JP2001511654A - 微生物を検出するためのセンサー器具、及びそのための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 臨床及び非臨床試料中の微生物の存在を検出することができる器具及び方法。センサー（１）である本器具は、液体サンプルに含まれる微生物コロニーを培養するための環境と、手動若しくは器械を用いてのどちらかで生物の検出及び定量を容易にするための手段とを提供する。センサー（１）は微生物固定化マトリックス層（１０）とセンサー層（１２）とを有する。検出された微生物コロニーは直ちにその後の試験のために利用できる。センサーは、液体サンプルを受け入れるための領域（２）、プレートの内面上に液体サンプルを固定化するための機構、サンプル中の微生物の増殖を容易にするための栄養素源、及びサンプル内の微生物コロニーの検出及び／又は計数を可能とするセンサーを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物を検出するためのセンサー器具、及びそのための方法 発明の背景 臨床試料中の微生物汚染の存在は、従来では、栄養素源の存在下で試料を培養 すること、及び一定期間後の試料中における又は試料上方の大気中における変化 を通して微生物活性を検出することによって決定される。例えば、Ａｈｎｅｌｌ らへ付与された米国特許第４，１８２，６５６号では、試料が炭素１３標識発酵 性基質を含む培地が充填された容器に入れられる。容器を密閉して試料を生物学 的活性に対して伝導性である条件を受けさせた後、試料上方のガス大気中におけ る炭素１３対炭素１２の比率が決定され、初期比率と比較される。米国特許第４ ，１５２，２１３号では、容器中のガス圧を監視することを通して試料上方の大 気中における酸素量の減少を検出することによって、試料中の酸素消費細菌の存 在が密閉容器中で決定される方法が主張されている。米国特許第４，０７３，６ ９１号は、培地を含む密閉容器中で一定期間後における試料上方のガス大気の性 質における変化を測定することによって、細菌を 含む生物学的に活性な物質の存在を決定するための方法を提供している。 Ｃａｌａｎｄｒａらへの米国特許第５，０９４，９５５号はある非侵襲性検出 方法を教示しており、その中では透明な密閉容器中で試料を無菌液体増殖培地と 一緒に培養することによって、例えば血液若しくはその他の体液のような臨床試 料中及び非臨床試料中の微生物の存在を検出するための器具が開示されている。 微生物の存在は、容器の内面又は容器を密閉するために使用される密閉手段に貼 付されたセンサーを用いて、試料のｐＨにおける変化又は試料内の二酸化炭素の 産生を検出又は測定することによって決定される。Ｃａｌａｎｄｒａら法では、 非線量計的及び非侵襲性手段を通して、例えば高濃度の赤血球のような妨害材料 の存在下で微生物を検出することができる。 Ｃａｌａｎｄｒａらの検出システムの欠点の１つは、微生物の存在を検出する ための所要時間が試料数又は試料内の微生物数に関連している点である。さらに 、微生物用の増殖培地が液体であるため、通例インキュベーション中には容器を 攪拌しなければならないが、これはインキュベーション装置を作製するときに含 まれる追加の出費となり、同時に又機械的故障の可能 性を増加させる。さらに、そうしたシステムは微生物の存在を決定することはで きるが、計数することはできない。さらにその上、微生物の検出後、その微生物 を同定すること及び／又は様々な抗生物質に対するそれらの感受性を決定するこ とが望ましいのがしばしば実状である。Ｃａｌａｎｄｒａ型システムでは、感受 性又は同定試験を実施する前には微生物を液体培地から取り出すことが必要にな り、そのためには追加の時間が必要とされるが、患者が極めて重篤な場合には、 必ずしもそのための時間の余裕がない。発明の概要 本発明は、臨床試料及び非臨床試料中における微生物の存在を検出するための 器具及び方法に関する。本器具（以後は「センサー・プレート」と呼ぶ）は、液 体サンプルに含まれる微生物コロニーを培養するための環境と、手動若しくは器 具を使用してのどちらかで微生物の検出及び定量を容易にするための手段とを提 供する。センサー・プレートは、固体、半固体又は粉末化ゲル固定化マトリック ス層とセンサー層とを含む。検出された微生物コロニーは分離され、直ちにそれ 以後の試験に利用できる。 より詳細には、センサー・プレートは未知の液体サンプル（微生物が存在する か否かが不明）を受け入れるための領域、液体サンプルをプレートの内面上に固 定化するための機構、サンプル中の微生物の増殖を容易にする成分（例、栄養素 源）、及びサンプル内の微生物コロニーの検出及び計数を許容するためのセンサ ーを提供する。センサー・プレートは、固定化マトリックス層中に吸収されるか 又は固定化マトリックス層と一緒にゲルを形成するサンプルと一緒に、固定化層 （例、ゲル層）及びセンサー層から構成され得る。センサー層は、微生物の存在 を指示するためにセンサー・プレートの少なくとも１つの表面上に配置できる。 固定化層における実際的な微生物コロニーの増殖を示す小さな面積又はゾーンの 変色は、センサー層において発生する。センサー・プレートは、微生物コロニー の存在、位置、及び／又は数を決定するために手動で、又は器具を用いて自動的 に検査される。 本発明のその他の様々な特徴及び長所は、添付の図面及び添付のクレームと結 合することにより下記の詳細な説明から明白になるであろう。図面の簡単な説明 図１は、センサー・プレート器具の図である； 図２は、センサー・プレート器具の断面図である； 図３は、センサー・プレート器具の１つの代替実施形態の断面図である； 図４は、センサー・プレート器具のさらにもう１つの代替実施形態の断面図で ある；及び 図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）に対して陽性である３枚のセンサー・プレー トの底面である。