HUT76406A - Process for detecting evanescently excited luminescence - Google Patents

Description

Eljárás elhaló gerjesztésű lumineszcencia detektálására

A jelen találmány tárgya eljárás elhaló (evanescent) gerjesztésű lumineszcencia meghatározására sík dielektrikum optikai érzékelőelrendezéssel, amely hullámvezető elven működik. A találmány tárgya még a találmány szerinti eljárás hasznosítása kvantitatív affinitásméréshez, valamint optika szempontból átlátszatlan folyadékok luminenszcens összetevőinek szelektív kvantitatív meghatározásához. A találmány tárgya még a találmányi eljárás végrehajtásához megfelelő érzékelő elrendezés.

Amikor egy hullámvezetőben fény halad, akkor a fényhullám nem teljesen korlátozódik a tényleges hullámvezetőre: valójában a fényhullám egy része a hullámvezetőhöz folytonosan csatlakozó, optikailag ritkább közegben halad. Ezt a részt nevezzük elhaló vagy eltűnő (evanescent) térnek, és ezt az effektust különböző módokon használják ki hullámvezetőkben az érzékelőtechnikában.

Az elhaló tér segítségével lehetséges lumineszcenciát gerjeszteni az optikailag ritkább közegben. Ez a gerjesztés a hullámvezető csatlakozó felületének (interface) közvetlen környezetére korlátozódik. Ezért az elhaló lumineszcencia gerjesztés alkalmazása analitikai célokra nagy érdeklődésre tarthat számot.

Egy síkérzékelő a legegyszerűbb esetben háromrétegű rendszerből áll: egy hordozóból (szubsztrát), hullámvezetőből és egy felületi rétegből v. fedőrétegből (superstrate) amelyet rendszerint a mérendő minta maga alkot. Különösen olyan vékony hullámvezetők esetén, ahol a hullámvezető réteg vastagsága vékonyabb mint a fény hullámhossza, a fénytér stabil,

63.120/BT*1*96-11-21 ti r

-2terjedésre képes módusainak száma néhány diszkrét hullámvezetőmódusra korlátozódik. Vastag hullámvezetőknél számos módust lehet továbbítani. Ebben az esetben gyakran mellőzhető a hordozó is, pl. ha a hullámvezető vastagsága eléri a néhány tizedmillimétert vagy annál is vastagabb.

Azok az ismert eljárások, amelyek alkalmasak az elhaló gerjesztésű (evanescently excited) lumineszcencia detektálására, a detektálható kiválasztott sugárzási rész alapján osztályozhatóak:

• A „térfogati lumineszcencia” detektálása: A vezetett hullám által gerjesztett lumineszcencia egy része a teljes térszögbe kisugárzódik, és ez a rész optikai úton mérhető és egy detektáló rendszerbe táplálható.

• Az „elhaló (evanescent) lumineszcencia” detektálása: a térbe kibocsátott lumineszcenciát kiegészítve, ez az elhaló lumineszcencia visszacsatolódik vezetett hullámként a hullámvezetőbe, ott továbbítódik, és a hullámvezető véglapján át kicsatolódik.

Ismert többek között eljárás és berendezés lumineszcens festékkel megjelölt antitestek vagy antigének elhaló gerjesztésű lumineszcenciájának detektálására, például az US-A-4582809 iratból. Az itt igényelt elrendezés optikai szálat és véglapkicsatolást használ az elhaló lumineszcencia gerjesztésére. Az ilyen optikai szálak rendszerint legfeljebb 1 mm-es átmérőjűek, és több módust is továbbítanak, amikor lézerfényt csatolnak be ilyenbe. Az elhaló gerjesztésű lumineszcencia egyszerűen mérhető a szálba visszacsatolt rész segítségével. Az elrendezés viszonylag nagy méretei és a viszonylag nagy mintavételi térfogatok további hátrányt jelentenek. Az elrendezés méretei nem csökkenthetőek számottevően, vagy különösen nem miniatürizálhatok optikai érzékelők méretére. Az érzékenység növelése rendszerint az elrendezés további növekedésével jár együtt.

További hátrány az érzékenység, amelyet a véglap-kicsatolási hatásfok korlátoz. Mivel a gerjesztő sugárzás és a lumineszcens sugárzás párhuzamosan haladnak, ezért azokat el kell egymástól választani sugárosztók és szűrők segítségével (pl. vágószűrők vagy sávszűrők segítségével), és ezért a szűrőegység karakterisztikája korlátozza a detektálás érzékenységét.

63.120/BT*2*96-11-21

-3 Sík, vastag hullámvezetők alkalmazása ismerhető meg a D. Christensen, D. Deyer, D. Fowers, J. Herron szerzők által közölt „Analysis of Excitation and Collection Geometries fór Planar Waveguide Immunosensors”, SPIE 1886, 2(1993)(Fibre Optic Sensors in Medical Diagnostics) kiadványban. Az itt leírt elrendezésnél a hullámvezetőbe becsatolt gerjesztési sugárzást a véglapon csatolják ki, és a térszögbe kibocsátott lumineszcens sugárzást detektálják. Alternatív megoldásként lehetséges a véglapon történő kicsatolás is. Ez utóbbi esetben az érzékenységet ugyanúgy korlátozzzák a szükséges sugárosztók és szűrők mint a fent leírt elrendezésnél. További hátrányt jelent a nagy érzékelő és az ahhoz kapcsolódó nagy mintatérfogat.

A WO 90/06503 irat eljárást ismertet teljes belső visszaverődésű fluoreszcencia (TIRF = totál internál reflection fluorescence) által gerjesztett lumineszcencia előállítására, amely eljárás során vékony, sík, előnyösen egymódusú hullámvezetőt alkalmaznak. Az ebben az eljárásban használt hullámvezetőt arra is használják, hogy növeljék a fényerőt az érzékelő felületén azáltal, hogy a gerjesztő sugárzást alulról sugározzák be, és az teljes visszaverődést szenved az érzékelőben. Ebben az esetben a térszögbe kibocsátott térfogati lumineszcenciát detektálják. Az eljárás során a gerjesztő fény és a lumineszcens tulajdonságú molekulák közötti kölcsönhatási térfogat az érzékelőre korlátozódik, mivel a gerjesztés csak a sugárátmérő területén következik be. Ebből következően az érzékelőt csak korlátozottan lehet a sugárátmérőhöz méretezni, mivel annak divergenciája és átmérője is erősen korlátozott a nagyon szűk rezonanciaszög miatt.

A technika állásából ismert egy vagy több csatoló rács alkalmazása a vezetett hullámok kiés becsatolására, amint az pl. K. Tiefenthaler és W. Lukosz: „Sensitivity of grating couplers as integrated-optical Chemical sensors”, J. Opt. Am. B6, 209 (1989), W. Lukosz, Ph. M. Nellen, Ch. Stamm, P. Weiss: „Output Grating Couplers on Planar Waveguides as Integrated Optical Chemical Sensors”, Sensors and Actuators Bl, 585 (1990) és T. Tamir,

S.T. Peng: , Analysis and Design of Grating Couplers”, Appl. Phys. 14, 235-254 (1977) c. közleményekből megismerhető. A Tiefenthaler és szerzőtársa által leírt eljárások alkalmasak affinitás érzékelésére a közvetlen detektálás módszerével (a törésmutató változásán keresztül). A csatolási szög rezonanciájának eltolódását határozzák meg, amely a törésmutató változása miatt a molekulák adszorpciójának vagy kötésének tulajdonítható.

63.120/BT*3*96-11-21 f

..... .:. .· · .

-4«*

Különböző kísérletek történtek az elhaló gerjesztésé lumineszcencia érzékenységének javítására, és integrált optikai érzékelők készítésére. Például a Biosensors & Bioelectronics 6 (1991), 595-607 sík monomódusú vagy alacsonymódusú hullámvezetőket ismertet, amelyeket kétlépcsős ioncserélési eljáráshoz állítanak elő, és amelyeknél a gerjesztő hullámba a fény becsatolását prizmákkal végzik. Az alkalmazott affinitásrendszer egy humán immunoglobulin-G/fluoreszcein-j elölt proteinA, ahol az antitest a hullámvezetőn van rögzítve (immobilizálva), és a detektálandó fluoreszceinnel jelölt proteinA a egy polivinil alkohol filmhez van hozzáadva foszfátpufferben. A filmmel a hullámvezető mérési tartománya van bevonva. Ennek az eljárásnak nagy hátránya, hogy csak jelentéktelen különbség érhető el a hullámvezető réteg és a hordozó (szubsztrát) réteg törésmutatói között, és ezzel csak viszonylag alacsony érzékenység érhető el.

A közölt érzékenység 20 nm proteinA-hoz kötődő fluoreszcein izo-tiocianát esetében. Ez még mindig kevés ahhoz, hogy mikronyomokat lehessen vele kimutatni, és az érzékenység további növelésére van szükség. Emellett gyakorlatban nehezen valósítható meg és nehezen ismételhető eredményeket ad a gerjesztő sugár prizmákkal történő becsatolása, mivel a csatolási hatásfok jelentősen függ a prizma és a hullámvezető közötti érintkezési felület minőségétől és méretétől.

