NO20023790L

NO20023790L - Anordning og fremgangsmåte ved overflatedyrkning av mikroorganismer fra bulkv¶sker

Info

Publication number: NO20023790L
Application number: NO20023790A
Authority: NO
Inventors: Jones M Hyman; Paul M Matsumura; Scott R Jeffrey; Martin J Maresch; Thurman C Thorpe
Original assignee: Bio Merieux Inc
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2002-10-08
Also published as: US6596532B1; JP4763956B2; CA2399150A1; WO2001059060A2; BR0108258A; US20030203477A1; US7183073B2; WO2001059060A3; JP2003524417A; AU2001234859A1; EP1297105A2; NO20023790D0; MXPA02007800A

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN.

Foreliggende søknad er relatert til US patentsøknad 08/989.560 til Jeffrey et al., innlevert 12. desember 1997 og US patentsøknad 09/113.929 til Maresch et al., (nå US patent 5.912.115) hvor innholdet av hver er inkorporert heri per referanse.

Tilstedeværelsen av mikrobiell forurensning i kliniske prø-ver blir konvensjonelt bestemt ved å dyrke prøvene i nærvær av næringsstoffer og påvise mikrobiell aktivitet via endringer i prøven eller atmosfæren over prøven etter en tidsperiode. For eksempel blir i US 4.182.656 til Anneli et al., prøven plassert i en beholder med et dyrkningsmedium omfattende et karbon-13-merket fermenterbart substrat. Etter forsegling av beholderen og å utsette prøven for be-tingelser som er gunstige for biologisk aktivitet, blir forholdet mellom karbon 13 og karbon 12 i den gassholdige atmosfæren over prøven bestemt og sammenlignet med det initiale forhold. I US patent 4.152.213 blir en fremgangsmåte krevd hvorved tilstedeværelsen av oksygenforbrukende bakterier i en prøve blir bestemt i en forseglet beholder ved å påvise en reduksjon i mengden oksygen i atmosfæren over prøven ved å overvåke trykket av gassen i beholderen. US patent 4.073.691 fremskaffer en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen av biologisk aktive materialer, innbefattende bakterier, i en forseglet beholder inneholdende et dyrkningsmedium, ved å måle endringer i karakteren av den gassholdige atmosfæren over prøven etter en tidsperiode .

En fremgangsmåte for ikke-invasiv påvisning er beskrevet av Calandra et al., US patent 5.094.955, hvor en anordning for påvisning av tilstedeværelsen av mikroorganismer i kliniske prøver så som blod eller andre kroppsvæsker samt i ikke-kliniske prøver er beskrevet, ved å dyrke prøven med et sterilt flytende vekstmedium i en gjennomsiktig forseglet beholder. Tilstedeværelsen av mikroorganismer bestemmes ved å påvise eller måle endringer i pH av prøven eller pro-duksjonen av karbondioksid inne i prøven ved å bruke en sensor festet til den indre overflate av beholderen eller til forseglingsinnretningene som benyttes for å forsegle beholderen. I Calandra et al. kan mikroorganismer bli påvist ved tilstedeværelsen av et interfererende materiale så som store konsentrasjoner av røde blodlegemer, via ikke-ra-diometriske og ikke-invasive metoder.

En ulempe ved påvisningssystemet ifølge Calandra et al. er at tiden som er nødvendig for å påvise tilstedeværelsen av mikroorganismer, er relatert til antallet mikroorganismer i prøven. I tillegg er vekstmediet for mikroorganismene en væske slik at beholderen vanligvis må være agitert under inkubasjon. Dette involverer den ytterligere kostnad å lage inkubasjonsutstyret så vel som en økning i sannsynlig-heten for mekanisk svikt. Dessuten muliggjør et slikt system påvisning av tilstedeværelsen av mikroorganismer, men tillater ikke opptelling. Videre er det ofte tilfelle at etter påvisning av mikroorganismer, er det ønskelig å iden-tifisere mikroorganismene og/eller bestemme deres følsomhet overfor forskjellige antibiotika. I et system av Calandra-type vil det være nødvendig å så ut mikroorganismene fra det flytende dyrkningsmedium for å sikre isolering av blan-dede arter før det utføres reaksjons- eller identifika-sjonsforsøk. Dette krever ytterligere tid (tid som ikke alltid er tilgjengelig dersom pasienten er meget syk). I tillegg kunne ikke et Calandra-type-system gi de ytterligere funksjoner å lese/avbilde plater for påvirkningsgrad av antibiotika og/eller mikrobiell identifikasjon.

Det er også kjent fremgangsmåter for å påvise mikroorganismer hvor en prøve blir sådd på en gel(agar)plate. I slike fremgangsmåter blir en prøve tørket eller "utstrøket" over gelplaten og mikroorganismevekst bestemmes ved å observere platen for å se om noen vekst inntreffer hvor prøven ble utstrøket på gelen. Selv om denne type påvisning er gunstig for den overflatekolonier (som umiddelbart kan testes for følsomhet overfor antibiotikum og/eller mikrobiell identifikasjon), er den ugunstig ved at den ikke kan hånd-tere de store prøvevolumer som er nødvendige ved mange pro-sedyrer så som blodkultur.

Enkelte konvensjonelle systemer som letter samtidig mikrobiell dyrkning og isolering fra bulkvæske involverer bruken av dehydrert granulært geldannende medium eller en flytende geldannende komponent som danner en gel etter at mikroorganismene er introdusert. I hvert tilfelle blir mikroorganismene innfanget gjennom mediet, og ikke bare på overflaten. Dette kompliserer innhøstingen av mikroorganismer for videre undersøkelse.

Overflatekulturer av mikroorganismer fra en flytende prøve kan bli foretatt på et standard semifast medium så som agar. Imidlertid er slike medier for stive til å svelle i vesentlig grad, og kan kun absorbere et væskevolum som typisk er mindre enn 5% at startvolumet. Filtreringsmetoder kan fange inn mikroorganismer fra et større væskevolum, men har et antall ulemper som innbefatter øket håndteringstid, høye materialkostnader, risiko for forurensning samt van-skeligheter med prøver som inneholder partikler.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I foreliggende oppfinnelse blir en "masse" væskeprøve, eventuelt inneholdende mikroorganismer, helt eller på annen måte påført overflaten av en gelmatrise. Væsken i prøven absorberes av gelen, likevel blir mikroorganismer holdt tilbake ved overflaten. Etter inkubering er gjensidig isolerte mikroorganismekolonier lett tilgjengelige på overflaten av mediet for innhøsting og videre bestemmelse. Dette gir den fordel at mikroorganismedyrkning og isolering fra en bulkvæske, tidligere foretatt som en totrinnsprosess, kan bli utført i et enkelt trinn, noe som fjerner en eller flere dager fra tiden som er nødvendig for å oppnå et kli-nisk relevant resultat. En annen fordel er at med lokali- sert mikroorganismevekst er de metabolske endringer i kulturmiljøet forårsaket av mikroorganismevekst, også lokaliserte, noe som gjør påvisning av disse endringer, og således mikroorganismene i seg selv lettere og raskere.

Gelmatrisen ifølge foreliggende oppfinnelse består fortrinnsvis av et polymert materiale som, ved sin natur og/eller fremstillingsteknikk gir et enestående sett egenskaper. Gelmatrisen er tilstrekkelig absorpsjonsdyktig til å trekke inn overskytende væske fra prøven, men med tilstrekkelig liten porestørrelse til å filtrere eller fange opp mikroorganismer ved overflaten. Væsken i prøven blir absorbert av gelen med tilstrekkelig hastighet til at, på en tidsskala som typisk strekker seg fra noen minutter til noen timer, formerer mikrober seg i diskrete kolonier heller enn å spre seg over overflaten av mediet.

Selv om bredden av polymere (i den foretrukne utførelses-form) som er passende for foreliggende oppfinnelse og som er anvendelige som utgangsmaterialer, er praktisk talt uendelig, er de fysiske egenskaper som er brukbare for foreliggende oppfinnelse godt definerte. Polymeren må 1) danne en gel eller sterk viskøs oppløsning hvor bulkstrøm av væske er stoppet under forsøksbetingelsene, 2) absorbere væske fra en vandig oppløsning eller suspensjon uten å tape kohesjon, 3) holde tilbake mikroorganismer som skal dyrkes på eller nær overflaten og som er i hovedsak immobilisert og 4) tillate veksten av mikroorganismene av interesse. Gelmatriser ifølge foreliggende oppfinnelse som er laget av en mengde polymere materialer, har blitt vist å inneha alle av disse egenskaper, og vil isolere og gro mikroorganismer fra prøvevolumer som er flere ganger større per enhetsare-ale enn hva som er mulig med agarplater.

Anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en beholder, og inne i beholderen et immobiliserende lag av et sammenbundet nettverk av polymerkjeder hvor interstitielle rom mellom det sammenbundne nettverk av polymerkjeder er av en størrelsesorden som er mindre enn den gjennomsnittlige størrelse av mikroorganismer som skal dyrkes slik at i hovedsak alle (eller alle) av mikroorganismene i en prøve under dyrkning blir immobilisert på overflaten av nevnte immobiliserende lag. Et volum på minst 0,04 ml per kvadratcentimeter av overflateareale av det immobiliserende lag kan bli tilsatt og absorbert av det immobiliserende lag, mens det opprettholder mikroorganismekolonier på overflaten av det immobiliserende lag. Bulkvæskeprøven kan være fullblod (eller en eller annen fraksjon), en annen kroppsvæske, fabrikksvæske, matvareprøve eller liknende.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 er en illustrasjon av en utførelsesform av anordningen for overflatedyrkning av mikroorganismer; Fig. 2 er et tverrsnitt av anordningen ifølge fig. 1; Fig. 3 er et tverrsnitt av en alternativ utførelsesform av overflatedyrkningsanordningen; Fig. 4 er et tverrsnitt av en ytterligere alternativ utfø-relsesform av overflatedyrkningsanordningen; Fig. 5 viser bunnen av tre overflatedyrkningsanordninger som er positive for E. Coli; Fig. 6 viser tilsetningen av en bulkvæskeprøve til anordningen for overflatedyrkning av mikroorganismer; Fig. 7 viser anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse hvor bulkvæskeprøven har blitt absorbert med mikroorganismer som er tilbake på overflaten; og Fig. 8 er et tverrsnitt av en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DEN FORETRUKNE UTFØRELSESFORMEN

Fig. 1 er en illustrasjon av sensorplate 1 som kan være i form av en flat, grunn beholder med minst en side (for eksempel bunnsiden) gjennomsiktig eller gjennomskinnelig. Selv om beholderen kan være åpen (eller til og med enkelt et substrat), er den foretrukket en lukket eller lukkbar beholder, og fortrinnsvis med en mengde av luftrom over

sensorplatelagene. Beholderen kan være utstyrt med en åpning 2, som kan bli lukket med en kork 3, skrulokk, septum, eller en kombinasjon derav (eller enhver annen tetningsan-ordning). Når en prøve er samlet opp i beholderen, kan sensorplaten bli konfigurert som enten en gasspermeabel eller gassimpermeabel beholder, avhengig av vekstvilkårene til mikroorganismen. Denne konfigurasjonen blir oppnådd ved å bruke forskjellige platesammensetningsmaterialer, laminater (gassimpermeable og/eller hydrofobe gasspermeable membraner) og/eller justerbare ventiler (for eksempel en gasspermeabel membran i en åpning av beholderveggen).

Inne i beholderen av sensorplateanordningen finnes ett eller flere lag som hjelper til med å immobilisere/absorbere prøven slik at kolonier av mikroorganismer kan vokse lokalt, noe som øker muligheten til å påvise mikroorganis-mekoloniene. I en utførelsesform har minst et lag i anordningen matriser som på negativ måte påvirker visualise-ring av mikroorganismer. Som man ser fra fig. 2, er det anbrakt et immobiliserende lag 10 (matriselag som fullstendig immobiliserer eller i det minste lokaliserer en for-søksprøve) og et sensorlag 12. Disse to lag, som vil bli beskrevet mer fullstendig nedenfor, kan også bli satt sammen til et enkelt lag, selv om det er foretrukket at de to lagene er plassert separat (under antagelsen av et sensorlag i det hele tatt foreligger). Som også vist i fig. 2 er platebunnen14, fortrinnsvis gjennomsiktig for observa-sjon/avbildning av endringer i sensorlaget grunnet mikroorganismevekst .

Det optiske sensorlag 12 kan bli anbrakt for formålet med å indikere stedet for mikrobiell vekst ved å fremskaffe en svært lokal dramatisk endring i det ultrafiolette, synlige og/eller infrarøde spektrum. Denne lokale endring er påviselig på bunnflaten av platen overfor sensoroverflaten nær den mikrobielle vekst. Sensorlaget omfatter et materiale som undergår en endring i en påviselig egenskap (for eksempel en indikator) som er plassert på og/eller i en matrise (støttemateriale) som fortrinnsvis er gjennomskinnelig. Med "gjennomskinnelig" menes at sensorlaget blokkerer i tilstrekkelig grad observasjonen eller påvisningen (i ethvert relevant elektromagnetisk område) av forsøksprøven og/eller faktiske mikroorganismekolonier som er immobilisert i det immobiliserende lag fra den motsatte side av sensorlaget (for eksempel semigjennomskinnelig, i hovedsak gjennomskinnelig eller fullstendig gjennomskinnelig). Selv om det er mulig å ha et gjennomsiktig eller relativt gjennomsiktig sensorlag dersom forsøksprøven også er i hovedsak gjennomsiktig (i hvilket tilfelle sensorlaget undergår lokale endringer fra gjennomsiktig til gjennomskinnelig ved nærvær av mikroorganismekolonier), er det foretrukket at sensorlaget ikke er gjennomsiktig. Forbedrede resultater blir oppnådd ved å påvise mikroorganismer i forsøksprøven som kunne interferere med påvisningen og opptellingen dersom sensorlaget er gjennomskinnelig. Dersom forsøksprøven i seg selv interfererer med synliggjøring/påvisning (for eksempel med øyet eller med et instrument) av tilstede-værelse eller vekst av mikroorganismer direkte i det immobiliserende lag, da er det foretrukket at minst ett av de immobiliserende lag eller sensorlaget (fortrinnsvis sensorlaget) er i stand til å blokkere påvisning/synliggjøring av den faktiske forsøksprøve og/eller faktiske mikroorganisme, og i stedet påvise endringer i sensorlaget som tilsvarer tilstedeværelse/vekst av mikroorganismer i det immobiliserende lag. Det immobiliserende lag kan også være gjennomskinnelig, og i en utførelsesform ved utførelse av oppfinnelsen er sensorlaget, det immobiliserende lag og prøven alle gjennomskinnelige.

Sensoren omfatter en fast sammensetning eller membran med et indikatormedium immobilisert på eller inne i seg. Sensorlaget er foretrukket plassert flatt mot den innvendige overflate av beholderen, eller i de forseglende innretninger som benyttes for å lukke beholderen, eller festet til de forseglende innretninger slik at sensorlaget er synlig fra utsiden. Den er fortrinnsvis festet til beholderen for å forhindre celler, proteiner eller faste stoffer eller andre gjennomskinnelige eller fargede komponenter fra å komme mellom denne og beholderoverflaten. I enkelte utførelsesformer er sensorlaget adskilt fra prø-ven og dens vekstmedium med en membran eller annet fast lag.

Sensoren er anvendelig ved at: 1) endringer i sensorlaget grunnet den mikrobielle metabolisme (for eksempel økninger eller minskninger i en gasskomponent grunnet metabolisme), blir påvist fra det faste eller semi-faste immobiliserende lag heller enn i atmosfæren over prøven, 2) fordi sensoren er festet til den indre overflate av platen eller lukke-eller forseglingsinnretningene, kan målinger blir foretatt fra utsiden av de lukkende eller forseglende innretninger, målinger kan bli foretatt fra utsiden av den gjennomsiktige vegg av platen eller forseglingsinnretningene uten å måtte bryte integriteten av platen, 3) de utvendige målinger kan bli foretatt ved visuell inspeksjon eller med et instrument som målt ved reflektans, fluorescens etc. eller ved bilde innfangning, 4) gjennomskinnlige/fargede eller fluorescente komponenter i prøven innvirker ikke muligheten for å påvise endringer eller målingen av disse endringer, og 5) en høy konsentrasjon av indikatormolekyler kan bli opprett-holdt inne i et lite volum i sensoren (for eksempel inne i polymeremulsjonen eller på membranen) slik at en endring lett kan bli observert eller påvist.

