CN102762711A - 微生物培养片 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种环境微生物的捕获效率优异的微生物培养片以及捕获效率优异的环境微生物的测定方法。微生物培养片其特征在于，含有基片、形成在前述基片上的干燥培养层以及覆盖前述干燥培养层的盖片，并且前述盖片在其内表面上叠层了粘着层和剥离膜。由于通过粘着层捕获环境微生物，因此捕获效率优异。

Description

微生物培养片
技术领域
本发明涉及一种可以通过盖片的粘着层以优异的捕获率捕获固体状态的被检验面上或浮游在空中的微生物的微生物培养片，以及含有前述微生物培养片和干燥培养层的凝胶化溶液的微生物培养试剂盒等。
背景技术
作为确认微生物的存在或测定微生物数量的方法，有琼脂平板混释法，该方法使用预先形成在已灭菌的培养皿上的琼脂培养基。此外，作为出于对食品、医药品的制造设备进行卫生管理等目的，而检测附着在料理器具、容器等表面上的细菌的方法，已知有戳印法。该戳印法是将琼脂培养基等直接附着在试验对象上，检测其表面上存在的细菌的方法，为了在采取细菌后可以直接培养，使用将含有能够增殖细菌的营养液的水溶液以戳印状形成固体的戳印培养基。对于戳印培养基，考虑到要按压在被检测对象上，因此使用在装满琼脂培养基等的培养皿主体上可拆卸地安装了盖子的材料。这些培养皿主体和盖子都由聚丙烯等塑料成型品构成，并且培养皿主体是在方形或圆形的基板上突出形成了圆形凹部的形状，盖子形成为可拆卸地嵌在培养皿主体的凹部外周的形状。然后，向培养皿主体的圆形凹部中填充琼脂培养基等，对其盖上盖子且使内部成为灭菌状态（专利文献1）。
此外，出于对食品、医药品的制造设备进行卫生管理等目的，还有一种微生物检测设备，其中在浓度为2.5%以上的含水琼脂培养基的上面覆盖了盖片，在盖片上形成了粘着层（专利文献2）。将捕获微生物的粘合片等叠层在固体培养基上培养微生物时，鉴于检测的微生物数量会根据固体培养基渗出液量而变化这样的问题，设计了该检测设备。即，通过使用浓度为2.5%以上的含水琼脂培养基，抑制了因固体培养基中所含的渗出液而导致的微生物移动，可以抑制检测的微生物数量的变化。
另一方面，有一种擦拭检查试剂盒，其特征在于，具有收容稀释液的容器主体、塞紧该容器主体开口部并且可装卸式安装的盖子、固定在该盖子上或与盖子一体化的棉棒轴、安装在该棉棒轴的前端并在盖子塞紧的状态下浸渍在稀释液中的棉球，并且上述盖子上可以安装延长棒（专利文献3）。擦拭检查法，即，使用通过灭菌后的磷酸缓冲生理盐水等进行湿润并灭菌的棉棒等，擦拭检测对象器具等的表面，然后将其装入到收纳瓶中，形成试样检测液，并且通过在盖子上安装延长棒，可以很容易地进行擦拭。
此外，还有一种用纤维层擦拭并捕获被检验面的微生物后，在水溶性高分子化合物层上进行培养的检测方法（专利文献4）。该微生物的擦拭检测方法，其特征在于，将擦拭被检测对象表面的纤维层放置在上层具有水溶性高分子化合物层的培养基上或与该培养基粘合在一起，进行培养，从而确认微生物的存在。使由含水基质和水溶性高分子化合物层所形成的微生物培养基中的前述含水基质层与检测对象直接接触而采取菌的方法，是鉴于培养基成分等会附着在检测对象上等问题而进行的方法，即，将纤维层与水溶性高分子化合物层分离，并用前述纤维层擦拭检测对象，然后在水溶性高分子化合物层中培养该纤维层。
此外，虽然各公司销售空中浮游菌用的空气取样器，但在洁净的环境下必须采取延长取样时间的方式，而如果长时间开放培养皿则培养基的水分会减少因而产生裂缝或干燥，有时会对菌的发育产生影响（专利文献5）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008－278772号公报
专利文献2：日本特开2006－230315号公报
专利文献3：日本特开2008－101971号公报
专利文献4：日本特开2001－333796号公报
专利文献5：日本特开2000－304663号公报
发明内容
本发明所解决的技术问题
然而，专利文献1中所记载的使用琼脂培养基作为戳印用培养基的方法，必须使琼脂培养基与被检测部位直接接触，因此存在有被检测部位被培养基成分或水分污染，接触部位成为菌类温床的情况。为了避免这种培养基的残留，需要在捕获菌后进行洗涤，因此操作繁杂。此外，在将琼脂培养基与被检测部位接触而捕获菌的方法中，微生物的捕获率低，附着在被检测部位上的菌的50%都无法捕获到。特别是在以白衣服等布作为被检测部位时，存在有布吸收了培养基成分和水分而导致白衣服受到污染，同时布上所附着的菌的捕获效率也进一步降低的情况。
此外，在专利文献1、专利文献2中，使用琼脂培养基作为培养基成分，但琼脂在100℃左右的加热下溶胶化，在45～50℃附近凝胶化，并且凝胶化物中容易渗出凝固水。因此，在将琼脂培养基用于对具有鞭毛的菌培养等时，存在有菌随着凝固水而游走，难以观察到菌落的情况。此外，琼脂中含有不饱和脂肪酸，因此不适合培养对不饱和脂肪酸的作用敏感的菌。
此外，在琼脂上覆盖盖片的粘着层时，有时会通过附着的异物而容易混入气泡，导致辨识性变差。
进一步，根据专利文献3的擦拭法，将稀释液与棉棒一起放置到容器中，用浸渍了前述稀释液的棉球擦拭检测对象，然后将棉球收回到容器中，然而仅仅一部分含有捕获到的菌的稀释液被分注到培养皿等检测容器中进行培养，因此通常会降低微生物的培养固体数。此外，由于使浸渍了稀释液的棉球与检测对象直接接触，因此有时会污染检测对象。
进一步，专利文献4的测定方法，在擦拭时使用湿润的纤维层这一点上和专利文献3是相同的，由于含水纤维层直接接触，因此有时会污染检测对象，并且和专利文献1所记载的戳印培养基同样，当检测对象为吸水物时，水分被样本对象吸收，有时会进一步降低附着在检测对象上的菌的捕获效率。
另一方面，微生物培养片优选能够简便地采取、处理样本，并且是小型的（compact）。专利文献1记载的戳印用培养基，由于使用含水琼脂培养基，因此需要有一定的厚度。另外，琼脂不是可溶于冷水的粉末或水溶性高分子化合物，难以调制成干燥的培养基。因此，希望开发一种使用干燥培养基的小型（compact）片状物。
此外，虽然专利文献3是使用含有稀释液的含水棉球，专利文献4是使用含有灭菌水等的含水纤维层捕获菌，然后再用其它的培养基培养菌，但在为了对食品、医药品的制造设备进行卫生管理等而捕获菌时，如果可以用盖片的粘着层捕获菌，则可以避免通过含水物捕获菌时所导致的被检验面污染。此外，如果能够使用干燥培养基，并通过在培养时投入凝胶化溶液而调制为含水培养层，则在使用前容易保存，并且可以轻量化。进一步，对于空气中微生物的检测，一直以来是通过琼脂培养基实施沉降菌法或撞击法，然而在要长时间捕获时，由于水分从琼脂中蒸发出来，对菌的生长产生了影响，因此在具有洁净度的室内进行检测时，不得不使用高价的薄膜过滤器等。
本发明鉴于上述问题而进行，其目的是提供一种小型（compact）微生物培养片，容易从被检验面上捕获微生物，具有可以培养捕获到的菌的干燥培养层，能够高精度地检测微生物，并且在检测空气中的微生物时，即使捕获时间长也能够进行培养。
用于解决技术问题的技术手段