好ましい実施形態の詳細な説明 図１は、透明若しくは半透明である少なくとも１つの側面(例、底面)を備えて いるフラットな浅い容器の形であってよいセンサー・プレート１の図である。容 器は開放していて（若しくは単純に基質であってさえ）よいが、好ましくは密閉 された若しくは密閉可能な容器であり、さらにセンサー・プレート層上方に幾ら かのヘッドスペースを備えているのが好ましい。容器にはポート２を備えること ができるが、これはストッパー３、スクリューキャップ、セプタム、又はそれら のいずれかの組合せ（若しくは何らかの他の密閉器具）を用いて密閉されてよい 。 サンプルがいったん容器内に収集されると、微生物の増殖栄養素源に依存して、 センサー・プレートはガス透過性又はガス不透過性容器のどちらかとして構成す ることができる。この構成は、種々のプレート合成材料、積層物（ガス不透過性 及び／又は疎水性ガス透過性膜）、及び／又は構成可能な通気口（例、容器壁の 開口部に付けられたガス透過性膜）を使用することによって成し遂げられる。 センサー・プレート器具の容器内には、微生物のコロニーを検出する能力を高 めるように配置された、微生物のコロニーが増殖できるようにサンプルを固定化 ／吸収するために役立つ１つ以上の層がある。ある実施形態では、器具内の少な くとも１つの層は微生物の視認に不都合な影響を及ぼすマトリックスを有する。 図２から明らかなように、固定化層（固定化マトリックス層）１０とセンサー層 １２とが備えられる。後により十分に説明するこれらの２つの層は、単一層内に 一緒に結合することもできるが、２つの層が別個に備えられることが好ましい。 同様に図２から明らかなようにプレート底部１４があるが、これは、好ましくは 微生物増殖に起因するセンサー層における変化を観察／画像描出するために透明 である。 センサー層１２は、紫外線、可視光線、及び／又は赤外線スペクトルにおいて 厳密に局在化された劇的変化を提供することにより微生物増殖の位置を示す目的 で備えられる。この局在化された変化は、微生物増殖近位のセンサー表面とは反 対側のプレートの底面上で検出できる。センサー層は検出可能な特性が変化する 物質（例、指示薬）を含むが、この物質は、好ましくは不透明なマトリックス（ 支持材料）上及び／又は内に包埋される。「不透明」という用語は、センサー層 （例、半不透明、実質的に不透明、又は完全に不透明）の反対側から固定化層に 固定化された試験サンプル及び／又は実際的微生物コロニーを観察又は検出（い ずれかの適切な電磁領域において）することをセンサー層が十分に遮断すること を意味している。試験サンプルも又実質的に透明である（その場合にはセンサー 層は微生物コロニーの存在下では透明から不透明へと局在変化をなす）場合には 透明若しくは比較的に透明なセンサー層を有していることが可能ではあるが、セ ンサー層が透明ではないことが好ましい。センサー層が不透明であれば、検出を 妨害する可能性がある試験サンプル中における微生物を検出する時に改善された 結果が得られる。試験サンプル自体が固定化層において微生物 の存在又は増殖を直接に観察／検出（例、目又は器具を用いて）することを妨害 する場合は、固定化層又はセンサー層の少なくとも１つ（好ましくはセンサー層 ）が実際的試験サンプル及び／又は実際的微生物の検出／視認を遮断できること 、そしてその代わりに固定化層における微生物の存在／増殖に対応するセンサー 層における変化を検出することが好ましい。固定化層も又不透明であってよく、 さらに本発明を実施した１つの実施形態では、センサー層、固定化層、及びサン プルの全てが不透明である。 センサーは、その上若しくは中に固定化された指示薬培地とともに、固体組成 物若しくは膜を含む。センサー層は、外側からセンサー層を視認できるように、 好ましくは容器の内側面と同じ高さに、又は容器を密閉するために使用される密 閉手段内に配置されるか、又は密閉手段に付着させられる。センサー層は、細胞 、タンパク質、その他の固体又はその他の不透明若しくは着色コンポーネントが それと容器面との間に入るのを防止するために容器に貼付されるのが好ましい。 ある実施形態では、センサー層は膜又は他の固体層によってサンプル及びその増 殖培地から分離される。 本発明の１つの実施形態は、透明であっても、又は透明部分を有していてもよ い、例えば蓋若しくはキャップのような密閉手段を含む。センサーは、透明な蓋 若しくは蓋の部分の近位へ配置することができる、又は蓋の一部として作ること ができる。容器を密閉するためにその蓋が使用される場合は、指示薬における変 化は透明な密閉手段を通して読み取られる。密開手段はさらに、被包化指示薬ミ セルを含む例えばポリマーのような材料から作られてもよい。その材料が微生物 の代謝によって惹起される変化に対して透過性であり、指示薬における変化が密 閉手段の表面上で視認できる限りは、容器又は密閉手段いずれかにおける透明部 分は必要とされない。 全サンプル量につき１種しか微生物を含有していない例えば血液のような体液 のサンプル中の微生物は、本発明を使用して検出することができる。そうしたサ ンプルは、微生物集団が臨界的レベルに到達する前、そして微生物代謝に関わる パラメーターにおける変化を測定できるようになるまでに多数の日数又は多数回 のインキュベーションを必要とすることがある。 そこで本センサーは、１）微生物代謝に起因するセンサー層における変化（例 、代謝に起因するガス成分の増加若しくは減 少）がサンプル上方の大気中におけるよりむしろ固体若しくは半固体固定化層か ら検出される、２）センサーがプレートの内面又は閉鎖若しくは密閉手段に貼付 されている又は閉鎖若しくは密閉手段の外側を通して付着させられているので、 プレート又は密閉手段の透明な壁の外側からプレートの完全性を侵害せずに測定 を行うことができる、３）目視検査によって、又は拡散反射率、蛍光その他によ り、若しくは画像捕獲によって測定する器械を用いて外部測定を行うことができ る、４）サンプル中の不透明／着色された若しくは蛍光性の成分は、変化を検出 する能力又はそれらの変化の測定を妨害しない、及び５）変化を容易に観察又は 検出できるようにセンサーの小さな容積内（例、ポリマー乳濁液内又は膜上）に 高濃度の指示薬分子を保持できると言う点において有用である。 