Næringskomponentene som utgjør et kompleks mikrobielt medium, influerer på de metabolske reaksjonsveier som benyttes av mikroorganismer. Organiske syrer, baser og for skjellige gasser blir dannet avhengig av de tilgjengelige næringsstoffer. Disse produkter varierer også fra art til art av mikroorganismer. Tilstedeværelsen av disse produkter i det immobiliserende lag kan endre dets pH. Sensorlaget benyttet i oppfinnelsen kunne inneholde pH-sensitive indikatorer som gir en målbar endring som svar på en forandring i pH. Alternativt kunne tilstedeværelsen av gasser som påvirker pH av indikatoren, så som C02, bli målt. Mikrobiell vekst kan også bli påvist ved måling av endringer i 02og/eller fluorescens. Sensorlaget kan bli utformet til å reagere på minskninger i 02-konsentrasjon grunnet metabolisme av mikroorganismer. En indikator kunne også bli utvalgt som undergår en forandring i fluorescens i stedet for en endring i farge eller en annen parameter. Karbondioksid er en vanlig metabolitt som dannes av de fleste mikroorganismer, og er derfor den foretrukne metabolitt for påvisning av mikrobiell vekst. Uansett den an-vendte mekanisme vil sensorlaget, i en foretrukket utførel-sesform, undergå en påviselig endring som reaksjon på til-stedeværelse/vekst av de fleste mikroorganismer.

Indikatoren kan bli bundet, enten kovalent eller ikke-kovalent, til et støttemedium. Alternativt kan indikatoren være innkapslet i en polymermatrise så som å være emulgert i en polymermatrise før herding.

En mengde forskjellige fluorescente og synlige indikatorer kan bli brukt som den aktive molekyltype i pH-, H2-, H2S-, NH3-, 02- eller C02-sensorer. Generelt er de eneste be-grensninger på utvelgelsen av indikatorer de krav at de må ha akseptable dynamiske områder og bølgelengdeendringer som er påviselige med infrarød, fluorescens, reflektans og/eller bildegivende teknologi.

Sensorer for påvisning av pH-endringer i kulturmediet i henhold til oppfinnelsen oppviser foretrukket en endring i fluorescensintensitet eller synlig farge over et pH-område på omkring 5,0 tikl omkring 8,0.

Indikatorer for en C02-sensor bør oppvise en endring i in-frarød intensitet, fluorescensintensitet eller synlig farge fortrinnsvis mellom omkring pH 13 og omkring pH 5, og mest foretrukket mellom omkring pH 13 til omkring 9 for å påvise endringer i C02-konsentrasjon.

Kun visse pH-indikatormolekyler kan bli bundet kovalent eller ikke-kovalent til et støttemedium og opprettholde sine pH-indikerende egenskaper. Indikatorer som tilhører xan-ten-, fenolftalein- og fenolsulfonftalein-gruppene er anvendelige. Eksempler på slike innbefatter fluorescein, coumarin, fenolftalein, tymolftalein, bromtymolblått, tymolblått, xylenolblått, orto-kresolftalein og a-naftolben-zein.

Støttemediet kan være en substans så som cellulose eller visse silikoner til hvilke en pH-indikator kan bli kovalent bundet ved å bruke organiske reaksjoner. Ikke-kovalent binding av pH-indikatorer kan bli oppnådd ved å bruke ioniske støttematerialer så som nylonmembraner som har et por sitivt eller negativt zeta-potensiale. Andre ioniske støt-tematerialer som kan bli brukt, er positivt eller negativt ladede ioniske resiner så som dietylaminoetyl (DEAE)-resin eller DEAE-cellulose. Forbehandling av støttematerialet med et protein kan være nødvendig dersom indikatormembranen skal være i direkte kontakt mikrobielt vekstmedium.

PH-indikator-sensorene påviser direkte pH-forandringer grunnet pH-miljøet av det mikrobielle vekstmedium. Imidlertid kan disse sensorer bli laget til selektivt å reagere på gasser (for eksempel karbondioksyd, ammoniakk, hydrogen, hydrogensulfid eller oksygen) grunnet mikrooganisme-metabolisme. En selektivt semipermeabel sammensetning eller membran kunne bli plassert på sensorlaget så som silikon, lateks, teflon eller forskjellige plastmaterialer som er sær-preget ved en kapasitet til selektivt å tillate diffusjon av en gass mens de forhindrer passasje av ioner. For sensorer som omfatter indikator innkapslet i en polymermat rise, virker polymeren som danner matrisen, som den semi-permeable barriere som tillater passasje av gasser, men ikke ioner.

I en utførelsesform omfatter C02-sensoren av et antall komponenter. Den første komponent er en synlig fluorescent pH-indikator som er reaktiv ved pH-området mellom 6 og 10. Eksempler på indikatorer som tilfredsstiller disse krite-rier er bromtymolblått, tymolblått, xylenolblått, fenolftalein, orto-kresolftalein, coumarin og fluorescein. En andre komponent er, om nødvendig, en syre, base eller buf-fer som opprettholder et optimalt pH-miljø for påvisning av C02med den utvalgte pH-indikator. En tredje komponent kan være glyserol eller en tilsvarende emulgator som kan gi små dråper av indikatoroppløsning emulgert med den uherdete polymer. En fjerde komponent kan være et pigment så som ti-tanoksid, zinkoksid, magnesiumoksid, jernoksid etc.. En femte komponent kan være en uherdet polymer så som silikon, som opprettholder et passende miljø for indikatoren. Enhver polymer kan bli brukt som ikke påvirker i for stor grad den kjemiske aktivitet av indikatoren, enten fra sine egne kjemiske eller fysiske egenskaper eller dets krav ved herding, så lenge den er permeabel for gasser, men ikke ioner, og ikke får disse egenskaper endret når den utsettes for sterilisering. Andre silikonpolymere som også er til-fredsstillende, er slike som blir herdet ved høy tempera-tur, ved katalytisk aktivitet eller med ultrafiolett vulka-nisering. En emulsjon fremstilles fra de forskjellige komponenter og polymeren herdes for å danne en semipermeabel matrise omkring de små dråper av pH-indikator, noe som tillater selektiv diffusjon av C02og andre gasser fra det immobiliserende lag, noe som resulterer i lokale målbare endringer i sensorlaget. Sensorlaget kan bli fremstilt separat, så som i en form, herdet, og så festet til platen med et passende klebemiddel så som et silikonklebemiddel. Alternativt, og foretrukket, blir sensoren dannet på bunnen av beholderen og herdet in situ. Etter herding kan beholderen med sensoren bli sterilisert så som ved autoklavering eller gammastråling. Hensiktsmessig kan de immobiliserende og ytterligere eventuelle lag bli innført i sensorplateanordningen før sterilisering og således også bli sterilisert ved denne prosess.

I et ytterligere eksempel omfatter indikatorlaget en indi-katoroppløsning emulgert i en pigmentert silikonmatrise. Indikatoroppløsningen omfatter tymolblåttindikator (0,65 g) oppløst i en oppløsning av 0,8 M kaliumhydroksid (10,0 ml) og isopropylalkohol (10,0 ml). Indikatoroppløsningen (5,0 g) blir så blandet med de pigmenterte silikonkomponenter.

Den pigmenterte silikonmatrise omfatter Sylgard 184 silikon

(komponent A (50,0 g) og B (5,0 g)) og hvitt pigment (del # 61-18000, Ferro Corp., New Jersey) (1,0 g). Sensormateria-let blir så helt og spredd på en plate i et tynt lag (omtrent 0,2 til 0,5 mm).

I et annet eksempel omfatter sensorlaget en indikatoropp-løsning blandet med en pigmentert silikonmatrise. Indika-toroppløsningen omfatter ortokresolftaleinindikator (2,0 g) oppløst i en oppløsning av isopropylalkohol (5,0 ml) og 0,9 M kaliumhydroksid (5,0 ml). Indikatoroppløsningen (2,5 g) blandes så med de pigmenterte silikonkomponenter. Den pigmenterte silikonmatrise omfatter Slygard 184 silikon (komponenter A (25,0 g) og B (2,5 g)) og hvitt pigment (del # 61-18000, Ferro Corp., New Jersey) (0,5 g). Sensormateri-alet blir så helt og spredd på en plate i et tynt lag (omtrent 0,2 til 0,5 mm). I en variant av dette eksempel blir det ovennevnte ortokresolftalein-sensorlag dekket med et overliggende lag omfattende den pigmenterte silikonmatrise.

I enda et annet eksempel omfatter sensorlaget en indikator-oppløsning blandet med en pigmentoppløsning og en silikonmatrise. Indikatoroppløsningen omfatter ortokresolftaleinindikator (2,0 g) oppløst i en oppløsning av isopropylalkohol (10,0 ml) og 0,8 M kaliumhydroksid (10,0 ml). Pigment-oppløsningen omfatter silikonolje (40,0 g), hvitt pigment

(del # 61-18000, Ferro Corp., New Jersey) (4,0 g). Sili-

konmatrisen omfatter Wacker Elastosil RT 601 silikon (komponenter A (200,0 g) og B (20,0 g) og toluen (40,0 g). In-dikatoroppløsningen (20,0 g) blir så blandet med pigment-oppløsningen (40,0 g) og silikonkomponenter. Sensormateri-alet blir så sprayet på en plate i et tynt lag (omtrent 0,1 til 0,3 mm tykt).