本发明对微生物培养片进行了详细的研究，结果发现，如果在盖片的内表面上叠层粘着层和剥离膜，则通过将剥离膜剥离并使粘着层与被检验面接触，能够以高捕获率捕获微生物，并且通过向检测对象微生物用组成的干燥培养层中滴加例如生理盐水或灭菌精制水等凝胶化溶液后覆盖盖片，可以在该培养层上培养检测对象微生物，此外，由于不会因培养基成分而污染检测部位，也不会引入水分，因此可以保持接触部位的洁净性，并且通过凝胶化溶液使盖片的粘着层与培养层接触，可以防止混入气泡，确保显著高于琼脂培养基的辨识性，从而由此完成了本发明。
也就是说，本发明提供一种微生物培养片，包括基片、形成在前述基片上的干燥培养层以及覆盖前述干燥培养层的盖片，并且前述盖片在其内表面上叠层了粘着层和剥离膜。
此外，提供一种微生物培养试剂盒，包括微生物培养片以及干燥培养层的凝胶化溶液，其中所述微生物培养片包括基片、形成在前述基片上的干燥培养层以及覆盖前述干燥培养层的盖片，并且前述盖片在其内表面上叠层了粘着层和剥离膜。
此外，提供一种菌的培养方法，其特征在于，其中所述菌是在前述微生物培养试剂盒的粘着层上所捕获的菌，该方法包括：在前述粘着层上捕获菌的工序；添加前述凝胶化溶液，在干燥培养层上覆盖盖片的粘着层，使干燥培养层凝胶化的工序；以及在凝胶化完成后进行培养。
此外，提供一种菌的培养方法，其特征在于，在检测空气中的微生物时，剥下剥离膜，使盖片的粘着层位于上方并粘附在培养皿的底面上，并将其安置在空气取样器中，进行规定时间的取样后，进行添加前述凝胶化溶液，在干燥培养层上覆盖盖片的粘着层，使干燥培养层凝胶化的工序，以及在凝胶化完成后进行培养。在不使用空气取样器进行沉降菌测定时，也可以使盖片的粘着层位于上方并放置规定时间后进行上述操作。
发明的效果
根据本发明，仅仅使盖片内表面上所形成的粘着层与被检验面接触就可以很容易地定量捕获微生物，使用简便。而且，由于使用基本上没有水分的粘着层，因此不会污染被检验面。
根据本发明，与专利文献3那样进行擦拭并取10mL稀释液中的1ml来测量的检测法相比，可以更准确地测量该部位上的菌。
根据本发明，在向干燥培养层中滴加凝胶化溶液后，由于覆盖捕获了菌的盖片粘着层并且凝胶化溶液润湿扩展到粘着层，因此气泡的混入少，不会因气泡而导致辨识性下降，并且菌和菌以外的尘土或气泡等的区别很明确，辨识性提高，因此可以高精度地检测微生物。
根据本发明，由于可以通过粘着层捕获空气中的微生物，因此可以消除以往因使用琼脂培养基而在沉降菌法和撞击法中成为问题的培养基干燥的缺陷，因而可以优选使用。
根据本发明，当在基片上形成边框层时，即使投入生理盐水等凝胶化溶液，边框层也不会坍塌是稳定的，并且作业的操作性和稳定性优异。
本发明的微生物培养片，可以用透明材料制成基片和盖片，并且可以通过从背面、侧面入射的光测量微生物菌落，可以扩大使用方法的选择范围。
此外，本发明的微生物培养片，由于具有覆盖干燥培养层的盖片，因此可以防止因培养操作中的沉降菌等而导致的污染，同时可以防止投入凝胶化溶液后干燥培养层的水分蒸发。
进一步，根据本发明，其显然是小型的，并且有助于减少使用后的废弃物。
附图说明
[图1]是表示本发明涉及的包括基片、干燥培养层和盖片的微生物培养片的一个例子的平面图（a）、A－A’线截面图（b）和B－B’线截面图（c），并且其表示如下实施方式：盖片（40）在与前述干燥培养层（30）相对的内表面上叠层了粘着层（43），进而前述粘着层（43）被剥离膜（45）覆盖，圆形的培养层形成在基片的大致中央处。
[图2]是表示本发明涉及的包括基片、干燥培养层和盖片的微生物培养片的一个例子的截面图，图2（a）表示基片为多层结构的实施方式，图2（b）表示干燥培养层为多层结构的实施方式的图。
[图3]是表示本发明涉及的包括基片、干燥培养层、边框层和盖片的微生物培养片的一个例子的平面图（a）、A－A’线截面图（b）和B－B’线截面图（c），并且其表示如下实施方式：在方形的基片（10）的大致中央处形成干燥培养层（30），并且盖片（40）在与前述干燥培养层（30）相对的内表面上叠层了粘着层（43），此外前述粘着层（43）被剥离膜（45）覆盖，并且在前述干燥培养层（30）的外周形成了边框层（20），以及设置覆盖它们用的方形的盖片（40）。
[图4]是表示本发明涉及的包括基片、干燥培养层、边框层以及粘着层和、剥离膜和盖片的微生物培养片的一个例子的截面图，图4（a）表示基片为多层结构的实施方式，图4（b）表示干燥培养层为多层结构的实施方式。
[图5]是说明本发明涉及的包括基片、干燥培养层以及叠层了粘着层和剥离膜的盖片的微生物培养片的制造方法的图，并且平面图（a）和截面图（b）、（c）表示如下实施方式：将基片和盖片连接设置，在基片上形成干燥培养层，以及在盖片上叠层粘着层和剥离膜，接着将盖片折弯形成微生物培养片。
[图6]是表示本发明涉及的包括基片、干燥培养层以及叠层了粘着层和剥离膜的盖片的微生物培养片的截面图，且是如下实施方式：形成了干燥培养层的基片，通过双面胶带（50）固定设置在盖片上。
[图7]是表示本发明涉及的包括基片、干燥培养层以及叠层了粘着层和剥离膜的盖片的微生物培养片的截面图，且是如下实施方式：在基片的整面上形成干燥培养层，以及通过双面胶带（50）将盖片固定设置在基片上。
[图8]是本发明涉及的包括基片、干燥培养层和盖片的微生物培养片的外观斜视图。
[图9]是表示实施例1中检测的菌落图。
[图10]是表示比较例2中检测的菌落图。
[图11]是表示实施例4中检测的菌落图。
[图12]是表示比较例3中检测的菌落图。
具体实施方式
本发明第一是一种微生物培养片，包括基片、形成在前述基片上的干燥培养层以及覆盖前述干燥培养层的盖片，并且前述盖片在其内表面上叠层了粘着层和剥离膜。
由于在盖片上叠层了粘着层和剥离膜，因此通过剥离剥离膜并使粘着层与被检验面接触，可以容易地定量捕获微生物，并且由于培养层由干燥培养层形成，因此是小型的并且保存稳定性优异。也可以在基片上形成边框层，并在其内侧形成干燥培养层。在基片上形成边框层，并且由疏水性树脂制成该边框层，则即使投入生理盐水等凝胶化溶液，边框层也不会坍塌，从而可以稳定地进行作业。干燥培养层，可以在前述基片上形成图案，并且通过将盖片的粘着层以及凝胶化溶液和干燥培养层组合起来，可以防止气泡混入进行培养，提高了培养后的辨识性。以下，对本发明进行详细说明。
（1）微生物培养片的结构
本发明的微生物培养片的一例优选方式示于图1（a）、（b）、（c）。图1（a）是平面图，图1（b）是图1（a）的A－A’线截面图，图1（c）是图1（a）的B－B’线截面图。
图1表示如下实施方式：在长方形的基片（10）的大致中央处形成干燥培养层（30），并且设置长方形盖片（40）用以覆盖前述干燥培养层（30）。前述盖片（40）在与前述干燥培养层（30）相对的内表面上叠层了粘着层（43），此外前述粘着层（43）被剥离膜（45）覆盖。另外，如图1（c）所示，前述盖片（40）通过粘着层（43）而固定在基片（10）上。
