úvahy vzdialenosť molekuly od povrchu vlnovodu.

Na detekciu luminiscencie sa teraz zistilo, že evanescenčná spätná kopulácia luminiscencie je účinným procesom pre tenké rovinné vlnovody s vysokým indexom lomu. Voľba hrúbky vrstvy a indexu lomu má vplyv ako na excitačnú účinnosť, tak aj na spätnú evanescenčnú kopuláciu. V poslednom uvedenom prípade tu existuje konkurenčný efekt medzi vstupnou kopuláciou radiačných frakcií molekúl viazaných v blízkosti povrchu vlnovodu a vstupnou kopuláciou neviazaných molekúl z objemu vzorky.

Zistilo sa, že na účinnú detekciu molekúl, ktoré majú luminiscenčné vlastnosti a nachádzajú sa v blízkosti povrchu vlnovodu pri spôsobe podľa vynálezu musia byť parametre vlnovodu v nasledujúcich rozmedziach:

- index lomu n väčší alebo rovný 1,8 pre excitačnú vlnovú dĺžku lambda,

- hrúbka vrstvy t menšia alebo rovná excitačnej vlnovej dĺžke lambda, s výhodou menšia alebo rovná hodnote lambda/2.

Obzvlášť výhodné uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu spočíva v tom, že hrúbka vrstvy sa zvolí v rozsahu od 40 do 160 nm a súčasne hĺbková modulácia mriežok leží v rozsahu od 3 do 60 nm, pričom pomer hĺbkovej modulácie k hrúbke vrstvy je menší ako 0,5.

Tlakové vlnovody sa môžu charakterizovať tým, že umožňujú len šírenie vlnovodových módov nižšieho rádu, keď počet módov m je nižší alebo rovný 3.

Luminiscencia, ktorá je evanescenčne spätne kopulovaná do vlnovodu, je týmto vlnovodom transportovaná. Pre tento transport tu platí útlmový súčiniteľ Γ vedenej vlny. Pri nízkom Stokesovom posune sa môžu predpokladať rovnaké útlmové hodnoty ako pre excitačné, tak aj pre luminiscenčné žiarenie (možnými príčinami útlmu vo vlnovode sú rozptylové straty na rozhraní vlnovodu s okolitými prostredím, ako aj absorpcia vo vlnovodivej vrstve alebo v podložke alebo vrchnej vrstve. V prípade, že nejde o vyslovene úzke absorpčné pásy, potom sa môže očakávať pre rozptyl a absorpciu nevýznamná zmena v útlme spôsobená Stokesovým posunom, ktorá je typicky 10 až 50 nm. Takým spektrálne úzkopásmovým absorpčným účinkom je možmé zabrániť vhodnou voľbou materiálu, z ktorého sa zhotoví senzorová základňa) .

Uvedená luminiscenčná radiácia transportovaná vlnovodom sa musí potom dekopulovať z vlnovodu a zaviesť do detekčného systému. Výstupná kopulácia v koncovej rovine vlnovodu nie je vhodná. Taká kopulácia jednak vyžaduje vysokú kvalitu okrajov vlnovodu a v niektorých prípadoch aj uvedenie do styku okrajov vlnovodu s optickými detekčnými prostriedkami pomocou zaliatia kvapalným alebo gélovým médiom a jednak zabraňuje integrácii senzorových prvkov s komôrkou pre kvapalné vzorky.

Použitie druhej kopulačnej mriežky, ktorá je priestorovo odsadená od kopulačnej mriežky na vstupnú kopuláciu excitačného žiarenia, na dekopuláciu luminiscenčného žiarenia z vlnovodu úplne eliminuje vyššie uvedené ťažkosti, ktoré pramenia z dekopulácie v koncovej rovine vlnovodu. Ďalšia výhoda spočíva v tom, že vzdialenosť obidvoch uvedených kopulačných mriežok A v smere x (t.j. v smere vedenej vlny) sa môže zvoliť voľne. Takto sa tu poskytuje možnosť optimálneho nastavenia vzdialenosti A pre útlm každej vlnovej dĺžky a to bez toho, aby bolo nevyhnutné meniť vonkajšie rozmery senzorov a uvedenej komôrky. Okrem toho je tiež výhodou to, že vonkajšie strany senzorového prvku nemusia spĺňať žiadne požiadavky optickej kvality, takže ich konfigurácia sa môže prispôsobiť kvapalinovej komôrke a predovšetkým konfigurácii použitého tesnenia.

Zistilo sa, že optimálna vzdialenosť medzi mriežkami B je rovná B = x s možnosťou variácie v rozsahu

1/e

B ~ (0,2 - 3)*x _e (^Xx/e ^: dĺžka pre pokles intenzity vedenej excitačnej vlny v smere x).

(Konverzia . r[dB/cm] -> x_i/et1/mm]:x_i/e = 100/(1η10*Γ)).

Pri väčších vzdialenostiach sú ako excitačné svetlo, tak aj vedené luminiscenčné svetlo silne zoslabené, čo vedie k silnej redukcii signálu. Obmedzenie v smere pod uvedený optimálny rozsah sa neprejavuje v zhoršenej kvalite excitačnej a spätnoväzobnej kopulácie, ale v narastajúcich problémoch spojených s polohovaním obidvoch kopulačných mriežok. Vzdialenosť obidvoch mriežok menšia ako 10 mikrometrov tu nie je vhodná a to tiež vzhľadom na dimenzovanie šírky vstupnej kopulačnej mriežky, ktoré bude opísané ďalej a k priemeru svetelného lúča excitačného žiarenia na strane vstupnej kopulačnej mriežky.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález detailnejšie opísaný pomocou pripojených výkresov.

Stručný opis obrázkov

Na pripojených výkresoch

- obr. 1 znázorňuje schématický bokorysný pohľad na základňu optického senzora, ktorý je obzvlášť vhodný na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu s možnou radiačnou krivkou a

- obr.2 znázorňuje pôdorysný pohľad na senzorovú základňu z obr. 1.

Podľa obr. 1 je senzorová základňa 1 tvorená kopulačnou mriežkou 2 na kopuláciu excitačného žiarenia, kopulačnou mriežkou _3 na dekopuláciu luminiscencie, vlnovodivou vrstvou 4 a podložkou 5.

Na obr. 1 je zobrazená možná dráha lúčov excitačného a luminiscenčného žiarenia, ktoré sú vstupne kopulované do senzorovej základne a výstupne dekopulované z tejto senzorovej základne. Kopulačnou mriežkou 2 je na úrovni senzora excitovaná vedená vlna so smerom šírenia x v prípade, keď je splnená rezonančná podmienka vzhľadom na komponenty x vlnových vektorov:

k = k ± m * k = k ± m * 2π/A.

WL e±n G θ±η ' G kde m je celé číslo a k_G znamená recipročný mriežkový vektor.

k = 2πA * N = k * N : vlnový vektor - vedená vlna s účinným modálnym indexom lomu N_ef?e.

Na obr. 1 je zobrazený negatívny uhol pre vstupnú kopuláciu lsh s k = k *cost^ (kde k je rád vlnového vektora v v rovine výkresu), takže vedená vlna prebieha v opačnom smere k excitácii (tzv. spätná kopulácia). Na dekopuláciu excitačnej vlny (s k ) a luminiscenčného žiarenia (s k ) sú zvolené pozitívne uhly.