I tillegg til indikatorer som er reaksjonsdyktige overfor endringer i oksygen, karbondioksid og pH, som nevnt ovenfor, kan indikatorer også bli benyttet ti å påvise endringer i ammoniakk, oksidasjonreduksjonspotensiale, hydrogen, hydrogensulfid eller enhver annen substans som undergår en endring grunnet tilstedeværelsen eller veksten av mikroorganismer. Dessuten kan et antall forkjellige indikatorer bli benyttet i sensorlaget (eller i et antall av sensorlag).

Sensorlaget er fortrinnsvis gjennomskinnelig for å forhindre at egenskaper hos prøven (for eksempel naturlig fluorescens, gjennomskinnlighet, etc.) påvirker eller maskerer responsen hos sensoren. Sensorlaget forandrer seg fortrinnsvis fra en gjennomskinnelig tilstand til en annen gjennomskinnelig tilstand ved nærvær av mikroorganismer, hvor forandringen er en forandring som er påviselig med bildeinnfangning eller prosessering. Som et eksempel kan sensorlaget være en emulgert blanding av ortokresolftaleinindikator i en hvitt pigmentert silikonmatrise med et over-lag av hvitt pigmentert silikon. Eller så kunne sensorlaget være en pigmentert silikonmatrise emulgert med en eller flere indikatorer så som tymolblåttindikator, en xylen-blått-indikator eller en "universell"indikator. Matrisen i sensorlaget kan være en passende lateks-, polyuretan-, nylonmembran (for eksempel ladet nylonmembran) eller cellu-losepulver. Sensorlagsmatrisen kan også være en silikonmatrise så som Sylgard 184, Wacker 601 eller Wacker 934. Alternativt kunne sensorlaget være dannet av to lag så som et indikatorlag og et gjennomskinnelig lag.

Det andre hovedlaget i sensorplateanordningen er det immobiliserende lag 10. Det immobiliserende lag i foreliggende oppfinnelse kan være plassert alene eller i kombinasjon med andre lag så som sensorlaget beskrevet ovenfor. Formålet med det immobiliserende lag er å immobilisere mikroorganismer i prøven på overflaten av en matrise. Prøven i seg selv kan være en væske eller en suspensjon. Prøven kan bli påført på en allerede gelformet matrise eller på en dehydrert eller en delvis dehydrert gelmatrise for å immobilisere mikroorganismene på overflaten av gelen. Et geldannende middel kan også være inkludert i en støttematrise for å tilføre fysisk støtte. Eksempler innbefatter glass, cellulose eller syntetiske polymerfibre enten blandet gjennom det hele eller i form av vevde eller ikke-vevde tøystoffer.

Mer enn et geldannende middel kan bli benyttet i sensorplateanordningen enten blandet sammen eller som separate lag. For eksempel kan en blanding av guargummi og xantangummi, kombinert per vekt ved et omtrentlig forhold på 2:1, bli brukt. Andre geldannende midler kan bli brukt alene eller i kombinasjon, innbefattende naturlige og syntetiske hydro-genpulvere. Et eller flere geldannende midler kan bli slått sammen valgt fra gummier, agarstoffer, agaroser, ca-rageenaner, bentonitt, alginater, kollagener, gelatiner, fuserte silikater, vannoppløselige stivelser, polyakryla-ter, celluloser, cellulosederivater, polyetylenglykoler, polyetylenoksider, polyvinylalkoholer, dekstraner, po-lyakrylamider, polysakkarider eller ethvert annet geldannende eller viskositetsøkende middel.

Dehydrerte og/eller delvis dehydrerte gelmatriser kan bli brukt for overflatekoloniisolering/immobilisering innbefattende en eller flere naturlig hydrofile polymere. Dersom mer enn et geldannende middel blir brukt, kunne slike være blandet sammen eller plassert som et antall lag. I et eksempel kan et øvre lag være plassert i hovedsak for å fange inn mikroorganismer på overflaten, og et nedre lag kunne være plassert som et forsterket absorpsjonsmiddel for å trekke den flytende prøve gjennom det øvre lag (for eksempel et tynt agarlag over en modifisert cellulose, syntetisk polymer eller hydrogel).

Dersom et sensorlag blir benyttet, må immobiliseringslaget ikke på uheldig måte påvirke sensorlaget. Dersom sensorlaget undergår en påviselig endring grunnet en forandring i pH, så kunnet et meget surt gellag påvirke på uheldig måte sensorlaget (i tillegg er enkelte fremstillingsprosesser sure og kunne etterlate et surt residuum som kunne påvirke sensorlaget negativt). Dessuten bør det være sikkert at dette laget ikke blir surt mår det blandes med prøve etter som dette også kunne gjøre at sensorlaget endret seg selv ved fravær av mikroorganismer.

Slik som videre kan bli observert i Fig. 2, kan er eventuelt kondisjonerende lag 16 bli plassert på (eller inne i eller under) det immobiliserende lag. Selv om det er illustrert separat fra det immobiliserende lag i Fig. 2, er de kondisjonerende materialer fra det kondisjonerende lag fortrinnsvis inkorporert i det immobiliserende lag i seg selv. Kondisjonerende komponenter, uansett om de er plassert inne i det immobiliserende lag eller i et separat lag, kan innbefatte et eller flere av medier for vekst av mikroorganismer, lytiske midler, lytiske enzymer, antibiotiske nøytraliserende midler, overflateaktive midler eller andre materialer som hjelper til med å forbedre mikroorganismepå-visning og/eller antallsbestemmende egenskaper. Kondisjonerende komponenter kan også bli plassert både inne i det immobiliserende lag og i et separat lag i samme sensorpla-teanordning.

Lytiske midler for kondisjonering kan bli tisatt for å ly-sere blodceller i forsøksprøven, for å danne en glattere gel og/eller for bedre rehydrering av gelen. Eksempler på mulige lytiske midler innbefatter saponin, digitonin, Tween™-materialer, polysorbitan-monolaurat og andre overflateaktive stoffer. Lytiske enzymer, typisk, men ikke nødvendigvis proteolytiske enzymer, kan bli tilsatt for å spalte cellulært materiale i en blodprøve, for å danne en glattere gel og/eller for bedre rehydrering av gelen. De lytiske enzymer for kondisjonering kan innbefatte en eller flere proteaser, for eksempel en enzymblanding avledet fra Aspergillus oryzae eller liknende.

Antibiotiske nøytralisatorer kan bli tilsatt for kondisjonering, spesielt for raskere og/eller bedre gjenvinning av mikroorganismer fra forsøksprøven. En eller flere av slike nøytralisatorer kan bli valgt fra resiner, gummier og kar-bonbaserte materialer (for eksempel aktivt trekull eller Ecosorb™) eller et av et antall enzymer til spesifikt å bryte ned forskjellige antibiotika (for eksempel beta lak-tamase).

Medier kan også bli tilsatt for kondisjonering (enten direkte til det immobiliserende lag eller separat). Medier tilsettes for å gi næringsstoffer for vekst av mikroorganismer. Selv om mange typer medier til forskjellige typer mikroorganismer kan bli brukt, kan mediet, dersom mikroorganismen er en aerob organisme, innbefatte, som et eksempel (en eksempelvis mengde av hver er opplistet i parentes i g/l): trypton (17), soyton (3), proteosepepton (5), malt-ekstrakt (2,5), dekstrose (2,5) og MOPS (23). Dersom mikroorganismen er en anaerob organisme, likeledes Hemin (0,005), L-cystin (0,2), Na-m-bisulfid (0,2) og Menadion (0,0005) .

For koliformer kan mediet innbefatte, som et eksempel, lak-tose (5), gallesalter #3 (0,8), K2HP04(7), KH2P04 (3), (NH4)2S04(0,5), MgS04(0,1), Na-m-bisulfid (0,4) og SDS (0,1). For gjær, mugg og andre syretolerante mikroorganismer kan mediet innbefatte, som et eksempel, dekstrose (10), gjærekstrakt (10), (NH4)citrat (2)og vinsyre til en pH på 5,5.

