CN118091110A - 一种用于单分子免疫检测的生物探针及检测方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请属于单分子免疫检测技术领域，涉及一种用于单分子免疫检测的生物探针及检测方法和用途，用于单分子免疫检测的生物探针，包括第一探针和第二探针；第一探针包括寡核苷酸序列DNA1和靶分子结合序列Ab1；第二探针包括寡核苷酸序列DNA2和靶分子结合序列Ab2；寡核苷酸序列DNA1包括间隔区、寡核苷酸序列DNA2互补区，以及，分子信标互补区1；寡核苷酸序列DNA2包括间隔区、寡核苷酸序列DNA1互补区，以及，分子信标互补区2。这一对生物探针能够互补杂交，且能够与荧光信号和靶分子结合，通过均相免疫反应，一步实现单分子识别；操作简单，快速，成本低。
Description
技术领域
本申请属于免疫检测技术领域，具体涉及一种用于单分子免疫检测的生物探针剂及检测方法和用途。
背景技术
单分子免疫技术是对免疫复合物产生的信号进行绝对计数，是一种“数字化”的高灵敏方法，灵敏度可达到10-16M，能够满足低丰度蛋白的高灵敏检测，在体外诊断的领域中备受关注。
近年来，发展了许多新的单分子免疫检测方法，基于微流控芯片的单分子免疫方法的金标准是单分子阵列技术(SiMoA)。但该方法存在磁珠装载效率低、芯片加工成本高、非均相反应操作复杂等问题。
发明内容
因此，本申请要解决的技术问题在于提供一种用于单分子免疫检测的生物探针及检测方法和用途。解决了非均相单分子免疫操作复杂，误差积累的问题，突破了均相单分子免疫需要液滴收集、变温孵育的复杂操作瓶颈，构建了均相、快速、可恒温孵育的单分子免疫方法。
为此，本申请提供了以下技术方案：
第一方面，本申请提供了一种用于单分子免疫检测的生物探针，所述生物探针包括第一探针和第二探针；所述第一探针和第二探针部分序列能够互补杂交；
所述第一探针的5’-3’方向上依次包括靶分子结合序列Ab1和寡核苷酸序列DNA1；
所述第二探针的5’-3’方向上依次包括寡核苷酸序列DNA2和靶分子结合序列Ab2；
所述靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2均能与靶分子结合；
所述寡核苷酸序列DNA1的5’-3’方向上依次包括间隔区、寡核苷酸序列DNA2互补区，以及，分子信标互补区1；
所述寡核苷酸序列DNA2的5’-3’方向上依次包括分子信标互补区2、寡核苷酸序列DNA1互补区，以及，间隔区；
间隔区序列用来减小蛋白结合时的空间位阻。
所述分子信标互补区1和所述分子信标互补区2分别能够与分子信标两端的部分序列结合。
在一种可选的实施方式中，所述靶分子包括蛋白质、非蛋白类抗原、非蛋白类抗体或非蛋白类微生物表面抗原；
和/或，所述靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2均为能够与靶分子结合的单链核酸、抗体、抗原或适配体。
在一种可选的实施方式中，所述靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2为与靶分子不同部位结合的一对抗体。
在一种可选的实施方式中，所述寡核苷酸序列DNA1的3’端与所述分子信标序列的5’端互补；所述寡核苷酸序列DNA2的5’端与所述分子信标序列的3’端互补；
所述寡核苷酸序列DNA1和靶分子结合序列Ab1，或者，所述寡核苷酸序列DNA2和靶分子结合序列Ab2的连接方法均包括但不限于使用链霉亲和素-生物素亲和反应或者化学修饰共价反应。
第二方面，本申请还提供了一种单分子免疫检测系统，所述单分子免疫检测系统包括：所述的用于单分子免疫检测的生物探针和分子信标，
所述分子信标序列的两端分别连接有荧光增强基团和淬灭基团；
所述分子信标序列的两端部分序列互补杂交形成发夹结构。