複合微生物培地を作り上げる栄養成分は、微生物が使用する代謝経路に影響を 及ぼす。利用可能な栄養素源に依存して、有機酸、塩基及び様々なガスが比例し て産生される。これらの生成物は又、微生物の種毎に相違する。固定化層におけ るこれらの生成物の存在は固定化層のｐＨを変化させることがある。本発明に使 用されるセンサー層は、ｐＨ変化に反応して測定可能 な変化を生じるｐＨ感受性指示薬を含むことができる。又は、指示薬のｐＨに影 響を及ぼす例えばＣＯ₂のようなガスの存在を測定できる。微生物増殖はさらに 又、Ｏ₂及び／又は蛍光における変化の測定によっても検出できる。センサー層 は、微生物の代謝に起因するＯ₂濃度における減少に反応するようにデザインす ることができる。さらに指示薬は、色又はその他のパラメーターよりむしろ蛍光 が変化するように選択できる。二酸化炭素はほとんどの微生物が産生する一般的 代謝産物であるので、微生物増殖を検出するための好ましい代謝産物である。ど のような機構を利用したとしても、好ましい実施形態では、センサー層はほとん どの微生物の存在／増殖に反応して検出可能な変化を生じるであろう。 指示薬は、支持培地へ共有的又は非共有的のどちらかで付着させることができ る。或いは又、指示薬は硬化前にポリマーマトリックス内で乳化されるように、 ポリマーマトリックス内で被包化することができる。 センサー層は、必要であれば好ましくは適切な接着剤を用いて適切な透明容器 の内側又は透明密閉手段に貼付される。それらはさらに密閉手段の統合部分を含 んでいても、又はその場所 で硬化するポリマーマトリックス内で乳化される指示薬として密閉手段若しくは 容器内に貼付されてもよい。それらはさらに又、センサーに影響を及ぼすような 微生物に起因する代謝性変化を許容する方法が提供される限り、容器の外側に置 くこともできる。 ｐＨ、Ｈ₂、Ｈ₂Ｓ、ＮＨ₃、Ｏ₂若しくはＣＯ₂センサーにおける活性分子種と して、様々な種類の蛍光及び可視ｐＨ指示薬を使用できる。一般に、指示薬の選 択に関する唯一の制限は、それらが赤外線、蛍光、拡散反射率及び／又はイメー ジングテクノロジーによって検出可能な容認できるダイナミックレンジ及び波長 変化を有していることが必要であるということである。 本発明による培地中のｐＨ変化を検出するためのセンサーは、好ましくは約５ ．０〜約８．０のｐＨ範囲に渡る蛍光強度又は可視光における変化を示す。 ＣＯ₂センサーに対する指示薬は、ＣＯ₂濃度における変化を検出するためには 、約ｐＨ１３〜約５、及び最も好ましくは約ｐＨ１３〜約９の間で赤外線強度、 蛍光強度又は可視光線における変化を示さなければならない。 一定のｐＨ指示薬分子だけが支持培地へ共有的又は非共有的 に結合することができ、それらのｐＨ指示特性を保持することができる。キサン テン、フェノールフタレイン及びフェノールスルホンフタレインの群に属する指 示薬は有用である。これらの例には、フルオレセイン、クマリン、フェノールフ タレイン、チモールフタレイン、ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシ レノールブルー、オルトクレゾールフタレイン及びα−ナフトールベンゼインが 含まれる。 支持培地は、例えばセルロース又は一定のシリコン類のような、有機反応によ ってそれにｐＨ指示薬を共有的に付着させることのできる物質であってよい。ｐ Ｈ指示薬の非共有的付着は、例えばナイロン膜のような正若しくは負のゼータ電 位を有するイオン性支持材料を用いて達成できる。使用できるその他のイオン性 支持材料は、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂又はＤＥＡＥセルロ ースのような正若しくは負に荷電したイオン性樹脂類である。指示薬膜が微生物 増殖培地と直接接触しなければならない場合は、タンパク質による支持材料の前 処理が必要になることがある。 ｐＨ指示薬センサーは、微生物増殖培地のｐＨ環境に起因するｐＨ変化を直接 検出する。しかし、これらのセンサーは微生 物代謝に起因するガス（例、二酸化炭素、アンモニア、水素、硫化水素、又は酸 素）に選択的に反応するようにさせることができる。選択的に半透過性合成物若 しくは膜は、センサー層上に例えばシリコーン、ラテックス、テフロン、又はイ オンの通過を防止しながらガスの拡散を選択的に許容する能力を特徴とする様々 なプラスチック類を備えることができる。ポリマーマトリックス内に被包化され た指示薬を含むセンサーについては、マトリックスを形成するポリマーはガスの 通過は許容するがイオンの通過を許容しない半透過性障壁として機能することが できる。 ある実施形態では、ＣＯ₂センサーは複数の成分を含む。第１成分は、６〜１ ０のｐＨ範囲で反応性である可視又は蛍光ｐＨ指示薬である。これらの基準を満 たす指示薬の例は、ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシレノールブル ー、フェノールフタレイン、オルトクレゾールフタレイン、クマリン、及びフル オレセインである。必要な場合の第２成分は、選択されたｐＨ指示薬によってＣ Ｏ₂を検出するための最適のｐＨ環境を維持する酸、塩基又は緩衝液である。第 ３成分は、未硬化ポリマー内で乳化される指示薬溶液の溶滴を作り出すことので き るグリセロール若しくは同等の乳化剤であってよい。第４成分は、例えば酸化チ タン、酸化亜鉛、酸化マグネシウム、酸化鉄その他のような顔料であってよい。 第５成分は、指示薬にとって適正な環境を維持する、例えばシリコーンのような 未硬化ポリマーであってよい。ガスには透過性であるがイオンには透過性ではな い限り、独自の化学的若しくは物理的特性又は硬化するための必要条件のいずれ かから指示薬の化学的活性に過大に影響を及ぼさない、そして滅菌処理を受けた ときにこれらの特性が変化しないあらゆるポリマーを使用することができる。