Som videre kan bli observert i Fig. 2, kan en vegg av beholderen bli utstyrt med åpninger 20 under hvilke det er en hydrofob gasspermeabel film 22 og over hvilke det er en gassimpermeabel (fjernbar) film 24. Alternativt kan beholderen bli utstyrt med en åpning i en vegg derav med en gassimpermeabel film og den hydrofobe gasspermeable film festet sammen og som dekker åpningen. Dersom organismen er anaerob vil den gassimpermeable film forbli på plass. Imidlertid dersom organismen er aerob, vil den gassimpermeable film bli fjernet ved tiden for tilsetning av en for-søksprøve på sensorplateinnretningen. Selvfølgelig behøver den hydrofobe gasspermeable film ikke å være plassert i det hele tatt, selv om den er gunstig for å forhindre foruren-sende stoffer å trenge inn i beholderen, samt for å forhindre potensielt infeksjonsdyktig forsøksmateriale fra å lekke ut fra anordningen.

Areal A i Fig. 2 er illustrert i ytterligere detalj i Fig. 3 og 4. Som kan bli observert fra Fig. 3, kan det, i en ytterligere utførelsesform av sensorplateinnretningen, i stedet for et enkelt immobiliserende matriselag, bli plassert et eller flere av: et isolerende gellag 3 0 for en semi-rigid overflate for å tillate overflateinnfanging og gjenvinning etter vekst, et klebende lag 31, et absorberende gellag 32 og et ytterligere klebende lag 33. Det absorberende gellag 32 kan innbefatte en eller flere kondisjonerende komponenter (i geler), medier for vekst av mikroorganismer, lytiske enzymer og antibiotiske nøytralisato-rer. Som videre kan bli observert i Fig. 3 kan det, i stedet for et enkelt sensorlag, være plassert et eller flere av: et overliggende lag 34, et klebende lag 35, et indikatorlag 36 og et ytterligere klebende lag 37 i kontakt med platebunn 38.

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen, som illustrert i Fig. 4, er det plassert et matriselag 40 som omfatter: et dehydrert geldannende lag pulver og tørre kondisjonerende komponenter så som media, lytiske enzymer og an tibiotiske nøytralisatorer. Som i Fig. 3 kan det, i stedet for et enkelt sensorlag, være plassert et eller flere av: et klebende lag 41, et dekkende lag 42, et klebende lag43, et indikatorlag 44 og et klebende lag 45 i kontakt med platebunn 46.

Størrelsen av sensorplateinnretningen kan bli variert avhengig av den ønskede prøvestørrelse. I et eksempel har sensorplateinnretningen et immobiliserende lag av dimensjoner 74 mm x 117 mm. Dersom det immobiliserende lag omfatter en våttype-gel, da kunne prøvestørrelsen bli gjort meget liten (for eksempel 1 ml eller mindre), eller, så som med en blodprøve, kunne prøvestørrelsen være opp til 15 ml. På den annen side dersom det immobiliserende lag omfatter en dehydrert tørrforpulvret gel, da kunne prøvestørrelsen være enda større, avhengig av typen mengden av forpulvrete gel og prøve (for eksempel kunne prøven være 30 ml eller større).

Ved bruk blir en væskeprøve innført i sensorplateanordningen. Prøven blir "kondisjonert" (om ønsket) etter som den sprer seg over bunnflaten av sensorplaten. Prøven absorberes i et immobiliserende matriselag. Sensorplaten blir så inkubert for å fremme veksten av mikroorganismekolonier. Et sensorlag som ligger mot en bunnflate av sensorplateanordningen, undergår en påviselig forandring for å indikere tilstedeværelsen av mikroorganismekolonier. Ende-lig blir sensorplateinnretningen inspisert manuelt eller automatisk for å bestemme tilstedeværelsen og beliggenheten av mikroorganismekolonier.

Instrumentet utfører tre hovedfunksjoner på sensorplaten: plateinkubering, bildefremskaffelse/innfangning og bildebe-handling. Instrumentet fremskaffer et kontrollert miljø for inkuberingsplater, og som kan innbefatte en varmeinn-retning dersom inkubering skal finne sted ved en øket tem-peratur i forhold til romtemperatur (selv om en øket tempe-ratur ikke er nødvendig i alle situasjoner). En væskeprøve settes til sensorplateinnretningen hvorpå sensorplaten blir plassert i et instrument hvor den etterfølgende blir av-følt/observert av en bildedannende/innfangende innretning (for eksempel et kamera eller en skanner) under inkube-ringsperioden.

Bilder av bunnen av sensorplateinnretningen kan bli tatt ved jevne og på forhånd bestemte intervaller og etterføl-gende analysert ved å bruke en eller flere bildebehandlende teknikker og algoritmer for å bestemme hvorvidt en mikroorganismekoloni er tilstede på sensorplaten. Den bildebehandlende algoritme som benyttes for å påvise og antalls-bestemme mikroorganismer består av en eller flere av de følgende trinn: a) Bildemaskering - å isolere området av interesse fra omliggende bildedata; b) Bildesubtraksjon - å isolere de forandrete områder mellom to bilder tatt ved forskjellige tidsinter-valler; c) Bildeekvalisering - å forsterke størrelsen av end-ringene som opptrer i det subtraherte bildet; d) Bildeuklarhet - å redusere effektene av enkel pik-selstøy i det ekvaliserte bilde; e) Bildekontrast- og klarhetsøkning - å ytterligere forsterke lokale forskjeller i det filtrerte bilde; f) Dannelse av bildeterskel (med flere terskler om nødvendig) - å preparere bildet for den kolonipåvi-sende/opptellende algoritme og/eller g) Kolonipåvisning, opptelling og klassifisering - å bestemme tilstedeværelsen av mikrobielle organismer

på platen, å telle opp antallet av kolonier på pla-

ten og/eller utføre fargeanalyse for å klassifisere kolonier på platen.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det immobiliserende lag utformet for å absorbere store volumer av bulkforsøksprøve som overflatekolonier på eller nær overflaten av det immobiliserende lag. I dette tilfellet er overflatekolonier definert som å være tilgjengelige fra overflaten uten å trenge gjennom mediet, selv om kolonien faktisk kan være delvis inneskuttet i mediet. Umiddelbart etter primær inkubering er isolerte kolonier av mikroorganismer tilgjengelige og lett klare for innhøsting og videre testing. I sin enkleste form omfatter anordningen det immobiliserende lag i en beholder (for eksempel på en plate eller enkelt substrat) og ved fravær av et sensorlag. Det immobiliserende lag omfatter et mikroporøst sterkt svellbart medium som er i stand til å absorbere store volumer av prøvevæske.

Som formulert for foreliggende oppfinnelse, kan hydrofile polymere danne en gel ved interkjedet innfiltring og/eller kryssbinding av polymerkjedene (en polymerkjede, som benyttet heri, betegner en molekylkjede av en polymer). I foreliggende oppfinnelse blir overflateinnfanging av mikroorganismer fra bulkvæske gjort mulig fordi polymerkjedene i gelen er dannet som et kontinuerlig, mikroporøst og sterkt svellbart nettverk. Porene, i hovedsak rommet mellom poly-merkj edene, kan bli gjort så store at mikroorganismene av interesse ikke kan trenge langt inn i gelen, mens mindre partikler eller molekyler så som vann, salter, proteiner og næringsstoffer passerer fritt gjennom dette.

Primærkomponenten av det immobiliserende lag er i denne ut-førelsesform et absorberende kulturmedium omfattende et hydrofilt polymert nettverk, eller et hydrogen, som er i

stand til å svelle i vesentlig grad for å absorbere vandige væsker uten å tape sin semifaste eller sterkt viskøse, mik-roporøse natur. Når en vandig væske blir påført overflaten

av et slikt polymert nettverk, diffunderer væsken inn i nettverket, som ekspanderer som en følge av dette. Vann og molekyler eller partikler som er mindre enn porestørrelsen av det polymere nettverk, vil diffundere fritt gjennom gelen. Partikler så som mikroorganismer, som er større enn porestørrelsen av gelen, blir fanget på eller nær overflaten. Som kan bli observert fra Fig. 6, blir et stort volum væskeprøve 60, som skal undersøkes for mikroorganismer, tilsatt til beholderen 62 (med det mikroporøse sterkt svellbare medium 64 deri). Som kan bli observert fra fig. 7, ekspanderer det mikroporøse medium sterkt grunnet ab-sorpsjonen av bulkvæskeprøven, mens polymernettverket av mediet forblir intakt.

Det immobiliserende lag (gelpolymerlaget) bør ikke hemme veksten av mikroorganismene som skal påvises. Mens et geldannende medium kan hemme veksten av enkelte mikroorganismer, kan det samme medium fremme veksten av andre. Selv om selektiv inhibering av visse mikroorganismer med fordel kan bli brukt, verken fremme eller hemmer, i en foretrukket ut-førelsesform av oppfinnelsen, det geldannende medium veksten av et bredt område av mikroorganismer, men virker i stedet som et inert skaffeli for mikroorganismevekst. Polymerene som benyttes for å danne deg gelformende medium er fortrinnsvis hydrofile. Generelt jo mer hydrofil polymeren er, desto raskere vil den svelle med prøvevæske. Selv om hydrofile og hydrofobe polymere kan bli brukt som del av matrisen for å gi de ønskede egenskaper, bør størstedelen av det geldannende medium være hydrofilt.