在一种可选的实施方式中，所述分子信标序列的5’端连接有荧光增强基团；所述分子信标序列的3’端连接有淬灭基团；
和/或，所述荧光增强基团包括FAM或ROX；
和/或，所述淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
在一种可选的实施方式中，所述分子信标序列还包含酶切位点；
优选地，所述分子信标序列还包含两个酶切位点；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括与所述酶切位点对应的内切酶(内切酶的切割位点与MB序列中一致)；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括酶切缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括反应缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括液滴生成剂，所述液滴生成剂包括油类，所述油类包括但不限于矿物油、氟化油和/或热固油。
MB(分子信标)序列中包含有两个重复的酶切位点，内切酶的切割位点与MB序列中一致。
在一种可选的实施方式中，所述内切酶包括但不限于使用Nt.BbvCI和/或Nb.Btsl；
和/或，所述酶切缓冲液中含有10～50mM的KAc溶液、10～30mM的Tris-Ac溶液、10～20mM的Mg(Ac)2溶液为和80～150μg/ml的BSA溶液(牛血清白蛋白溶液)；
和/或，所述反应缓冲液中含有120～140mM的NaCl溶液、5～10mM的Na2HPO4溶液、5～10mM的K2HPO4溶液和5～10mM的MgCl2溶液；
和/或，所述液滴生成剂还包括表面活性剂，所述表面活性剂包括但不限于SDS、Triton-X100和/或Lecithin等。
在一种可选的实施方式中，所述单分子免疫检测系统包括单分子免疫检测试剂盒；
所述单分子免疫检测试剂盒包括A反应试剂装置、B反应试剂装置和C反应试剂装置；
所述A反应试剂装置盛放的反应试剂包括第一探针；所述B反应试剂装置盛放的反应试剂包括第二探针；所述C反应试剂装置盛放的反应试剂包括分子信标。
在一种可选的实施方式中，所述单分子免疫检测试剂盒还包括D反应试剂装置，所述D反应试剂装置盛放的反应试剂包括内切酶和/或酶切缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测试剂盒还包括E反应试剂装置，所述E反应试剂装置盛放的反应试剂包括反应缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测试剂盒还包括F反应试剂装置，所述F反应试剂装置盛放的反应试剂包括液滴生成剂。
液滴生成剂中包括油类和表面活性剂。
在一种可选的实施方式中，所述单分子免疫检测系统还包括微流控芯片或液滴发生器。
所述的微流控芯片为液滴微流控芯片。
在一种可选的实施方式中，所述微流控芯片为PDMS微流控芯片，还可以采用PMMA等。
第三方面，本申请还提供了一种单分子免疫检测的方法，包括利用所述的用于单分子免疫检测的生物探针和/或所述的单分子免疫检测系统对靶分子进行检测；
将包括第一探针、第二探针、靶分子、分子信标的试剂混合并反应，然后对反应液进行单分子免疫检测。
在一种可选的实施方式中，第一探针和第二探针的摩尔比为(0.5-1.5):1；
和/或，第一探针和第二探针在反应液中的浓度均为100～500pM；
和/或，靶分子在反应液中的浓度为0-1.5pg/mL；
和/或，所述分子信标在反应液中的浓度为1～30μM；
和/或，所述混合并反应的温度为30～40℃，所述混合并反应的时间为30～40min；
和/或，所述方法还包括将反应液、内切酶形成混合反应液，在液滴生成剂的作用下分散形成单分子液滴，孵育，再进行检测。