在本发明中，干燥培养层（30）也可以在基片（10）上以图案状形成。如图2（a）的截面图所示，基片（10）可以是由基片（11）和基片（13）这两层所形成的多层片，此外，也可以是叠层了塑料以外的其它层的多层片。并且，如图2（b）所示，干燥培养层（30）也可以以2层以上的多层而构成。另外，通过以图案状形成所调制的干燥培养层（30）的形状，并不限定于图1所示的圆形，也可以是正方形、长方形、以及其他的多边形、无定形。在这一点上，基片（10）的形状也同样如此。
此外，本发明的微生物培养片，如图3所示，也可以在基片（10）上形成边框层（20），并在其内侧形成干燥培养层（30）。通过在干燥培养层（30）的外周形成边框层（20），可以将生理盐水等凝胶化溶液限定在规定的范围内，并且可以防止凝胶化溶液遗漏。因此，在边框层（20）的外侧不需要存在干燥培养层。具有这种边框层（20）的微生物培养片的一例优选方式示于图3（a）、（b）、（c）。图3（a）是平面图，图3（b）是图3（a）的A－A’线截面图，图3（c）是图3（a）的B－B’线截面图。
图3表示如下实施方式：在长方形的基片（10）的大致中央处形成干燥培养层（30），并且在前述干燥培养层（30）的外周形成边框层（20），为了将它们覆盖设置长方形的盖片（40）。前述盖片（40）在与前述干燥培养层（30）相对的内表面上叠层了粘着层（43），此外前述粘着层（43）被剥离膜（45）覆盖。通过在基片（10）上直接形成干燥培养层（30），并且用疏水性树脂调制该边框层（20），从而即使在向干燥培养层（30）中投入凝胶化溶液的情况下，边框层（20）也不会因凝胶化溶液而坍塌。
此外，在通过形成边框层（20）而以边框层（20）包围的干燥培养层（30）上滴加凝胶化溶液，放下盖片（40）并仅仅覆盖盖片（40）的粘着层（43），可以使凝胶化溶液均匀扩散至边框层（20）内的干燥培养层（30）的整个区域中，不使用特别的器具，操作性优异。
本发明中，优选用疏水性树脂在基片（10）上形成边框层。因此，如图4（a）的截面图所示，基片（10）可以由基片（11）和基片（13）的多层片构成，此外，也可以叠层塑料以外的其它层。并且，如前述图4（b）所示，干燥培养层（30）也可以以2层以上的多层而构成。另外，本发明中，包含疏水性树脂的边框层，优选形成在基片（10）的表面上，并且在基片（10）和边框层之间不存在干燥培养层（30）。由此，可以在基片（10）上稳定地形成包含疏水性树脂的边框层，并且可以避免培养基材料的浪费。本发明中，前述干燥培养层（30）的等价圆直径为20～80mm，更优选为30～70mm。滴加在微生物培养片上的凝胶化溶液通常为1ml，通过在上述范围内，可以充分地吸收凝胶化溶液。
此外，边框层（20）的高度通常调制为比干燥培养层的高度高100～1200μm，优选高200～1000μm，更优选高300～800μm。如果为上述范围，则在向干燥培养层（30）中投入凝胶化溶液时，凝胶化溶液不会遗漏或产生空隙，可以快速地扩散至边框层（20），并且不等干燥培养层吸收凝胶化溶液就可以立即覆盖盖片（40），从而可以提高作业效率。
此外，边框层的宽度并不限定于均匀的宽度，但最细部的宽度优选为0.5～5.0mm，更优选为1.0～3.0mm。这是由于在上述范围内与盖片的密合性优异。
另外，本发明中，只要在基片上的干燥培养层的外周具有包含疏水性树脂的边框层即可，其并不限定于单一的边框层，也可以是这样的边框层，即，在在上述边框层的外侧进一步形成有边框层的多重框所形成的边框层。
进一步，如图5（c）所示，盖片（40）可以固定设置在基片（10）上，这时，如图6所示，盖片（40）和基片（10）可以通过双面胶带（50）等进行固定设置。另外，本发明的微生物培养片，可以在基片（10）的整面上形成干燥培养层（30），也可以在干燥培养层中含有无纺布。
（2）基片
本发明中使用的基片，必须具有耐溶剂性、印刷适应性。此外，作为微生物培养片，还要求耐水性，并且要求具有能够耐受形成干燥培养层时的干燥处理的耐热性。基片可以是单层的，也可以是2层以上的叠层片。
当基片为单层时，例如，可以优选使用聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯等塑料片。这些塑料片，由于透明性优异，因此即使通过由基片透过的光，也可以观察微生物菌落，提高了辨识性，并且可以扩大测量方法的选择范围。具体来说，本发明的微生物培养片，是对在干燥培养层上所生长的菌落进行观察并计数的微生物培养片，而如果基片或盖片是透明的，则可以通过从微生物培养片背面所投射的光进行观察，也可以通过从侧面入射的光进行观察。因此，可以从盖片侧，也可以从基片侧进行观察和计数。并且，还可以使用通过发泡而呈白色的材料，或任意着色的材料。根据培养的菌种不同，并不限定为透明的，在通过着色而容易对生长出的菌落进行计数时，可以进行适当选择。
此外，作为叠层片，可以举例叠层了2种以上上述塑料片的叠层片。此外，还可以适当使用在上述塑料片上叠层了纸质基材的叠层片或在纸质基材上涂布合成树脂的叠层片等。作为这种叠层片，例如，可以举例聚乙烯膜和纸质基材的叠层片。
进一步，还可以使用以合成树脂为主原料像纸那样进行成型的合成纸作为基片。作为这种合成纸，可以举例日本YUPO公司制造的商品名“YUPO”或东洋纺织制造的“库里斯帕（クリスパー）”等。
为了提高本发明中所使用的基片与上述干燥培养层的密合性，也可以在形成干燥培养层的一侧预先进行表面处理。作为这种表面处理，有电晕放电处理、臭氧处理、使用氧气或氮气等的低温等离子体处理、辉光放电处理、使用化学试剂等进行处理的氧化处理、及其它预处理等。
此外，还可以在本发明中所使用的基片表面上，预先涂布锚涂剂（anchorcoating agent）进行表面处理。作为这种锚涂剂，可以举例异氰酸酯系（氨基甲酸酯系）、聚乙亚胺系、聚丁二烯系、有机钛系、及其它锚涂剂。更优选为，例如，以通过甲苯二异氰酸酯、二苯基甲烷二异氰酸酯、多亚甲基多亚苯基多异氰酸酯等芳香族多异氰酸酯，或六亚甲基二异氰酸酯、苯二甲基二异氰酸酯等脂肪族多异氰酸酯等多官能异氰酸酯，与聚醚系多元醇、聚酯系多元醇、聚丙烯酸酯多元醇及其它含羟基化合物的反应而得到的聚醚聚氨酯系树脂、聚酯聚氨酯系树脂、聚丙烯酸酯聚氨酯类树脂作为主成分的锚涂剂。
基片优选平坦、没有卷曲等，其厚度没有特别限制，通常为25～1500μm，更优选为50～500μm。
另外，还可以在基片上预先用不溶于水且不会对微生物的生长产生影响的油墨印刷方格印刷图案。这是由于通过进行方格印刷，可以在形成较多菌落时，通过分开测量几处方格内的菌数而求出总体数量。印刷的版式没有特别限定，可以为任意形式，而从着色剂、树脂、溶剂等选择范围广的方面考虑优选凹版印刷。对于方格的大小，1cm见方左右是适当的。
（3）干燥培养层
本发明的微生物培养片，在基片上配设了干燥培养层。在干燥培养层上培养由粘着层所捕获的微生物时，前述干燥培养层必须含有适合微生物发育的水分，一般来说，可以广泛使用能够凝胶化或增粘的现有公知的水溶性高分子化合物等。在本发明中，将这种材料总称为凝胶化剂。此外，在干燥培养层中也可以含有营养成分及其它成分。进一步，干燥培养层还可以是含有无纺布的结构。
（i）凝胶化剂