Az US-A.5 081 012 sz. irat a jelen találmány szerinti értelemben ismerteti a rácsok alkalmazását lumineszcenica detektálásánál. Ez az US szabadalom olyan rácsstruktúrákat ismertet, amelyekkel egyrészt a gerjesztő fényt lehet a hullámvezetőbe becsatolni, másrészt olyan speciális reflexiós rácsokat, amelyek lehetővé teszik, hogy a gerjesztő hullám többször is végighaladjon a hullámvezetőn. A közöltek szerint az érzékenység ilyen módon javítható. A térfogati lumineszcencia a térszögbe sugárzódik ki. Emellett a gerjesztési sugárzás két úthossz megtétele után a becsatoló rácson keresztül kicsatolódik, és referenciajelként használható. Ennek az eljárásnak az a hátránya, hogy erősen megnő a reflexiós rács által okozott háttérsugárzás, amely a lumineszcenciajellel együtt a térszögbe van kibocsátva. Ezért ismét szűrőket kell alkalmazni, amelyek megint csak korlátozzák a detektálási érzékenységet.

63.120/ΒΤ*4*96·11·21

- 5 A találmány célja ennek megfelelően eljárás megadása lumineszcencia meghatározására sík optikai hullámvezetővel, amely eljárás egyszerű, gazdaságosan megvalósítható, és különösen amelyhez csak kis mintatérfogatra van szükség. A találmány tárgya még sík optikai hullámvezető alapú miniatürizálható érzékelő elrendezés megadása, a találmány szerint eljárás végrehajtására.

A találmány értelmében a fenti célt olyan eljársással érjük el, amely eljárás során sík dielektrikum optikai érzékelőelrendezést alkalmazunk, amely átlátszó hordozóból és azon elhelyezett vékony transzparens hullámvezető rétegből áll, továbbá amely érzékelőelrendezés a gerjesző fény becsatolásához becsatoló ráccsal van ellátva, és amely érzékelőelrendezésnél a hordozó törésmutatója kisebb, mint a hullámvezető réteg törésmutatója, azzal jellemezve, hogy folyadékmintát mint fedőréteget érintkezésbe hozunk a hullámvezető réteggel, és a mintában elhelyezkedő vagy a hullámvezető réteghez kötött lumineszcens tulajdonságokkal bíró összetevők által keltett lumineszcenciát optoelektronikus úton megmérjük, oly módon, hogy a gerjesztő fényt a becsatoló ráccsal becsatoljuk a sík hullámvezető rétegbe, hogy a gerjesztő fény végighaladjon a hullámvezető rétegen, miáltal a lumineszcens tulajdonságokkal bíró összetevők a gerjesztés hatására lumineszcenciát bocsátanak ki a hullámvezető réteg elhaló (evaneszcens) terében, továbbá amely eljárás során a gerjesztő sugárzás λ hullámhosszánál kisebb vastagságú a gerjesztő sugárzás hullámhosszán 1,8-nél nagyobb vagy egyenlő törésmutatójú hullámvezető réteget alkalmazunk, továbbá a hullámvezető rétegbe visszacsatolódott lumineszcens sugárzást egy második, az első csatoló rácstól térben elválasztott csatoló ráccsal kicsatoljuk és detektáljuk.

Előnyösen az eljárás a 20-23 igénypontokban meghatározott körülmények között hajtható végre. A találmány szerinti eljárás végrehajtására különösen alkalmas érzékelő elrendezés és annak célszerű kiviteli alakjai a 24-38. igénypontokban van ismertetve. Az eljárás előnyös változatait a 2-19. igénypontok írják le.

A találmányi megoldás szerint a gerjesztési sugárzást csatoló ráccsal csatoljuk be a hullámvezetőbe, és az vezetett hullámként halad a hullámvezető rétegben. A hatékony elhaló lumineszcencia gerjesztés érdekében az érzékelő felületén vagy annak közelében a

63.120/BT*5*96-11-21 . ·. ··· ·; ·’*· < .....* ··· :^: ·;:

-6hullámhosszfüggő paraméterek (törésmutató, rétegvastagság) megfelelő megválasztásával lehetséges nagy térerőt elérni.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az alábbiakban leírt módon méretezve a hullámvezetőt, a lumineszcenciasugárzás jelentős része elhaló módon visszacsatolódik a hullámvezetőbe, és a gerjesző sugárzással együtt továbbítódik. Ezért a lumineszcenciasugárzás kicsatolható a hullámvezetőből az elsőtől térben elválasztott második csatolórácson, és a detektáló rendszerhez továbbítható. Ez a „ráccsal detektált elhaló lumineszcencia” a korábbiakban leírt „térfogati detektálású” eljárásokkal szemben azért előnyös, mert sokkal egyszerűbben miniatürizálható az érzékelőelrendezés és a hozzátartozó detektáló rendszer.

A lehető leghatékonyabb lumineszcencia gerjesztéshez a sík hullámvezető méretezését a sík hullámvezetők elmélete alapján végezhetjük el. Ebben az összefüggésben a következő méreteket kell szem előtt tartani (lásd még: W. Lukosz: „Principles and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors fór direct affinity sensing and immunosensing”, Biosensors & Bioelectronics 6, 215-255 (1991), valamint D.G. Hall, „Optical waveguide diffraction gratings: coupling between guided modes”, Progress in Optics, szerk. E. Wolf, Elsevier, New York (1991)):

Egy sík hullámvezető elhaló terének (evanescenst field) behatolási mélysége a csatlakozó rétegbe a következő egyenlettel fejezhető ki:

Az eva

ahol N_eff az effektív modális törésmutató, n^^ a csatlakozó réteg (superstrate) törésmutatója, és λ a gerjesztő fény hullámhossza. A fenti egyenletben z a hullámvezető felületére merőleges irányú koordinátát jelzi, míg x a vezetett hullám terjedési iránya. Ha figyelembe vesszük az elektromos térerő f standardizációs tényezőjét a hullámvezető felszínén, ahol

bt fim blsub

63.120/BT*6*96-11-21

-Ί ahol n_fi]m a hullámvezető törésmutatója és a hordozó törésmutatója, akkor megkapjuk, hogy az I_E elhaló tér intenzitási görbéje a következőképpen alakul:

-2z

Az elhaló térnek a hullámvezető felületére merőleges intenzitási görbéje meghatározza a lényeges skálázási tényezőket a rétegvastagság méretezéséhez és a hullámvezető törésmutatójához. A hullámvezető réteg közelében tartózkodó lumineszcens molekulák detektálásához analitikai célú felhasználásoknál figyelembe kell venni a molekula távolságát a hullámvezető felületétől a hullámvezető méretezése során.

Lumineszcencia detektálásához azt találtuk, hogy a lumineszcencia elhaló visszacsatolódása hatékonyan megy végbe vékony, nagy visszaverőképességű sík hullámvezetőknél. A régegvastagság és törésmutató választása hatással van a (számított) gerjesztési hatásfokra és az elhaló visszacsatolásra egyaránt. Ez utóbbi esetben versengés jön létre a hullámvezető felületének közelében kötött molekulák sugárzási frakciói és a mintatérfogatban kötetlen molekulák sugárzási frakciói között.

Abból a célból, hogy hatékonyan detektálhatóak legyenek a hullámvezető felületének közelében található lumineszcens molekulák, úgy találtuk, hogy a hullámvezető paramétereit a következő tartományban kell kialakítani:

• a hullámvezető törésmutatója n_film > 1.8 a gerjesztési sugárzás λ hullámhosszán • a rétegvastagság t_fi1ni < λ gerjesztési hullámhossz, előnyösen t_film < λ/2.

Az eljárás egy különösen előnyös megvalósításánál a rétegvastagságot a 40-160 nm tartományból választjuk, és ezzel együtt a rácsok mélységi modulációját 3-60 nm-nek választjuk, míg a modulációs mélység és a rétegvastagság aránya <0.5.

Ezek a hullámhosszok azt is jelentik, hogy tipikusan csak m<3 módusok terjedését engedik meg.

A hullámvezetőbe elhalóan visszacsatolt lumineszcencia abban továbbterjed, és jellemzi a vezetett hullám Γ csillapítási tényezője. Alacsony Stokes-eltolódást feltételezve a gerjesztett és lumineszcens sugárzásra azonos csillapítási adatokkal számolhatunk (a hullámvezetőben

63.120/BT*7*96-11-21 ··· • · ·

-8fellépő csillapítás lehetséges okai belépő felületeken fellépő szóródási veszteségek, valamint a hullámvezetőben, hordozóban és/vagy csatlakozó rétegben fellépő elnyelődés. Ha nincsenek kifejezett keskeny abszorpciós sávok, akkor a tipikusan 10-50 nm értékű Stokeseltolódás nem okoz jelentős eltérést a csillapításban, sem a szórási veszteségek, sem az abszorpció alapján. Az ilyen spektrális keskenysávú abszorpciós effektusokat el kell kerülni az érzékelő elrendezés anyagainak megfelelő kiválasztásával.