Takou vstupnou a výstupnou kopulačnou konfiguráciou s jednoznačne odlišnými smermi pre dopadajúce svetlo a pre svetlo, ktoré je dekopulované z vlnovodu sa dosiahne vysoká miera voľnosti pozadia. Priestorová separácia rôznych radiačných frakcií zaisťuje optimálny pomer signál-šum pri detekcii luminiscencie: excitačné žiarenie, ktoré je dekopulované z vlnovodu a luminiscenčné žiarenie nie sú vedené po spoločnej dráhe, takže filtre (prahové alebo pásmové filtre nie sú na obr. 1 zobrazené) sú použité len na potlačenie rozptýleného svetla, avšak nie pre všetku intenzitu excitačného žiarenia, ktoré je dekopulované z vlnovodu.

Ďalšia výhoda použitia výstupnej kopulačnej mriežky spočíva v tom, že rôzne spektrálne komponenty luminiscenčného žiarenia sú dekopulované v rôznych smeroch. Pomocou vynálezu sa preto môžu detegovať tiež molekuly v slabo luminiscenčných testovaných prostrediach a to dokonca bez dodatočných filtrov v prípade, že luminiscencia molekúl, ktoré sa majú detegovať a luminiscencia prostredia vzorky sú spektrálne odlišné.

Nastavenie uhlov pre vstupnú a výstupnú kopuláciu sa môže uskutočniť voľbou mriežkových konštánt Λ a Λ₂. Pre výhodné uskutočnenie zobrazené na obr. 1 so smerovou separáciou vstupnej a výstupnej kopulácie sa musia uvedené mriežkové konštanty zvoliť výrazne odlišne.

Alternatívne sa môžu zvoliť rovnaké mriežkové konštanty pre kopulačnú mriežku 2 a pre kopulačnú mriežku 2 a to za účelom zjednodušenia výroby senzora. To môže byť dôležité pre pokiaľ možno čo najhospodárnejšiu výrobu senzora, pretože pri použití holografickej tvorby štruktúry produkovaných mriežok sa môže vypustiť určitý počet produkčných stupňov. V prípade použitia rovnakých mriežkových konštánt je ešte viac zabezpečená priestorová separácia smeru dekopulovaného excitačného žiarenia a luminiscenčného žiarenia. Len v prípade, keď nie je zabezpečená separácia reflektovaného na vstupe kopulovaného žiarenia, sú nevyhnutné dodatočné prvky na reflexnú plošnú detekciu, napríklad clony a svetelné priepuste.

Kopulačné uhly sa môžu s výhodou nastaviť voľbou mriežkových konštánt v rozsahu od |η^| =1’ do 50° (pre veľkosť uhla). Nemali by sa použiť nižšie hodnoty kvôli Braggovmu odrazu, pretože inak k tomuto odrazu príde dokonca aj pri nízkych toleranciách nastavenia senzora v spojení s neexistenciou vstupnej alebo výstupnej kopulácie. Tiež sú možné aj väčšie uhly až do takmer 90°. Avšak nemali by sa použiť uhly veľmi presahujúce pravý uhol a to za účelom realizácie dobre definovanej dráhy žiarenia.

Dimenzovanie mriežkovej hĺbky sa môže uskutočniť v súlade s doterajším stavom techniky (T. Tamir, S. T. Peng Analysis and Design of grating Couplers·', Appl. Phys. 14, 235-254 (1979), T. Tamir, Beam and waveguide couplers in integrated Optics, vyd. T. Tamir, Springer, Berlín (1979)). Ako charakteristický znak je tu použitý tzv. rozptylový parameter alfa: alfa opisuje 1/e-pokles intenzity vedenej vlny vo vlnovo13 de, ktorého rozsah je vybavený kopulačnou mriežkou hĺbky t v . Hodnota 1/alfa je teda charakteristickou dĺžkou pre prenos radiačnej energie z vedenej vlny do vlny, ktorá sa šíri voľne a naopak.

Pre voľbu hĺbky vstupnej kopulačnej mriežky nie je najdôležitejšia absolútna hodnota rozptylového parametra, ale nastavenie rozptylového parametra a radiačného parametra dopadajúceho svetla (priemer a divergencia lúča). Za účelom dosiahnutia optimálnej vstupnej kopulácie laserového lúča s Gaussovým profilom (Gaussov parameter νθ) cez priestorovo limitovanú mriežku je nevyhnutné sledovať nasledujúce podmienky pre rozptylové parametre, priemer lúča a polohovanie lúča vzhľadom na okraj mriežky:

.a‘w = 1,36 .X /W =0,733.

g o

Hodnota x_o opisuje posun stredu svetelnej škvrny vzhľadom na polohu okraja mriežky. Tento posun musi prebiehať mimo okraja štruktúrovanej oblasti. Sledovaním tejto podmienky je možné dosiahnuť vstupné účinnosti dokonca vyššie ako 80 %.

Analogické sledovanie výstupnej kopulácie má za následok dosiahnutie veľmi vysokej kopulačnej účinnosti rovnej 80 % alebo hodnotám ešte vyšším. Vychádza sa z toho, že laterálna expanzia mriežky v smere x je výrazne vyššia ako rozptylový parameter. Intenzitný profil voľne sa šíriaceho svetelného lúča, ktorý bol dekopulovaný z vlnovodu je však asymetricky okrem iného k útlmu vedenej vlny, ktorá prechádza mriežkou.

Pri nastavovaní rozptylového parametra pre vstupnú kopuláciu sa musia sledovať nasledujúce aspekty:

- polohovanie svetelnej škvrny vzhľadom na okraj mriežky a

- miniaturizácia senzorového prvku.

Aj keď malé rozptylové parametre (alfa je oveľa menšie ako 1/mm) a zodpovedajúce veľké priemery lúča (w° je oveľa väčšie ako 1 mm) uľahčujú polohovanie, je možnosť miniaturizácie senzora veľmi obmedzená v prípade šírok mriežky, ktoré sú podstatne väčšie ako A = 3 mm. Mriežková šírka by mala byť A > ³*^wo ^na dosiahnutie úplnej kopulácie. Okrem toho majú na kopulačnú účinnosť negatívny účinok nehomogenity mriežky a vlnovodu. Zatial čo vysoké rozptylové parametre (alfa je väčšie ako 10/mm) pri priemeroch lúčov menších ako 10 mikrometrov umožňujú veľmi malé rozmery mriežok, tieto vysoké rozptylové parametre tiež umožňujú presnosť polohovania oveľa menšiu ako 100 mikrometrov. Okrem toho je kopulačná účinnosť v tomto prípade limitovaná okrem iného skutočnosťou, že divergencia lúča je oveľa väčšia ako uhlový rozsah kopulačnej rezonancie.

Zistilo sa, že rozsah rozptylových parametrov alfa = (0,2 až 5)/l mm predstavuje dobrý kompromis medzi adjustážnymi požiadavkami, polohovacími toleranciami a miniaturizáciou. Pre vyššie opísanú hrúbku vlnovodivej vrstvy zodpovedá typicky tomuto rozsahu rozsah t „ = 3 až 60 nm, predovšetkým 3 až 40 nm, pre mriežkovú hĺbku v prípade použitia sínusovej modulácie na rozhraní podložka vlnovod. Pretože rozptylový parameter je výrazne závislý na profilovej forme mriežky, je pre funkciu senzora dôležitým ukazovateľom nie geometrická hĺbka, ale rozptylový parameter.

Podložka senzorovej základne musí byť transparentná pre excitačnú a emisnú vlnovú dĺžku. Táto podložka sa môže tiež vytvoriť z plastickej hmoty, ako je to opísané napríklad v patentovom dokumente EP-A-0533074.

Podložka môže byť tiež tvorená kompozitným systémom rôznych materiálov, napríklad systémom vrstiev na nosnej doštičke a podobne. V tomto prípade je len nutné, aby index lomu materiálu, ktorý je priamo priľahlý k vlnovodu, bol menší ako index lomu vlnovodivej vrstvy.