作为构成本发明干燥培养层的凝胶化剂，可以举例角叉胶、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、藻胶、淀粉及其衍生物、纤维素衍生物（例如羧甲基纤维素、羟烷基纤维素等）等水溶性高分子多糖类、聚乙烯醇（PVA）或改性PVA、不饱和二羧酸共聚的物质、丙烯酸及其衍生物、聚醚（例如聚乙二醇、聚丙二醇等）等水溶性聚合物等。瓜尔胶由于在低浓度下就呈现出极高的粘度，因此少量使用就能够形成适于菌发育的环境，因而特别优选。此外，考虑到粘度、强度以及菌的发育性，还可以将2种以上的凝胶化剂混合使用。
（ii）营养成分
在本发明的干燥培养层中，除了上述凝胶化剂以外，还可以配合营养成分。
作为营养成分，例如，作为一般活菌检查用，可以使用酵母提取物·胨·葡萄糖混合物、肉提取物·胨混合物、胨·大豆胨·葡萄糖混合物等，作为大肠杆菌、大肠菌群检查用，可以使用胨·柠檬酸铁铵·乳糖等，作为葡萄球菌用，可以使用肉提取物·胨·甘露糖醇·蛋黄混合物、胨·肉提取物·酵母提取物·丙酮酸钠等，作为弧菌用，可以使用酵母提取物·胨·蔗糖·硫代硫酸钠·柠檬酸钠等，作为肠球菌用，可以使用牛脑提取物·心脏提取物·胨·葡萄糖等，作为真菌用，可以使用胨·葡萄糖混合物、酵母提取物·葡萄糖混合物、马铃薯提取物·葡萄糖混合物等。根据要发育的微生物，可以从其中选择一种或一种以上的营养成分来混合使用。
（iii）显色指示剂、选择剂、基质、缓冲剂（pH调节剂）等其他成分
在本发明的干燥培养层中，除了上述凝胶化剂以外，还可以配合显色指示剂、选择剂、基质等其它成分，形成干燥培养层。
由于在培养过程中发育的微生物产生代谢，显色指示剂使菌落着色，因此其具有使菌落数的计数变得极其容易的效果。作为这种显色指示剂，具体有氯化三苯基四唑（以下表示为TTC）、对甲苯基四唑红、四唑紫、对甲苯基四唑蓝等四唑鎓盐或者中性红混合物、酚红、溴百里酚蓝、百里酚蓝混合物等pH指示剂。随着微生物的生长而显色或变色，容易观察到微生物的生长，此外通过特定微生物所具有的酶的显色或加入荧光酶基质，可以检测特定的微生物。
进一步，还可以加入抑制检测目的以外的微生物生长的选择剂，作为这种选择剂，可以使用抗生素、合成抗菌剂等抗生剂、色素、表面活性剂、无机盐等。作为抗生素，可以举例甲氧西林、头孢美唑、头孢克肟、头孢他啶、头孢磺啶、杆菌肽、多粘菌素B、利福平、新生霉素、黏菌素、林可霉素、氯霉素、四环素、链霉素等，作为合成抗菌剂，可以举例磺胺剂、萘啶酮酸、喹乙醇等。此外，作为色素，可以举例具有抑菌或杀菌作用的结晶紫、亮绿、孔雀绿、亚甲蓝等。此外，作为表面活性剂，可以举例Tergitol 7、十二烷基硫酸盐、月桂基硫酸盐、聚氧乙烯（20）脱水山梨醇单油酸酯（Tween80）、聚氧乙烯（20）脱水山梨醇单月桂酯（Tween20）等。此外，作为无机盐类，可以举例亚硒酸盐、亚碲酸盐、亚硫酸盐、氮化钠、氯化锂、草酸盐、高浓度的氯化钠等。除此以外，还可以使用牛磺胆酸盐、甘氨酸、胆汁粉、胆汁酸盐、脱氧胆酸盐、高浓度的糖类等。缓冲剂具有当检测液中的pH变大偏离7.0时使其回到7.0的作用。这是由于适宜菌生存的pH在中性的7.0附近。作为缓冲剂，可以举例磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠等的组合。
另外，根据显色指示剂的种类，在灭菌处理时有时会显著着色，因此也可以不包含在干燥培养层中，而是使用在后述的凝胶化溶液中含有显色指示剂的材料，形成显色的培养基。
在本发明的干燥培养层中，至少含有凝胶化剂（i）即可，也可以进一步含有营养成分（ii）或显色指示剂、选择剂、基质等其它成分（iii）。另外，通过显色指示剂、选择剂的组合，有时会因混合而发生反应，而通过将它们包含在不同的层中，可以防止混合反应。此外，通过将显色指示剂形成在最上层，能够提高菌落的辨识性。
（iv）干燥培养层的构成
本发明中所使用的干燥培养层，只要至少含有上述凝胶化剂（i）的材料可以形成在基片上即可，除此以外也可以含有营养成分（ii）、显色指示剂、选择剂、基质等其它成分（iii），并且干燥培养层也可以是2层以上的多层。此外，干燥培养层可以形成在基片的整面上，也可以以图案状形成。进一步，在干燥培养层中还可以含有无纺布等。作为无纺布，优选合成纤维（例如，尼龙、聚酯（特别是进行了亲水化处理的聚酯）、聚丙烯腈、聚烯烃（特别是进行了亲水化处理的聚烯烃）、聚氨酯等）、半合成纤维（例如，人造丝等）、天然纤维（例如，纤维素、棉、绢、羊毛（动物毛）等）、无机纤维（例如，玻璃纤维等）等材料。
在本发明中，其构成不含无纺布的干燥培养层的厚度，在干燥时为50～1000μm，更优选为200～600μm。此外，涂布量，在干燥时为5～400g/m2，更优选为100～300g/m2。通过在上述范围内，可以形成粘度最适于菌发育的干燥培养层。
（4）盖片
在本发明中，其特征在于在盖片的内表面上叠层了粘着层和剥离膜。本发明中所使用的盖片，具有防止培养中沉降菌等所导致的污染，同时还防止投入凝胶化溶液后干燥培养层水分蒸发的作用。进一步，除去叠层的剥离膜，使粘着层与被检验面接触而捕获菌，然后注入凝胶化溶液，使其与干燥培养层接触，从而可以在干燥培养层中培养菌。
因此，盖片优选具有容易和被检验面或干燥培养层接触的柔软性。此外，优选具有防水性、水蒸气不透过性，同时，为了在培养微生物后，可以通过盖片对菌落进行观察和计数，优选为透明的。
例如，可以使用在前述基片中所列举的聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃，聚酯、聚酰胺，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚氯乙烯等塑料片。另外，考虑到盖片开合等操作性，特别优选聚酯膜、聚烯烃膜。此外，在盖片上还可以进行前述基片事项中所记载的电晕放电处理等表面处理。另外，取决于培养的微生物的种类，盖片优选具有适当的气体透过性，主要是氧透过性或氧不透过性，其可以考虑这一点而进行选择。
盖片优选要确保可以与被检验面接触的适度的柔软性。因此，盖片的厚度优选为10～200μm左右，进一步优选为20～70μm左右。另外，盖片可以是任意形状，但为了防止杂菌进入，其必须为大于干燥培养层的尺寸，以可以覆盖干燥培养层。
叠层在盖片内表面上的粘着层，只要具有充分捕获被检验面上微生物的粘合性，并且不会污染、污损捕获部位即可。作为构成这种粘着层的粘合剂，例如，可以列举丙烯酸系粘合剂、橡胶系粘合剂、有机硅系粘合剂。特别是从微生物粘合面上的荧光标识性的观点考虑，粘合剂优选透明性高，并且无荧光性。更优选为丙烯酸系粘合剂或有机硅系粘合剂。
作为这种丙烯酸系粘合剂的优选具体例，可以列举以选自烷基的碳数为2～13的直链或支链烷基的（甲基）丙烯酸烷基酯，例如，（甲基）丙烯酸乙酯、（甲基）丙烯酸丙酯、（甲基）丙烯酸丁酯、（甲基）丙烯酸己酯、（甲基）丙烯酸辛酯、（甲基）丙烯酸壬酯和（甲基）丙烯酸癸酯等中的1种或2种以上为主单体，并使其与（甲基）丙烯酸、衣康酸、马来酸、（甲基）丙烯酸羟乙酯、（甲基）丙烯酸甲氧基乙酯、（甲基）丙烯酸乙氧基乙酯、（甲基）丙烯酸丁氧基乙酯、（甲基）丙烯酸乙二醇酯这样的1种或2种以上的亲水性单体进行共聚所得的共聚物。此外，为了改善粘合特性（特别是粘合力），还优选使用通过对这些聚合物以异氰酸酯化合物、有机过氧化物、含有环氧基的化合物这样的热交联剂进行处理，或以紫外线、γ射线、电子束等进行照射处理而实施了交联的材料。