さ らに同様に申し分のないその他のシリコーン系ポリマーは、高温、触媒活性、又 は紫外線加硫によって硬化するポリマーである。乳化剤は様々な成分から調製さ れ、ポリマーは硬化するとｐＨ指示薬の溶滴の周囲に半透過性マトリックスを形 成し、これは固定化層からのＣＯ₂及びその他のガスの選択的拡散を許容し、セ ンサー層における局在性の測定可能な変化を生じさせる。センサー層は、例えば 型に入れて個別に調製し、硬化させ、さらにその後に例えばシリコーン系接着剤 のような適切な接着剤を用いてプレートに付着させることができる。或いは又、 そして好ましくは、センサーは容器の底面上で形成され、その場 所で硬化させられる。硬化後、センサーを備えた容器は、例えばオートクレーブ 又はガンマ線照射によって滅菌処理することができる。便宜的には、固定化及び 追加のオプション層は滅菌処理の前にセンサー・プレート器具内に導入して、こ うして同様にその工程によって滅菌することができる。 他の例では、センサー層は顔料が添加されたシリコーンマトリックス中に乳化 させた指示薬溶液を含む。この指示薬溶液は、０．８Ｍ水酸化カリウム（１０． ０ｍｌ）及びイソプロピルアルコール（１０．０ｍｌ）の溶液内に溶かしたチモ ールブルー指示薬（０．６５ｇ）を含む。この指示薬溶液（５．０ｇ）はその後 、顔料が添加されたシリコーン成分と混合される。顔料が添加されたシリコーン マトリックスは、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４シリコーン（成分Ａ（５０．０ｇ）及び Ｂ（５．０ｇ））及び白色顔料（製品番号６１−１８０００、Ｆｅｒｒｏ Ｃｏ ｒｐ．、ニュージャージー州）(１．０ｇ)を含む。その後にセンサー材料が注ぎ 入れられ、プレート上に薄層状（およそ０．２〜０．５ｍｍ）で広げられる。 別の例では、センサー層は顔料が添加されたシリコーンマトリックスと混合さ れた指示薬溶液とを含む。この指示薬溶 液は、イソプロピルアルコール（５．０ｍｌ）及び０．９Ｍ水酸化カリウム（５ ．０ｍｌ）の溶液内に溶解させたオルト−クレゾールフタレイン指示薬（２．０ ｇ）を含む。この指示薬溶液（２．５ｇ）は、その後後顔料を添加したシリコー ン成分と混合される。顔料が添加されたシリコーンマトリックスは、Ｓｙｌｇａ ｒｄ１８４シリコーン（成分Ａ（２５．０ｇ）及びＢ（２．５ｇ））及び白色顔 料（製品番号６１−１８０００、Ｆｅｒｒｏ Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州 ）(０．５ｇ)を含む。その後センサー材料が注ぎ入れられ、プレート上に薄層状 （およそ０．２〜０．５ｍｍ）で広げられる。この実施例の変形では、上記のオ ルト−クレゾールフタレインセンサー層は顔料が添加されたシリコーンマトリッ クスを含むオーバーコート層で被覆される。 さらに別の例では、センサー層は顔料溶液及びシリコーンマトリックスと混合 された指示薬溶液を含む。この指示薬溶液は、イソプロピルアルコール（１０． ０ｍｌ）及び０．８Ｍ水酸化カリウム（１０．０ｍｌ）の溶液内に溶解させたオ ルト−クレゾールフタレイン指示薬（２．０ｇ）を含む。この顔料溶液は、シリ コーン油（４０．０ｇ）、白色顔料（製品番号６１− １８０００、Ｆｅｒｒｏ Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州）（４．０ｇ）とを 含む。シリコーンマトリックスは、Ｗａｃｋｅｒ Ｅｌａｓｔｏｓｉｌ ＲＴ ６０１シリコーン（成分Ａ（２００．０ｇ）及びＢ（２０．０ｇ））及びトルエ ン（４０．０ｇ）とを含む。この指示薬溶液（２０．０ｇ）はその後顔料溶液（ ４０．０ｇ）及びシリコーンコンポーネントと混合される。センサー材料はその 後、プレート上に薄層状（厚さおよそ０．1〜０．３ｍｍ）で広げられる。 上記のような酸素、二酸化炭素及びｐＨにおける変化に反応性の指示薬に追加 して、アンモニア、酸化還元電位、水素、硫化水素、又はあらゆるその他の微生 物の存在若しくは増殖に起因して変化する物質における変化を検出する指示薬を 利用できる。同様に、センサー層（又は複数のセンサー層）において複数の相違 する指示薬を使用することもできる。 センサー層は、好ましくはサンプルの特性（例、自然蛍光性、不透過性等）が センサーの反応に影響を及ぼすこと若しくは遮蔽することを防止できるように不 透明である。センサー層は、好ましくは微生物の存在下にある不透明な状態から 別の不透明な状態へ変化するが、その変化は画像の捕獲及び処理によって 検出可能な変化である。１つの例として、センサー層は白色顔料が添加されたシ リコーンのオーバーレイを伴う、白色顔料が添加されたシリコーンマトリックス におけるオルト−クレゾールフタレイン指示薬の乳化混合物であってよい。又は 、センサー層は例えばチモールブルー指示薬、キシレノールブルー指示薬、若し くは「汎用」指示薬のような１種以上の指示薬と一緒に乳化された顔料が添加さ れたシリコーンマトリックスであってよい。センサー層内のマトリックスは、適 切なラテックス、ポリウレタン、ナイロン膜（例、荷電ナイロン膜）又はセルロ ース粉末であってよい。センサー層マトリックスはさらに又、例えばＳｙｌｇａ ｒｄ １８４、Ｗａｃｋｅｒ ６０１、又はＷａｃｋｅｒ ９３４のようなシリ コーンマトリックスであってよい。又は、センサー層は、例えば指示薬層と不透 明層のような２つの層から作製されてもよい。 センサー・プレート器具におけるもう１つの主要な層は固定化層１０である。 固定化層の目的は、マトリックス内若しくはマトリックスの表面上のどちらかで サンプル内の微生物を固定化することである。サンプル自体は、液体、半固体又 は半液体（例、ペースト若しくはゲル）のサンプルであってよい。液体 サンプルは、混合されると微生物固定化ゲルマトリックスを形成する乾燥粉末ゲ ル化剤と混合することができる。液体サンプルは、好ましくは既にセンサー・プ レート器具内の層として用意されている乾燥粉末ゲル化剤に添加される。