Hospodárna výroba senzorovej základne je možná predovšetkým v prípade, keď sa môžu ako podložka pre vlnovodivý povlak použiť mikroštrukturované polyméry. V tomto prípade môže byť citlivosť detekcie obmedzená excitáciou podložky - vlastná luminiscencia. K excitácii tejto vlastnej luminiscencie a k jej evanescenčnej spätnej kopulácii dochádza na rozhraní materiálov vlnovodu a podložky mechanizmom, ktorý je analogický s vyššie opísaným mechanizmom uvedených javov na rozhraní medzi vlnovodom a vrchnou vrstvou. Táto podložková luminiscencia sa môže eliminovať použitím neluminiscenčnej medzivrstvy s nízkym indexom lomu (t.j. indexom lomu nižším alebo rovným indexu lomu vlnovodu), ktorá sa na podložku nanesie ešte pred povrstvením podložky vlnovodivým povlakom. Obzvlášť vhodným materiálom tejto medzivrstvy je oxid kremičitý alebo je tento materiál v podstate tvorený na báze oxidu kremičitého so zložením SiO H C , do ktorého sa môžu dodatočne» zaviesť nižšie x y z uhľovodíkové skupiny. Hrúbka t tejto medzivrstvy by sa mala zvoliť tak, aby došlo k lokalizácii enerejie transportovanej evanescenčným poľom vedenej vlny na podložkovej strane do uvedenej medzivrstvy. Táto podmienka je prakticky splnená v prípade, keď t _£ je väčší ako šesťnásobok hodnoty penetračnej hĺbky ζθ_ν& evanescenčného poľa. Päťnásobná hodnota je vhodná na dosiahnutie optimálneho pomeru signál-šum na detekciu evanescenčne excitovanej luminiscencie. Táto podmienka je bezpečne splnená pre tmenšie alebo rovné 2000 nm.

Ďalšou výhodou použitia medzivrstvy môže byť tiež zníženie povrchovej hrubosti (drsnosti) podložky. Tým sa zníži útlm vlnovodu F, čo má pozitívny vplyv na pomer signál-šum pri detekcii evanescenčne excitovanej luminiscencie.

Pre excitáciu luminiscencie je vhodné len v podstate pararelné svetlo. V rámci tohto vynálezu je potrebné pod pojmom v podstate pararelné rozumieť divergenciu menšiu ako 5’. To znamená, že použité svetlo môže byť mierne divergentné alebo mierne konvergentné. Väčšia divergencia zjednodušuje nastavenie vstupného kopulačného uhla, avšak znižuje luminiscenčné signály, pretože šírka vstupnej kopulačnej rezonancie je potom oveľa menšia ako uhol divergencie a takto je pre excitáciu luminiscencie dostupná len malá frakcia dopadajúceho svetla.

V rámci tohto vynálezu výraz rovinná dielektrická senzorová základňa znamená, že uvedená základňa má formu pásu, doštičky, kruhového disku alebo má ľubovoľnú inú geometrickú formu za predpokladu, že môže byť pri pozorovaní púhym okom považovaná za rovinnú. Odchýlky od takého rovinného uskutočnenia nemajú rozhodujúci význam v prípade, že vedená vlna je schopná šírenia vo vlnovodivej vrstve a že sa môže realizovať vstupná a výstupná kopulačná schéma, ktorá je analogická so schémou podľa obr. 1. Zvolená geometrická forma môže byť diktovaná konštrukciou celého zariadenia, do ktorého je senzorová základňa zabudovaná. Výhodnými uskutočneniami sú také uskutočnenia, ktoré umožňujú podstatnú miniaturizáciu.

Okrem vyššie opísaného použitia organických mikroštrukturovaných podložiek môžu sa tiež použiť anorganické podložky, ktoré sú napríklad tvorené sklom alebo kremeňom. Také podložky majú v porovnaní s polymérnymi podložkami výhodu v tom, že majú nízku vlastnú luminiscenciu. Pre hospodárnu výrobu senzorových základní je však nutné vybaviť tieto podložky povlakom s nízkym indexom lomu, do ktorého je zabudovaná mriežková štruktúra pre kopulačné mriežky, ako je opísané v patentovom dokumente EP-A-05330074.

Okrem toho sa môžu kopulačné mriežky umiestniť na rozhraní vlnovodu a vrchnej vrstvy.

Spôsoby výroby takých mriežok sú známe. Na výrobu mriežok sa takto používajú prevažne fotolitografické alebo holografické metódy a leptacie techniky, ktoré sú okrem iného opísané v Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors V. Proc. SPIE, zv. 2068, 1 až 13, 1994.

Mriežková štruktúra sa môže realizovať na podložke a potom previesť na vlnovodivú vrstvu, v ktorej sa potom mriežková štruktúra zobrazí, alebo sa mriežka produkuje priamo v samotnej vlnovodivej vrstve.

Mriežková perióda môže byť 200 až 1000 nm, pričom mriežka má s výhodou len jedinú periodicitu, čo znamená, že je monodifrakčná.

V rámci tohto vynálezu sa pod pojmom vzorka rozumie celý roztok, ktorý sa má testovať a ktorý môže obsahovať látku, ktorá sa má detegovať, t.j. analyt. Táto detekcia sa môže uskutočniť jednostupňovým alebo viacstupňovým stanovením, počas ktorého sa povrch senzorovej základne uvedie do styku s jedným alebo viacerými roztokmi. Aspoň jeden z použitých roztokov môže obsahovať látku s luminiscenčnými vlastnosťami, ktorá sa môže detegovať pri praktickom uskutočňovaní tohto vynálezu.

V prípade, že látka, ktorá má luminiscenčné vlastnosti, je už adsorbovaná na vlnovodivej vrstve (b) , potom môže byt vzorka bez luminiscenčných zložiek. Vzorka môže obsahovať ďalšie zložky, typicky pufre pH, soli, kyseliny, zásady, povrchovo aktívne látky, modifikátory viskozity alebo farbivá. Ako rozpúšťadlo sa môže predovšetkým použiť fyziologický roztok. Ak je samotná luminiscenčná zložka kvapalinou, potom sa nemusí pridať rozpúšťadlo. V tomto prípade môže vzorka obsahovať až 100 % zložky, ktorá má luminiscenčné vlastnosti.

Vzorka môže ďalej obsahovať biologické prostredie, napríklad vajcový žĺtok, telesnú tekutinu alebo jej zložku, predovšetkým krv, sérum, plazmu alebo moč. Ďalej môže byť vzorka tvorená povrchovou vodou, roztokmi alebo extraktmi prírodných alebo syntetických prostredí, akými sú pôda alebo časti rastlín a bioprocesné alebo syntézne brečky.

Vzorka môže byt buď neriedená alebo do nej môže použiť dodatočne rozpúšťadlo.

Vhodnými rozpúšťadlami sú voda, vodné pufre a roztoky proteínov v organických rozpúšťadlách. Vhodnými organickými rozpúšťadlami sú alkoholy, ketóny, estery a alifatické uhľovodíky. S výhodou sa používa voda, vodné pufre alebo zmes vody a s vodou miešatelného organického rozpúšťadla.

Vzorka však môže tiež obsahovať zložky, ktoré sú nerozpustné v rozpúšťadle, napríklad častice pigmentov, dispergačné činidlá, prírodné a syntetické oligoméry alebo polyméry. V tomto prípade má vzorka formu opticky kalnej disperzie alebo emulzie.