Gelen dannet av polymerene må opprettholde kohesjon eller høy viskositet under anvendelsesforholdene. Gelen må opprettholde integritet gjennom hele volumet og gjennom tempe-raturendringene som kreves ved dens bruk. Det er også ønskelig at polymere ikke lett er nedbrytbare av mikroorganismene som blir dyrket. Dessuten må den interkjedete fornet-ting eller innfiltring av de geldannende polymere være høy nok til å opprettholde geldannelse eller høy viskositet, men lav nok til å tillate en høy grad av svelling. Mer spesielt er det, uavhengig av materialet som benyttes (naturlige, syntetiske eller semi-syntetiske polymere eller andre materialer), foretrukket at det foreligger et sammenbundet nettverk av polymerkjeder som er tilstrekkelig fleksible til å absorbere væske uten å ødelegge nettverket. De interstitielle rom mellom de sammenbundne polymerkjeder er av en størrelse som gjennomsnittlig er mindre enn en gjen-nomsnittsstørrelse av mikroorganismen som dyrkes slik at i hovedsak alle mikroorganismene i prøven som undersøkes blir immobilisert på overflaten av polymergelen (det "immobiliserende lag"). Med sammenbundet menes at polymerkjedene er fysisk sammenfiltret og/eller fornettet.

Basert på de fysiske egenskaper finnes det to hovedklasser av geldannende materialer som kan bli brukt som basis for det absorberende kulturmedium ifølge foreliggende oppfinnelse, nemlig rigide geler og myke geler. Hver krever en forskjellig fremstillingsmetode.

Rigide geler er vanligvis homogent kryssbundne og har en gelatinliknende konsistens. Kryssbindingen kan bestå av kovalente, ioniske og hydrogenbindinger, hydrofobe inter-aksjoner eller en blanding av enhver eller alle av disse. Denne type gel er generelt fast og sprø, men kan bli gjort meget fleksibel og svellbar for anvendelse i foreliggende oppfinnelse ved å begrense mengden av kryssbinding. Geler av denne type vil bli støpt i de sluttlig ønskede dimensjoner, derpå dehydrert før bruk. Alternativt kan gelen bli støpt i en dehydrert form slik at den oppnår, etter svelling med den flytende prøve, den ønskede form.

Enkelte naturlige geldannende midler så som agarose og gelatin, vil danne rigide geler som kun har begrenset anvendelse i foreliggende oppfinnelse. Når de en gang er dannet vil disse geler ikke svelle i nevneverdig grad ved tilsetning av en bulkvæskeprøve. Om tørket og etterfølgende rehydrert, vil de ikke vende tilbake til sine opprinnelige dimensjoner. Dette skjer på grunn av det ukontrollerte antall assosiative kryssbindinger (hydrogen eller ioniske bindinger) som holder gelen sammen og danner tettere og tettere kryssbindinger etter som gelen krymper ved dehydre-ring.

Mer anvendelige geler for et absorberende medium kan bli laget fra polymere som har svakere assosiative bindinger eller hvis assosiative bindinger er svekket ved kjemisk mo-difikasjon, men med det nøye kontrollert antall kryssbindinger. Geler av denne type kan bli fremstilt ved et antall fremgangsmåter. Samtidig friradikalpolymerisering og kryssbinding, for eksempel polyakrylamid-geler liknende dem benyttet i elektroforese, kan bli brukt for å lage geler som er egnet for foreliggende oppfinnelse. Alternativt kan polymere bli kjemisk kryssbundet etter polymerisering. Eksempler på slike geler innbefatter dekstran kryssbundet med butandioldiglycidyleter (BDE), CMC kryssbundet med polyva-lente kationer, gelatin kryssbundet med glutaraldehyd (GA) og polyvinylalkohol kryssbundet med GA.

Et effektivt alternativ til kjemisk kryssbinding er fornet-ting med bestrålning. Polymerkjeder eksponert for høyener-getisk bestråling så som gammastråler eller elektronståler, vil spontant kryssbinde via frie radikaler initiert av be-strålingen. Nesten enhver polymer kan bli kryssbundet med denne fremgangsmåten. Hydrofile polymere så som polyvinyl-pyrrolidon (PVP), PEO og lineær polyakrylamid har blitt vist å være mottakelige for denne prosedyre, men den ekstra fordel i foreliggende oppfinnelse at det oppnås mikrobiell sterilisering.

Den andre type gel (basert på fysiske egenskaper) som kan bli brukt i foreliggende oppfinnelse, er en myk gel. Myke geler har en puddingliknende konsistens som blir funnet i et kontinuum som strekker seg fra viskøse væsker til for-bare faste stoffer, avhengig av sammensetningen av det geldannende medium og dets konsentrasjon. Slike geler har den ønskede egenskap at de kan motstå strømning under lave skjærkrefter, men kan bli formet til enhver form under tilstrekkelig trykk. Egenskapene til en myk gel oppstår i hovedsak via innfiltring av lange, ofte forgrenede, polymer-kj eder.

De fleste av naturlige gummier og mange ikke-kryssbundne, eller minimalt kryssbundne, syntetiske polymere vil danne myke geler. Fremstillingsprosessen for disse geler vil in-volvere enten tørking av en oppløsning eller suspensjon av polymeren for å danne en film, eller ekstrudering, utstan-sing eller valsing av en delvis hydrert polymerpasta til den ønskede form.

Den spesifikke type polymermateriale som kan bli brukt i foreliggende oppfinnelse, og hvorvidt det er en rigid eller myk gel, eller hvorvidt den er en naturlig, syntetisk eller semi-syntetisk, er i stor grad uviktig. Mer relevant de spesifikke fysiske egenskaper av materialet som benyttes i foreliggende oppfinnelse. Polymere som kan være anvendelige i foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til de følgende: polysakkarider så som xantangummi, guargummi, locustbønnegummi, pektin, stivelse, tra-gakantgummi, dekstran, agar, agarose, carrageenan, alginat og andre naturlige gummier, semisyntetiske polymere så som karboksymetylcellulose (CMC) og hydroksyetylcellulose og annen cellulose, stivelse, guar, alginat, kitin og dekstranderivater, syntetiske polymere dannet fra enhver kombinasjon av monomere innbefattende akrylsyre, akrylamid, vinylpyrrolidon, vinylalkohol, hydroksyetylmetakrylat og mange andre akryl-, vinyl- eller styrenbaserte monomere så vel som polyetylenglykol, polyetylenoksyd, polypropylengly-kol, polybutylenglykol og kopolymere eller blandinger av enhver av de ovennevnte.

I den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen er det immobiliserende lag dannet av et sammenbundet nettverk av polymerkjeder som er tilstrekkelig fleksible til å absorbere store volumer av væskeprøve uten å ødelegge det sammenbundne nettverk, og hvor de interstitielle rom mellom de sammenbundne polymerkjeder er av en størrelse som gjennomsnittlig er mindre enn gjennomsnittsstørrelsen av mikroorganismene som skal dyrkes/påvises. Følgelig vil alle eller de fleste av mikroorganismene i prøven bli immobilisert på en toppoverflate av det immobiliserende lag selv om prøve-volumet er stort. Mange mikroorganismer er omtrent 0,1 til 1 mikrometer i diameter. Følgelig er, i en foretrukket ut-førelsesform av oppfinnelsen, de interstitielle rom mellom de sammenbundne polymerkjeder mindre enn 1 mikrometer (for eksempel mellom 0,1 og 1 mikrometer), og mer foretrukket mindre enn 0,5 mikrometer, og enda så små som 0,1 mikrometer eller mindre.