此外，作为橡胶系粘合剂，可以举例天然橡胶、胶乳、苯乙烯系聚合物嵌段和共轭二烯系聚合物嵌段的嵌段共聚物，苯乙烯系聚合物嵌段与、苯乙烯系单体和共轭二烯系单体的无规共聚物嵌段的嵌段共聚物及其氢化物等苯乙烯系弹性体，除此之外，还可以举例在天然橡胶、苯乙烯－异戊二烯－苯乙烯共聚物、苯乙烯－丁烯共聚物、苯乙烯－乙烯－丁烯－苯乙烯共聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、聚异丁烯、聚异戊二烯等基体聚合物中，组合了萜烯树脂、脂肪族烃树脂、脂环族烃树脂、香豆酮－茚系树脂、松香系树脂、酚系树脂、二甲苯系树脂、苯乙烯系树脂等粘合性赋予剂以及石蜡系油、环烷系油等软化剂所得的材料等。
此外，作为有机硅系粘合剂，可以列举由下述聚合物成分和下述交联成分所形成的部分交联的聚硅氧烷所构成的有机硅系树脂、主成分由二甲基硅氧烷和/或苯基甲基硅氧烷所形成的物质、以含有二甲基硅氧烷单元的聚有机硅氧烷为主成分的物质等，前述聚合物成分是在以－SiO（CH3）2－作为重复单元的聚合物末端具有硅醇基（SiOH）的高分子量聚二甲基硅氧烷、聚二甲基二苯基硅氧烷等聚合物成分，前述交联成分是具有三维硅酸酯结构且末端具有三甲基甲硅烷氧基的交联成分。
在使用上述丙烯酸系共聚物等水溶性粘合剂时，可以根据需要以每100重量份粘合剂5～40重量份的范围添加增塑剂，通过添加增塑剂，可以进一步提高粘合剂的柔软性和粘合性。另外，其特征在于粘着层的厚度为1～100μm，更优选为10～60μm。
此外，作为剥离膜，只要在使用时可以很容易地剥离粘着层就没有特别限定。可以举例在与粘着层的接触面上实施了有机硅处理的聚酯膜、聚氯乙烯膜、聚偏氯乙烯膜等。剥离膜的厚度，优选为10～200μm，更优选为20～100μm。
本发明的微生物培养片，也可以在由前述粘着层捕获菌之后，再用剥离膜覆盖前述粘着层。在使用很多微生物培养片捕获菌，并暂时向其中投入凝胶化溶液时，从方便角度出发，可以用剥离膜暂时对粘着层进行再覆盖。为了进行这种再覆盖，可以将剥离膜的一部分固定设置在盖片上，以不会将其全部剥离。
另外，当没有在基片上印刷方格印刷图案时，也可以在盖片上预先用不溶于水且不会对微生物的生长产生影响的油墨印刷方格印刷图案。印刷的版式和基片一样，从着色剂、树脂、溶剂等选择范围广的方面考虑优选凹版印刷等。对于方格的大小，1cm见方左右是适当的。
（5）边框层
在本发明中，可以在基片上形成边框层。该边框层是在基片上所形成的干燥培养层的外周进行调制的。通过形成边框层，向干燥培养层中投入凝胶化溶液，覆盖盖片，能够使凝胶化溶液快速地扩散至边框层，由此可以在短时间内进行作业。此外，凝胶化溶液使位于边框层内侧的干燥培养层吸水并膨润，可以防止因干燥培养层和盖片的密合性而导致的干燥培养层干燥。进一步，由于和盖片的密合性优异，因此在盖片上不需要形成用于形成菌落的层等，可以确保优异的菌落辨识性。
本发明中在基片上所形成的边框层的高度，调制为比干燥培养层的高度高100～1200μm，更优选高200～1000μm，特别优选高300～800μm。如果低于100μm，则在扩散后无法抑制凝胶化溶液的蔓延，有时会产生泄漏。另一方面，如果超过1200μm，则由于在吸水后的干燥培养层的上部产生了过度的空间部分，因此难以确保与盖片的密合性，并且在培养中干燥培养层容易干燥，或者，如果在盖片与干燥培养层已经密合时，由于过度的空间，盖片也会从干燥培养层上剥离，有时会导致干燥培养层的干燥。如果为上述范围，则可以使凝胶化溶液被干燥培养层吸收，同时扩散至整面且不会遗漏，还可以确保与盖片的密合性。
此外，上述边框层是形成在基片上的。如果在干燥培养层上形成边框层，则在干燥培养层吸收凝胶化溶液后，存在有边框层坍塌的情况，而由于直接形成在基片上，因此不会被凝胶化溶液浸润，可以避免边框层的剥离等。
本发明中所使用的疏水性树脂，对于培养时所投入的凝胶化溶液的蔓延，可以排斥水而防止其泄漏，并且由于凝胶化溶液是水系的，因此使用能够排斥该溶液的疏水性树脂。因此，作为用于边框层的疏水性树脂，只要不是水溶性树脂或亲水性树脂，就可以使用任何的疏水性树脂，它们还可以被着色，其可以适当地使用UV固化树脂、热熔树脂、热发泡油墨或UV发泡剂等。
作为UV固化树脂，可以举例，自由基型：丙烯酸酯系、不饱和聚酯系，阳离子型：环氧丙烯酸酯系、氧杂环丁烷系、乙烯基醚系等，但并不限定于这些。用于使UV固化树脂固化的照射条件是累积光量为50～2000mJ/cm2，并更优选为100～1000mJ/cm2。
此外，作为热熔树脂，可以优选使用软化点温度为120℃以下，更优选为100℃以下的树脂。其原因在于，如果超过120℃，则基片有时会卷曲。作为本发明中可以优选使用的热熔树脂，可以列举聚氨酯系、聚酰胺系、聚烯烃系、聚酯系、乙烯乙酸乙烯酯系、苯乙烯丁二烯橡胶系或者聚氨酯橡胶系等合成橡胶系等，但并不限定于这些。
作为疏水性树脂，可以适当地使用热发泡油墨或者UV发泡剂等。例如，可以使用采用作为粘合剂的聚氨酯系树脂、聚酰胺系树脂、聚氯乙烯系树脂、聚丙烯酸酯系树脂、聚酯系树脂，以及氯化聚丙烯等聚烯烃系树脂、或者氯化橡胶或环化橡胶等橡胶类等的油墨。这些油墨如果是斥水性的，则比仅仅为疏水性的更加优选，从这一点考虑，则更优选在上述树脂中添加了有机硅类或蜡类的油墨。特别是用于边框层的疏水性树脂，在具有疏水性、斥水性的同时，还必须使涂膜的厚度增厚，因此在上述的树脂中添加现有公知的发泡剂等以用作发泡油墨是有效的。作为这种UV发泡油墨，可以举例在至少由丙烯酸酯反应性稀释剂或甲基丙烯酸酯反应性稀释剂等活性稀释剂，和氨基甲酸酯丙烯酸酯光聚合性低聚物、聚酯丙烯酸酯光聚合性低聚物、环氧丙烯酸酯光聚合性低聚物、丙烯酸系光聚合性低聚物、特殊光聚合性低聚物等光聚合性低聚物以及光聚合引发剂所形成的紫外线固化型油墨中含有无机发泡剂、有机发泡剂、液体发泡剂等发泡剂的紫外线固化型发泡油墨。
另外，在上述疏水性树脂中，作为添加剂，可以添加消泡剂、阻聚剂、颜料分散剂等。此外，可以在不到15质量%的范围内含有通常所使用的着色颜料，而如果超过15质量%，则有阻碍发泡的担忧，因此有时不优选。
在本发明中，可以优选使用上述任意材料作为疏水性树脂，并特别优选UV固化树脂或热熔树脂。其原因在于边框层的形成，必须形成具有一定高度的图案，并且这2种树脂在非溶剂体系的状态下容易通过使用分配器等涂布进行形状加工，然后再通过光照射或者冷却而很容易地使其固化，就可以以图案状形成。
为了像这样形成边框层，只要通过对上述疏水性树脂进行印刷、涂布或涂覆而形成图案即可。然后，使用金属卤化物灯、水银灯等照射紫外线（UV），或冷却。
此外，作为边框层，还可以将疏水性材料的挖空制品粘接在干燥培养层的外周形成边框层。进一步，还有使用压纹加工品作为基片的方法。例如，如果是将边框层的形状形成为凸状的压纹加工品，则只要在前述凸状的内侧形成干燥培养层即可，另一方面，将形成干燥培养层的位置形成为凹部，由此可以将以凸状方式所形成的剩余部分用作为边框层。