Vhodnými luminiscenčnými zlúčeninami sú luminiscenčné farbivá, ktoré vykazujú luminiscenciu v rozsahu vlnových dĺžok od 330 nm do 1000 nm a ktoré zahŕňajú typicky rodamíny, deriváty fluoresceínu, kumarínové deriváty, distyrylbifenyly, deriváty stilbénu, ftalocyaníny, naftalocyaníny, polypyridylruténiové komplexy, akými sú tris(2,2'-bipyridyl)ruténiumchlorid, tris(l,10-fenantrolín)ruténiumchlorid, tris(4,7-difenyl-1,10-fenantrolín)ruténiumchlorid a polypyridylfenazín-ruténiové komplexy, komplexy platiny a porfyrínu, ako oktaetylplatina-porfyrín, dlhodobé komplexy európia a terbia alebo cyanínové farbivá. Na analýzu krvi alebo krvného séra sú obzvlášť vhodnými farbivami farbivá, ktoré vykazujú absorpčné a emisné vlnové dĺžky v rozsahu 600 až 900 nm.

Obzvlášť vhodnými luminiscenčnými zlúčeninami sú farbivá ako fluoresceínové deriváty s obsahom funkčných skupín, ktoré môžu byť kovalentne viazané, napríklad fluoresceín-izokyanát.

Tiež veľmi vhodné sú fluorescenčné farbivá, ktoré sú dostupné u firmy Biological Detection Systems Inc., napríklad mono- a bifunkčné farbivá Cy5,5™, ktoré sú okrem iného opísané v Clinical Chemistry 40 (9): 1819 až 1822, 1994.

Výhodnou luminiscenciou je fluorescencia. Pre excitáciu je výhodné použiť koherentné svetlo, pretože takto sa môže splniť s vysokou účinnosťou rezonančná podmienka vo vstupnej kopulačnej mriežke. Laserové svetelné zdroje použité v rámci vynálezu sa potom zvolia podľa absorpčnej vlnovej dĺžky luminiscenčných alebo fluorescenčných molekúl. Obzvláštny význam majú v tejto súvislosti laserové diódy alebo superluminiscenč4 Κ· né diódy, pretože také svetelné zdroje umožňujú vysokú miniaturizáciu detekčného systému priradeného k senzorovej základni .

Luminiscenčné farbivá, ktoré prichádzajú do úvahy na použitie v rámci vynálezu, môžu byť chemicky viazané k polymérom alebo k jednému z väzbových partnerov biochemických afinitných systémov, akými sú napríklad protilátky alebo fragmenty protilátok, antigény, proteíny, peptidy, receptory alebo ich ligandy, hormóny alebo hormónové receptory, oligonukleotidy, reťazce DNK a reťazce RNK, DNK alebo RNK analógy, väzbové proteíny, ako proteín A a G, avidín alebo biotín, enzpy, enzýmové kofaktory alebo inhibítory, lektíny alebo uhľohydráty. Posledné uvedené kovalentné luminiscenčné značenie predstavuje výhodné uskutočnenie pre reverzibilné alebo ireverzibilné (bio)chemické stanovenie. Ďalej sa môžu použiť luminiscenčné značené steroidy, lipidy a chelátory. Tiež sú zaujímavé interkalačné luminiscenčné farbivá na hybridizačné stanovenie za použitia reťazcov DNK alebo oligonukleotidov, predovšetkým v prípade, keď tieto farbivá, podobne ako rôzne ruténiové komplexy, vykazujú zlepšenú luminiscenciu v rámci interkalácie. V prípade, že sa tieto luminiscenčné značené zlúčeniny uvedú do styku s ich afinitnými partnermi imobilizovanými na povrchu senzorovej základne, potom sa môže väzba stanoviť kvantitatívne zo zmeranej intenzity luminiscencie. Analyt sa môže tiež kvantitatívne stanoviť zmeraním zmeny luminiscencie v prípade, keď vzorka vstúpi do interakcie s luminofórmi, napríklad vo forme luminiscenčného zhášania kyslíkom alebo luminiscenčného zosilnenia konformačnými modifikáciami proteínov.

Vhodnými materiálmi na vytvorenie vlnovodivej vrstvy sú typicky anorganické látky, ako TiO , ZnO, Nb 0 , Ta O , HfO

2 5 2 5 2 alebo ZrO .

Výhodnými anorganickými oxidmi sú Ta₂O_s a TxO₌.

V rámci spôsobu podľa vynálezu sa môže uviesť vzorka do styku s vlnovodivou vrstvou v imobilnom stave alebo sa môže okolo vlnovodivej vrstvy kontinuálne viesť, pričom sa môže použiť otvorený alebo uzavretý cyklus.

Špecifické uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu spočíva v tom, že sa látky, ktoré majú luminiscenčné vlastnosti a sú určené na stanovenie analytu, imobilizujú priamo na povrchu vlnovodivej vrstvy (b). Touto látkou, ktorá má luminiscenčné vlastnosti, môže byť napríklad luminofór, ktorý je viazaný k proteínu a ktorý môže byť týmto spôsobom excitovaný za vzniku luminiscencie na povrchu vlnovodivej vrstvy. V prípade, že je okolo tejto vrstvy vedený partner, ktorý má afinitu k uvedenému proteínu, potom môže dôjsť k modifikácii luminiscencie a množstvo uvedeného partnera sa môže týmto spôsobom stanoviť na základe miery modifikácie luminiscencie. Predovšetkým môžu byť luminofórmi značení obidvaja partneri afinitného komplexu tak, aby sa mohlo uskutočniť stanovenie koncentrácií z prenosu energie medzi obidvoma partnermi, napríklad vo forme luminiscenčného zhášania.

Ďalšie výhodné uskutočnenie spôsobu uskutočňovania chemických alebo biochemických afinitných stanovení spočíva v tom, že sa na povrchu senzorovej základne imobilizuje špecifický väzbový partner, akým je chemická alebo biochemická detekčná látka pre samotný analyt alebo pre jeden z väzbových partnerov. Týmto stanovením môže byť jednostupňové alebo viacstupňové stanovenie, počas ktorého sa v následných stupňoch uvádza do styku s povrchom senzorovej základne jeden alebo viac ako jeden roztok, ktorý obsahuje väzbového partnera pre detekčné látky imobilizované na povrchu senzorovej základne, pričom k väzbe analytu dochádza v niektorom z parciálnych stupňov. Detekcia analytu sa uskutočňuje väzbovými luminiscenčné značenými účastníkmi afinitného stanovenia. Uvedenými luminiscenčné značenými látkami môžu byť jeden alebo viac ako jeden väzbový partner afinitného testu alebo analóg analytu vybavený luminofórom. Jediným kritériom pritom je to, že prítomnosť analytu vedie k luminiscenčnému signálu alebo k zmene luminiscenčného signálu, pričom tento luminiscenčný signál alebo táto zmena luminiscenčného signálu sú selektívne pre da21 ný analyt.

Imobilizácia detekčných látok sa môže typicky uskutočniť hydrofóbnou absorpciou alebo kovalentnou väzbou priamo na vlnovodivú vrstvu alebo až po úprave jej povrchu, napríklad silanizáciou alebo nanesením polymérnej vrstvy. Okrem toho sa môže priamo na vlnovodivú vrstvu naniesť tenká medzivrstva, napríklad tvorená oxidom kremičitým, ktorá plní funkciu vrstvy podporujúcej adhéziu a ktorá uľahčuje imobilizáciu detekčných látok priamo na vlnovode. Hrúbka tejto medzivrstvy by nemala presahovať 50 nm, s výhodou 20 nm.

Vhodnými detekčnými látkami sú typicky protilátky pre antigény, väzbové proteíny, akými sú protein A a B pre imunoglobulín, receptory pre ligandy, oligonukleotidy a reťazce RNK a DNK pre ich komplementárne reťazce, avidín pre biotín, enzýmy pre enzýmové substráty, enzýmové kofaktory alebo inhibítory, lektíny pre uhľohydráty. To, ktorý z väzbových partnerov sa pri afinitnom stanovení imobilizuje na povrch senzorovej základne, bude závisieť na skúsenosti odborníka, ktorý stanovenie uskutočňuje.