En typisk agarplate benyttet for dyrkning av mikroorganismer, absorberer omtrent 0,02 ml/cm<2>eller mindre av prøve-væsken tilsatt til denne. I foreliggende oppfinnelse kan det sammenbundne nettverk av polymerkjeder absorbere væske-prøve fra 50% til 400% av det initiale volum av polymernettverket. I foreliggende oppfinnelse kan væskevolumer bli absorbert som er større enn 0,04 ml/cm<2>(for eksempel fra 0,04 til 1,0 ml/cm<2>, eller fra to til femti ganger det hos den gjennomsnittlige agarplate). I en foretrukket ut-førelsesf orm kan væskevolumer som er større enn 0,05 ml/cm<2>, eller til og med større enn 0,1ml/cm<2>, så som fra0,1ml/cm<2>til 0,7 ml/cm<2>(fem til tretti ganger det hos standardplaten) bli absorbert. I en ytterligere foretrukket utførelsesform kan væskevolumer som er større enn 0,2 ml/cm<2>, så som fra 0,2 ml/cm<2>til 0,4 ml/cm<2>(10 til 20 ganger det hos en standard agarplate) bli absorbert. Slike væskevolumer kan bli absorbert av nevnte immobiliserende lag innen 20 timer, fortrinnsvis mindre enn 10 timer, eller til og med mindre enn 4 timer (i enkelte utførelsesformer blir bulkvæsken absorbert innen 15 minutter).

Denne egenskap til å absorbere slike store volumer av prø-vevæske mens det fremdeles opprettholdes mikroorganismer på overflaten muliggjør bruk av dyrknings/påvisningsanord-ningen i en mengde områder innbefattende plassering av blod direkte på platen (for eksempel direkte trukket fra en pa-sient) . Lytiske midler og/eller enzymer kan bli dispergert på og/eller i det immobiliserende lag for å bryte åpen celler i blodprøven. I tillegg dersom en prøve (for eksempel en matprøve, industriell væske eller drikkevann) er svært fortynnet, blir mulighetene for at en mikroorganisme er tilstede i prøven som er tilsatt platen, øket etter som prøvevolumet som tilsettes er øket for således å forbedre effektiviteten av testen.

Det immobiliserende lag kan innbefatte (i tillegg til gelmatrisen) dyrkningsmedier, antibiotika, antibiotiske nøytralisatorer, indikatorer, detergenter, lytiske materialer eller en eller flere støttematriser (avhengig av den endelige bruk av anordningen). Støttematerialet kan være et vevet eller ikke-vevet tøymateriale, en filtermembran eller individuelle fibere så lenge det er porøst nok til å passere væske gjennom seg (væskepassasje er nødvendig dersom støttematerialet er plassert på toppen av det immobiliserende/matriselaget) og på hvilket bulkvæskeprøven så vil bli tilsatt. Støttematerialet kan også være plassert mellom det immobiliserende lag og sensorlaget (dersom et er tilstede), eller være dispergert gjennom det immobiliserende lag. Som et eksempel, slik som kan bli observert i Fig. 8, er et øvre støttelag 80 plassert på det immobiliserende lag 82, som er plassert på et andre støttelag 84, som i sin tur er plassert på sensorlag 86, hvor alle ligger inne i beholder 88.

Til i dag har flere forskjellige eksempler blir undersøkt for å vise anvendbarhet. Mengden av metoder viser hvordan dette konsept kan bli skreddersydd for et bredt område an-vendelser .

Eksempel 1

CMC tørket film

En oppløsning av 1,5% (w/v) karboksymetylcellulose (CMC, Aldrich Chemical Company, gjennomsnittlig MW på 700.000) ble autoklavert ved 121°C i 15 minutter i flytende cyklus. Etter avkjøling ble oppløsningen tilsatt i 10 ml porsjoner til 60 mm (52 mm innvendig diameter, 21,2 m<2>) petriskåler og tørket over natten ved 50°C. Temperaturen ble så øket til 80°C i 1 time for å redusere enhver bakteriell tilsetning fra forurensning.

Saueblod ble tilsatt S. Aureus (ATCC #25923) ved en konsentrasjon på omtrent 10 CFU/ml og ble lysert ved tilsetning av saponin tikl en sluttkonsentrasjon på 0,5% (w/v). De tørkede CMC-filmer ble innokulert med 2,5 ml av den ly-ser te blodoppløsning, dekket og inkubert over natten ved 3 5°C.

Etter inkuberingen over natten hadde all væske blitt absorbert inn i gelen og gjensidig isolerte kolonier av S. Aureus ble lett observert på, og innhøstet fra, overflaten av gelen. Det var ingen synlig penetrering av bakterier inn i gelen, og heller ikke fantes det noen kolonier som var fanget inne i massen av gelen. I dette eksempel var væskevolumet som var absorbert per overflateenhet, 0,12 ml/cm<2>.

Eksempel 2

Polyakrylamid

En prepolymeriseringsoppløsning for dannelse av lett initi-erte polyakrylamidgeler ble laget med den følgende sammensetning: Akrylamid/bisakrylamid (10%T, 0,4%C0, TEMED (0,04% v/v), riboflavinfosfat (0,0025%, w/v) og natriumfosfat (10 mm pH 6,5, sluttkonsentrasjon). Oppløsningen bli satt i 20 ml porsjoner til 90 mm (86 mm innvendig diameter) 58,1 cm<2>petriskåler. Petriskålene ble stablet og forseglet i en anaerob dyrkningskrukke med en anaerob atmosfære- generatorpakke. Den anaerobe krukke ble så plassert i mørke i 30 minutter for å gi tid for oksygen til å bli fjernet før polymerisering.

Platene i krukken ble så bestrålt under en 15W fluorescent bordlampe ved en avstand på omtrent 10 cm over natten ved omtrent 23°C. Etter polymerisering ble 5 ml av 10% glyserol tilsatt på toppen av hver gel, gelene ble derpå tørket over natten ved 35°C og bakt i 1 time ved 65°C for å redusere enhver bakteriell forurensning.

Gelene ble delvis rehydrert med 10 ml tryptisk soyamedium (TSB). Etter at TSB var absorbert ble gelene innokulert med ytterligere 5 ml TSB tilsatt E. Coli (ATCC #25922) ved en tetthet på omtrent 10 CFU/ml. De innokulerte geler ble dekket og inkubert over natten ved 35°C.

Etter inkuberingen over natten hadde all væske blitt absorbert inn i gelen og gjensidig isolerte kolonier av E. coli ble lett observert på, og innhøstet fra, overflaten av gelen. I dette eksempel ved væskevolumer absorbert per overflateenhet 0,26 ml/cm<2>.

Eksempel 3

Xantan/Guar-pasta med støttemateriale

En pasta ble fremstilt ved å kombinere10 g pre-hydrert xantangummi og 2,5 g prehydrert guargummi med 50 ml tryptisk soyamedium (TSB). Porsjoner av pastaen ble lagt mellom to lag av vevet nylon støttegitter og presset mellom plastplater inntil 1,5 g pasta dannet sirkler med omtrent 60 mm diameter. En 51 mm diameters stanse ble benyttet for å skjære ut de aktuelle sirkler av pasta lagmateriale, som ble overført til et polykarbonatark og sterilisert ved autoklavering. Etter avkjøling ble pastasirklene overført til 60 mm (52 mm innvendig diameter) petriskåler sammen med 0,5 ml TSB for delvis å hydrere pastaen og hjelpe med plassering av skivene.

Humant blod ble samlet opp med SPS som et antikoagulerings-middel og tilsatt S. Aureus (ATCC #25923) eller E. coli (ATCC #25922) ved en konsentrasjon på omtrent 25 CFU/ml. Det mikroorganismeinneholdende blod ble lysert ved tilsetning av en lik mengde TSB med 2,0% saponin (w/v). Gummi-pastaskivene ble innokulert med 5,0 ml av den lyserte blod-oppløsningen, dekket og inkubert over natten ved 35°C.

Etter inkuberingen over natten hadde all væske blitt absorbert inn i gelen og gjensidig isolerte kolonier av S. Aureus eller E. coli ble lett observert på, og innhøstet fra, overflaten av gelen. Det fantes ingen observerbar inn-trengning av bakterier i gelen, og heller ikke var noen kolonier oppfanget med massen av gelen. I dette eksempel var væskevolumet absorbert per overflateenhet 0,24 ml/cm<2>.

Eksempel 4

Xantan/guar-pasta med trekull

En pasta ble formulert i henhold til Eksempel 3, bortsett fra at 10 g av farmasøytisk gradert forpulvret trekull (et antimikrobielt nøytraliserende middel) ble tilsatt til blandingen. Pastaskiver av denne formulering ble fremstilt og innokulert som i Eksempel 3. Væskeabsorpsjon og orga-nismevekst ble ikke nevneverdig påvirket sammenlignet med Eksempel 3.

Eksempel 5.

Xantan/guar-pasta med membranfilter støttemateriale

Pastaskiver ble fremstilt og innokulert som i eksempel 3, bortsett fra at det øvre ytre støttemateriale var et membranfilter (Gelman Supor-450). Væskeabsorpsjon ble ikke nevneverdig påvirket sammenlignet med eksempel 3, men overflaten av vekstmediet hadde et glattere utseende og de bakterielle kolonier var lettere å gjøre synlige.