进一步，可以采用如下方法：使用厚的疏水性基材作为基片，并将形成干燥培养层的部分削成凹状，进而将剩余部分作为边框层的方法，或者是将边框层的形状形成为凸状，并在该凸状的内侧形成干燥培养层，则可以将前述凸状用作为边框层的方法。但是，并不限定于这些方法。
（6）方格印刷层
在本发明的微生物培养片上，可以叠层方格印刷层。这种方格印刷层，如前所述，可以形成在基片或盖片上，本发明中，在使用将纸质基材叠层在塑料片上形成的叠层片作为前述基片的情况下，可以在这种纸质基材上形成方格印刷层。方格印刷，从着色剂、树脂、溶剂等选择范围广的方面考虑优选凹版印刷等。对于方格的大小，1cm见方左右是适当的。
（7）凝胶化溶液
本发明的微生物培养片，在培养菌类之前，必须向干燥培养层中投入凝胶化溶液，使其凝胶化。
作为凝胶化溶液，可以针对构成微生物培养片的干燥培养层的组成进行适当选择。例如，在前述干燥培养层仅为凝胶化剂时，使用溶解了营养成分的凝胶化溶液。在向微生物培养片中投入适合凝胶化的规定量时，营养成分的浓度是适合培养菌类的浓度。进一步，还可以含有显色指示剂、选择剂和基质等。
另一方面，在干燥培养层中含有营养成分、显色指示剂、选择剂、基质等时，可以使用灭菌生理盐水或灭菌精制水等作为凝胶化溶液。另外，在使用由干燥培养层中未包含的营养成分、显色指示剂、选择剂和基质等特定成分所形成的被检验溶液作为凝胶化溶液时，在这些特定成分在灭菌处理和其他的工序中容易产生变质、变色、分解等的情况下是特别有效的。另外，也可以使干燥培养层中含有显色指示剂、选择剂、基质等，并仅使用营养成分作为凝胶化溶液。
此外，通过使用凝胶化溶液，可以使粘着层和干燥培养层之间通过凝胶化溶液而接触，从而可以防止气泡的混入。
（8）微生物培养片的使用方法
本发明的微生物培养片，可以将叠层在盖片上的剥离膜剥离，使粘着层露出，并使该粘着层与被检验面接触，从而捕获菌。接着，向构成微生物培养片的干燥培养层中投入规定量的前述凝胶化溶液，将前述粘着层覆盖在培养层上，在凝胶化结束后在规定温度下培养规定时间，由盖片或基片观察微生物菌落。
本发明的微生物培养片，为了进行食品、医药品等制造工序中的卫生管理，可以将装置或设施等的表面作为被检验面，并通过粘着层捕获前述被检验面上的微生物。作为这种被检验面，并不限定于上述制造工序，也可以适当地用于快餐等食品销售的店铺、医院、诊所、学校的食堂等公共设施中的卫生管理。
进一步，本发明的微生物培养片，还可以用于作为空气中存在的微生物的测定方法的沉降菌法。沉降菌法，是使空中浮游的微生物自然地落在开放一定时间的一定面积的琼脂平板培养基上并将其捕捉的方法，在一定时间后将其回收进行培养以及测量菌落数，而由于在空中浮游的微生物较少的环境下微生物少，因此为了检测而需要较长的开放时间。在使用以往的平板琼脂培养基时，存在有水分会蒸发，培养基会干燥这样的缺点，并且即使在空调等空气喷出口中，也存在有培养基干燥的问题。然而，本发明的微生物培养片，由于使用干燥培养层，并且在捕获菌后通过凝胶化溶液使干燥培养层凝胶化或增粘，因此没有上述问题。
（9）微生物培养试剂盒
在本发明中，可以形成含有上述微生物培养片和前述凝胶化溶液的微生物培养试剂盒。
使用这种微生物培养试剂盒，剥下前述微生物培养片的盖片上的剥离膜，使粘着层与被检验面接触而捕获菌，并添加前述凝胶化溶液，将盖片的粘着层覆盖在干燥培养层上，使干燥培养层凝胶化，并在凝胶化结束后进行培养，从而可以评价产生的菌落。
此外，作为菌的捕获方法，也可以剥下前述微生物培养片的盖片上的剥离膜，使粘着层在规定时间内为开放状态，捕获沉降菌。接着，添加前述凝胶化溶液，将盖片的粘着层覆盖在干燥培养层上，使干燥培养层凝胶化，在凝胶化结束后进行培养，从而可以评价产生的菌落。
在使用本发明的微生物培养试剂盒时，可以将捕获菌类的粘合面覆盖在上述微生物培养片上进行保存，并在即将培养前向干燥培养层中投入上述凝胶化溶液使其凝胶化，然后再培养菌。当存在多个捕获菌类的微生物培养片时，通过上述操作，可以高效地进行作业。
另外，微生物培养片中所使用的干燥培养层的含有成分和凝胶化溶液，与菌类的培养具有密切的关系。因此，当凝胶化溶液中含有适合于特定菌类增殖的营养成分、显色指示剂、选择剂、基质等时，通过将不同的凝胶化溶液与同一微生物培养片组合起来，可以简便地进行各种菌类的培养。
（10）制造方法
本发明的微生物培养片，只要可以在前述基片的上方形成至少含有凝胶化剂的干燥培养层，则其制造方法就没有限定。
例如，可以在基片上涂覆粘接剂，并使上述凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂、基质、缓冲剂（pH调节剂）等其它成分以粉末状均匀粘接，从而进行调制。作为粘接剂，只要不会对微生物的发育产生阻碍性，就可以使用。可以优选使用不溶于水的粘接剂，例如丙烯酸系压敏粘接剂等。
此外，可以通过印刷、涂布、涂覆、喷雾等将至少含有凝胶化剂，此外还含有营养成分、显色指示剂、选择剂、基质、缓冲剂（pH调节剂）中的1种以上的培养液形成在基片的上方。为了能够将成分直接固定粘附在基材上，培养液至少溶解了具有粘接性的成分，并且溶解或分散了构成干燥培养层的成分。例如，可以列举在使用醇作为溶剂时，将聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基纤维素等溶解在甲醇或乙醇中，并至少在其中将凝胶化剂溶解、悬浮或分散，或者在使用水作为溶剂时，将聚乙烯醇或聚乙二醇等溶解在水中，并进一步溶解、分散凝胶化剂等。另外，干燥培养层，可以如前述图1所示，形成在基片的一部分上，也可以如图7所示，形成在基片的上部整面上。
此外，不限定于在基片上直接形成干燥培养层的情况，也可以在基片上配设无纺布，并使前述无纺布浸渍培养液，形成干燥培养层。例如，只要在基片上设置人造丝无纺布等合成纤维无纺布、棉无纺布等天然纤维无纺布等网眼尺寸为15～100目左右的材料，并通过涂布、喷雾等使其浸渍至少含有凝胶化剂，此外还含有营养成分、显色指示剂、选择剂、基质、缓冲剂（pH调节剂）中的1种以上的培养液即可。
除此以外，前述的干燥培养层还可以是2层以上的多层。例如，将前述培养液叠层在基片上，接着叠层含有显色指示剂等的溶液，由此可以形成菌落辨识性进一步提高的干燥培养层。
在本发明中，通过使用干燥培养层，可以和琼脂培养基同样地对微生物菌落进行观察并计数，并且判断可以确保比使用琼脂培养基时极其优异的辨识性。另外，培养层的干燥，只要可以除去培养液中所含的前述溶剂即可，并且可以根据温度、压力等以往公知的方法进行干燥。
当本发明的微生物培养片在干燥培养层的外周具有边框层时，可以预先形成边框层，然后再形成干燥培养层，也可以在形成干燥培养层之后形成边框层。此外，还可以使用预先形成了边框层的基片。
作为形成了边框层的基片，是表面上至少具有疏水性树脂的基片，并且还有方法是使用在基片上压纹加工边框层的材料。例如，在基片上将边框层的形状形成为凸状的基片，只要在前述凸状的内侧形成干燥培养层，就可以制造本发明的微生物培养片。另外，还可以通过凹部的压纹加工形成干燥培养层形成用的位置，并将前述凹部外周所形成的凸部作为边框层。