在一种可选的实施方式中，孵育的温度为37～45℃，加热时间30～50min；
和/或，所述内切酶在混合反应液中的浓度为2～5U/mL；
和/或，单分子液滴的形成过程包括：将混合反应液和液滴生成剂通入微流控芯片或液滴发生器，使之分散形成单分子液滴；
和/或，所述检测具体为，将微流控芯片或液滴发生器放在荧光显微镜下，进行观察和分析。
液滴生成剂中包括油类和表面活性剂；用泵系统调节油相(油类和表面活性剂)流速为2μL/min，水相流速为1μL/min。
所述的荧光显微镜包括但不限于使用普通的荧光显微镜、倒置荧光显微镜等。
所述荧光显微镜激发光波长包括但不限于497nm、649nm、550nm等。
所述检测具体为，将微流控芯片或液滴发生器放在荧光显微镜下，进行观察和分析。
液滴生成剂中表面活性剂的含量为1％～3vol％。
所述单分子液滴的直径大小范围为50～60μm。
第四方面，本申请还提供了一种所述的用于单分子免疫检测的生物探针或所述的单分子免疫检测系统或所述的单分子免疫检测方法在单分子免疫检测中的用途。
本申请技术方案，具有如下优点：
1.本申请提供的一种用于单分子免疫检测的生物探针，包括第一探针和第二探针；第一探针和第二探针部分序列能够互补杂交；第一探针包括寡核苷酸序列DNA1和靶分子结合序列Ab1；第二探针包括寡核苷酸序列DNA2和靶分子结合序列Ab2；靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2均能与靶分子结合；寡核苷酸序列DNA1包括间隔区、寡核苷酸序列DNA2互补区，以及，分子信标互补区1；寡核苷酸序列DNA2包括间隔区、寡核苷酸序列DNA1互补区，以及，分子信标互补区2；分子信标互补区1和分子信标互补区2分别能够与分子信标两端的部分序列结合。这一对序列能够互补杂交，且能够与分子信标和靶分子结合，通过均相免疫反应，无需变温扩增，一步实现单分子识别，避免磁珠装载；操作简单，快速，成本低；能够检测最低浓度为0.15fg/mL的靶分子，灵敏度高。
2.本申请提供的一种单分子免疫检测方法，将第一探针、第二探针、靶分子和分子信标的试剂混合并反应；进行检测。在检测前只需一步均相反应，降低操作的复杂性，无需多余清洗步骤，简洁快速省时，成本低；经实验例验证，基于所述的用于单分子免疫检测的生物探针可以实现对靶分子的高灵敏度和高特异性检测。
3.本申请提供的单分子免疫检测系统，包括第一探针、第二探针和分子信标，分子信标序列的两端分别连接有荧光增强基团和淬灭基团；通过分子信标点亮单分子液滴，实现了快速的、低成本的、高灵敏度和特异性的单分子免疫检测。
4.本申请提供的单分子免疫检测系统中，分子信标包含酶切位点，借助内切酶对分子信标进行酶切循环，从而实现信号的放大，对靶标的精准靶向及靶标分子的定量检测。特异性强、灵敏度高、背景信号低以及反应温度低，无需变温扩增技术，为靶分子的定量检测提供了一种高灵敏的分析手段。
5.本申请提供的单分子免疫检测方法不依赖昂贵的PCR仪器，操作方法更加简化便捷，应用简单的荧光显微镜进行观察，无需使用全内反射显微镜、共聚焦显微镜等精密装置，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例4基于邻近杂交和分子信标的均相免疫反应示意图；
图2为本申请实施例4液滴内恒温扩增反应的示意图；
图3为实施例5中50μm直径液滴的条件下，样本在荧光显微镜中的明场图片及荧光成像图；
图4为实施例6中不同浓度梯度样品的单分子荧光成像图。
图5为对比例1中单分子技术与传统ELISA方法的检测能力比较。
图6为对比例2中单分子技术与相同方法学下液相反应的检测能力比较。