A hullámvezetőben terjedő lumineszcenciasugárzást ki kell csatolni és a detektáló rendszerhez kell továbbítani. A véglapos kicsatolás nem célszerű: egyrészt kiváló minőségű hullámvezető élek kellenek hozzá, és egyes esetekben az optikai detektáló eszközöket valamilyen folyadék vagy gélimmerzióval kell csatlakoztatni, másrészt ilyen módon nagyon bonyolulttá válik az érzékelő elemek folyadékcellához való csatlakoztatása.

A gerjesztő sugárzás becsatolására szolgáló csatolórácstól térben elválasztott második csatolórács alkalmazása a lumineszcenciasugárzás kicsatolására teljesen kiküszöböli a véglap-kicsatolássál kapcsolatban felmerülő problémákat. További előny, hogy szabadon választható az x irányban (vagyis a vezetett hullám terjedésének irányában) a rácstávolság. Ezzel biztosítható, hogy optimálisan hozzáigazítható az A távolság a rácsok között az egyes hullámhosszokon fellépő csillapításhoz, és nincsen szükség az érzékelőelrendezés és a folyadékcella külső méreteinek megváltoztatására. Szintén előnyös, hogy az érzékelő elem külső éleinek nem kell optikai minőségűnek lenniük, és ezek kialakítása a folyadékcellához illeszthető, különös tekintettel az alkalmazott tömítésre.

Úgy találtuk, hogy a B rácstávolság optimális értéke B = X_1/e, esetleg változtatható a B ~ (0.2-3)»x_1/e tartományban (x_1/e : az a hossz, ahol a vezetett gerjesztő hullám intenzitása e-1szeresére csökken).

(Konverzió: Γ [dB/cm] -» x_1/e [mm]: x_1/e = 100/(1η10·Γ))

Nagyobb távolságoknál a gerjesztő fény és a vezetett lumineszcens fény is erősen csillapítódik, és jelentős jelcsökkenést okoz. A távolság alsó határát nem elsősorban a gerjesztés és a visszacsatolás határozza meg, hanem inkább mindkét rács elhelyezése és a gerjesztő sugárzásnak a becsatoló rácson történő pozicionálása által támasztott követelmények. A 100 pm-nél kisebb távolság nem célszerű, tekintettel a becsatoló rács

63.120/BT*8*96-11-21 ··· < ··· .:. ....

-9Ζ szélességének alább leírt meghatározására is, valamint a gerjesztő sugárzás fénysugarának átmérőjára a becsatoló rács élén.

A találmányt a továbbiakban az ábrák segítségével részletesebben mutatjuk be, ahol az

1. ábra egy optikai érzékelő elrendezés vázlatos oldalnézete, és amely elrendezés különösen alkalmas a találmány szerinti eljárás végrehajtására egy lehetséges sugárzási görbe mellett, míg a

2. ábra az 1. ábra szerinti érzékelő elrendezés felülnézete.

Az 1. ábrán látható az 1 érzékelő elrendezés, a 2 csatolórács a gerjesztő sugárzás becsatolásához és a 3 csatolórács a lumineszcenciasugárzás kicsatolásához. Látható még a 4 hullámvezető réteg és az 5 hordozó.

Az 1. ábrán látható még a be- és kicsatolt gerjesztő- lumineszcenciasugárzás lehetséges sugármenetei. Az x irányban terjedő vezetett hullám a 2 csatoló rács hatására akkor csatolódik be az érzékelő síkjába, amikor a rezonanciafeltételek teljesülnek a hullámvektor x komponensére:

kwL ⁼ ± m*ko = ± πι*2π/Λ_ο, ahol m egész és ko a reciprok rácsvektor ahol kwL = 2π/λ*Ν_βί = kO*N_eff: a hullámvektorral jellemzett terjedő hullám N_eff effektív modális törésmutató mellett.

Az 1. ábrán látható, hogy a becsatolás negatív θ szög alatt történik, ahol K_in = KO * cos θ (%: a hullámvektor nagysága a rajz síkjában), vagyis a vezetett hullám a gerjesztő hullám irányához képest „ellenkező irányban” terjed (ún. visszafelé történő csatolás”). A gerjesztő hullám kicsatolása pozitív szög alatt történik (ko_Ut jelöléssel), és a lumineszcenciasugárzás szintén (k_out jelöléssel).

Egy ilyen be- és kicsatolási elrendezéssel nagyfokú háttérszabadság érhető el, mivel jelentősen különbözik a visszaverődő beeső fény és a kicsatolt fény iránya. A különböző sugárzási frakciók térbeli elválasztása optimális jel/zaj viszonyt biztosít a lumineszcencia

63.120/BT*9*96-11-21

- 10detektálásához: a kicsatolt gerjesztő sugárzás és a lumineszcencia sugárzás különböző sugármeneteket követ, és így a szűrőket (az 1. ábrán nincsenek feltüntetve, vágószűrők vagy sávszűrők) csak a szórt fény kiszűrésére kell használni, nem pedig a kicsatolt gerjesztő sugárzás teljes intenzitásához.

A kicsatoló rács használata azzal a további előnnyel jár, hogy a lumineszcenciasugárás különböző spektrális komponensei különböző irányokban vannak kicsatolva. Ezért a találmány segítségével lehetséges a molekulák detektálása gyengén lumineszcens mintaanyagokban is, akár további szűrők nélkül is, ha a detektálandó molekulák és a mintaközeg lumineszcenciája spektrálisan különbözik.

A ki- és becsatolási szög megfelelő beállítása a Aj és A₂ rácsállandók megválasztásával lehetséges. Az 1. ábrán mutatott előnyös kiviteli alaknál, ahol a be- és kicsatolás iránya eltér, a rácsállandókat is határozottan különbözőre kell választani.

Elképzelhető az is, hogy azonos rácsállandót használjunk a 2 és 3 rácshoz egyaránt, az érzékelő egyszerűbb előállítása érdekében. Ennek akkor lehet szerepe, ha az érzékelőt minél olcsóbban kell előállítani, mivel így a holografikus strukturálást használva a rács előállításához, több gyártási lépést ki lehet hagyni. A kicsatolt gerjesztő sugárzás és a lumineszcenciasugárzás irányának térbeli elválasztása akkor is biztosítva van, ha a rácsállandók azonosak. Ekkor csupán a visszavert becsatolt sugárzás biztonságos leválasztása marad el, így további intézkedéseket kell tenni a a visszavert fény kiszűrésére, pl. apertúrákat vagy fénycsapdákat alkalmazva.

A csatolási szögeket a rácsállandók megfelelő megválasztásával a |θ| « 1-50° érhető el (a szög nagyságát tekintve). Ennél kisebb értékek kerülendők, a Bragg-visszaverődés szempontjából, mivel egyébként ilyen visszaverődés könnyen fellép akkor is a ki- és becsatolás során, ha egyébként az érzékelő beállítása vagy síkja nagy pontossággal történt vagy az érzékelő geometriai méretei (síkfelületei) pontosan vannak kialakítva. Lehetséges nagy szögek használata is, majdnem 90°-g, de a szokásosnál nagyobb szögek használata szintén kerülendő, a sugármenetek megfelelő kialakíthatósága érdekében.

63.120/BT*10*96-11-21

- 11 <

A rácsmélység méretezését az ismert módon lehet elvégezni (lásd T. Tamir, S. T. Peng „Analysis and Design of Grating Couplers”, Appl. Phys. 14, 235-254 (1979); T. Tamirm „Beám and waveguide couplers” in Integrated Optics, szerk. T. Tamir, Springer Verlag, Berlin (1979). Itt alkalmazzuk az ún α „szivárgási paramétert” (leak paraméter): az a meghatározza a vezetett hullám intenzitásának 1/e-szeresére csökkenését egy olyan hullámvezetőben, amelynek a csatlakozó felületét tg^g mélységű csatoló ráccsal látták el. Ebből következően l/α az a karakterisztikus hossz, amelyen a vezetett hullám sugárzási energiája átadódik egy szabadon haladó hullámnak vagy fordítva. A becsatoló rács mélységének megválasztásánál elsősorban nem a szivárgási paraméter abszolút értéke a fontos, hanem a szivárgási paraméter és a beeső fény sugárzási paraméterének (sugárátmérő és divergencia) egymáshoz illesztése. Egy Gauss-nyalábú lézersugár becsatolásához (wO Gauss-paraméterrel) egy térben korlátozott rácson keresztül a következő feltételeket kell teljesítenie a szivárgási paraméternek, a sugárátmérőnek és a sugár elhelyezkedésének a rács széléhez képest:

• a*w₀ =1.36 • _Xc/w0 = 0.733

Az x_c értéke megadja a fényfolt közepének eltolódását a rács széle felé. Ennek az eltolódásnak a széltől a struktúráit terület felé kell irányulnia. A feltételek teljesülése esetén elérhető 80 %-nál nagyobb ki- és becsatolási hatásfok.

A ki- és becsatolással kapcsolatos, hasonló megfigyelés szintén azt eredményezi, hogy itt is elérhető a magas, 80% -os vagy nagyobb csatolási hatásfok. Ennek az a feltétele, hogy a rács kiterjedése az x irányban jóval nagyobb legyen, mint a szivárgási paraméter. A kicsatolt szabadon terjedő fénysugár intenzitásprofilja azonban többek között a vezetett hullámnak a rácson át való csillapítódása következtében aszimmetrikus.