另一方面，作为在基片上形成干燥培养层之前将边框层以图案状形成的方法，例如，可以将疏水性树脂挖成规定形状，并将其与基片粘合在一起，作为边框层。进一步，还有使用厚的疏水性树脂板作为基片，将形成干燥培养层的部分削成凹状，并以剩余部分作为边框层的方法，或者只要将边框层的形状形成为凸状，在该凸状的内侧形成干燥培养层，就可以使用前述凸状作为边框层。
此外，可以使用前述UV固化油墨、热熔油墨、热发泡油墨或UV发泡剂等作为疏水性树脂，并进行图案的形成而形成边框层。它们是非溶剂体系，可以通过分配器涂布等而容易地加工形成图案，并且固化也容易，因此特别优选。
为了使用上述UV固化油墨等作为疏水性树脂并形成边框层，可以将上述疏水性树脂溶解在适当的溶剂中，并通过印刷、涂布或涂覆而以图案状形成。
当疏水性树脂为UV固化油墨或UV发泡油墨时，在形成图案后，照射UV。作为紫外线（UV）照射条件，累积光量优选为50～2000mJ/cm2，并更优选为100～1000mJ/cm2，并且还可以将紫外线照射灯的光和热并用。能够发泡的照射条件的范围，根据发泡剂的种类而变化。在无法一次性确保规定高度时，可以通过进行多次印刷而形成边框层。作为紫外线照射灯，可以使用金属卤化物灯、水银灯等。
在本发明中，在形成干燥培养层之后形成边框层时，可以使用上述UV固化油墨、热熔油墨、热发泡油墨或UV发泡剂等，并通过以图案状形成而形成边框层。这时，当干燥培养层中含有会因UV照射而产生变质的成分时，优选在UV照射时用金属等覆盖干燥培养层。
此外，还可以将疏水性树脂板挖成规定形状，并将其粘接在形成干燥培养层的基片的前述干燥培养层外周的基片上作为边框层。
本发明的微生物培养片，在盖片（40）上叠层了粘着层（43）和剥离膜（45）。通过在盖片（40）上涂覆形成粘着层的粘合剂溶液并干燥而形成粘着层，接着叠层剥离膜，然后再叠层在形成了干燥培养层（30）及根据需要的边框层（20）的基片（10）上。通过将前述粘着层（43）与基片（10）接触，可以将盖片（40）固定设置在基片上。
另一方面，当盖片和基片是由相同材料构成时，可以预先在盖片（40）上叠层粘着层（43）和剥离膜（45），然后再通过热封、层压粘接或其它方式将其固定设置在基片上。如图5（a）的平面图、图5（b）的截面图所示，可以直接在基片（10）和盖片（40）连在一起的情况下，在基片（10）上形成边框层（20）和干燥培养层（30），另一方面，在盖片（40）上叠层粘着层（43）和剥离膜（45），然后将其折弯形成微生物培养片。图6（c）表示其截面图。根据该方法，由于基片（10）和盖片（40）连在一起，因此在干燥培养层（30）上培养粘着层（43）所捕获的微生物时，不需要移动粘着层（43）就可以覆盖在干燥培养层（30）上。
另外，如图6的横截面图所示，也可以分开调制叠层了粘着层（43）和剥离膜（45）的盖片（40）和基片（10），并用双面胶带（50）等将盖片（40）与形成了干燥培养层（30）的基片（10）粘合在一起。
进一步，图8中表示在盖片（40）上形成了方格印刷，并且盖片（40）与形成了干燥培养层（30）的基片（10）在端部粘接的本发明的微生物培养片的外观斜视图。
本发明的微生物培养片，实施伽马射线照射或环氧乙烷气体灭菌等灭菌处理后，制成本发明的微生物培养片制品。
本发明的微生物培养片，可以根据所含的微生物营养成分的种类、所用的基片、盖片的通气性以及其他情况而进行各种微生物的培养。
实施例
接着，列举实施例对本发明进行详细说明，但这些实施例并不限制本发明。
（实施例1）
通过分配器使UV固化油墨（十条化学公司制造，商品名“莱伊库阿（レイキュアー）GA 4100－2”）在聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（帝人杜邦（デュポン）制造，商品名“Teijin Tetoron Film(テイジンテトロンフィルム)”）上形成宽1.0mm、高750μm、直径52mm的圆形边框层，并使用水银灯以250mJ/cm2的累积光量进行照射，使边框层固化。所得边框层的高度为750μm（与干燥培养层的高度差为+400μm），宽度为1mm。
接着，将20g聚乙烯基吡咯烷酮K－90溶解在210ml甲醇中，并向其中分散60g瓜尔胶粉末（三晶公司制造，商品名“NEOVISCO G”，400目型），然后进一步混合作为营养成分的3.26g胰蛋白胨（Becton，Dickinson andCompany公司制造，商品名“BACT TRYPTONE”）、0.82g肉提取物（Oxoid公司制造，商品名“Lab－Lemco”）、0.03g酵母提取物（Becton，Dickinsonand Company公司制造，商品名“酵母提取物”）、0.16g葡萄糖（和光纯药工业公司制造，商品名“D－（+）－葡萄糖”）、0.41g氯化钠（和光纯药工业公司制造）和0.37g磷酸氢二钠（和光纯药工业公司制造），调制涂布液。
通过涂布器将含有该营养成分、凝胶化剂的涂布溶液涂布在形成了前述边框层的基材的框内。接着，在50℃下将涂布后的层干燥15分钟，形成干燥培养层。干燥时层的厚度为350μm。
接着，在100重量份丙烯酸系粘合剂（SK达依恩（SKダイン）1495/综研化学）中混合调整1重量份异氰酸酯系固化剂（L/45/综研化学），并将其涂布在进行了有机硅处理的厚度为50μm的聚酯膜上，使干燥后的厚度为20μm，再与厚度为40μm的OPP膜（OP－U－1/东压）的电晕处理面粘合在一起制作粘着层，再叠层在形成了前述边框层和干燥培养层的PET基材上，并粘接端部，然后用γ线灭菌，得到本发明的微生物培养片。
使用黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）作为菌株，并将在36±1℃下在液体培养基（TRYPTIC SOY BROTH）中培养18小时的菌液用灭菌生理盐水进行稀释，使菌数为103/ml，将1mL该稀释液滴到橡胶板的表面上，并将自然干燥后的表面作为被检验面。所得的橡胶板，在200cm2上附着了1×103个黄色葡萄球菌。对于该橡胶板，剥下上述微生物培养片上由聚酯膜所形成的剥离膜，并使粘着层对着被检验物压粘1次，捕获黄色葡萄球菌。
接着，用灭菌后的吸液管在上述微生物培养片的干燥培养层上添加1ml0.05g/L的添加了TTC的灭菌精制水，并在其上方覆盖盖片，前述灭菌精制水扩散至边框层内全体，静置约1分钟形成凝胶后，放入到孵化器中，在36±1℃下培养48小时。
分别对培养后所产生的菌落数进行计数。结果示于表1。此外，产生的菌落示于图9。
（比较例1）
使用市售的微生物检测片（智索（チッソ）株式会社制造，商品名“SANITAKUN（サニ太くん）”，一般活菌用）。打开该微生物检测片的盖子，向无纺布部分添加1ml灭菌生理盐水，放置15分钟。
对于和实施例1所调制的材料相同的被检验物，剥下上述微生物检测片的剥离膜，并使无纺布部分对着被检验物压合1次，捕获黄色葡萄球菌。
接着，在上述微生物检测片中湿润的无纺布上覆盖盖片，并放入到孵化器中，在36±1℃下培养48小时。分别对培养后所产生的菌落数进行计数。结果示于表1。
（实施例2）