图7为对比例3中生物探针不含间隔区的荧光成像图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本申请，并不局限于所述最佳实施方式，不对本申请的内容和保护范围构成限制，任何人在本申请的启示下或是将本申请与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本申请相同或相近似的产品，均落在本申请的保护范围之内。
本申请中的所述溶液如无特殊说明均为无菌水溶液。下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的材料和试剂均为市售产品，以下述为例，具体如下：
寡核苷酸(DNA1，DNA2)，分子信标(MB)序列均由上海生工合成。靶标分子(CRP)货号CRP313、抗体Ab1货号CRP103和Ab2货号CRP105，均购买自博岳生物。
上述的产品的序列如下表1中。
表1序列表
表1中，下划线为“”表示分子信标互补区，下划线为“”表示DNA1、DNA2的互补杂交区，斜体为间隔序列。下划线为“”MB的酶切位点序列(该位点对应Nt.BbvCI酶)。
内切酶(Nt.BbvCI、Nb.Btsl，酶活为10,000U/ml)、酶切缓冲液均购自New EnglandBiolabs公司。其他化学品均来自上海生工公司，分析纯。
实施例1单分子免疫检测的生物探针
本实施例提供了一种单分子免疫检测的生物探针，包括第一探针和第二探针；
第一探针包括寡核苷酸序列DNA1和靶分子结合序列Ab1；
第二探针包括寡核苷酸序列DNA2和靶分子结合序列Ab2；
将DNA1和Ab1、DNA2和Ab2使用链霉亲和素-生物素亲和反应或者化学修饰共价反应进行连接。
第一探针(DNA1-Ab1)的制备：采用链霉亲和素-生物素亲和反应，DNA1合成时连接生物素，Ab1进行链霉亲和素连接。第二探针(DNA1-Ab1)采用与第一探针相同的方法制备。
寡核苷酸序列DNA1包括间隔区、寡核苷酸序列DNA2互补区，以及，分子信标互补区1；
寡核苷酸序列DNA2包括间隔区、寡核苷酸序列DNA1互补区，以及，分子信标互补区2。
本实施例中靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2为靶分子的一对抗体。靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2均为能够与靶分子结合的单链核酸、抗体、抗原或适配体；
寡核苷酸序列DNA1的3’端与分子信标序列的5’端互补；寡核苷酸序列DNA2的5’端与分子信标序列的3’端互补。
最终得到的第一探针和第二探针的寡核苷酸序列见表1中的DNA1(序列表中SEQID NO.1)和DNA2(序列表中SEQ ID NO.2)。所述第一探针的5’端连接Ab1抗体，所述第二探针的3’端连接Ab2抗体。
实施例2单分子免疫检测系统
本实施例提供了一种单分子免疫检测系统，包括第一探针、第二探针和分子信标，
分子信标序列的两端分别连接有荧光增强基团和淬灭基团；
分子信标序列的5’端连接有荧光增强基团；分子信标序列的3’端连接有淬灭基团；
本实施例中的荧光增强基团为FAM(也可以是ROX等具有发光性质的材料)；淬灭基团为BHQ1(也可以是BHQ2等具有淬灭性质的材料)。
分子信标序列还包含两个重复的酶切位点；最终的分子信标的核苷酸序列见表1中的MB序列(序列表中SEQ ID NO.3)。
单分子免疫检测系统还包括内切酶(Nt.BbvCI)；内切酶也可以是Nb.Btsl；
单分子免疫检测系统还包括酶切缓冲液；酶切缓冲液中含有10～50mM的KAc溶液、10～30mM的Tris-Ac溶液、10～20mM的Mg(Ac)2溶液为和80～150μg/ml的BSA溶液；
单分子免疫检测系统还包括反应缓冲液，反应缓冲液中含有120～140mM的NaCl溶液、5～10mM的Na2HPO4溶液、5～10mM的K2HPO4溶液和5～10mM的MgCl2溶液；