A szivárgási paraméter meghatározása során a következőkre kell figyelemmel lenni a becsatoláshoz:

• a fényfolt elhelyezkedése a rács széléhez képest • az érzékelőelem miniatürizálása.

63.120/ΒΤΊ 1“96-11-21 •·· ·♦·'

- 12 Habár kis értékű szivárgási paraméterek (a«l/mm) és ahhoz tartozó nagy sugárátmérők (w₀ » 1 mm) egyszerűsítik a beállítást, az érzékelő miniatürizálásának lehetősége jelentősen csökken A = 3 mm- nél nagyobb rácsszélesség alkalmazása esetén. A rácsszélesség előnyösen A > 3*w₀ legyen, a teljes csatolás érdekében. Emellett a rács és a hullámvezető inhomogenitásai negatívan hatnak a csatolási hatásfokra. Ezzel szemben bár a nagy szivárgási paraméter (a>10/mm) és w₀< lOpm nagyságrendű kis sugárátmérő nagyon kis rácsméreteket is lehetővé tesz, ugyanakkor 100 pm-nél jobb pozicionálási pontosságot is lehetővé tesz. Továbbá ebben az esetben a csatolási hatásfokot az is korlátozza, hogy a sugárdivergencia jelentősen nagyobb a csatolási rezonancia szögtartományánál.

Megállapítottuk, hogy az a=(0.2-5)/l mm tartományba eső szivárgási paraméterek jó kompromisszumot jelentenek a beállítási követelmények, pozicionálási tűrések és a miniatürizálási követelmények között. A fent leírt hullámvezető rétegvastagságok esestében a tgrating ⁼ 3-60 nm, különösen a 3-40 nm tartomány előnyös a rácsmélységhez, szinuszos modulációval a hordozó-hullámvezető réteg csatlakozó felületen. Mivel a szivárgási paraméter erősen függ a rácsprofiltól, az érzékelő működése szempontjából nem a rács geometriai mérete, hanem a szivárgási paraméter bír jelentőséggel.

Az érzékelő elrendezésben alkalmazott hordozónak átlátszónak kell lennie a gerjesztési és emissziós hullámhosszon. A hordozót lehet műanyagból is készíteni, pl. az EP-A-0533074 iratban leírtak szerint.

A hordozó több különböző anyagból álló összetett rendszer is lehet, például egy hordozólapon elhelyezett rétegrendszer vagy hasonló. Ebben az esetben csak arra van szükség, hogy a hullámvezető réteggel közvetlenül érintkező anyag törésmutatója kisebb legyen, mint a hullámvezető réteg törésmutatója.

Különösen akkor lehetséges költségtakarékos módon előállítani az érzékelőelrendezést, ha a hullámvezető bevonathoz mikrostrukturált polimereket lehet használni hordozóként. Ebben az esetben a detektálási érzékenységet a hordozóban fellépő (substrate-intrinsic) lumineszcencia korlátozhatja. Ennek a belső lumineszcenciának a gerjesztődése és elhaló visszacsatolása a fent leírt, a hullámvezető-fedőréteg határfelületen fellépő

63.120/ΒΤ·12*96-11-21

- 13mechanizmusokhoz hasonló módon lép fel a hullámvezető-hordozóanyag határfelületen. Ez a hordozó-lumineszcencia elkerülhető egy alacsony törésmutatójú (vagyis a hullámvezető törésmutatójánál nem nagyobb törésmutatójú) nem-lumineszcens köztes réteg közbeiktatásával, amelyet a hordozón alakítunk ki a hullámvezető bevonat elkészítése előtt. Különösen alkalmas köztesréteg-anyag a SiO₂, vagy lényegében abból álló, SiO_xH_yC_z összetételű SiO₂, amelyhez alacsonyabb szénhidrogén gyökök köthetők utólag is. Ennek a köztes rétegnek a t_buffer vastagságát úgy kell megválasztani, hogy a hullámvezetőnek az elhaló tere által szállított energia a hordozó oldalán teljesen a köztes rétegben maradjon. Ezt a feltételt gyakorlatban úgy lehet teljesíteni, ha t_buffer legalább hatszorosa az elhaló tér z^ behatolási mélységének. Az ötszörös érték megfelelő az elhaló lumineszcencia detektálása során az optimális jel/zaj viszony eléréséhez. Ez a feltétel nagy biztonsággal teljesül, ha tbuffer Á 2000 nm.

A köztes réteg használata azzal a további előnnyel jár, hogy csökkentheti a hordozó felületi érdességét. Ezzel csökken a Γ hullámvezető csillapítás, és ez pozitív hatást gyakorol az elhaló lumineszcencia detektálás jel/zaj viszonyára.

Csak a lényegében párhuzamos fény alkalmas a lumineszcencia gerjesztéséhez. A találmány értelmében a „lényegében párhuzamos” kifejezést úgy kell érteni, hogy divergencia 5°-nál kevesebb. Ez azt jelenti, hogy a fény gyengén divergens vagy konvergens lehet. A nagyobb divergenciák egyszerűsítik a becsatolási szög beállítását, de csökkenti a lumineszcencia jelet, mivel a becsatolási rezonancia sokkal keskenyebb mint a divergenciaszög, és így a beeső energiának csak egy kis része áll rendelkezésre a lumineszcencia gerjesztéséhez.

A találmány értelmében a sík dielektrikum optikai érzékelő elrendezés úgy értendő, hogy az elrendezés (platform) szalag, lemez, kerek tárcsa vagy más geometriai forma alakú, feltéve, hogy puszta szemmel nézve síknak látszik. A sík alaktól való eltérés nem kritikus, ha a vezetett hullám képes a terjedésre a hullámvezető rétegben, és megvalósítható az 1. ábrával analóg be- és kicsatolási elrendezés. A geometriai forma választását a teljes berendezés konstrukciója befolyásolhatja, amelybe az érzékelőelrendezés beépítésre kerül. Előnyösen olyan elrendezések jöhetnek szóba, amelyek jelentős miniatürizálást tesznek lehetővé.

63.120/BT*13*96-11-21 .·\ · ··· \

- 14Α fent leírt szerves mikrostrukturált hordozók mellett alkalmazhatóak nem szerves, például üveg vagy kvarz hordozók is. Ezek előnye a polimerekkel szemben az alacsony belső (intrinsic) lumineszcencia. Az érzékelőelrendezések kötségtakarékos előállításához célszerű ezeket a hordozókat egy alacsony törésmutatójú bevonattal ellátni, amelybe elkészíthető a csatolórácsok rácsstruktúrája, pl. az EP-A-0533074 irat szerint.

Emellett a csatoló rácsot el lehet helyezni a hullámvezető/fedőréteg határfelületen is.

Az ilyen rácsok előállítására szolgáló eljárások önmagukban ismertek. Ezek előállítására főleg fotolitográfiai vagy holografikus és maratási technikákat alkalmaznak, ahogy az többek között a Chemical, Biochemical and Enviromental Fiber Sensors, V. Proc. SPIE, Vol. 2068, 1-13, (1994) közleményből megismerhető.

A rácsstruktúrát elő lehet állítani a hordozón és azt követően átvihető a hullámvezető rétegre, amelybe a rácsstruktúrát utána leképezik, vagy a rács elkészíthető a magában a hullámvezető rétegben.

A rácsperiódus 200-1000 nm lehet, míg a rácsnak előnyösen csak egy periodicitása van, vagyis monodiffraktív.

A találmány értelmében a „minta” kifejezés alatt a teljes mérendő oldatot értjük, amely oldat tartalmazhatja a detektálandó vegyületet vagy összetevőt. A detektálás történhet egylépéses vagy többlépcsős mérésben, amelynek során az érzékelő elrendezés felületét egy vagy több oldattal hozzuk érintkezésbe. Az oldatok közül legalább egy tartalmazhat lumineszcens tulajdonságokkal rendelkező anyagot, amely a találmány szerinti eljárással detektálható.

Ha egy lumineszcens tulajdonságú anyag már abszorbeálva van a hullámvezető rétegen, akkor a minta is mentes lehet lumineszcens összetevőktől. A minta további összetevőket is tartalmazhat, tipikusan pH-puffereket, sókat, savakat, bázisokat, felületaktív anyagokat, viszkozitás-befolyásoló adalékokat vagy festékeket. Különösen fiziológiás sós oldatot használhatunk oldószerként. Ha a lumineszcens összetevő maga is folyadék, akkor a további

63.120/BT*14*96-11-21 ········ · ·· • · ·· ·

oldat használatától el is lehet tekinteni. Ebben az esetben a minta 100 %-ban lumineszcens tulajdonságú összetevőből állhat.

A minta emellett biológiai közeget (médium) tartalmazhat, például tojássárgáját, testnedvet vagy annak összetevőjét, különösen vért, szérumot, plazmát vagy vizeletet. Emellett a minta lehet felületi víz, természetes vagy mesterséges anyagok mint pl. talaj vagy növényi részek kivonataiból készített oldat, bioeljárással készített elegy vagy szintetikus elegyek.

A minta lehet tömény vagy további oldószerrel együtt alkalmazott.