Samotné stanovenie môže byť jednostupňovým komplexujúcim procesom, ktorý má formu konkurenčného testu, alebo tiež viacstupňovým procesom, ktorý má formu napríklad sendvičového testu.

V najjednoduchšom prípade konkurenčného testu sa vzorka, ktorá obsahuje analyt s neznámou koncentráciou a známym množstvom zlúčeniny, ktorá je rovnaká ako analyt s výnimkou luminiscenčného značenia, uvedie do styku s povrchom senzorovej základne, kde si luminiscenčné značené molekuly a neznačené molekuly vzájomne konkurujú pri obsadzovaní väzbových miest na ich detekčných látkach, ktoré sú tu imobilizované. Maximálny luminiscenčný signál sa pri tomto usporiadaní testu získa v prípade, keď vzorka neobsahuje žiadny analyt. So stúpajúcou koncentráciou látky, ktorá sa má detegovať, vo vzorke dochádza k zmenšovaniu luminiscenčného signálu.

Pri konkurenčnom imunologickom stanovení to nemusí byt nevyhnutne protilátka, ktorá sa imobilizuje. Na povrchu senzorovej základne sa môže ako detekčná látka imobilizovať tiež antigén. Obvykle je nepodstatné, ktorý z obidvoch partnerov sa pri chemickom alebo biochemickom teste imobilizuje na povrchu senzorovej základne. To je podstatnou výhodou stanovení založených na luminiscencii v porovnaní s metódami, akými sú povrchová plazmonová rezonančná metóda alebo interferometria, ktoré sú založené na zmene adsorbovanej hmoty v evanescenčnom poli vlnovodivej vrstvy.

Okrem toho v prípade konkurenčných stanovení nemusí byt obmedzená na konkurenciu látok pri obsadzovaní väzbových miest na povrchu senzorovej základne. Tak napríklad na povrchu senzorovej základne sa môže imobilizovať známe množstvo antigénu a tento povrch sa môže potom uviesť do styku so vzorkou, ktorá obsahuje neznáme množstvo určené na stanovenie rovnakého antigénu ako analyt a luminiscenčné značenej protilátky. V tomto prípade dochádza medzi antigénmi, ktoré sú imobilizované na povrchu senzorovej základne a ktoré sú prítomné v roztoku, k vzájomnej konkurencii pri viazaní protilátok.

Najjednoduchším prípadom viacstupňového testu je sendvičový imunologický test, pri ktorom sa najprv protilátka imobilizuje na povrchu senzorovej základne. Viazanie antigénu, ktorý sa má stanoviť a luminiscenčné značenej sekundárnej protilátky použitej na uskutočnenie stanovenia k druhému epitopu antigénu sa môže uskutočniť buď postupným uvedením do styku s roztokom, ktorý obsahuje antigén a druhým roztokom, ktorý obsahuje luminiscenčné značenú protilátku alebo predbežným zlúčením obidvoch týchto roztokov tak, aby sa nakoniec dosiahlo viazanie parciálneho komplexu tvoreného antigénom a luminiscenčné značenou protilátkou.

Afinitné stanovenia môžu tiež zahŕňať ďalšie dodatočné väzbové stupne. Tak napríklad v prípade sendvičového imunologického stanovenia sa môže v prvom stupni imobilizovať na po23 vrchu senzorovej základne proteín A, ktorý špecificky viaže imunoglobulíny, ktoré potom pôsobia ako primárne protilátky pri následnom sendvičovom teste, ktorý sa uskutočňuje vyššie opísaným spôsobom, v ich tzv. časti F .

Existuje celý rad ďalších typov afinitných stanovení, ktoré obvykle využívajú známy afinitný systém avidín-biotín.

Príklady typov afinitných stanovení sa môžu nájsť v J. H. Rittenburg, Fundamentals of Immunoassay, v Development and Application of Immunoassay for Food Analysis, J. H. Rittenburg (vyd.), Elsevier, Essex 1990 alebo v P. Tijssen, Practice and Theory of Enzýme Immunoassays, R. H. Burdon, P.H. van Knippenberg (vyd.), Elsevier, Amsterdam 1985.

Povrch senzorovej základne sa nemusí okrem toho použiť len raz, ale môže sa regenerovať pre opätovné použitie. Za vhodných podmienok, ktorými sú napríklad nízka hodnota pH, zvýšená teplota, použitie organických rozpúšťadiel alebo tzv. chaotripných činidiel (solí), je možné selektívne rozložiť afinitné komplexy a to bez podstatného zhoršenia väzbovej kapacity imobilizovaných detekčných látok. Presné podmienky, ktoré by sa mali použiť v konkrétnych prípadoch, budú do značnej miery závisieť na špecificky použitom afinitnom systéme.

Ďalšie základné uskutočnenie spôsobu podía vynálezu spočíva jednak v obmedzení produkcie signálu - v prípade spätnej kopulácie to tiež platí pre signálovú detekciu - na evanescenčné pole vlnovodu a jednak v reverzibilite tvorby afinitného komplexu vo funkcii rovnovážneho procesu. Za použitia vhodných prietokových rýchlostí v kontinuálnom prietokovom systéme sa môže monitorovať v reálnom čase viazanie alebo desorpcia alebo disociácia viazaných luminiscenčné značených afinitných partnerov v evanescenčnom poli. Tento spôsob je preto vhodný pre kinetické štúdie, pri ktorých sa stanovujú rôzne asociačné alebo disociačné konštanty, alebo tiež pre vytesňovacie testy.

Detekcia evanescenčne excitovanej luminiscencie sa môže uskutočniť známymi metódami. Pritom sa môžu vhodne použiť fotodiódy, fotobunky, fotonásobiče, CCD kamery a detektorové súbory, napríklad CCD články. Luminiscencia sa môže zobraziť optickými prvkami, akými sú zrkadlá, hranoly, šošovky, Fresnelove šošovky a šošovky s gradientom indexu lomu. Za účelom výberu emisnej vlnovej dĺžky sa môžu použiť známe prostriedky, akými sú filtre, hranoly, monochromatické filtre, dichromatické zrkadlá a ohybové mriežky.

Jednou z výhod spôsobu podľa vynálezu je to, že okrem detekcie luminiscencie sa môže tiež stanoviť absorpcia ožarovacieho excitačného svetla. V porovnaní s multimodálnymi vlnovodmi v tvare optického vlákna alebo s rovinnou konštrukciou sa v tomto prípade získa podstatne lepší pomer signál-šum. Súčasné meranie luminiscencie a absorpcie umožňuje stanoviť efekt luminiscenčného zhášania s vysokou citlivosťou.

V rámci jednoduchého uskutočnenia vynálezu sa môže spôsob podľa vynálezu uskutočniť ožiarením excitačným svetlom v kontinuálnom vlnovom móde (mód cw), čo znamená, že sa excitácia uskutočňuje za použitia intenzity svetla, ktorá je konštantná v čase.