单分子免疫检测系统还包括液滴生成剂，液滴生成剂中含有矿物油(也可以是氟化油和/或热固油)；
液滴生成剂还包括表面活性剂，表面活性剂包括但不限于SDS、Triton-X100、Lecithin等。
实施例3单分子免疫检测试剂盒
本实施例提供了一种单分子免疫检测试剂盒，包括A反应试剂装置、B反应试剂装置和C反应试剂装置；
A反应试剂装置盛放的反应试剂包括第一探针；B反应试剂装置盛放的反应试剂包括第二探针；C反应试剂装置盛放的反应试剂包括分子信标；
优选地，单分子免疫检测试剂盒还包括D反应试剂装置，D反应试剂装置盛放的反应试剂包括内切酶和/或酶切缓冲液；
单分子免疫检测试剂盒还包括E反应试剂装置，E反应试剂装置盛放的反应试剂包括反应缓冲液；
单分子免疫检测试剂盒还包括F反应试剂装置，F反应试剂装置盛放的反应试剂包括液滴生成剂。
实施例4单分子免疫检测方法
本实施例提供了一种单分子免疫检测的方法，利用实施例1的单分子免疫检测的生物探针或实施例2单分子免疫检测系统或实施例3的单分子免疫检测试剂盒对靶分子进行检测；
通过邻近杂交和分子信标完成单分子识别，然后通过液滴内恒温扩增使单分子点亮单液滴，具体地，包括如下步骤：
步骤一：构建均相免疫体系，进行单分子识别，如图1所示，图1中：
Ab1—靶分子结合序列(抗体1)；Ab2—靶分子结合序列(抗体2)；DNA2-Ab2—第二探针；DNA1-Ab1—第一探针；MB—分子信标；PH复合物—邻近杂交复合物；MB-PH复合物—均相免疫复合物。
反应体系包括：8μM的MB、0.5μM的DNA1-Ab1、0.5μM的DNA2-Ab2、137mM的NaCl、8mM的Na2HPO4、5mM的K2HPO4、5mM的MgCl2和不同浓度靶蛋白样品，具体的，靶分子在反应液中的浓度为：0、0.15fg/mL、1.5fg/mL、15fg/mL、0.15pg/mL、1.5pg/mL。以C反应蛋白(CRP)为靶分子。
将上述反应体系在37℃下混合并反应30min，得到均相免疫复合物。
步骤二：均相免疫复合物与内切酶形成混合反应液，混合反应液与油相(热固油和表面活性剂)在微流控芯片的作用下分散成单分子液滴，使单液滴装载单分子。表面活性剂在油相中的含量为2vol％。
将10μL内切酶(Nt.BbvCI)与步骤一中的均相免疫复合物、酶切缓冲液混合形成酶含量为3U/mL的混合反应液(作为水相)，与油相一起通入PDMS微流控芯片。用泵系统调节油相流速为2μL/min，水相(均相免疫复合物与内切酶为水相)流速为1μL/min，生成单分子液滴(50μm)。
所述的酶切缓冲液包含50mM Kac、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA。
步骤三：进行恒温扩增，使单分子点亮单液滴。
对PDMS微流控芯片中液滴观察的区域进行恒温加热，使其中的体系进行酶切循环(图2)。酶切反应的温度为40℃，加热时间40min。
从实施例中可以看出：与本申请在芯片外只需一步均相免疫反应，在芯片内也只需提供一步恒温的孵育，操作过程简单、快速、对专业性要求不高。本申请解决了目前非均相免疫在芯片外需要多步冲洗；均相免疫需要变温扩增，依赖PCR仪的问题。
实施例5单分子免疫检测并观察
本实施例为以直径50μm液滴为标准，在实施例4的基础上，利用所述单分子均相免疫方法检测实验样品的信号结果。
具体地，将实施例4形成的免疫复合物和内切酶在PDMS芯片中通过泵系统分散成单液滴，在对液滴进行恒温孵育后，利用荧光显微镜观察，测试结果如图3所示(靶蛋白浓度为0.3pg/mL)。
所述的荧光显微镜激发光选用497nm。
从实验结果可以看出，在明场图像(图左)中，液滴的直径大约在50μm左右，对应的荧光图像(图右)为检测时的显微镜中单分子液滴成像图。