Megfelelő oldószerek a víz, vizes pufferek, fehérjeoldatok, és szerves oldószerek. Ilyen szerves oldószerek az alkoholok, ketonok, észterek, alifás szénhidrogének. Előnyösen használható víz, vizes puffer vagy víz és vízoldékony szerves oldószer keveréke.

A minta tartalmazhat azonban olyan összetevőket is, amelyek az oldószerben nem oldódnak, mint például pigmentrészecskék, diszpergáltatószerek, természetes vagy szintetikus oligomerek vagy polimerek. Ebben az esetben a minta optikailag átlátszatlan diszperzió vagy emulzió.

Megfelelő lumineszcens összetevők azok a lumineszcens festékek, amelyek lumineszcenciasugárzásának hullámhossza a 330-1000 nm tartományba esik. Tipikusan ilyenek a rodaminok, fluoreszceinszármazékok, kumarinszármazékok, disztiril bifenilek, sztilbénszármazékok, ftalocianinok, naftalocianinok, polipiridil-ruténium komplexek, mint pl. a trisz(2,2’-bipiridil) ruténium-klorid, trisz(l,10-fenantrolin)-ruténium-klorid, trisz(4,7difenil-l,10-fenantrolin)-ruténium-klorid és polipiridil-fenazin-ruténium komplexek, platinum-porfirin komplexek mint az oktaetil-platinum-porfirin, hosszú élettartamú európium és terbium komplexek és cianinfestékek. Különösen azok a festékek alkalmasak vér vagy szérum analízishez, amelyek abszorpciós és emissziós hullámhossza a 600-900 nm-es tartományba esik.

63.120/BT* 15*96-11-21 ···· ····

- 16Különösen alkalmas lumineszcens összetevők az olyan festékek, mint a kovalens kötéssel megköthető funkcionális csoportokat tartalmazó fluoreszceinszármazékok, pl. a fluoreszcein izotiocianát.

Szintén nagyon alkalmasak azok a funkcionális fluoreszcens festékek, amelyeket a Biological Detection Systems Inc. cég értékesít, pl. a mono- és bifunkcionális Cy5.5™ festékek, amelyeket egyebek között a Clinical Chemistry 40(9): 1819-1822, 1994 közlemény ismertet.

Az előnyös lumineszcencia a fluoreszcencia. A gerjesztéshez előnyösen használható koherens fény, mivel ekkor nagy pontossággal teljesíthető a becsatoló rácsra a rezonanciafeltétel. Ennek megfelelően lézer fényforrást választunk, a lumineszcens vagy fluoreszcens molekulák abszorpciós hullámhosszának megfelelően.

Ezzel összefüggésben különösen fontosak a lézerdiódák vagy szuperlumineszcens diódák, mivel az ilyen fényforrások lehetővé teszik az érzékelőelrendezéshez rendelt detektáló rendszer nagyfokú miniatürizálását.

A felhasználható lumineszcens festékeket kémiai úton polimerekhez köthetjük vagy a biokémiai affinitásrendszerben szereplő kötésbe lépő összetevők egyikéhez, pl. antitest töredékekhez, antigénekhez, proteinekhez, peptidekhez, receptorokhoz vagy azok ligandumaihoz, hormonokhoz vagy hormonreceptorokhoz, oligonukleotidekhez, DNAszálakhoz vagy RNA szálakhoz, DNA vagy RNA analógokhoz, kötő fehérjékhez mint az A és G fehérje, avidinhez vagy biotinhoz, enzimekhez, enzim kofaktorokhoz vagy inhibitorokhoz, lecitinekhez vagy szénhidrátokhoz. Az utóbb említett kovalens lumineszcens megjelölés az előnyös módszer a reverzibilis vagy irreverzibilis (bio)kémiai affinitásmérésekhez. Ugyancsak lehetséges lumineszcencia-jelölt szteroidok, lipidek és kelátorok használata. Különösen érdekesek a beágyazódó (intercalating) lumineszcens festékek a DNA-szálakkal vagy oligonukleotidokkal végzett hibridizációs mérések számára, különösen ha azok a beágyazódás során - hasonlóan a különböző ruténium komplexekhez fokozott lumineszcenciát mutatnak.

63.120/BT*16*96-11-21

- 17Ha ezeket a lumineszcensen jelölt vegyületeket érintkezésbe hozzuk az érzékelő elrendezés felületén rögzített (immobilizált) affinitáspárjukkal, akkor a kötés kvantiatívan meghatározható a mért lumineszcencia intenzitásából. A mérendő anyag kvantitatív meghatározása szintén lehetséges, a lumineszcenciaváltozás mérésével, amikor a minta kölcsönhatásba lép a luminofor anyagokkal, például oxigénnel végzett lumineszcencia elnyomás vagy kioltás (quenching) alakjában, vagy fehérjék konformáció-módosulása által előidézett lumineszcencia-erősödés alakjában.

A hullámvezető réteg előállításához alkalmas anyagok tipikusan szervetlen anyagok, előnyösen szervetlen fémoxidok, mint pl. a TiO₂, ZnO, Nb₅O₅, HfO₂ vagy ZrO₂.

Előnyösen alkalmazható Ta₂O₅ és TiO₂.

A találmány szerinti eljárásban a minta mozdulatlan állapotban is érintkezésbe hozható a hullámvezető réteggel, és folyamatosan el is vezethető felette, nyílt vagy zárt ciklusban egyaránt.

Az eljárás egyik megvalósítása során a mérendő anyag detektálásához használt, lumineszcens tulajdonságokkal rendelkező összetevőt közvetlenül a hullámvezető rétegen helyezzük el. A lumineszcens tulajdonságú összetevő például egy fehérjéhez kötött luminofor lehet, és amelyet így a hullámvezető réteg felületén lumineszcenciára lehet gerjeszteni. Ha a fehérjéhez affinitást mutató partnert elvezetjük ezen rögzített régeg felett, akkor a lumineszcencia módosítható és a fenti partner mennyisége meghatározható. Különösen előnyös, ha az affinitás komplex mindkét tagja megjelölhető luminoforokkal, és így meghatározhatóak a koncentrációk is a kettő közötti energiaátadásból, pl. lumineszcenciaelnyomás (quenching) újtán.

A találmány egy további előnyös megvalósítása során kémiai vagy biokémiai affinitást úgy lehet mérni, hogy az érzékelő elrendezés felületén rögzítünk egy specifikus kötőpartnert, mint kémiai vagy biokémiai detektor vegyületet a mérendő anyag számára, vagy annak egyik kötőpartnere számára. A mérés lehet egy- vagy többlépcsős, amelynek során az egymást követő lépésekben az érzékelő elrendezés felületén rögzített detektor vegyület

63.120/ΒΤΊ 7*96-11-21

- 18számára kötőpartnereket tartalmazó, egy vagy több oldatot vezetünk el az érzékelő felett, és a mérendő anyag az egyik lépés során kötésbe kerül. A mérendő anyag detektálása úgy történik, hogy az affinitás mérésben megkötődnek a lumineszcens-jelölt összetevők. Ezek a lumineszcens-jelölt összetevők az affinitásmérés során alkalmazott egy vagy több kötőpartner lehet, vagy a mérendő anyag egy luminoforral ellátott analógja. Az egyetlen feltétel, hogy a mérendő anyag jelenléte szelektíven idézzen elő egy lumineszcens jelet, vagy egy lumineszcens jel szelektív változását.

A detektor vegyület rögzítését (immobilizálását) tipikusan hidrofób abszorpcióval vagy a hullámvezetőn történő közvetlen kovalens kötéssel vagy a felület kémiai módosítása után szilanizációval vagy egy polimer réteg felhordásával lehet elérni. Emellett pl. SiO2 anyagú, adhézió-javító köztes réteget lehet elhelyezni közvetlenül a hullámvezető rétegen, a detektor vegyületnek közvetlenül a hullámvezetőn történő rögzítésének elősegítése céljából. Ennek a köztes rétegnek a vastagsága nem haladhatja meg az 50 nm-t, előnyösen a 20 nm-t.

Megfelelő detektor vegyületek tipikusan antitestek antigének számára, kötő fehérjék mint pl. protein A és G immunoglobulin számára, receptorok a ligandumok számára, oligonukleotidek és egyes RNA és DNA szálak a kiegészítő száluk számára, avidin biotin számára, enzimek az enzim szubsztrátok, enzim kofaktorok vagy inhibitorok számára, lecitinek a szénhidrátok számára. Azt, hogy melyik affinitás partner van rögzítve az érzékelő elrendezés felületén, a mérés felépítésétől függ.

A mérés lehet egylépéses komplex-képző eljárás, például egy kompetitív mérés, vagy lehet többlépcsős eljárás, például egy szendvics-mérés.

A kompetitív mérés legegyszerűbb esetében a mérendő anyagot ismeretlen koncentrációban tartalmazó, és ahhoz hasonló, de lumineszcens jelölésű ismert vegyületet tartalmazó mintát érintkezésbe hozunk az érzékelő elrendezés felületével, ahol a lumineszcensen jelölt és a jelöletlen molekulák versengenek a rögzített detektor vegyület kötési helyeiért. Ennél a mérésnél a legnagyobb lumineszcencia-jel akkor adódik, ha a minta nem tartalmazza a mérendő vegyületet. A mérendő anyag növekvő koncentrációjával a megfigyelhető lumineszcencia jel csökken.