Spôsob podľa vynálezu sa však môže tiež uskutočniť ožiarením excitačným svetlom vo forme časovaných pulzov s dĺžkou pulzu napríklad od jednej pikosekundy až do 100 sekúnd a časovo rozloženou detekciou luminiscencie - v prípade krátkych dĺžok pulzov - alebo v intervaloch sekúnd až minút. Táto metóda je obzvlášť výhodná v prípade, že je potrebné napríklad monitorovať analyticky rýchlosť tvorenia väzby alebo zabrániť zmenšeniu luminiscenčného signálu v dôsledku zhášania luminiscenčného signálu za použitia krátkych expozičných časov. Použitím príslušne krátkej dĺžky pulzu a vhodnej časovo rozloženej detekcie je tiež možné odlíšiť rozptýlené svetlo, Ramanovu emisiu a krátkodobú luminiscenciu každej nežiadúcej luminiscenčnej zložky prítomnej vo vzorke alebo v materiáli senzora od luminiscencie značiacej molekuly, ktorá je v tomto prípade s výhodou dlhodobá, detekciou emisie analytu potom, čo došlo k zhasnutiu uvedeného krátkodobého žiarenia. Okrem toho umožňuje časovo rozložená detekcia luminiscencie po pulznej excitácii rovnako ako modulovaná excitácia a detekcia výskum vplyvu viazania analytu na rozpad molekulovej luminiscencie. Okrem špecifického rozpoznania analytu imobilizovanými detekčnými látkami a priestorového obmedzenia tvorenia signálu na evanescenčné pole vlnovodu môže sa čas rozpadu molekulovej luminiscencie použiť ako ďalšie kritérium selektivity.

Spôsob podľa vynálezu sa môže tiež uskutočňovať vstupnou kopuláciou excitačného svetla, ktoré má jednu alebo viac ako jednu frekvenciu s modulovanou intenzitou, a detekciou výsledného fázového posunu a modulácie luminiscencie vzoriek.

Vynález sa ďalej týka použitia spôsobu podľa vynálezu na kvantitatívne stanovenie analytov pri chemických alebo biochemických afinitných stanoveniach so známymi afinitnými partnermi a metodikami testov detegovaním emisie značených väzbových partnerov schopných luminiscencie alebo detegovaním zmien luminiscenčných vlastností imobilizovaných luminiscenčné značených afinitných partnerov interakciou s analytom.

Pretože tvorenie a detekcia signálov sú obmedzené na povrch vlnovodu a vzhľadom na to, že sú diskriminované interferenčné signály z prostredia, môže sa monitorovať v reálnom čase väzba látok k imobilizovaným detekčným prvkom. Spôsob podľa vynálezu sa môže preto tiež použiť na triediace afinitné testy alebo na vytesňovacie testy, predovšetkým na vývoj farmaceutických produktov a to priamou detekciou asociačných a disociačných rýchlostí v prietokových kontinuálnych systémoch s vhodnými prietokovými rýchlosťami.

Vynález sa ďalej týka použitia spôsobu podľa vynálezu na kvantitatívne stanovenie protilátok alebo antigénov.

Spôsob podľa vynálezu sa môže tiež použiť na kvantitatívne stanovenie receptorov ligandov, oligonukleotidov, reťazcov DNK alebo RNK, analógov DNK alebo RNK, enzýmov, enzýmových substrátov, enzýmových kofaktorov alebo inhibítorov, lektínov a uhľohydrátov.

Vynález sa ďalej týka použitia spôsobu podľa vynálezu na selektívne kvantitatívne stanovenie luminiscenčných zložiek v opticky kalných tekutinách.

Opticky kalnými kvapalinami môžu byť typicky biologické tekutiny, akými sú vajcový žĺtok, telesné tekutiny, akými sú krv, sérum alebo plazma a tiež vzorky, ktoré sa týkajú analýzy životného prostredia, medzi ktoré patrí povrchová voda, rozpustené pôdne extrakty a rozpustené rastlinné extrakty. Vhodnými tekutinami sú tiež reakčné roztoky získané v chemickej výrobe, predovšetkým roztoky farbív alebo reakčné roztoky, ktoré pochádzajú z výroby fluorescenčných bieliacich činidiel. Tiež vhodné sú všetky typy disperzií a formulácií, ktoré sa obvykle používajú v textilnom priemysle, za predpokladu, že obsahujú jeden alebo viac ako jeden luminiscenčný komponent. Tento spôsob sa môže takto použiť na kontrolu dodržania kvality výrobkov.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou príkladov konkrétneho uskutočnenia vynálezu, pričom tento príklad má len ilustračný charakter a žiadnym spôsobom neobmedzuje rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Optický systém

Použitým svetelným zdrojom je laserová dióda, ktorá vyžaruje svetlo s vlnovou dĺžkou lambda = 670 nm (firma Oz

Optics). Nastavenie na svetelnú stopu, ktorá má priemer v rovine senzora 0,4 nm vertikálne k čiaram kopulačnej mriežky a 2,5 mm pararelne k čiaram mriežky sa uskutoční pomocou zobrazovacieho systému.

Nastavenie vstupného kopulačného uhla a polohovanie svetelnej stopy vzhľadom na okraj mriežky sa uskutočňuje pomocou mechanických adjustážnych jednotiek. Výkon laseru na senzorovom čipe sa môže zvoliť v rozsahu P = 0 až 3 mW, zatiaľ čo P = 1,2 mW sa zvolí pre nasledujúce pokusy uskutočňované za účelom charakterizácie mriežok a P = 0,2 mW sa zvolí pre meranie fluorescencie. Lineárne polarizované svetlo s orientáciou TE alebo TM môže byť vstupne kopulované za použitia otočných polarizujúcich prvkov.

Prietoková komôrka utesnená vzhľadom na senzor kruhovým tesnením je umiestnená na hornej strane senzorovej základne. Objem komôrky určený pre vzorku je rovný asi 8 mikrolitrom. Do vzorkovej komôrky sa môžu zavádzať rôzne roztoky za použitia prúdových čerpadiel a preraďovacích ventilov.

Excitácia a detekcia sa uskutočňujú zo spodnej strany senzorovej základne, ako je zrejmé z obr. 1.

V rámci uvedeného príkladného usporiadania sú k dispozícii tri meracie kanály na detekciu: pre fluorescenčné a excitačné svetlo dekopulované z vlnovodu výstupnou kopulačnou mriežkou (v smeroch K· a k podľa obr. 1) a dopadajúce excitačné svetlo cez delič lúča (nie je znázornený).

Na detekciu fluorescenčného žiarenia je ako detektor použitý násobič v monofotónovom počítacom móde (Hamamatsu R 4632 SEL) s impulzotvornou elektronikou (Hamamatsu C3 866). Jeho TT1 výstupný signál je spojený s konvenčným impulzovým počítačom (Hewlett-Packard 53131 A). Fluorescenčné žiarenie z uhlových sektorov môže byť zaostrené na detektor cez fokuzačný šošovkový systém. Pred čelo detektora sú umiestnené interferenčné filtre pre potlačenie rozptýleného svetla (pásmový filter: lambda = 725 nm pri polovici šírky 25 nm, firma Omega).

Ako referenčné detektory pre dopadajúcu radiáciu a excitačnú radiáciu, ktorá je dekopulovaná z vlnovodu, sú použité

Si-diódy (UDT PIN 10D) s meracím zosilovačom (UDU 101 C) zapojené do série.

Počas uskutočňovania nižšie opísaného testu sú simultánne vyhodnocované všetky tri meracie kanály za použitia konvenčného systému pre príjem dát.

Senzorová základňa

Ako podložka sa použije polykarbonát, ktorý je mikroštrukturovaný ďalej uvedeným spôsobom dvomi mriežkami pre vstupnú a výstupnú kopuláciu.

Vstupná kopulačná mriežka s periódou Λ = (299,5 ± 0,7 nm), hĺbkou t = 6,9 nm až 12,3 nm a výstupná kopulačná mriežka s periódou = (489,5 ± 0,7 nm), hĺbkou t_ = 8,2 nm až 12, 8 nm, ktoré sú použité, majú približne profil sin⁴.

Usporiadanie mriežok na senzore je zrejmé z obr. 2 a má nasledujúce geometrické charakteristiky: vzdialenosť mriežok A = 4 mm, šírka mriežok (kolmo na čiary) Β_χ = B₂ = 2 mm, výška mriežok (pararelne s čiarami) = 4 mm, pričom rozmery senzorovej základne sú 12 x 20 mm².