实施例6不同浓度靶分子的单分子免疫检测
在实施例4和5的基础上，本实施例为50μm直径液滴的条件下，检测不同浓度梯度靶分子(CRP)蛋白样品检测的荧光成像图，测试结果如图4所示，图4中，从左到右依次为0、0.15fg/mL、1.5fg/mL、15fg/mL、0.15pg/mL、1.5pg/mL。
从实验结果可以看出，不同浓度的蛋白样品所产生的单分子荧光现象不同，且发光液滴数与样品浓度成正比。本申请所提出的方法能够对蛋白质样品完成单分子均相免疫检测。
对比例1
采用传统ELISA方法对CRP进行检测，ELISA试剂盒购买自Abcam公司，货号ab260058，依照说明书操作步骤测得不同浓度下的O.D.值，检测结果如图5所示，根据结果我们可以看出在单纯的ELISA方法中，对于CRP蛋白的检测限大概约为14.43pg/mL。但是利用本申请中单分子均相免疫恒温扩增技术策略，检测限明显下降，可以达到0.15fg/mL。通过对比，本申请所提出的单分子免疫方法能够实现对靶分子的高灵敏检测。
对比例2
按照实施例4步骤一的方法形成均相免疫复合物，随后，将10μL内切酶(Nt.BbvCI)与均相免疫复合物、酶切缓冲液混合形成酶含量为3U/mL的混合反应液在管中进行孵育，采用荧光分度计捕获荧光信号，而非借助微流控芯片进行单分子检测。
检测结果如图6所示，根据结果我们可以看出在单纯的液相方法中，对于CRP蛋白的检测限大概约为10pg/mL。但是利用本申请中单分子均相免疫恒温扩增技术策略，检测限明显下降，可以达到0.15fg/mL。通过对比，本申请所提出的单分子免疫方法能够实现对靶分子的高灵敏检测。
对比例3
采用实施例1基本相同的探针，唯一区别在于：第一探针和第二探针均不包括间隔区。
根据实施例4和实施例5完全相同的方法进行单分子免疫检测。
结果显示，当靶标浓度为0和0.3pg/mL时，荧光液滴现象如图7所示(左图对应靶标浓度为0，右图对应靶标浓度为0.3pg/mL)，信号与背景结果相似，不存在梯度现象。这可能是由于当间隔序列不存在时，两个抗体结合靶标后，核酸链没有足够的空间互相靠近从而发生杂交互补。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本申请创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种用于单分子免疫检测的生物探针，其特征在于，所述生物探针包括第一探针和第二探针；所述第一探针和第二探针部分序列能够互补杂交；
所述第一探针的5’-3’方向上依次包括靶分子结合序列Ab1和寡核苷酸序列DNA1；
所述第二探针的5’-3’方向上依次包括寡核苷酸序列DNA2和靶分子结合序列Ab2；
所述靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2均能与靶分子结合；
所述寡核苷酸序列DNA1的5’-3’方向上依次包括间隔区、寡核苷酸序列DNA2互补区，以及，分子信标互补区1；
所述寡核苷酸序列DNA2的5’-3’方向上依次包括分子信标互补区2、寡核苷酸序列DNA1互补区，以及，间隔区；
所述分子信标互补区1和所述分子信标互补区2分别能够与分子信标两端的部分序列结合。
2.根据权利要求1所述的用于单分子免疫检测的生物探针，其特征在于，所述靶分子包括蛋白质、非蛋白类抗原、非蛋白类抗体或非蛋白类微生物表面抗原；
和/或，所述靶分子结合序列Ab1和靶分子结合序列Ab2为与靶分子不同部位结合的单链核酸、抗体、抗原或适配体。