63.120/BT*18*96-11-21 ···· ···« . »

- 19Egy kompetitív immuno-mérésnél nem feltétlenül az antitestet kell rögzíteni: az antigén is rögzíthető az érzékelő elrendezés felületén detektorvegyületként. Rendszerint nincs különösebb jelentősége annak, hogy melyik partner van rögzítve a kémiai vagy biokémiai affmitásmérések során. Ez a lumineszcencia-alapú mérések alapvető előnye az olyan módszerekkel szemben, mint a felületi plazmon rezonancia vagy interferometria, amely utóbbiak a hullámvezető réteg elhaló terében abszorbeált tömeg változásán alapulnak.

Emellett a kompetitív mérések esetében a versengésnek nem kell szükségszerűen az érzékelő elrendezés felületén adott kötőhelyekre korlátozódnia. Például ismert mennyiségű antigént lehet rögzíteni az érzékelő elrendezés felületén, és ezt lehet olyan mintával érintkezésbe hozni, amely ugyanabból az antigénből ismeretlen mennyiséget, mint mérendő anyagot, és lumineszcens jelölésű antitesteket tartalmaz. Ebben az esetben a felületen rögzített és az oldatban tartózkodó antigének között lép fel versengés az antitestekkel való kötésért.

A többlépcsős mérés legegyszerűbb esete a szendvics immuno-mérés, amelynél egy primer antitest van rögzítve az érzékelő elrendezés felületén. A detektálandó antigén és a detektáláshoz használt, lumineszcens-jelölt szekunder antitest kötését az antigén második epitópjához vagy az antigént tartalmazó első oldat és a lumineszcens-jelölt antitestet tartalmazó második oldat egymást követően érintkezésbe hozásával lehet elérni, vagy ezeket az oldatokat előbb össze lehet keverni, úgy, hogy végül az antigénből és a lumineszcensjelölt antitestből álló részleges komlex kerül kötésbe.

Az affinitásmérések további kötési lépéseket is tartalmazhatnak. Például szendvics immunoméréseknél a protein A, amely specifikusan megköti az immounoglobulinokat, amelyek aztán primer antitestként hatnak egy következő szendvicsmérés során, a fenti leírtak szerint, rögzíthetőek az ún. Fc részüknél fogva az érzékelő elrendezés felületén az első lépésben.

Az affinitásméréseknek egy egész további csoportját jelentik az ismert avidin-biotin affmitásrenszert alkalmazó mérések.

63.120/BT*19*96-11-21 ···· ····

-20A különböző affinitásmérésekre találhatunk példát a J.H. Rittenburg: „Fundamentals of

Immunoassays”; in: Development and Application of Immunoassays fór Food Analysis, szerk. J.H. Rittenburg, Elsevier, Essex 1990, vagy a P. Tijssen: „Practice and Theory of

Enzyme Immunoassays”, szerk. R.H: Burdon, P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1985) c. kiadványokban.

Emellett az érzékelő elrendezés felületét nem csak egyszer lehet használni, de azt regenerálni is lehet. Megfelelő körülmények között, pl. alacsony pH és emelt hőmérséklet mellett, szerves oldószerekkel vagy ún. kaotróp reagensekkel (sókkal) lehetséges az affinitáskomplexeket szelektíven disszociálni, a rögzített detektorvegyületek kötési képességének jelentős romlása nélkül. Ennek pontos feltételei nagyon erősen függnek az egyes affinitásrendszertől.

Az eljárás egy további lényeges megvalósítási módja során egyrészt a jel előállítását a hullámvezető elhaló terére korlátozzuk - visszacsatolás esetén ez a jeldetektálásra is vonatkozik másrészt az affinitás komplex-képződési rendszert egyensúlyi folyamatként kialakítva azt reverzibilissé tesszük. Egy folyamatosan áramló rendszerben, megfelelő áramlási paraméterek mellett, lehetséges valós időben figyelni az elhaló térben a kötött lumineszcens-jelölt affinitáspartnerek kötését, deszorpcióját vagy disszociációját. Ezért a találmány szerinti eljárás alkalmas különböző asszociációs vagy disszociációs állandók meghatározása céljából folytatott kinetikus mérésekhez, vagy eltolódási mérésekhez (displacement assays).

Az elhaló gerjesztésű lumineszcencia detektálása önmagában ismert módön végzehető. Előnyösen alkalmazhatóak fotodiódák, fotocellák, fotoelektronsokszorozók, CCD-kamerák és detektormátrixok, pl. CCD-cellák. A lumineszcenciát optikai elemekkel lehet leképezni, pl. tükrökkel, prizmákkal, lencsékkel, Fresnel-lencsékkel és azon elhelyezett GRIN (gradient-index) lencsékkel. Az emissziós hullámhossz kiválasztására ismert elemek használhatók, pl. szűrők, prizmák, monokromatikus szűrők, dikromatikus tükrök és diffrakciós rácsok.

63.120/BT*20*96-11-21

-21 A találmány szerinti eljárás egyik előnye, hogy a lumineszcencia detektálása mellett a kisugárzott gerjesztő fény abszorpciója is meghatározható. Az optikai szálakból készült vagy síkszerkezetu multimódusú hullámvezetőkkel összehasonlítva, határozottan jobb jel/zaj viszony érhető el a találmányi elrendezéssel. A lumineszcencia és az abszorpció párhuazamos mérése lehetővé teszi a lumineszcenciaelnyomási v. kioltási (quenching) jelenségek nagy érzékenységű meghatározását.

A találmány egyik egyszerű kiviteli alakjánál az eljárás során a gerjesztő fényt folyamatos módban (cw) sugározzuk, vagyis a gerjesztés időben állandó intenzitással történik.

Azonban az eljárás úgy is végrehajtható, hogy a gerjesztő fénysugarat időzített pulzusok alakjában állítjuk elő, ahol az egyes pulzusok hossza 1 ps-tól akár 100 s-ig terjedhet, és ilyen esetben a lumineszcenciát időben felbontva detektáljuk - rövid impulzushosszaknál vagy másodperces-perces időközönként. Ez a módszer különösen akkor előnyös, ha pl. analitikusan kívánjuk vizsgálni egy kötés kialakulásának ütemét, vagy a rövid expozíciós idő használatával meg akarjuk akadályozni a lumineszcenciajel csökkenését a fotokémiai kifakulás (fading) következtében. Elég rövid impulzusokkal és megfelelő időfelbontást használva lehetséges a szórt fény, Rámán emisszió és a rövid élettartamú lumineszcencia, és a mintából és az érzékelőből származó nemkívánatos lumineszcenciaösszetevők megkülönöböztetése a jelölő molekula lumineszcenciájától, amely utóbbi ebben az esetben előnyösen hosszú élettartamú, oly módon, hogy a mérendő anyag emisszióját csak akkor mérjük meg, ha a rövid élettartamú sugárzás már lecsökkent. Továbbá az időben felbontott lumineszcenciadetektálás a pulzusos gerjesztés után - ugyanúgy, mint a modulált gerjesztés és detektálás esetén - lehetővé teszi a mérendő anyag kötébe lépésének a molekuláris lumineszcenciára gyakorolt hatásának vizsgálatát. A mérendő anyag specifikus felismerése mellett a rögzített detektor vegyület által és amellett, hogy a jel generálása a hullámvezető elhaló terére korlátozódik, a molekuláris lumineszcencia lecsökkenési ideje a szelektivitás további kritériuma lehet.

Az eljárás úgy is végezhető, hogy a gerjesztő fényt egy vagy több frekvencián modulált intenzitással csatoljuk be, és mérjük a fellépő fázistolást és a minta lumineszcenciájának modulációját.

63.120/BT21 *96-11-21 ···· ····

-22• · ·

A találmány tárgya még a találmány szerinti eljárás alkalmazása ismert affinitáspartnereket tartalmazó kémiai vagy biokémiai affinitásméréseknél és mérési elrendezéseknél összetevők kvantitatív meghatározására, a megjelölt, lumineszcenciasugárzásra képes emissziójának detektálása útján, vagy a rögzített, lumineszcencia-jelölt affinitáspartnerek lumineszcenciatulajdonságainak a mérendő anyaggal való kölcsönhatása során fellépő változás detektálása útján.

Mivel a jel előállítása és detektálása a hullámvezető kémiai vagy biokémiai detektáló felületére korlátozódik, és az anyagból érkező interferáló jelek meglcülönböztethetőek, az anyagok kötése a rögzített detektorvegyületekhez valósidejűén figyelhető meg. Ezért a találmány szerinti eljárás affinitás szűréshez (screening) vagy eltolódási mérésekhez (displacement assays) is használható, különösen gyógyszerészeti termékfejlesztésben, az asszociációs és disszociációs ütem közvetlen detektálásával folyamatos áramlású rendszerekben, megfelelő áramlás mellett.

A találmány tárgya még a találmányi eljárás alkalmazása antitestek vagy antigének kvantitatív meghatározására.

A találmány tárgya még a találmány szerinti eljárás egy további alkalmazása a receptorok vagy ligandumok, oligonukleotidek, DNA vagy RNA szálak, DNA vagy RNA analógok, enzimek, enzimszubsztrátok, enzim kofaktorok vagy inhibitorok, lecitinek és szánhidrátok kvantitatív meghatározására.