しかし 、液体サンプルは乾燥粉末ゲル化剤と混合して、その後にゲル化が発生する前に 両方を直ちにセンサー・プレート器具内に添加することもできる。同様に、液体 サンプルは、ゲルの表面上で微生物を固定化できるように既にゲル化したマトリ ックス上又は脱水された若しくは部分的に脱水されたゲルマトリックス上に塗布 することもできる。ゲル化剤はさらに、物理的支援を加えるために支持マトリッ クス内に包埋することもできる。例には全体が混合された、若しくはウーブン若 しくはノンウーブンファブリックの形のどちらかで混合されたガラス若しくはセ ルロース合成ポリマー繊維が含まれる。さらに、サンプルを固定化するために、 固定化層がゲル化剤である必要はなく、むしろ例えばスポンジ材料、セルロース 、ガラス繊維、濾紙、その他のような非ゲル吸収性材料を含むことができる。 センサー・プレート器具には、一緒に混合して若しくは個別層のどちらかで１ 種以上のゲル化剤を利用することができる。 およそ２：１の重量比で結合した例えばグアーゴム及びキサンタンゴムの混合物 を使用することができる。その他のゲル化剤は、単独で、又は天然及び合成ヒド ロゲル粉末を含む組合せで使用することができる。１種以上のゲル化剤は、ゴム 、寒天、アガロース、カラゲナン、ベントナイト、アルギン酸塩、コラーゲン、 ゼラチン、溶融ケイ酸塩、水溶性デンプン、ポリアクリレート、セルロース、セ ルロース誘導体、ポリエチレングリコール、酸化ポリエチレン、ポリビニルアル コール、デキストラン、ポリアクリルアミド、多糖又はその他のゲル化剤若しく は増粘剤類から選択したものと一緒に結合できる。 表面コロニー分離／固定化のためには、１種以上の合成又は天然親水性ポリマ ーを含む脱水された及び／又は部分的に脱水されたゲルマトリックスが使用でき る。２種以上のゲル化剤を使用する場合は、そうしたゲル化剤は一緒に混合され ても複数の層で備えられもよい。ある実施形態では、上層は表面上に微生物を捕 らえるために備え、下層は上層を通して液体サンプルを引き出すためのウィッキ ング剤として備えることができる（例、修飾セルロース吸収剤上方の薄層寒天層 、又は吸収性パッド、ポリマー若しくはヒドロゲル上方の多孔質親水性膜）。 固定化層はセンサー層に不都合な影響を及ぼしてはならない。センサー層がｐ Ｈ変化に起因して検出可能に変化する場合、極めて酸性のゲル層はセンサー層に 不都合な影響を及ぼす可能性がある（同様に一部の製造工程は酸性であり、セン サー層に不都合な影響を及ぼす可能性のある酸性残留物を残すことがある）。さ らにその上、固定化層が粉末化ゲル層である場合は、微生物が不在である場合に さえセンサー層の変化が引き起こされる可能性があるので、この層を血液サンプ ルと混合したときに確実に酸性に転換してはならない。 さらに図２から明らかなように、固定化層の上方（又はその中若しくは下方） にオプションのコンディショニング層を用意することができる。図２では固定化 層とは別個に図示されているが、コンディショニング層に含まれるコンディショ ニング材料は、好ましくは固定化層の中に組み込まれる。コンディショニング成 分は、固定化層の中に備えられる場合と個別層に備えられる場合のどちらにおい ても、微生物を増殖させるための１種以上の培地、溶解剤、溶解酵素、抗生物質 中和剤、界面活性剤又はその他の微生物検出能力を向上させるのに有用な材料を 含むことができる。コンディショニング成分は、さらに又固定 化層の中にでも同一センサー・プレート器具内の個別層のどちらにでも備えるこ とができる。 コンディショニングのための溶解剤は、試験サンプル中の血球を溶解させるた め、より平滑なゲルを許容するため、及び／又はより良好なゲルの再脱水のため に添加することができる。考えられる溶解剤の例には、サポニン、ジギトニン、 トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）^TM、ポリソルビタンモノラウレート及びその他の界面 活性剤類が含まれる。典型的には必ずしもタンパク質分解酵素とは限らない溶解 酵素類は、血液サンプル中の細胞材料を消化するため、より平滑なゲルを作製す るため、及び／又はより良好なゲルの再脱水のために添加されてよい。コンディ ショニングのための溶解酵素類は、１種以上のプロテアーゼ類、例えばＡｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリザエ）その他に由来する 酵素混合物を含むことができる。 抗生物質中和剤は、コンディショニングのため、特に試験サンプル中のより迅 速及び／又はより良好な微生物の回収のために添加されてよい。１種以上のそう した中和剤は樹脂、ゴム、 は特異的に様々な抗生物質を分解するための種々の酵素類（β−ラクタマーゼ） の１つから選択することができる。 さらにコンディショニングのためには培地を添加することができる（固定化層 へ直接又は別個のどちらかで）。培地は、微生物を増殖させるための栄養素源を 供給するために添加される。様々なタイプの微生物に対して多数のタイプの培地 を使用できるが、微生物が好気性微生物である場合は、ある実施例（各々の量の 例は括弧内にｇ／ｌで示されている）のように培地は下記のものを含むことがで きる：トリプトン（１７）、ソイトン（３）、プロテオースペプトン（５）、麦 芽エキス（２．５）、デキストロース（２．５）及びＭＯＰＳ（２３）。微生物 が嫌気性微生物である場合は、培地はさらに好気性微生物のために上記に列挙し た培地の他にヘミン（０．００５）、Ｌ−シスチン（０．２）、Ｎａ−ｍ−二硫 化物（０．２）及びメナジオン（０．０００５）を含むことができる。 大腸菌型に対しては、培地は、１つの例として、ラクトース（５）、胆汁塩類 ＃３（０．８）、Ｋ₂ＨＰＯ₄（７）、ＫＨ₂ＰＯ₄（３）、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（０ ．５）、ＭｇＳＯ₄（０．１）、Ｎａ−ｍ−二硫化物（０．