3.一种单分子免疫检测系统，其特征在于，所述单分子免疫检测系统包括：权利要求1或2所述的用于单分子免疫检测的生物探针和分子信标；所述分子信标序列还包含酶切位点；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括与所述酶切位点对应的内切酶；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括酶切缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括反应缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测系统还包括液滴生成剂，所述液滴生成剂包括油类，所述油类包括但不限于矿物油、氟化油和/或热固油。
4.根据权利要求3所述的单分子免疫检测系统，其特征在于，所述内切酶包括但不限于Nt.BbvCI和/或Nb.Btsl；
和/或，所述酶切缓冲液中含有10～50mM的KAc溶液、10～30mM的Tris-Ac溶液、10～20mM的Mg(Ac)2溶液和80～150μg/ml的BSA溶液；
和/或，所述反应缓冲液中含有120～140mM的NaCl溶液、5～10mM的Na2HPO4溶液、5～10mM的K2HPO4溶液和5～10mM的MgCl2溶液；
和/或，所述液滴生成剂还包括表面活性剂，所述表面活性剂包括但不限于SDS、Triton-X100和/或Lecithin。
5.根据权利要求3所述的单分子免疫检测系统，其特征在于，所述单分子免疫检测系统包括单分子免疫检测试剂盒；
所述单分子免疫检测试剂盒包括A反应试剂装置、B反应试剂装置和C反应试剂装置；
所述A反应试剂装置盛放的反应试剂包括第一探针；所述B反应试剂装置盛放的反应试剂包括第二探针；所述C反应试剂装置盛放的反应试剂包括分子信标。
6.根据权利要求5所述的单分子免疫检测系统，其特征在于，
所述单分子免疫检测试剂盒还包括D反应试剂装置，所述D反应试剂装置盛放的反应试剂包括内切酶和/或酶切缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测试剂盒还包括E反应试剂装置，所述E反应试剂装置盛放的反应试剂包括反应缓冲液；
和/或，所述单分子免疫检测试剂盒还包括F反应试剂装置，所述F反应试剂装置盛放的反应试剂包括液滴生成剂；
和/或，所述单分子免疫检测试剂盒还包括G反应芯片装置，所述G反应芯片装置包括微流控芯片或液滴发生器。
7.一种单分子免疫检测方法，其特征在于，包括利用权利要求1或2所述的用于单分子免疫检测的生物探针和/或权利要求3-7任一项所述的单分子免疫检测系统对靶分子进行检测；
将包括第一探针、第二探针、靶分子、分子信标的试剂混合并反应，然后对反应液进行单分子免疫检测。
8.根据权利要求7所述的单分子免疫检测方法，其特征在于，第一探针和第二探针的摩尔比为(0.5-1.5):1；
和/或，第一探针和第二探针在反应液中的浓度均为100～500pM；
和/或，靶分子在反应液中的浓度为0-1.5pg/mL；
和/或，所述分子信标在反应液中的浓度为1～30μM；
和/或，所述混合并反应的温度为30～40℃，所述混合并反应的时间为30～40min；
和/或，所述方法还包括将反应液、内切酶形成混合反应液，在液滴生成剂的作用下分散形成单分子液滴，孵育，再进行检测。
9.根据权利要求8所述的单分子免疫检测方法，其特征在于，
孵育的温度为37～45℃，加热时间30～50min；
和/或，所述内切酶在混合反应液中的浓度为2～5U/mL；
和/或，单分子液滴的形成过程包括：将混合反应液和液滴生成剂通入微流控芯片或液滴发生器，使之分散形成单分子液滴；
和/或，所述检测具体为，将微流控芯片或液滴发生器放在荧光显微镜下，进行观察和分析。
10.权利要求1或2所述的用于单分子免疫检测的生物探针或权利要求3-6任一项所述的单分子免疫检测系统或权利要求7-9任一项所述的单分子免疫检测方法在单分子免疫检测中的用途。
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