A találmány tárgya továbbá a találmányi eljárás alkalmazása optikailag átlátszatlan vagy zavaros folyadékok lumineszcens összetevőinek szelektív kvantitatív meghatározására.

Ilyen optikailag átlátszatlan vagy zavaros folyadék lehet pl. tojássárgája, testnedvek mint pl. vér, szérum, plazma, illetve környezetvédelmi elemzésből származó minták, egyebek között felületi víz, oldott talaj kivonatok és oldott növényi kivonatok. Megfelelő folyadékok még a kémiai termelésben kialakuló reagáló oldatok, különösen festékoldatok vagy fluoreszcens fehérítőszerek előállításából származó reagens oldatok. Szintén alkalmasak az

63.120/ΒΤ*22*96·11·21 » · · · · · · • · • · · · • ·

Β · · · · összes fajta diszperziók és keverékek, amelyeket a textiliparban használnak, amennyiben ezek egy vagy több lumineszcens összetevőt tartalmaznak. Ilyen módon a találmány szerinti eljárás minőségellenőrzésre is használható.

A találmányt a továbbiakban a következő példával részletesebben ismertetjük. Az M koncentráció mól/litert jelöl.

Példa

Optikai rendszer

A használt fényforrás λ=670 nm -es lézerdióda (Oz Optics). A fényfoltot egy leképező rendszer úgy alakítja ki, hogy a folt átmérője az érzékelő síkjában 0.4 mm merőlegesen a csatoló rács vonalaira és 2,5 mm párhuzamosan a rácsvonalakkal.

A becsatolási szöget és a fényfoltnak a rács széléhez való távolságát mechanikus beállító egységekkel állítottuk be. A lézer teljesítménye az érzékelő lapkán a P=0...3 mW tartományban választható; P=l,2 mW értékkel végeztük a rács jellemzését a következő kísérletben, míg P=0.2 mW teljesítményen történt a fluoreszcencia mérése. TE vagy TM orientációjú lineárisa polarizált fényt forgatható polarizáló elemek útján lehet becsatolni.

Az érzékelő elrendezés felső oldalán O gyűrűkkel tömített áramlási cellát helyeztünk el. A cella mintatérfogata kb. 0.8 μΐ. A cellába sugárszivattyú és fordítható szelepek segítségével különböző oldatok juttathatók.

A gerjesztés és a detektálás az érzékelő elrendezés alsó feléről történt, az 1. ábra szerinti vázlat szerint.

A detektáláshoz 3 mérési csatornát használtunk, a fluoreszcens és a gerjesztő fényt a kicsatoló rácson csatoljuk ki (k’_out és irányban, az 1. ábra szerint), továbbá egy sugárosztón keresztül a beeső gerjesztő fényt is mértük (az 1. ábrán nincs feltüntetve).

63.120/BT*23*96-11-21 • · · • · · · · · · ·· ··· · ·· · ··

-24A fluoreszcens sugárzás detektálására egy fotoelektronsokszorozót (Hamamatsu R 4632 SEL) használtunk, egyes foton számláló üzemmódban, impulzusalakkító elektronikával (Hamamatsu C3 866). Ennek a TTL kimenő jelét egy hagyományos impulzusszámlálóval (Hewlett-Packard 53131 A) számláltuk. A fluoreszcens sugárzást az egyes szögtartományokban egy fókuszáló lencserendszer fókuszálta a detektorokra. A szórt fény elnyomására interferenciaszűrőket használtunk (sávszűrő λ=725 nm, félszélesség 25 nm, Omega), amely a detektor előtt volt elhelyezve.

Referenciadetektorként sorbakapcsolt Si diódákat (UDT PIN 10D) használtunk, mérőerősítővel (UDU 101 C), amelyekkel a beeső és kicsatolt gerjesztő sugárzást mértük.

Mindhárom mérőcsatomát egyszerre lehetett kiértékelni az alább ismertetendő mérés során, egy hagyományos adatfeldolgozó rendszeren keresztül.

Érzékelő elrendezés

Hordozóként mikrostrukturált polikarbonátot használtunk, két ráccsal a be- és kicsatoláshoz. A rácsok méretei a következők voltak:

A becsatoló rács periódusa A_t= (299,5±0.7) nm, mélysége ti=6.9 nm-12.3 nm.

A kicsatoló rács periódusa A₂ = (489,5±0.6) nm, mélysége ^=8.2 nm-12.8 nm. Mindkét rács profilja kb. sin⁴ függvényt követett.

A rácsok elhelyezése az érzékelőn a 2. ábra szerint történt, a következő geometriai méretekkel: A rácsok távolsága A=4 mm, rácsszélesség (a vonalakra merőlegesen) Bj = B₂ = 2 mm, rácsmagasság (a vonalakkal párhuzamosan) 4 mm, az érzékelő elrendezés (lapka) külső mérete 12 x 20 mm .

A polikarbonát ön-fluoreszcenciájának elnyomása céljából a hordozót SiO₂ köztes réteggel vontuk be, amelynek a törésmutatója n = 1. 46 és a vastagsága t_buffer = (100±10) nm volt. Erre került a TiO₂ hullámvezető réteg, nagy törésmutatóval, n_fito = 2.35 λ = 670 nm-en, a réteg vastagsága t_fi)m = (170±5) nm volt.

63.120/BT*24*96-11-21

-25A gerjesztő fénnyel az m=0 módusok kelthetők a hullámvezetőben ezzel a rácshullámvezető kombinációval: TE₀-hoz a becsatolás Θ = (-10±1.6)° alatt, vagy pedigTM₀hoz a becsatolás Θ = (-22.7±3.7)° alatt.

A fluoreszcencia sugárzás TE polarizációval csatolódik ki, Θ = 31-40° tartományban, a gerjesztő fényre a szög Θ > 42°. A spetrális tartomány λ = 685-715 nm. A TM polarizációra a fluoreszcenciasugárzás kicsatolási szöge a Θ = 17.25° tartományba esik, míg a gerjesztő fényre a szög Θ > 27°. TE polarizációnál 1,2 mW beeső lézerteljesítménynél P = 30-50 pW fényteljesítmény mérhető a kicsatoló rács után.

Cy5.5™-jelölt immunoglobulin detektálása

Az immunoglobulin megjelölése Cy5.5™ festékkel:

Házinyúl immunoglobulint (házinyúl IgG, Sigma Chemicals) úgy jelöltünk meg, ahogy a festékgyártó előírta, a FluoroLink™ Cy5.5™ bifunkcionális cianinfestékkel (Biological Detection Systems, Pittsburgh PA 15238, USA):

1. 2,5 mg házinyúl IgG-t 1 ml festékben feloldottunk, 45 percig inkubáltuk, az oldatot minden 10 percben felráztuk.

2. Ezt az oldatot 1 ml festékhez adtuk, 45 percig inkubáltuk, az oldatot minden 10 percben felráztuk.

3. Szeparáltuk a fehérje-kötött és kötetlen festéket egy Sephadex R G25 oszlopon (Pharmacia LKB, Biotechnology AB, Uppsala, Svédország), amelyet előzőleg 50 ml, pH 7 értékű foszfát pufferrel egyensúlyba hoztunk, majd

- eltávolítottuk az 1 ml-t

- összegyűjtöttük a frakciókat.

63.120/8T*25*96-11-21 • ·

-264. Meghatároztuk a festék/fehérje arányt a 678 nm-en mért optikai sűrűségekből (a festék abszorpciós sávja) és 280 nm-en (a fehérje abszorpciós sávja). Ebből megállapítottuk, hogy a fehérje és a festék molekulák aránya 2:1.

A felhasznált oldatok

1) (0.041 M Na₂HPO₄ + 0.028 M KH₂PO₄), 0.151 M NaCI, 200 mg/1 nátriumazid, 50 ml methanol összetételű pufferoldat, 1 liter desztillált vízzel felhígítva

2) a protein A (Sigma Chemicals) rögzítéséhez használt oldat: 1 mg/ml desztillált víz;

3) semlegesítő oldat: 1) pufferoldat +10 mg/ml marhaszérum albumin, (bovine serum albumin, BSA, Sigma Chemicals);

4) öblítő oldat: a háttérjel meghatározására is ezt használtuk, 1) pufferoldat + 1 mg/ml BSA;

5) mintaoldatok: Cy5.5™-jelölt immunoglobulin különböző koncentrációkban: 10' M, 10' Μ, 3·10'^1θ Μ 1·10'^1θ M az 1) pufferoldatban 1 mg/ml BSA adalékkal;

6) regeneráló oldat: glicin puffer, pH 2.5.

A protein A biokémiai indikátor réteg felvitele

Az optikai érzékelő elrendezést 10 órán át inkubáltuk a 2) oldattal a protein A rögzítése céljából. Az esetleges szabadon maradó adszorpciós helyek semlegesítése céljából az érzékelő elrendezést desztillált vízzel átmostuk és további 1 óra hosszat inkubáltuk a semlegesítő oldattal, amely 10 g/1 BSA-t tartalmazott.