剥下比较例1中检测片的盖片，使用实施例1的盖片，再对于和实施例1所调制的材料同样的被检验物，剥下上述微生物检测片的剥离膜，使粘着层压合被检验物1次，捕获黄色葡萄球菌。
接着，在比较例1中所用的微生物检测片的无纺布部分上添加1ml灭菌生理盐水，充分湿润后用盖片的粘着层覆盖，并放入到孵化器中，在36±1℃下培养48小时。分别对培养后所产生的菌落数进行计数。结果示于表1。
（比较例2）
作为培养基，将2.5g酵母提取物（Becton，Dickinson and Company公司制造）、5.0g胰蛋白胨（Becton，Dickinson and Company公司制造，商品名“BACTTRYPTONE”）、1.0g D－（+）－葡萄糖（Nacalai Tesque公司制造）、15.0琼脂在1000ml精制水中形成均匀悬浮液，然后在121℃下高压蒸汽灭菌15分钟，冷却至50℃，再分注到容器中形成标准琼脂培养基，使用该标准琼脂培养基，并调制厚度为3.5mm、面积为10cm2的戳印培养基。用γ线对其进行灭菌，作为比较戳印培养基。
对于和实施例1所调制的材料同样的被检验物，将上述比较戳印培养基压合1次，捕获黄色葡萄球菌。
接着，在上述比较戳印培养基上加盖，并放入到孵化器中，在36±1℃下培养48小时。分别对培养后所产生的菌落数进行计数。结果示于表1。此外，产生的菌落示于图10。
[表1]菌数测定结果[单位：个]
  菌落数
实施例1   55
比较例1   4
实施例2   33
比较例2   5
（结果）
比较例1和比较例2，使含水培养层与检测对象直接接触而捕获微生物，培养的菌落数分别为4个和5个。相反，实施例1和实施例2，使剥下剥离膜后露出的粘着层与检测对象直接接触而捕获微生物，培养的菌落数为55个和33个。由此可以判定，使剥下剥离膜后露出的粘着层与检测对象直接接触而捕获微生物的方法，其捕获效率优异。
此外，将图9所示的实施例1的菌落和图10所示的比较例2的菌落相比，可以判定，使用实施例1的干燥培养层比使用比较例2的琼脂培养基，菌落辨识性辨识性优异。
（实施例3）
作为前述干燥培养层，（i）使用和实施例1同样组成所制作的微生物培养片，（ii）使用除了在干燥培养层中不含营养成分以外，和实施例1同样操作所调制的微生物培养片，对于和实施例1中所调制的同样的被检验物，剥下上述微生物检测片的剥离膜，使粘着层对着被检验物压合1次，捕获黄色葡萄球菌。另外，上述（i）、（ii）在干燥时的干燥培养层厚度为320～360μm。
接着，在使用（i）的微生物培养片时，向前述微生物培养片的干燥培养层上添加1ml规定的稀释液（凝胶化溶液），在使用（ii）的微生物培养片时，向前述微生物培养片的干燥培养层上添加1ml每1000ml灭菌精制水中溶解了下述物质的营养成分液（凝胶化溶液）：20.0g胰蛋白胨（Becton，Dickinson andCompany公司制造，商品名“BACT TRYPTONE”）、5.0g肉提取物（Oxoid公司制造，商品名“Lab－Lemco”）、1.0g酵母提取物（Becton，Dickinson andCompany公司制造，商品名“酵母提取物”）、1.0g葡萄糖（和光纯药工业公司制造，商品名“D－（+）－葡萄糖”）、1.0g氯化钠（和光纯药工业公司制造）、1.0g磷酸氢二钠（和光纯药工业公司制造）和0.05g TTC（和光纯药工业公司制造），然后在其上方分别覆盖盖片，前述凝胶化溶液扩散至边框层内全体，静置约1分钟形成凝胶后，放入到孵化器中，在36±1℃下培养48小时，分别对培养后所产生的菌落数进行计数。结果示于表2。
[表2]菌数测定结果[单位：个]
 干燥培养层   菌落数
 含有营养成分   171
 不含营养成分   195
（结果）
在干燥培养层中含有营养成分，用不含营养成分的凝胶化溶液使干燥培养层凝胶化的情况，以及在干燥培养层中不含营养成分，用含有营养成分的凝胶化溶液使干燥培养层凝胶化的情况，检测出的菌落数大概相同。由此判断，在使干燥培养层凝胶化时，使用含有营养成分的凝胶化溶液，则可以在制造微生物培养片时，通过添加不同的凝胶化溶液而检测不同的菌，并且可以使生产线统一化。
（实施例4）
剥下实施例1中制造的微生物培养片的粘着层的剥离膜（聚酯膜），用手指按住粘合面，然后向前述微生物培养片的干燥培养层中分注入0.05g/L添加了TTC的灭菌精制水，接着一边将前述粘着层的粘合面覆盖在培养层上，一边使前述灭菌精制水扩散至微生物培养片的边框层内全体，静置约1分钟形成凝胶后，放入到孵化器中，在36±1℃下培养48小时。培养后所产生的菌落数示于图11。
（比较例3）
使用市售的戳印培养基DD CHEKER（DDチェッカー）（极东制药工业制造，一般细菌检测用DD琼脂培养基），用手指按住左侧的琼脂培养基表面，对于右侧的琼脂培养基表面，和实施例4同样地用手指按住微生物培养片的粘着层使其粘合，并放入到孵化器中，在36±1℃下培养48小时。培养后所产生的菌落数示于图12。
（结果）
如图11所示可以判定，含有干燥培养层的微生物培养片与盖片的粘着层的组合，其辨识性非常好，并且菌落良好。
与此相比，如图12的右侧所示，将粘着层与琼脂培养基进行组合时，容易混入细小的气泡，并且菌落在粘着层与琼脂之间扩散，无法对比，难以观察。
工业实用性
本发明的微生物培养片，可以提供一种菌的捕获率优异的微生物培养片。干燥培养层和琼脂培养基相比，其菌落的辨识性优异并且有用。
符号说明
10…基片、
20…边框层、
30…干燥培养层、
40…盖片、
43…粘着层、
45…剥离膜、
50…双面胶带

Claims (10)

1.一种微生物培养片，包括基片、形成在前述基片上的干燥培养层以及覆盖前述干燥培养层的盖片，其中，前述盖片在内表面上叠层了粘着层和剥离膜。
2.如权利要求1所述的微生物培养片，其特征在于，前述粘着层的厚度为1～100μm。
3.如权利要求1所述的微生物培养片，其中，前述干燥培养层为在前述基片上使含有凝胶化剂的培养液图案形成的层。
4.如权利要求1或2所述的微生物培养片，其特征在于，前述基片在前述干燥培养层的外周具有包含疏水性树脂的边框层。
5.如权利要求4所述的微生物培养片，其特征在于，前述边框层的高度比前述干燥培养层的高度高100～1200μm。
6.如权利要求1～5任一项所述的微生物培养片，其特征在于，前述基片和/或盖片，包含透明塑料片。
7.一种微生物培养试剂盒，包含权利要求1的微生物培养片以及凝胶化溶液，所述凝胶化溶液含有在前述干燥培养层中未包含的能够培养菌的成分、显色指示剂和选择剂等。
8.一种菌的培养方法，其特征在于，该方法是在权利要求7所述的微生物培养试剂盒的粘着层上所捕获的菌的培养方法，其包括：
在前述粘着层上捕获菌的工序，
添加前述凝胶化溶液，在干燥培养层上覆盖盖片的粘着层，并使干燥培养层凝胶化的工序，以及
在凝胶化完成后进行培养。
9.如权利要求8所述的菌的培养方法，其中，前述菌的捕获方法是使前述粘着层与被检验面接触而捕获菌的方法。
10.如权利要求8所述的菌的培养方法，其中，前述菌的捕获方法是使前述粘着层在规定时间内为开放状态，捕获沉降菌的方法。
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