Eksempel 6

Xantan/guar-pasta mot agar

En pasta ble formulert som i eksempel 3, bortsett fra at pastaen besto av 20 g prehydrert xantangummi, 5 g prehydrert guargummi og 50 ml tryptisk soyamedium (TSB). Pastaskiver av denne formulering ble fremstilt som i eksempel 3 og innokulert med E. coli (ATCC #25922) ved omtrent 25 CFU/ml i TSB. Et område av innokuleringsvolumer ble under-søkt opp til 10,6 ml. På samme tid ble kommersielt tilgjengelige 90 mm blodagarplater (86 mm innvendig diameter,58,1 cm<2>) på liknende måte innokulert med volumer opp til 2,0 ml. Begge sett av innokulerte plater ble innelukket i en perforert plastpose og inkubert over natten ved 3 5°C. Etter inkuberingen ble platene fjernet og undersøkt for væskeopptak og bakterielle kolonier.

Alle av pastaskivene hadde absorbert alt av inokulerings-væsken, så mye som 10,6 ml, og bakterielle kolonier var synlige på overflaten. På blodagarplatene var det maksi-male absorberte volum 1,0 ml. I dette eksempel hadde pastaskivene absorbert 0,50 ml/cm2, mens agarplatene hadde absorbert mindre enn 0,02 ml/cm<2>.

Den foregående beskrivelse er tilstrekkelig til å gjøre fagpersonen i stand til å utføre oppfinnelsen. Eksemplene heri bør ikke bli betraktet som begrensende for omfanget av kravene på noen måte. Faktisk vil forskjellige modifika-sjoner av oppfinnelsen, i tillegg til dem vist og beskrevet heri, bli tydelige for fagpersonen fra den foregående beskrivelse og faller inn under omfanget av de medfølgende krav.

Claims

1. Anordning for dyrkning av mikroorganismer omfattende en beholder og inne i nevnte beholder et immobiliserende lag dannet av et sammenkoblet nettverk av polymerkjeder, hvor interstitielle rom mellom nevnte sammenkoblede polymerkjeder er av en størrelse som gjennomsnittlig er mindre enn en gjennomsnittsstørrelse på mikroorgansimer som skal dyrkes, slik at i hovedsak alle av mikroorganismene i en prøve under dyrkning blir immobilisert på overflaten av nevnte po-lymerlag.

2. Anordning ifølge krav 1, hvor nevnte interstitielle rom er mindre enn 10 mikrometer.

3. Anordning ifølge krava 2, hvor nevnte interstitielle rom er mindre enn 1,0 mikrometer.

4. Anordning ifølge krav 3, hvor nevnte interstitielle rom er mindre enn 0,1 mikrometer.

5. Anordning ifølge krav 1, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere mer enn 0,4 ml prøve per hver cm <2> av overflateareal av nevnte immobiliserende lag.

6. Anordning ifølge krav 5, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere mer enn 0,05 ml prøve per hver cm <2> av overf lateareal av nevnte immobiliserende lag.

7. Anordning ifølge krav 6, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere mer enn 0,1 ml prøve per hver cm <2> av overf lateareal av nevnte immobiliserende lag.

8. Anordning ifølge krav 1, ytterligere omfatende lytiske midler og/eller enzymer dispergert på og/eller i nevnte immobiliserende lag.

9.A nordning ifølge krav 1, hvor nevnte immobiliserende lag er et fast stoff eller semi-fast lag.

10. Anordning ifølge krav 9, hvor nevnte immobiliserende lag omfatter en hydrofil polymer.

11. Anordning ifølge krav 1, hvor nevnte immobiliserende lag omfatter næringsstoffer for å fremme vekst av mikroorganismer.

12. Anordning ifølge krav 1, hvor nevnte immobiliserende lag ytterligere omfatter minst et av antibiotika, antibiotiske nøytralisatorer, indikatorer, detergenter, selektive midler og dyrkningsmedier.

13. Anordning ifølge krav 1, ytterligere omfattende en støttematrise.

14. Anordning ifølge krav 13, hvor nevnte støttematrise er plassert inne i det immobiliserende lag og/eller som et tilstøtende lag.

15. Anordning ifølge krav 1 ytterligere omfattende et sensorlag plassert mellom nevnte immobiliserende lag og nevnte beholder.

16. Anordning ifølge krav 15, hvor nevnte sensorlag omfatter en indikator som gjør at sensorlaget endrer farge i områder som tilstøter deler av nevnte immobiliserende lag som har mikroorganismer på seg.

17. Anordning ifølge krav 15, hvor nevnte sensorlag er i stand til å undergå en lokal forandring i det ultrafiolette, synlige og/eller infrarøde spektrum.

18. Anordning ifølge krav 17, hvor nevnte lokale forandring er påviselig gjennom en vegg av beholderen.

19. Anordning ifølge krav 1, ytterligere omfattende kondisjonerende midler som ligger i nærheten av eller inne i nevnte immobiliserende lag,

20. Anordning ifølge krav 15, hvor nevnte sensorlag er gj ennomskinnelig.

21. Fremgangsmåte ved påvisning av mikroorganismer omfattende : å fremskaffe en anordning for dyrkning av mikroorganismer omfattende en beholder hvor det inne i nevnte beholder er et immobiliserende lag laget av et sammenkoblet nettverk av polymerkjeder, hvor interstitielle rom mellom nevnte sammenkoblede polymerkjeder er av en størrelse som gjennomsnittlig er mindre enn en gjennomsnittlig størrelse av mikroorganismer som skal dyrkes; tilsette en væskeprøve til nevnte anordning, hvor nevnte prøve potensielt inneholder mikroorganismer og som har et volum på minst 0,04 ml per kvadratcentimeter av overflateareale av nevnte immobiliserende lag; tillate nevnte væskeprøve å bli fullstendig absorbert og immobilisert inne i nevnte immobiliserende lag, mens i hovedsak alle mikroorganismer som er tilstede i nevnte væs-keprøve blir immobilisert på en toppoverflate av nevnte immobiliserende lag; inkubere anordningen med nevnte prøve over en tidsperiode for å tillate vekst av enhver mikroorganisme som er tilstede; og påvise enhver mikroorganisme som er tilstede på nevnte immobiliserende lag.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor, etter påvisningen av nevnte mikroorganismer, minst en mikroorganismekoloni blir fjernet fra nevnte toppoverflate av nevnte immobiliserende lag for ytterligere undersøkelse.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, hvor nevnte ytterligere undersøkelse er antibiotikumfølsomhet og/eller identifika-sjonstesting.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor nevnte prøve er en gj ennomskinnelig væskeprøve.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, hvor nevnte prøve er fullblod eller en del derav.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor nevnte prøve er en kroppsvæske eller rnatvareprøve.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor nevnte væskeprøve er av et volum som er minst 0,05 ml per kvadratcentimeter av overflateareale av nevnte immobiliserende lag.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, hvor nevnte væskeprøve har et volum på minst 0,1 ml per kvadratcentimeter overflateareal av nevnte immobiliserende lag.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor nevnte interstitielle rom av nevnte immobiliserende lag er mindre enn 10 mikrometer.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, hvor nevnte interstitielle rom av nevnte immobiliserende lag er mindre enn 1,0 mikrometer.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, hvor nevnte interstitielle rom av nevnte immobiliserende lag er mindre enn 0,1 mikrometer.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder absorberer nevnte prøve innen en tidsperiode slik at enhver mikroorganisme som er til stede i nevnte prøve blir immobilisert på overflaten av det immobiliserende lag som diskrete kolonier.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder absorberer nevnte væskeprøve innen 20 timer.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder absorberer nevnte væskeprøve innen 10 timer.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder absorberer væskeprøve på fra 50% til 400% av det initiale volum av nettverket.

36. Anordning ifølge krav 1, ytterligere omfattende en membran på nevnte immobiliserende lag for å øke synlighet av mikroorganismer og for å lette innhøsting av mikroorganismer .

37. Anordning ifølge krav 1, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere nevnte prøve innen en tidsperiode som er slik at enhver mikroorganisme som er tilstede i nevnte prøve blir immobilisert på overflaten av det immobiliserende lag i diskrete kolonier.

38. Anordning ifølge krav 33, vor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere nevnte prøve innen 20 timer.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 34 , hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere nevnte prøve innen 4 timer.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 39, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere nevnte prøve innen 15 minutter.

41. Anordning ifølge krav 38, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere nevnte prøve innen 4 timer.

42. Anordning ifølge krav 41, hvor nevnte sammenbundne nettverk av polymerkjeder er i stand til å absorbere nevnte prøve innen 15 minutter.