Mérési eljárás

A teljes eljárás alatt 0.25 ml/perc folyadékáramot tartottunk fenn az aktív érzékelő felületen: Az eljárás a következő egyedi lépésekből áll:

- mosás 4 percen keresztül a 4) öblítő oldattal, közben a háttérjel rögzítése;

- az 5) mintaoldat hozzáadása 4 percen keresztül;

63.120/BT*26*96-11-21 ti • · ·

-2Ί - mosás 4 percen keresztül a 4) öblítő oldattal

- a 6) regeneráló oldat hozzáadása 4 percen keresztül;

- mosás 4 percen keresztül a 4) öblítő oldattal

A második rácson át kicsatolt fluoreszcencia jelet a teljes folyama alatt mértük. A különböző koncentrációk mellett az alább következő jelváltozást rögzítettük a minta hozzáadásának befejeztével, a kezdeti háttérjellel összehasonlítva: jel/zaj viszony 50 és 100 impulzus/másodperc (cps):

[Cy 5.5 tgG]

10⁸M

10'⁹M

3·10^1θΜ fluoreszcencia jel [cps]

7000

850

300

A detektálás korlátja a ráccsal történő kicsatolással végzett fluoreszcencia detektálásnál egyértelműen 3·10’¹⁰ M alatt van, amely 3·10’¹³ mól Cy5.5 jelölt IgG koncentrációnak felel meg.

63.120/BT*27*96-11-21

Claims (37)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás lumineszcencia meghatározására sík dielektrikum optikai érzékelőelrendezéssel, amely átlátszó hordozóból és azon elhelyezett vékony transzparens hullámvezető rétegből áll, továbbá amely érzékelőelrendezés a gerjesző fény becsatolásához becsatoló ráccsal van ellátva, és amely érzékelőelrendezésnél a hordozó törésmutatója kisebb, mint a hullámvezető réteg törésmutatója, azzal jellemezve, hogy folyadékmintát mint fedőréteget érintkezésbe hozunk a hullámvezető réteggel, és a mintában elhelyezkedő vagy a hullámvezető réteghez kötött lumineszcens tulajdonságokkal bíró összetevők által keltett lumineszcenciát optoelektronikus úton megmérjük, oly módon, hogy a gerjesztő fényt a becsatoló ráccsal becsatoljuk a sík hullámvezető rétegbe, hogy a gerjesztő fény végighaladjon a hullámvezető rétegen, miáltal a lumineszcens tulajdonságokkal bíró összetevők a gerjesztés hatására lumineszcenciát bocsátanak ki a hullámvezető réteg elhaló (evaneszcens) terében, továbbá amely eljárás során a gerjesztő sugárzás λ hullámhosszánál kisebb vastagságú a gerjesztő sugárzás hullámhosszán 1,8-nél nagyobb vagy egyenlő törésmutatójú hullámvezető réteget alkalmazunk, továbbá a hullámvezető rétegbe visszacsatolódott lumineszcens sugárzást egy második, az első csatoló rácstól térben elválasztott csatoló ráccsal kicsatoljuk és detektáljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy λ/2-nél kisebb vastagságú hullámvezető réteget alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40-160 nm vastagságú hullámvezető réteget alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3-60 nm modulációs mélységű rácsot alkalmazunk.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gerjesztő sugárzást a lumineszcens sugárzás kicsatolási szögétől különböző szög alatt csatoljuk ki.

   63.120/BT*28*96-11-21 • · «a ··········· “ * ······ • ··· · ··· • · · » · ·· «·· ··· · « ·

   -296. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gerjesztő sugárzást hátrafelé csatoljuk be a hullámvezetőbe és a hullámvezető által továbbított gerjesztő sugárzást és a lumineszcens sugárzást előrefelé csatuljuk ki a hullámvezetőből.
6. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gerjesztő sugárzást 1-50 ⁰ alatti szögben csatoljuk be a hullámvezetőbe.
7. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hullámvezetőbe visszacsatolódott lumineszcenciasugárzást 1-50 ⁰ alatti szögben csatoljuk ki a hullámvezetőből.
8. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozó által keltett lumineszcenciát elnyomjuk.
9. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében párhuzamos fénnyel gerjesztjük a lumineszcenciát.
10. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az analizálandó anyag detektálására használt lumineszcenciára képes összetevőt közvetlenül a hullámvezető réteg felületén rögzítjük.
11. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az analizálandó anyaghoz vagy ahhoz kötődő vegyülethez kötődő specifikus vegyületet rögzítünk vegyi vagy biokémiai detektorként az érzékelőelrendezés felületén, egy olyan többlépcsős mérés során, amelynek menetében az analizálandó anyag az egyik részlépésben kötésbe lép.
12. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyben meghatározzuk a besugárzott gerjesztő fény abszorpcióját is.
13. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gerjesztő fényt folyamatos (cw) módusban csatoljuk be a hullámvezetőbe.

    63.120/BT*29‘96-11-21 • · ····«· • ··« · ··· ·· • · « · · · ·· ··· ··· · ··

    -30···· ····
14. 15. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gerjesztő fényt időzített pulzusként csatoljuk be és a lumineszcenciát időben felbontva mérjük.
15. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pulzushosszot 1 ps és 100 s között választjuk.
16. 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több frekvencián modulált intenzitással csatoljuk be a gerjesztő fényt és a minta lumineszcenciájának fellépő modulációját és fázistolódását detektáljuk.
17. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintaként tojássárgáját, vért, szérumot, plazmát vagy vizeletet mérünk.
18. 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintaként felületi vizet, talaj- vagy növénykivonatot, bioeljárás-elegyet vagy szintetikus elegyet mérünk.
19. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biokémiai vegyületek affinitásérzékelésének kvantitatív meghatározására használjuk.
20. 21. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestek vagy antigének kvantitatív meghatározására használjuk.
21. 22. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazása receptorok vagy ligandumok, oligonukleotidek, DNA vagy RNA törzsek, DNA vagy RNA analógok, enzimek, enzimszubsztrátok, enzim kofaktorok vagy inhibitorok, lektinek és karbohidrátok kvantitatív meghatározására.
22. 23. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazása optikailag átlátszatlan folyadékokban lumineszcens komponensek szelektív kvantitatív meghatározására.

    63.120/BT*30*96-11-21 ·· · ·«·· ··*·

    -31
23. 24. Optikai érzékelőelrendezés lumineszcencia meghatározására az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárással, amely elrendezés tartalmaz egy lényegében sík, optikailag transzparens hordozót, amelyen vékony hullámvezető van elhelyezve, és amely elrendezés el van látva a gerjesztő sugárzás becsatolásához csatoló ráccsal, továbbá amely hordozó törésmutatója kisebb mint a hullámvezető törésmutatója, azzal jellemezve, hogy a hullámvezető réteg vastagsága kisebb mint a gerjesztő sugárzás λ hullámhossza, továbbá a hullámvezető réteg anyagának törésmutatója a gerjesztő sugárzás hullámhosszán nagyobb, mint 1,8; valamint az érzékelő elrendezés második, az első csatoló rácstól térben elválasztott, a hullámvezető rétegbe visszacsatolódott lumineszcenciasugárzást kicsatoló rácsot tartalmaz.
24. 25. A 24. igénypont szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a hullámvezető réteg vastagsága λ/2-nél kisebb.
25. 26. A 24. igénypont szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a hullámvezető réteg vastagsága 40-160 nm közötti.
26. 27. A 24. igénypont szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a rács modulációs mélysége

    3-60 nm.
27. 28. A 24-27. igénypontok bármelyike szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a az első, a gerjesztő sugárzást becsatoló rács rácsállandója különbözik a második, a lumineszcenciasugárzást kicsatoló rács rácsállandójától.
28. 29. A 24-27. igénypontok bármelyike szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a rácsállandó B < X_1/e, ahol X_1/e az a hossz, amelyen a beeső sugárzás I_o intenzitása Ve értékre csökken.
29. 30. A 29. igénypont szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a rácsállandó B < 0.2 · X_1/e.

    63.120/BT*31‘96-11-21 • ·

    -32···· ···· ··
30. 31. A 24-30. igénypontok bármelyike szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a hordozó lumineszcenciáját elnyomó, alacsony törésmutatójú köztes réteg van a hordozó és a hullámvezető réteg között.
31. 32. A 31. igénypont szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy az alacson törésmutatójú köztes réteg lényegében SiO₂ vagy SiO_xC_yH_z összetételű.
32. 33. A 31. vagy 32. igénypont szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a köztes réteg vastagsága < lOOOnm
33. 34. A 24-33. igénypontok bármelyike szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy szerves mikro strukturált hordozót tartalmaz.
34. 35. A 24-34. igénypontok bármelyike szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy mikrostrukturált szerves bevonattal ellátott szerves hordozót tartalmaz.
35. 36. A 24-35. igénypontok bármelyike szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a sík transzparens hullámvezető réteg anyaga Ta2O5 vagy TiO2.
36. 37. A 24-36. igénypontok bármelyike szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy a hullámvezető réteg és a minta között adhéziót javító réteg van.
37. 38. A 37. igénypont szerinti elrendezés, azzal jellemezve, hogy az adhéziót javító réteg vastagsága < 50 nm.