Za účelom potlačenia autofluorescencie (vlastnej fluorescencie) polykarbonátu je uvedená podložka povrstvená medzivrstvou z oxidu kremičitého, ktorá má index lomu n =1,46 a hrúbku t = (100 ± 10 nm) a potom vlnovodivou vrstvou z oxidu titaničitého, ktorá má vysoký index lomu h _x = 2,35 pri vlnovej dĺžke lambda = 670 nm a hrúbke vrstvy t_£ixm = = (170 ± 5 nm).

Pomocou excitačného svetla môžu byť excitované vo vlnovode pre túto kombináciu mriežka-vlnovod módy rádu m =0: pre ΤΕθ sa vstupná kopulácia uskutočňuje pod uhlom Θ = (-10 ± ± 1,6)’, pre ΤΜθ pod uhlom Θ = (-22,7 ± 3,7)’.

Fluorescenčné žiarenie sa dekopuluje z vlnovodu s polari29 záciou TE v uhlovom rozsahu Θ = 31’ až 40°, zatiaľ čo excitačné svetlo sa dekopuluje z vlnovodu pod uhlom θ > 42⁴. Ide o spektrálnu oblasť lambda asi 685 nm až 715 nm. Pre TM polarizáciu je výstupný kopulačný uhol v rozsahu θ = 17’ až 25’ pre fluorescenciu a Θ >27’ pre excitačné žiarenie. Pre TE polarizáciu sa deteguje za výstupnou kopulačnou mriežkou svetelná účinnosť P = 30 až 50 μΝ pri dopadajúcom výkone laseru P = 1,2 mW.

Detekcia Cy 5,5™-značeného imunoglobulínu

Značenie imunoglobulínu farbivom Cy 5,5™:

Králičí imunoglobulín (králičí IgG, Sigma Chemicals) sa označil rovnako, ako sa to doporučuje producentom farbiva, bifunkčným cyanínovým farbivom FluoroLink™ Cy 5,5™ (Biological Detection Systems, Pittsburgh PA 15238, USA):

1) roztok 2,5 mg králičieho IgG v 1 ml farbiva, inkubačný čas 45 minút, roztok sa pretrepe každých 10 minút,

2) pridanie tohto roztoku k 1 ml farbiva, inkubačný čas 45 minút, roztok sa pretrepe každých 10 minút,

3) oddelenie farbiva viazaného k proteínu od neviazaného farbiva na stĺpci produktu Sephadex R G25 (Pharmacia LKB, Biotechnology AB, Uppsala, Švédsko), ktorý sei predbežne uviedol do rovnovážneho stavu s 50 ml fosfátového pufra s pH 7:

- odliatie asi 1 ml a

- odoberanie daného počtu frakcií,

4) stanovenie pomeru farbivo/proteín na základe optickej hustoty pri vlnovej dĺžke 678 nm (absorpčné pásmo farbiva) a pri vlnovej dĺžke 280 nm (absorpčné pásmo proteínu), pričom zo zistených výsledkov sa stanoví pomer 1 molekuly farbiva k dvom molekulám proteínu.

..

Použité roztoky

1) Pufrový roztok tvorený (0,041 M Na₂HPO^ + 0,028 M ΚΗ,,ΡΟ^) , 0,151 M NaCl, 200 mg/1 azidu sodného a 50 ml metanolu, pričom zvyšok do jedného litra je tvorený destilovanou vodou,

2) roztok imobilizujúceho proteínu A (Sigma Chemicals) : : 1 mg/ml destilovanej vody,

3) neutralizačný roztok: pufrový roztok 1)+10 mg/ml albumínu z bovinového séra (BSA, Sigma Chemicals),

4) oplachovací roztok: (je tiež použitý na stanovenie signálu v pozadí) pufrový roztok 1) + 1 mg/ml albumínu z bovinového séra,

5) roztoky vzorky: Cy 5,5™-značený imunoglobulín v rôznych koncentráciách 10~^sM, 10“®M, 3.10^-:L°M, 1.10^-loM v pufrovom roztoku 1) s 1 mg/ml albumínu z bovinového séra,

6) regeneračný roztok: glycínový pufor s pH 2,5.

Aplikácia biochemickej indikátorovej vrstvy proteínu A

Optická senzorová základňa sa inkubuje počas 10 hodín s roztokom 2) za účelom imobilizácie proteínu A. Za účelom neutralizácie všetkých ešte voľných adsorpčných miest sa senzorová základňa premyje destilovanou vodou a potom opäť inkubuje počas jednej hodiny v neutralizačnom roztoku, ktorý obsahuje 10 h/1 albumínu z bovinového séra.

Merací postup/stanovenie

Počas celého stanovenia sa udržiava okolo účinného senzorového povrchu prietok 0,25 ml/min.

Proces stanovenia zahŕňa nasledujúce individuálne stupne:

- premývanie počas 4 minút oplachovacím roztokom 4), pričom sa zaznamenáva signál v pozadí,

- pridanie roztoku vzorky 5) počas 4 minút,

- premývanie počas 4 minút oplachovacím roztokom,

- pridanie regeneračného roztoku 6) počas 4 minút,

- premývanie počas 4 minút oplachovacím roztokom 4).

Počas celého postupu sa meria fluorescenčný signál dekopulovaný z vlnovodu druhou kopulačnou mriežkou. Pri rôznych koncentráciách sa zaznamenali po ukončení pridania vzorky nasledujúce zmeny signálu v porovnaní s pôvodným signálom pozadia (pomer signál-šum medzi 50 a 100 impulzmi za sekundu):

[Cy 5,5-IgG] fluorescenčný signál [impulzy.s^-1]

10^-sM 7000

10“⁹M 850

3.10^_:LOM 300

Detekčná medza pre detekciu fluorescencie dekopulovanej výstupnou kopulačnou mriežkou je jednoznačne pod 3.10^-1°M, čo zodpovedá analytovej koncentrácii 3.10^-13 mólu Cy

5,5-značeného IgG.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob stanovenia luminiscencie rovinnou dielektrickou optickou senzorovou základňou, ktorá je tvorená transparentnou podložkou (a), na ktorú je nanesená tenká vlnovodivá vrstva (b), pričom senzorová základňa je vybavená kopulačnou mriežkou na vstupnú kopuláciu excitačného svetla a index lomu uvedenej podložky (a) je nižší ako index lomu vlnovodivej vrstvy (b), uvedením kvapalnej vzorky do styku s vlnovodivou vrstvou (b) vo forme vrchnej vrstvy a meraním luminiscencie, produkovanej látkami s luminiscenčnými vlastnosťami a obsiahnutými vo vzorke alebo látkami s luminiscenčnými vlastnosťami a imobilizovanými na vlnovodivej vrstve (b), optoelektronický kopuláciou excitačného svetla kopulačnou mriežkou do rovinného vlnovodu tak, aby toto excitačné svetlo prešlo vlnovodivou vrstvou, pričom látky, ktoré majú luminiscenčné vlastnosti, sú excitované k luminiscencii v evanescenčnom poli vlnovodivej vrstvy, vyznačujúci sa tým, že sa použije vlnovodivá vrstva s hrúbkou menšou ako vlnová dĺžka lambda excitačného svetla a tvorená materiálom, ktorého index lomu pri uvedenej vlnovej dĺžke excitačného svetla je vyšší alebo rovný