４）及びＳＤＳ（０ ．１）を含むこ とができる。酵母、カビ及びその他の耐酸性微生物に対しては、培地はある実施 例のように、デキストロース（１０）、酵母エキス（１０）、（ＮＨ₄）クエン 酸塩（２）及びｐＨ５．５までの酒石酸を含むことができる。 さらに図２から明らかなように、容器の壁にはその下方が疎水性ガス透過性フ ィルム２２でありその上方がガス不透過性（脱着可能）フィルム２４である開口 部２０を備えることができる。又は、容器の壁にはガス不透過性フィルムとそれ に固着した疎水性ガス透過性フィルムが一緒に前記開口部を被覆している開口部 を備えることができる。微生物が嫌気性である場合、ガス不透過性フィルムはそ の場所に置かれたままにされるであろう。しかし微生物が好気性である場合は、 センサー・プレート器具へ試験サンプルを添加する時点でガス不透過性フィルム が取り除かれるであろう。もちろん、疎水性ガス透過性フィルムが用意される必 要は全くないが、容器内に汚染物質が侵入するのを防止するため、そして潜在的 に感染性の試験サンプルが器具から漏出するのを防止するためには有益である。 図２における領域Ａは、図３及び４においてより詳細に図示されている。図３ から明らかなように、センサー・プレート器 具の別の実施形態では、単一固定化マトリックス層の代わりに、下記のうちの１ つ以上を備えることができる：表面捕獲及び増殖後の回収を許容するために半剛 性面のための分離ゲル層３０、接着剤層３１、吸収性ゲル層３２及び追加の接着 剤層３３。吸収性ゲル層３２は１種以上のコンディショニング成分（ゲル中に） 、微生物増殖のための培地、溶解酵素類、及び抗生物質中和剤を含むことができ る。さらに図３から明らかなように、単一センサー層の代わりに、下記のうちの １つ以上を備えることができる：オーバーコート層３４、接着剤層３５、指示薬 層３６、及びプレート底面３８と接触している追加の接着剤層３７。 図４に図示されているような本発明の追加の実施形態では、下記を含むマトリ ックス層４０が備えられている：ゲル化粉末、及び例えば培地、溶解酵素類及び 抗生物質中和剤のような乾燥コンディショニング成分類。図３におけるように、 単一センサー層の代わりに、下記のうちの１つ以上を備えることができる。接着 剤層４１、オーバーコート層４２、接着剤層４３、指示薬層４４、及びプレート 底面４６と接触している接着剤層４５。 センサー・プレート器具のサイズは必要なサンプルサイズに依存して変化させ ることができる。ある実施例では、センサー・ プレート器具は７４ｍｍ×１１７ｍｍの寸法の固定化層を有している。固定化層 が湿性タイプのゲルを含んでいる場合は、サンプルのサイズを極めて小さく（例 、１ｍｌ以下）するか、又は血液サンプルを用いる場合のようにサンプルサイズ を１５ｍｌまでにすることができる。他方、固定化層が乾燥粉末化ゲルを含んで いる場合は、サンプルサイズは粉末化ゲルの量に依存してより大きくできる（例 、サンプルは３０ｍｌ以上）。 使用時に、液体サンプルはセンサー・プレート器具内に導入される。サンプル は、それがセンサー・プレートの底面に広げられるにつれて（必要な場合は）「 コンディショニング」される。サンプルはゲル内に吸収されるか、固定化マトリ ックス層と一緒にゲルを形成する。その後、センサー・プレートは微生物コロニ ーの増殖を促進するためにインキュベートされる。センサー・プレート器具の底 面に向けて配置されたセンサー層は微生物コロニーの存在を指示するように検出 可能に変化する。最後に、センサー・プレート器具は、微生物コロニーの存在及 び所在位置を決定するために手動で又は自動的に検査される。 センサー・プレート器具が自動的に検査される場合は、３つの主要機能を実行 する器械が備えられる：プレートのインキュ ベーション、画像収集／捕獲、及び画像処理。この器械はプレートをインキュベ ートするために制御された環境を提供するが、これはインキュベーションが周囲 より高温で発生する場合はヒーターを含むことができる（だが全ての状態におい て高温が必要とされるわけではない）。液体サンプルがセンサー・プレート器具 に添加され、その後にセンサー・プレートは器械内に置かれ、引き続いてインキ ュベーション期間中に画像収集／捕獲装置（例、カメラ又はスキャナー）によっ てセンシング／観察される。センサー・プレート器具の底面の画像は所定の定期 的間隔で捕獲でき、引き続いて１種以上の画像処理法及びアルゴリズムを用いて 微生物コロニーがセンサー・プレート上に存在するかどうかを決定するために解 析することができる。 種々のタイプのセンサー・プレート器具に関する数多くの実行可能性試験は、 良好な検出結果を示している：Ｅ．ｃｏｌｉは約９時間で、Ｅ．ｆａｃａｅｌｉ ｓは約１０時間で、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）は約１１時間で 検出された。図５は、隣接固定化マトリックス層における微生物コロニーの近位 にあるセンサー層の領域で検出可能に変化している４枚のセンサー・プレートの 下側を示している。試験で検出さ れたコロニーは引き続いてその後の試験のために直ちに使用可能な微生物希釈液 を産生した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マレツシユ，マーテイン・ジエイ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27712、ダラム、ドレイトン・コート・３ (72)発明者 ハイマン，ジヨーンズ・エム アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27703、ダラム、サウス・イーグル・サー クル・55 (72)発明者 ソープ，サーマン・シイ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27712、ダラム、リツプスコーム・ドライ ブ・6713