   1,8, pričom sa luminiscenčná radiácia, spätne kopulovaná do vlnovodivej vrstvy (b), dekopuluje z vlnovodivej vrstvy druhou kopulačnou mriežkou, priestorovo odsadenou od prvej uvedenej kopulačnej mriežky, a deteguje sa.
2. 2. Spôsob podía nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa použije vlnovodivá vrstva s hrúbkou menšou ako lambda/2.
3. 3. Spôsob podía nároku 1,vyznačujúci sa tým, že hrúbka vlnovodivej vrstvy je rovná 40 až 160 nm.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že modulačná hĺbka mriežky je rovná 3 až 60 nm.
5. 5. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že excitačné žiarenie je dekopulované pod iným uhlom, ako pod ktorým je dekopulované luminiscenčné žiarenie.
6. 6. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že excitačné žiarenie je kopulované do vlnovodu smerom dozadu a ako excitačné svetlo prenášané vlnovodom, tak aj luminiscencia transportovaná vo vlnovode sú z vlnovodu dekopulované smerom dopredu.
7. 7. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že excitačné žiarenie je kopulované do vlnovodu pod uhlom v rozsahu od asi 1 do -50’.
8. 8. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že luminiscenčné žiarenie spätne kopulované do vlnovodu je z vlnovodu dekopulované pod uhlom v rozsahu od asi 1 do 50°.
9. 9. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa potlačí luminiscencia podložky.
10. 10. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že pre excitáciu luminiscencie sa použije v podstate pararelné svetlo.
11. 11. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že látky schopné luminiscencie a použité na detekciu analytu sú imobilizované priamo na povrchu vlnovodivej vrstvy.
12. 12. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa imobilizáciu špecifického väzbového partnera vo funkcii chemickej alebo biochemickej detekčnej látky pre samotný analyt alebo pre jeden z väzbových partnerov na povrchu senzorovej základne pri viacstupňovom stanovení, počas ktorého sa analyt stane viazaným pri jednom z parciálnych stupňov.
13. 13. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že sa súčasne stanoví absorpcia ožarujúceho excitačného svetla.
14. 14. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že excitačné svetlo je kopulované do vlnovodu v kontinuálnom vlnovom móde (cw-mód).
15. 15. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa vstupnú kopuláciu excitačného svetla vo forme časovaného pulzu a časovo rozloženú detekciu luminiscencie.
16. 16. Spôsob podľa nároku 15,vyznačujúci sa tým, že dĺžka pulzu sa nastaví v intervale od jednej pikosekundy až do 100 sekúnd.
17. 17. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa vstupnú kopuláciu excitačného svetla s modulovanou intenzitou pri jednej alebo viac ako jednej frekvencii a detekciu výsledného fázového posunu a modulácie luminiscencie vzorky.
18. 18. Spôsob podľa niektorého z nárokov l až 17, vyznačujúci sa tým, že detegovanou vzorkou je vajcový žĺtok, krv, sérum, plazma alebo moč.
19. 19. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 18, vyznačujúci sa tým, že detegovanou vzorkou je povrchová voda, pôdny alebo rastlinný extrakt alebo bioprocesná alebo syntézna brečka.
20. 20. Použitie spôsobu podľa niektorého z nárokov 1 až 19 na kvantitatívne stanovenie biochemických látok pri snímaní afinity.
21. 21. Použitie spôsobu podľa niektorého z nárokov 1 až 19 na kvantitatívne stanovenie protilátok alebo antigénov.
22. 22. Použitie spôsobu podľa niektorého z nárokov 1 až 19 na kvantitatívne stanovenie receptorov alebo ligandov, oligonukleotidov, reťazcov DNK alebo RNK, analógov DNK alebo RNK, enzýmov, enzýmových substrátov, enzýmových kofaktorov alebo inhibítorov, lektínov a uhľohydrátov.
23. 23. Použitie spôsobu podľa niektorého z nárokov 1 až 19 na selektívne kvantitatívne stanovenie luminiscenčných zložiek v opticky kalných tekutinách.
24. 24. Optická senzorová základňa (1) na stanovenie luminiscenčného žiarenia podľa niektorého z nárokov 1 až 23, ktorá v podstate obsahuje rovinnú opticky transparentnú podložku (5), na ktorej je nanesená tenká vlnovodivá vrstva (4), pričom senzorová základňa je vybavená kopulačnou mriežkou (2) na vstupnú kopuláciu excitačného žiarenia a index lomu podložky je menší ako index lomu vlnovodivej vrstvy (4), vyznačujúca sa tým, že hrúbka vlnovodivej vrstvy (4) je menšia ako vlnová dĺžka lambda excitačného žiarenia a vlnovodivá vrstva je vytvorená z materiálu, ktorého index lomu pri vlnovej dĺžke excitačného svetla je väčší ako 1,8, pričom senzorová základňa obsahuje druhú kopulačnú mriežku (3), ktorá je priestorovo odsadená od prvej kopulačnej mriežky (2), na dekopuláciu luminiscenčného žiarenia, ktoré sa spätne kopulovalo do vlnovodu, z vlnovodu.
25. 25. Optická senzorová základňa podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že hrúbka vlnovodivej vrstvy (4) je menšia ako lambda/2.
26. 26. Optická senzorová základňa podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že hrúbka vlnovodivej vrstvy (4) je rovná 40 až 160 nm.
27. 27. Optická senzorová základňa podľa nároku 24, v y z n a č u— júca sa tým, že modulačná hĺbka mriežky je 3 až 60 nm.
28. 28. Optická senzorová základňa podľa niektorého z nárokov 24 až 27,vyznačujúca sa tým, že mriežková konštanta prvej kopulačnej mriežky (2) pre vstupnú kopuláciu excitačného žiarenia je odlišná od mriežkovej konštanty druhej kopulačnej mriežky (3) na dekopuláciu luminiscenčného žiarenia.
29. 29. Optická senzorová základňa podľa niektorého z nárokov 22 až 24,vyznačujúca sa tým, že vzdialenosť mriežok je B < X , kde X znamená dĺžku, v ktorej intenzita dopadajúceho žiarenia poklesla na Ιθ/e.
30. 30. Optická senzorová základňa podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že vzdialenosť mriežok je B > > 0,2.X

    X/e
31. 31. Optická senzorová základňa podľa niektorého z nárokov 24 až 30,vyznačujúca sa tým, že medzi podložkou (5) a vlnovodivou vrstvou (4) obsahuje medzivrstvu s nízkym indexom lomu na potlačenie luminiscencie podložky.
32. 32. Optická senzorová základňa podľa nároku 31, vyznačujúca sa tým, že medzivrstva s nízkym indexom lomu je v podstate vytvorená z SiO^ alebo Si^C^H^.
33. 33. Optická senzorová základňa podľa nároku 31 alebo nároku 32, vyznačujúca sa tým, že hrúbka medzivrstvy je menšia alebo rovná 1000 nm.
34. 34. Optická senzorová základňa podľa niektorého z nárokov 24 až 33,vyznačujúca sa tým, že sa použije organická mikroštrukturovaná podložka.
35. 35. Optická senzorová základňa podľa niektorého z nárokov 24 až 34,vyznačujúca sa tým, že sa použije organická podložka s mikroštrukturovaným organickým povlakom.
36. 36. Optická senzorová základňa podľa niektorého z nárokov 22 až 35, vyznačujúca sa tým, že rovinná transparentná vlnovodivá vrstva (4) je vytvorená z Ta_zO_s alebo TiO .
37. 37. Optická senzorová základňa podľa niektorého z nárokov 24 až 36,vyznačujúca sa tým, že medzi vlnovodivou vrstvou (4) a vzorkou je prítomná vrstva, ktorá podporuje adhéziu.
38. 38. Optická senzorová základňa podľa nároku 37, v y z n a č ujúca sa tým, že vrstva, ktorá podporuje adhéziu, má hrúbku menšiu alebo rovnú 50 nm.