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 容器； 微生物の存在又は数について試験するサンプルを固定化するための固定化層； 及び 固定化層と容器の壁の間に配置されたセンサー層であって、当該センサー層の 少なくとも一部分が固定化層の上及び／又は中で固定化された微生物の存在に起 因して検出可能に変化することのできるセンサー層； を含むセンサー器具。 ２． さらに、ａ）固定化層とセンサー層の間、及びｂ）センサー層と容器の壁 との間の少なくとも１つの間に接着剤層を含む請求項１に記載のセンサー器具。 ３． センサー層が不透明である請求項１に記載のセンサー器具。 ４． 前記固定化層がゲル化剤を含む請求項１に記載のセンサー器具。 ５． 前記ゲル化剤が固体ゲル、半固体ゲル、又は粉末化ゲルの少なくとも１つ である請求項４に記載のセンサー器具。 ６． 前記固定化層がさらに微生物の増殖を促進するための増殖成分を含む請求 項１に記載のセンサー器具。 ７． 前記容器が固定化層の上方にヘッドスペースを有する密開容器である請求 項１に記載のセンサー器具。 ８． さらに前記容器の壁にガス透過性膜を含む請求項７に記載のセンサー器具 。 ９． さらに前記ガス透過性膜に隣接して配置された脱着可能なガス不透過性シ ールを含む請求項８に記載のセンサー器具。 １０． 前記容器の前記壁が透明又は半透明である請求項１に記載のセンサー器 具。 １１． 前記センサー層が紫外線、可視光線、及び／又は赤外線スペクトルにお いて局在性変化をなすことができる請求項１に記載のセンサー器具。 １２． 前記局在性変化が前記容器の前記壁を通して検出できる請求項１１に記 載のセンサー器具。 １３． センサー層が酸素、水素、硫化水素、二酸化炭素、アンモニア、有機酸 、二酸化窒素及びｐＨのうちの１つ以上における変化に反応して検出可能に変化 する請求項１に記載のセンサー器具。 １４． 前記検出可能な変化が赤外線、紫外線若しくは可視光線スペクトルにお いて検出可能である請求項１３に記載のセンサー器具。 １５． 前記センサー層が画像描出、蛍光又は反射率テクノロジーによって検出 可能な変化を有する指示薬を含む請求項１３に記載のセンサー器具。 １６． 前記センサー層が約５．０〜１１．０のｐＨ範囲に渡って蛍光強度又は 視認できる色の変化を示す請求項１５に記載のセンサー器具。 １７． 前記固定化層がその中に微生物を含む固定化サンプルを含む請求項１に 記載のセンサー器具。 １８． 前記固定化層が単一のゲル化剤又は複数のゲル化剤を含む請求項１に記 載のセンサー器具。 １９． 前記ゲル化剤がゴム、寒天、アガロース、カラゲナン、ベントナイト、 アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチン、溶融ケイ酸塩、水溶性デンプン、ポリア クリレート、セルロース、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエ チレンオキシド、ポリビニルアルコール、デキストラン、ポリアクリルアミド及 び多糖類から選択された１つ以上の物質を含む請求項 １８に記載のセンサー器具。 ２０． 前記固定化層がその表面上に微生物を捕獲するための上層と当該上層を 通して液体サンプルを引き出すためのウィッキング剤として備えられている下層 とを含む請求項３に記載のセンサー器具。 ２１． 第１ゲル化剤が固定化層の上層に備えられ、さらに第２ゲル化剤が前記 固定化層の下層に備えられる請求項１８に記載のセンサー器具。 ２２． さらに微生物検出能力を向上させるために前記固定化層の近位若しくは その中にコンディショニング成分を含む請求項１に記載のセンサー器具。 ２３． 前記コンディショニング成分が溶解剤、溶解酵素、界面活性剤及び増殖 阻害剤中和用成分のうちの少なくとも１つを含む請求項２２に記載のセンサー器 具。 ２４． 前記センサー層がシリコーンを含む請求項１に記載のセンサー器具。 ２５． センサー層が固定化層における微生物コロニーの存在に対応して検出可 能に局在性変化するように構成される請求項１に記載のセンサー器具。 ２６． センサー層が微生物の存在下で不透明を維持しながら１つの色から第２ の色に変化する不透明な層である請求項２５に記載のセンサー器具。 ２７． 固定化層とセンサー層の少なくとも１つが不透明である請求項２５に記 載のセンサー器具。 ２８． 器具内の少なくとも１つの層が微生物コロニーの視認に不都合な影響を 及ぼすマトリックスを有する請求項２５に記載のセンサー器具。 ２９． 前記少なくとも１つの層が前記センサー層を包含する請求項２８に記載 のセンサー器具。 ３０． センサー層が固定化層と反対側のセンサー層の側からの試験サンプルの 視認を十分に遮断する請求項２５に記載のセンサー器具。 ３１． センサー層が固定化層と反対側のセンサー層の側からの試験サンプルの 目による視認又は検出器による検出を遮断する請求項２５に記載のセンサー器具 。 ３２． 容器； 微生物の存在又は数について試験するサンプルを固定化するための固定化層； 及び 少なくともセンサー層の一部分が、固定化層の上及び／又は中で固定化された 微生物の存在に起因して検出可能に変化することのできるように、固定化層の近 位に配置されたセンサー層； を含むセンサー器具。 ３３． センサー層が固定化層における微生物コロニーの存在に対応して検出可 能に局在性変化するように構成される請求項３２に記載のセンサー器具。 ３４． センサー層が不透明な層である請求項３３に記載のセンサー器具。 ３５． 固定化層とセンサー層の少なくとも１つが不透明である請求項３２に記 載のセンサー器具。 ３６． 器具内の少なくとも１つの層が微生物コロニーの視認に不都合な影響を 及ぼすマトリックスを有する請求項３２に記載のセンサー器具。 ３７． 前記少なくとも１つの層が前記センサー層を包含する請求項３６に記載 のセンサー器具。 ３８． センサー層が固定化層と反対側のセンサー層の側からの試験サンプルの 視認を十分に遮断する請求項３２に記載のセ ンサー器具。 ３９． センサー層が固定化層と反対側のセンサー層の側からの試験サンプルの 目による視認又は検出器による検出を遮断する請求項３２に記載のセンサー器具 。 ４０． さらに、ａ）固定化層とセンサー層の間、及びｂ）センサー層と容器の 壁の間の少なくとも１つの間に接着剤層を含む請求項３２に記載のセンサー器具 。 ４１． センサー層が微生物の存在下で色の強度を変化させる不透明な層である 請求項３２に記載のセンサー器具。 ４２． 前記固定化層がゲル化剤を含む請求項３２に記載のセンサー器具。 ４３． 前記ゲル化剤が固体ゲル、半固体ゲル、又は粉末化ゲルの少なくとも１ つである請求項４２に記載のセンサー器具。 ４４． 前記固定化層がさらに微生物の増殖を促進するための増殖成分を含む請 求項４３に記載のセンサー器具。 ４５． 前記センサー層が紫外線、可視光線、及び／又は赤外線スペクトルにお いて局在性変化をなすことができる請求項３２に記載のセンサー器具。 ４６． 前記局在性変化が前記容器の前記壁を通して検出でき る請求項４５に記載のセンサー器具。 ４７． センサー層が酸素、水素、硫化水素、二酸化炭素、有機酸、二酸化窒素 、アンモニア及びｐＨのうちの１つ以上における変化に反応して検出可能に変化 する請求項３２に記載のセンサー器具。 ４８． 前記検出可能な変化が赤外線、紫外線若しくは可視光線スペクトルにお いて検出可能である請求項４７に記載のセンサー器具。 ４９． 前記センサー層が画像描出、蛍光又は反射率テクノロジーによって検出 可能な変化を有する指示薬を含む請求項４７に記載のセンサー器具。 ５０． センサー層が約５．０〜１１．０のｐＨ範囲に渡って蛍光強度又は視認 できる色の変化を示す請求項４９に記載のセンサー器具。 ５１． さらに微生物検出能力を向上させるために前記固定化層の近位若しくは その中にコンディショニング層を含む請求項４１に記載のセンサー器具。 ５２． 前記コンディショニング層が溶解剤、溶解酵素、界面活性剤及び増殖阻 害剤中和用成分のうちの少なくとも１つを含 む請求項５１に記載のセンサー器具。 ５３． 前記固定化層が溶解剤、溶解酵素、界面活性剤及び増殖阻害剤中和用成 分のうちの少なくとも１つを含む請求項４１に記載のセンサー器具。 ５４． 前記センサー層がフルオレセイン、クマリン、フェノールフタレイン、 チモールフタレイン、ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシレノールブ ルー、オルトクレゾールフタレイン及びα−ナフトールベンゼインから選択され た少なくとも１種の指示薬を含む請求項３２に記載のセンサー器具。 ５５． 前記センサー層が微生物代謝に起因するガス成分の増加又は減少に反応 して変化する請求項３２に記載のセンサー器具。 ５６． 前記センサー層がセンサー層を着色するための少なくとも１種の顔料を 含む請求項３２に記載のセンサー器具。 ５７． 前記顔料が金属酸化物である請求項５６に記載のセンサー器具。 ５８． 前記顔料がチタン、亜鉛、マグネシウム又は鉄の酸化物である請求項５ ７に記載のセンサー器具。 ５９． 前記センサー層がポリマー材料を含む請求項４９に記 載のセンサー器具。 ６０． 前記容器が実質的に扁平な基体、一端で開放している保持器具、断面が 長方形の閉鎖型箱、又はボトルである請求項３２に記載のセンサー器具。 ６１． 前記固定化層が試験サンプルを吸収及び固定化するための吸収性材料を 含む請求項３２に記載のセンサー器具。 ６２． 前記吸収性材料が濾紙、スポンジ、ガラス繊維、及びセルロースから選 択される請求項６１に記載のセンサー器具。 ６３． さらに、前記固定化層の上又は中に溶解剤を含んでおり、前記溶解剤が サポニン、ジギトニン、トゥイーン及びポリソルビタンモノラウレートから選択 される請求項６１に記載のセンサー器具。 ６４． 前記ゲル化剤が固体ゲルであり、前記固体ゲルが脱水されたゲルを含む 請求項４３に記載のセンサー器具。 ６５． 前記ゲル化剤が半固体ゲルであり、前記半固体ゲルが部分的に脱水され た半固体ゲルを含む請求項４３に記載のセンサー器具。 ６６． 前記ゲル化剤が粉末である請求項４３に記載のセンサー器具。 ６７． さらに、微生物増殖阻害剤を中和するための成分を含む請求項３２に記 載のセンサー器具。 ６８． 前記中和成分が樹脂、エコソルブ（ｅｃｏｓｏｒｂ）及び活性炭のうち の少なくとも１つを含む請求項６７に記載のセンサー器具。 ６９． 微生物の検出方法であって、 試験されるサンプルが請求項３２に記載のセンサー器具の固定化層の上又は中 に固定化されるように前記サンプルを前記センサー器具に添加するステップ； 微生物コロニーの増殖を可能にする一定時間に渡りセンサー器具をインキュベ ートするステップ；及び 固定化層の上又は中における微生物コロニーの存在に相関するセンサー器具の センサー層における何らかの局在性変化を測定するステップ； を含む方法。 ７０． サンプルが裸眼による微生物コロニーの視認を妨害するように十分に不 透明である請求項６９に記載の方法。 ７１． サンプルが蛍光性である請求項６９に記載の方法。 ７２． サンプルが電磁領域において特性を有し、さらに前記 局在性変化が前記電磁領域での前記センサー層における変化を検出する検出器に より決定される請求項６９に記載の方法。 ７３． サンプルが蛍光性であり、センサー層が前記固定化層における微生物の 存在若しくは増殖に起因するガス成分における変化に反応して検出可能に変化す る請求項７２に記載の方法。 ７４． サンプルが着色されている及び／又は蛍光性であり、センサー層が蛍光 若しくは可視ｐＨ指示薬を含む請求項６９に記載の方法。 ７５． サンプルが血液サンプルである請求項７４に記載の方法。 ７６． 固定化層が粉末化ゲル層であり、サンプルが、固定化されてセンサー層 に付着するように粉末化ゲル及びゲル類と混合する液体サンプルである請求項６ ９に記載の方法。 ７７． 前記サンプルが食品サンプルである請求項６９に記載の方法。 ７８． 前記サンプルが滅菌体液サンプルである請求項６９に記載の方法。